Biosensor Ultrasensitif untuk Deteksi DNA Vibrio cholerae dengan Polystyrene-co-acrylic Acid Composite Nanospheres
Abstrak
Sebuah biosensor elektrokimia ultrasensitif untuk penentuan patogen Vibrio cholerae (V . kolera ) DNA dikembangkan berdasarkan matriks pembawa DNA polystyrene-co-acrylic acid (PSA) latex nanospheres-gold nanoparticles composite (PSA-AuNPs). Diferensial pulse voltametry (DPV) menggunakan label elektroaktif antrakuninon oligonukleotida digunakan untuk mengukur respon biosensor. Pemuatan nanopartikel emas (AuNPs) pada elektroda partikel lateks DNA telah secara signifikan memperkuat arus faradaik hibridisasi DNA. Bersama dengan penggunaan probe yang dilaporkan, biosensor telah menunjukkan sensitivitas yang tinggi. Biosensor DNA menghasilkan rentang respons linier yang luas dan dapat direproduksi untuk menargetkan DNA dari 1,0 × 10
−21
hingga 1.0 × 10
−8
M (deviasi standar relatif, RSD = 4,5%, n = 5) dengan batas deteksi (LOD) 1,0 × 10
−21
M (R
2
= 0.99). Biosensor memperoleh nilai pemulihan yang memuaskan antara 91 dan 109% (n = 3) untuk mendeteksi V . kolera DNA dalam sampel berduri dan dapat digunakan kembali untuk enam pengujian DNA berturut-turut dengan nilai RSD pengulangan 5% (n = 5). Respons biosensor elektrokimia stabil dan dapat dipertahankan pada 95% dari respons aslinya hingga 58 hari periode penyimpanan.
Latar Belakang
Vibrio kolera , patogen bawaan makanan, dapat menyebabkan epidemi kolera pada manusia melalui kondisi diare cair akut. Wabah kolera masih menjadi masalah serius di beberapa belahan dunia, mis. Asia dan Afrika, dan menyebabkan status sosial ekonomi rendah [1,2,3,4]. Patogen enterik ini merupakan penyebab utama morbiditas dan mortalitas, terutama di negara berkembang [5]. Epidemi dan pandemi kolera di berbagai daerah terutama disebabkan oleh V. kolera serogrup O1 dan O139 [1, 2, 6]. V. kolera serogrup O1 memiliki dua serotipe utama, yaitu Inaba dan Ogawa, yang dapat bergantian di antara epidemi kolera. Serotipe ketiga, Hikojima, juga ada tetapi jarang dan tidak stabil. Gen yang bertanggung jawab untuk biosintesis antigen O1 telah ditetapkan sebagai rfb. Mutasi yang mendefinisikan serotipe Inaba dan Ogawa adalah mutasi delesi tunggal pada gen rfbT [7]. Namun, wabah yang ditularkan melalui makanan sesekali pada manusia dengan diare parah juga telah dilaporkan disebabkan oleh non-O1/non-O139 V. kolera melalui konsumsi makanan laut yang kurang matang [8] atau paparan lingkungan perairan yang terkontaminasi [9]. Epidemi pertama V. kolera O139 terjadi pada tahun 1992 di Bangladesh dan India dan kemudian menyebar dengan cepat ke negara-negara lain di Asia Tenggara [10]. Di seluruh dunia, pada tahun 2005, total 131.943 kasus kolera dan 2272 kematian dilaporkan ke Organisasi Kesehatan Dunia (WHO) [11].
Pencarian metode yang efektif untuk pemantauan atau diagnosis toksikgen V. kolera bakteri sangat penting untuk mengendalikan epidemi kolera. Identifikasi tradisional V. kolera sering dicapai melalui isolasi dan penyaringan bakteri, yang melibatkan pra-pengayaan dalam air pepton alkali (APW) diikuti dengan isolasi V. kolera pada media kultur tiosulfat sitrat empedu garam sukrosa (TCBS) dan identifikasi dengan uji aglutinasi slide dengan antiserum spesifik [12]. Namun, teknik ini sangat memakan waktu dan tenaga, dan hasil yang diperoleh beberapa hari kemudian akan berarti keterlambatan dalam diagnosis klinis dan perawatan pasien. Metode molekuler yang melibatkan amplifikasi PCR untuk mendeteksi V. kolera [13] telah mengurangi waktu diagnosis [14], tetapi metode PCR membutuhkan infrastruktur profesional yang terampil dan mahal yang sulit dilakukan di negara-negara dengan pengaturan sumber daya yang rendah. Tes diagnostik cepat berdasarkan prinsip imunokromatografi telah dilaporkan untuk deteksi diskrit atau simultan V. kolera serogrup O1 dan O139. Beberapa teknik berbasis immunoassay lain yang digunakan untuk mendeteksi V. kolera adalah seperti enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), koaglutinasi, imunofluoresensi, dan quartz crystal microbalance (QCM). Namun, sebagian besar teknik ini memerlukan instrumentasi yang canggih, waktu pengujian yang lama, dan personel yang berkualifikasi tinggi dengan pengetahuan teknis yang terperinci [15,16,17,18,19,20].
Metode elektrokimia telah menarik perhatian yang cukup besar dalam deteksi asam nukleat karena sensitivitas tinggi, spesifisitas, kesederhanaan, dan protokol ekonomis, serta deteksi cepat dan kompatibel dengan teknologi mikrofabrikasi [21, 22]. Selain itu, metode elektrokimia yang digabungkan dengan teknologi miniaturisasi dapat digunakan untuk analisis desentralisasi in situ, misalnya, perangkat biosensor DNA berbasis chip mikrofluida, yang sangat berguna untuk pengaturan praktis [23]. Ada berbagai macam elektroda yang digunakan dalam pengukuran elektrokimia seperti elektroda karbon kaca (GCE), elektroda pasta karbon (CPE), elektroda emas, dan elektroda platinum. Baru-baru ini, penelitian telah dikonsentrasikan pada penggunaan screen-printed electrodes (SPEs) karena beberapa sifat uniknya seperti menyediakan arus latar belakang yang rendah dan jendela potensial yang luas, hemat biaya karena tinta karbon tidak mahal, dan dapat diproduksi secara massal. .
Ada beberapa metode elektrokimia yang dilaporkan untuk mendeteksi V. kolera terdiri dari serangkaian langkah yang kompleks. Sebuah elektrokimia V. kolera genosensor dilaporkan oleh Liew et al. [24] menggunakan metode adsorpsi elektrokimia untuk melumpuhkan probe DNA pada karbon SPE. Partikel PSA multilayer termodifikasi AuNPs terliofilisasi dengan polielektrolit membentuk biokonjugat dengan avidin untuk berfungsi sebagai label reporter dalam uji hibridisasi DNA sandwich. Namun, penambahan penstabil sorbitol diperlukan untuk mengawetkan biokonjugat PSA-AuNPs-avidin untuk memperpanjang masa operasional biosensor DNA hingga 30 hari. Elektrokimia enzimatik V. kolera Biosensor DNA baru-baru ini dirancang oleh Yu et al. [25], di mana probe DNA berlabel anti-fluorescein-terkonjugasi alkali fosfatase (anti-FCAP) berlabel terikat pada SPE emas melalui kimia emas-tiol. DNA target ditandai dengan fluorescein universal untuk memungkinkan pengenalan hibridisasi DNA dicapai melalui konversi enzimatik -naftil fosfat menjadi -naftol elektroaktif. Namun demikian, skema deteksi ini membutuhkan waktu pengujian yang lama sekitar 95 menit untuk hibridisasi DNA, pelabelan DNA hibrid dengan enzim fungsional diikuti dengan inkubasi elektroda dalam substrat -naftil fosfat elektroinaktif sebelum pengukuran amperometrik dapat dilakukan. Biosensor DNA elektrokimia enzimatik lainnya berdasarkan SPE karbon berlapis avidin yang terkonjugasi dengan probe DNA terbiotinilasi dikembangkan oleh Low dan anggota tim [26]. Sebuah probe reporter berlabel digoxigenin (DIG) juga digunakan dalam strategi hibridisasi ganda ini yang mengapit urutan cDNA. Horseradish peroxidase-linked anti-DIG (anti-DIG-HRP) digunakan sebagai label elektrokimia, yang secara bersamaan dapat mengkatalisis oksidasi 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) dengan reduksi H 2 O2 untuk menghasilkan transfer elektron ke permukaan elektroda untuk transduksi elektrokimia peristiwa hibridisasi DNA. Desain biosensor DNA yang mudah berdasarkan probe DNA tertiolasi elektroda kaca berlapis emas dideskripsikan oleh Patel et al. [22] untuk deteksi cepat V. kolera , dan metilen biru digunakan sebagai indikator hibridisasi DNA. Namun, jangkauan deteksi linier sistem terbatas pada tingkat M, yang membatasi penerapannya dalam sampel klinis.
Nanopartikel emas lateks sebelumnya telah digunakan sebagai label hibridisasi DNA melalui ikatan avidin/biotin ke probe DNA dalam mendeteksi V. kolera [24], patogen ikan Aphanomyces invadans [27], E. koli [28], dan hibridisasi DNA nonspesifik [29], dimana bola lateks dilapisi dengan multilayer polielektrolit sebelum koloid bermuatan negatif nanopartikel emas yang elektrostatik melekat padanya. Kawde dan Wang [29] menempelkan partikel lateks PSA ke probe reporter DNA untuk digunakan sebagai label hibridisasi DNA melalui pemuatan partikel lateks berlapis streptavidin dengan AuNP berlapis biotin. Kuan dkk. [24, 27] dan Liew et al. [24, 27] juga melaporkan metode pengikatan avidin-biotin yang sama menggunakan konjugat probe emas-PSA-DNA. Pinijsuwan dkk. [28] melaporkan penggunaan metode elektrostatik untuk memuat partikel PSA yang dilekatkan pada probe reporter DNA dan partikel PSA berlapis emas polielektrolit digunakan sebagai label untuk hibridisasi yang memperkuat respons arus DPV.
Dalam penelitian ini, kami melaporkan pendekatan imobilisasi DNA yang berbeda menggunakan nanopartikel emas lateks sebagai substrat imobilisasi probe DNA untuk mengembangkan sistem deteksi yang sangat sensitif untuk V. kolera DNA. Imobilisasi DNA dilakukan dengan prosedur yang sangat sederhana dan cepat menggunakan bahan kimia 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida/N-hidroksisuksinimida (EDC/NHS) sebagai reagen kopling untuk meningkatkan efisiensi imobilisasi [30] pada lateks terkarboksilasi permukaan partikel. Deteksi hibridisasi DNA didasarkan pada uji tipe sandwich, yang melibatkan reaksi hibridisasi antara probe DNA amobil dan urutan target diikuti oleh probe sinyal/reporter. Garam natrium monohidrat asam antrakuinon-2-sulfonat (AQMS) digunakan sebagai label elektrokimia untuk memantau peristiwa hibridisasi. Partikel lateks berukuran sub-mikron yang diusulkan meningkatkan kapasitas pengikatan probe DNA, dan sensitivitas biosensor DNA ditingkatkan dengan penggabungan nanopartikel emas yang sangat konduktif (AuNPs). Biosensor DNA menunjukkan sensitivitas yang luar biasa untuk mendeteksi V. kolera cDNA dan batas deteksi yang sangat rendah pada tingkat zeptomolar dibandingkan dengan teknologi avidin-biotin yang dilaporkan sejauh ini [24, 26].
Metode
Bahan Kimia dan Reagen
Styrene (St) dan asam akrilik (AA) dibeli dari Fluka. HAuCl4 ·3H2 O, trisodium sitrat dehidrasi, natrium dodesil sulfat (SDS), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida hidroklorida (EDC), dan N-hidroksisuksinimida (NHS) diperoleh dari Sigma-Aldrich. Amonium persulfat (APS), asam hidrobromat, dan bromin masing-masing dipasok oleh Riedel-De Haën, Ajax Finechem, dan Panreac. Semua larutan kimia disiapkan dengan air deionisasi. Baik oligonukleotida sintetik target 30 basa dan ketidakcocokan diperoleh dari Bio Service Unit (NSTDA). DNA non-pelengkap (ncDNA) dan probe sinyal berasal dari Sigma dan probe penangkapan yang dimodifikasi 5′-amino berasal dari Bioneer. Probe penangkap disiapkan dalam 0,05 M buffer kalium fosfat (pH 7), sedangkan DNA target, target yang tidak cocok, probe reporter, dan larutan DNA non-pelengkap disiapkan dalam buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7). Urutan oligonukleotida yang digunakan dalam penelitian ini ditunjukkan pada Tabel 1.
Aparat
Pengukuran elektroanalitik dilakukan dengan potensiostat/galvanostat (Autolab PGSTAT12, Metrohm) yang dilengkapi dengan perangkat lunak GPES (4.0.007). Percobaan voltametri dilakukan dengan sistem tiga elektroda konvensional yang terdiri dari elektroda kerja sablon pasta karbon (SPE) (Quasense, Bangkok, Thailand), elektroda referensi Ag/AgCl (3 M KCl), dan batang platina ( diameter 2 mm) elektroda lawan. Teknik voltametri pulsa diferensial (DPV) digunakan untuk semua penyelidikan elektrokimia pada potensial langkah 0,02 V dan laju pemindaian 0,5 V/s dari 0,0 hingga +1,0 V dalam buffer pengukur 4,5 mL (0,05 M buffer kalium fosfat) pada pH 7 dan suhu lingkungan. Semua potensi yang diukur dalam penelitian ini mengacu pada elektroda Ag/AgCl, dan larutan homogen disiapkan menggunakan rendaman sonikator (Elma S30H). Mikroskop elektron pemindaian (SEM, LEO 1450VP) digunakan untuk menentukan ukuran dan distribusi bola lateks.
Metode
Sintesis Nanopartikel Emas Koloid
AuNPs koloid dibuat dengan reduksi natrium sitrat mengikuti metode Turkevich [31]. Secara singkat, sekitar 10 mL 5 mM HAuCl4 ·3H2 O dilarutkan dalam 180 mL air deionisasi dan dididihkan di bawah kondisi pengadukan terus menerus pada perangkat pengaduk magnet pelat panas gabungan. Sepuluh mililiter 0,5% (w /v ) dari trisodium sitrat kemudian ditambahkan ke dalam larutan mendidih, dan warna larutan diamati secara bertahap berubah dari merah pucat menjadi merah delima.
Persiapan Partikel Lateks
Partikel lateks dibuat dengan reaksi kopolimerisasi emulsi bebas sabun seperti yang dijelaskan oleh Polpanich et al. [23] dengan beberapa modifikasi. Singkatnya, sekitar 190 g air deionisasi dibersihkan dengan gas nitrogen dalam labu leher tiga yang direndam dalam penangas air selama 1 jam dengan pengadukan pada 350 rpm. Kemudian ditambahkan 20 gram St dan 0,5 g AA, dan suhu dipertahankan pada 70 °C. Setelah itu, sekitar 0,2 g APS ditambahkan ke dalam 10 mL air deionisasi diikuti dengan menuangkan formulasi ke dalam labu leher tiga untuk memulai reaksi polimerisasi radikal, dan proses polimerisasi dilanjutkan selama 8 jam. Bola lateks karboksil hasil sintesis dipanen dengan sentrifugasi dengan air deionisasi dua kali pada 13.000 rpm selama 20 menit [23, 27, 28] dan disuspensikan kembali dalam air deionisasi pada suhu kamar (25 ° C) sampai digunakan. Morfologi dan ukuran rata-rata partikel lateks PSA ditentukan dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM).
Modifikasi Permukaan SPE dan Immobilisasi Probe DNA
Sebelum modifikasi permukaan, karbon SPE dibilas secara menyeluruh dengan air deionisasi dan kemudian dilapisi dengan suspensi PSA pada 3 mg/mL dan dibiarkan kering di udara pada kondisi sekitar diikuti dengan pengecoran dengan 5 mg/mL koloid AuNPs. . Karakteristik elektrokimia karbon SPE sebelum dan sesudah dimodifikasi dengan partikel lateks dan AuNP diperiksa dengan metode CV. Karbon SPE (PSA-AuNPs-SPE) termodifikasi lateks-AuNPs kemudian dibilas dengan air deionisasi dan direndam dalam 0,1 M buffer kalium fosfat (pH 5) yang mengandung reagen pengikat silang karbodiimida, yaitu 0,002 M EDC dan 0,005 M NHS selama 2 jam [32] sebelum direndam semalaman dalam 0,05 M buffer kalium fosfat (pH 7) yang mengandung 5 M probe penangkap. Setelah itu, PSA-AuNPs-SPE yang dimodifikasi DNA (DNA-PSA-AuNPs-SPE) dicuci secara menyeluruh dengan buffer kalium fosfat (0,05 M, pH 7) untuk menghilangkan probe yang teradsorpsi secara fisik. Elektroda DNA direndam dalam 0,05 M buffer natrium fosfat pada pH 7 yang mengandung DNA target linier (1 M) dan label hibridisasi DNA AQMS (5 mM) untuk hibridisasi parsial selama 1 jam dan kemudian dicelupkan ke dalam 0,05 M buffer natrium fosfat (pH 7) dikondisikan dengan 1 M probe reporter dan 5 mM AQMS selama 1 jam lagi untuk proses hibridisasi DNA penuh. Akhirnya, elektroda DNA dibilas dengan buffer kalium fosfat (0,05 M, pH 7) untuk menghilangkan urutan oligonukleotida non-hibridisasi. Respon elektrokimia dari setiap zat tambahan yang menempel pada SPE diselidiki dengan metode DPV. Gambar 1 mewakili prosedur bertahap untuk pengembangan V. kolera Biosensor DNA berdasarkan dukungan solid PSA-AuNPs koloid.
Representasi skematik prosedur fabrikasi bertahap biosensor DNA
Optimasi Hibridisasi Oligonukleotida Sintetis
Pengaruh berbagai parameter seperti probe DNA dan konsentrasi AQMS, pH, kekuatan ionik dan kapasitas buffer pada respons hibridisasi probe DNA amobil dengan probe sinyal dan DNA target telah diperiksa sebelum penentuan rentang linier dinamis DNA biosensor. Selain itu, imobilisasi probe tangkap dan durasi hibridisasi DNA serta masa pakai dan regenerasi biosensor juga dinilai sebelum V yang dikembangkan. kolera Biosensor DNA telah siap untuk diaplikasikan pada eksperimen spike-and-recovery. Probe penangkap dan pemuatan AQMS dioptimalkan dengan memvariasikan konsentrasinya dari 1 hingga 6 M dan 0,1–5 mM, masing-masing, sedangkan konsentrasi DNA target dan probe reporter dipertahankan pada 5 M dalam 0,05 M buffer natrium fosfat (pH 7,0). Studi efek pH dan konsentrasi buffer dilakukan dengan mengubah pH dan konsentrasi buffer natrium fosfat masing-masing dari pH 5,5 menjadi 8,0 dan 0,001 menjadi 1.000 M. Adanya kation yang berbeda dalam respon hibridisasi DNA biosensor DNA elektrokimia dilakukan dengan menambahkan Na
+
, K
+
, Ca
2+
, dan Fe
3+
ion pada 1,0 M ke dalam buffer hibridisasi DNA yang mengandung 1 mM AQMS dan 5 M cDNA dan probe deteksi pH 7,0. Efek kekuatan ionik diperiksa dengan memvariasikan konsentrasi NaCl pada kisaran 0,1–3,0 M pada pH 7,0. Rentang dinamis biosensor DNA kemudian ditentukan dalam 1.0 × 10
−21
hingga 1.0 × 10
−8
M V. kolera cDNA menggunakan konsentrasi probe sinyal konstan pada 5 M dan pH 7,0. Durasi imobilisasi probe DNA ditentukan dengan merendam elektroda DNA ke dalam 5 M larutan capture probe (pH 7.0) antara 1 dan 13 jam, dan respons DPV diambil setiap 1-2 jam. Sementara itu, waktu hibridisasi DNA ditentukan dengan membiarkan reaksi hibridisasi DNA terjadi antara 15 dan 180 menit, dan respons biosensor DNA dicatat setiap 15-30 menit. Umur simpan biosensor DNA ditentukan dengan mengukur respon biosensor DNA secara berkala terhadap deteksi 5 M V. kolera cDNA selama 120 hari. Analisis dilakukan dalam lima ulangan menggunakan elektroda DNA baru untuk setiap uji hibridisasi sandwich. Regenerasi elektroda DNA dilakukan dengan menggunakan 0,1 M larutan NaOH selama 4 menit, dan rehibridisasi biosensor DNA (60 menit) dilakukan dengan menggunakan larutan rehibridisasi yang mengandung 5 M cDNA dan probe deteksi dan 1 mM AQMS pada kekuatan ion 2,0 M dalam 0,05 M buffer kalium fosfat (pH 7,0). Eksperimen regenerasi dilakukan dalam enam ulangan.
V. kolera Kuantifikasi Menggunakan Biosensor DNA Elektrokimia Berbasis PSA-AuNPs
Berbagai V. kolera strain bakteri yaitu J2126-I, J2126-II, J3324-I, J3324-II, J3330-I, J3330-II, CDHI 5294-II, dan UVC1324 termasuk Citrobacter freundii (CF-I) dan Citrobacter freundii (CF-II) diperoleh dari Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Ilmu Terapan, AIMST University, Kedah. Ekstraksi DNA genom kemudian dilakukan pada bakteri ini menggunakan QIAGEN Genomic-tip 500/G sesuai dengan protokol pabrikan. DNA yang diekstraksi kemudian diencerkan 100 kali lipat menggunakan buffer natrium fosfat (0,05 M, pH 7,0). Sekitar 300 mL DNA yang diekstraksi yang mengandung 2,0 M NaCl dan 1 mM AQMS disonikasi selama 15 menit untuk melepaskan pemutusan DNA. Kemudian, probe DNA amobil direndam selama 1 jam untuk memungkinkan proses hibridisasi DNA berlangsung dan dicuci dengan hati-hati dengan buffer kalium fosfat 0,05 M (pH 7,0) untuk menghilangkan DNA yang tidak terikat. Evaluasi respon biosensor DNA berdasarkan arus puncak DPV diukur dan dibandingkan dengan respon arus yang dihasilkan oleh elektroda DNA tanpa reaksi dengan cDNA sebagai sinyal kontrol. Setiap percobaan dilakukan dalam rangkap tiga di bawah kondisi percobaan yang sama. Umum t Uji ini digunakan untuk mengetahui perbedaan yang signifikan antara respon DNA biosensor dan respon kontrol. Pemulihan V. kolera J3324 dan V. kolera DNA UVC1324 pada 1.0 × 10
−4
g L
−1
, 1.0 × 10
−5
g L
−1
, dan 1.0 × 10
−6
g L
−1
dibubuhkan ke dalam buffer hibridisasi kemudian dilakukan menggunakan biosensor DNA elektrokimia berbasis PSA-AuNPs yang diusulkan.
Hasil dan Diskusi
Morfologi Partikel Lateks dan Perilaku Elektrokimia SPE Termodifikasi Nanopartikel Emas Lateks.
Gambar 2 menunjukkan mikrograf SEM dari bola lateks terkarboksilasi dengan ukuran partikel rata-rata 186.1 ± 4.6 nm. Distribusi ukuran bola PSA yang seragam memungkinkan imobilisasi homogen molekul DNA pada permukaan lateks untuk meningkatkan respons reproduktifitas biosensor DNA. Mikroskop elektron pemindaian (SEM, LEO 1450VP) digunakan untuk menentukan ukuran dan distribusi bola lateks.
Mikrograf SEM dari bola lateks PSA yang disintesis pada 10.000 perbesaran
Hasil elektrodinamik dari SPE yang dimodifikasi ditabulasikan pada Tabel 2. Pemisahan potensial puncak (ΔEp) menunjukkan kinetika transfer elektron dari sistem. PSA-modified SPE (PSA-SPE) menunjukkan nilai Ep tertinggi karena proses transfer muatan yang lambat di lapisan partikel koloid kopolimer, yang membuat sistem bergerak menuju keadaan quasi-reversibel. Namun, ketika AuNP dimuat pada PSA-SPE, penurunan Ep menyiratkan peningkatan pada laju transfer elektron pada permukaan elektroda.
Gambar 3 menunjukkan voltamogram pulsa diferensial dari respons oksidasi AQMS pada SPE yang dimodifikasi lateks dan respons hibridisasi berurutan dari V. kolera biosensor DNA. Perbedaan arus puncak DPV yang signifikan diamati antara elektroda yang hanya mengandung mikrosfer termodifikasi lateks dan tanpa DNA tangkap yang diimobilisasi (percobaan (a) dan (b)) dan dimodifikasi dengan probe DNA tangkap yang diimobilisasi dengan adanya cDNA dan probe yang dilaporkan (percobaan (g )). Hal ini menunjukkan bahwa probe penangkap DNA aminasi berhasil diimobilisasi ke bola lateks PSA terkarboksilasi melalui protokol kopling EDC/NHS [33]. Eksperimen (g) juga menunjukkan respons DPV yang jauh lebih tinggi dibandingkan dengan elektroda DNA dengan adanya ncDNA dan probe reporter yang dilaporkan (percobaan (d)), pada DNA yang tidak cocok dan probe reporter yang dilaporkan (eksperimen (e)), dan target cDNA dengan tidak ada penyelidikan yang dilaporkan (percobaan (f)). Ini karena hibridisasi lengkap DNA target dengan probe penangkap dan reporter melalui reaksi hibridisasi sandwich pada permukaan biosensor DNA seperti yang ditunjukkan dalam percobaan (g). Ini juga menunjukkan bahwa penggunaan probe yang dilaporkan dapat meningkatkan sinyal dari hibridisasi DNA. Namun demikian, arus DPV yang dihasilkan dari hibridisasi yang diamati dengan adanya DNA target tanpa penggabungan probe yang dilaporkan (percobaan (f)) masih lebih tinggi daripada sinyal arus DPV yang diamati untuk DNA yang tidak dihibridisasi (percobaan (c), (d), dan (e)).
Sinyal voltamogram pulsa diferensial dari AQMS elektroda (a ) PSA-SPE, (b ) PSA-AuNPs-SPE, (c ) menangkap probe-PSA-AuNPs-SPE dan ketika ada (d ) penyelidikan ncDNA dan reporter, (e ) ketidakcocokan DNA dan penyelidikan reporter, (f ) cDNA saja, dan (g ) cDNA dan penyelidikan reporter
Pengaruh Pemuatan Probe DNA dan Konsentrasi AQMS
Pengaruh konsentrasi probe DNA pada respon hibridisasi DNA diamati melalui respon oksidasi elektrokimia AQMS. Gambar 4a menunjukkan bahwa respons biosensor DNA meningkat secara bertahap dengan meningkatnya jumlah probe DNA yang diimobilisasi pada PSA-AuNPs-SPE dari 1 menjadi 4 M. Ini dikaitkan dengan peningkatan jumlah AQMS elektroaktif yang diselingi dalam DNA untai ganda (dsDNA) untuk membuat transfer elektron melalui heliks DNA yang tidak bergerak. Respon DPV dari biosensor DNA diamati menjadi hampir dataran tinggi antara probe DNA 4 dan 6 M, yang menunjukkan pemuatan probe DNA yang optimal pada permukaan elektroda tercapai [34]. Oleh karena itu, probe penangkap 4 M dipilih sebagai pemuatan probe DNA yang optimal dalam percobaan selanjutnya. Konsentrasi label AQMS juga telah dioptimalkan dalam elektrolit pengukur antara 0,1 dan 5,0 mM, dan konsentrasi AQMS pada 1 mM ditemukan cukup untuk reaksi interkalasi DNA yang optimal (Gbr. 4b).
Efek probe tangkapan (a ) dan konsentrasi AQMS (b ) pada respon biosensor DNA yang dilakukan dengan 5 M cDNA dan sinyal probe dalam 0,05 M buffer natrium fosfat (pH 7,0)
Pengaruh pH, Kekuatan Ionik, dan Kapasitas Buffer
Laju reaksi hibridisasi DNA sangat bergantung pada pH larutan. Seperti dapat dilihat pada Gambar. 5a, di bawah lingkungan yang lebih asam, protonasi tulang punggung fosfodieter DNA mengurangi kelarutan molekul DNA, yang akhirnya menurunkan laju reaksi hibridisasi DNA. Sedangkan dalam medium dasar, ia memutuskan ikatan hidrogen lemah yang menyatukan pasangan basa DNA. Reaksi hibridisasi DNA yang optimal lebih menguntungkan dalam kondisi netral, di mana ia mendorong lebih banyak probe penangkapan untuk berhibridisasi dengan DNA target dan selanjutnya memungkinkan interkalasi probe redoks AQMS untuk membuat pengenalan hibridisasi DNA menjadi bisnis. Jadi, 0,05 M buffer natrium fosfat pada pH 7,0 digunakan sebagai media hibridisasi DNA untuk studi biosensor DNA selanjutnya. Ion bermuatan positif seperti Ca
2+
, Na
+
, K
+
, dan Fe
3+
ion dapat berinteraksi dengan rantai fosfodiester DNA bermuatan negatif. Reaksi ionik ini akan menetralkan muatan molekul DNA, sehingga mengurangi tolakan sterik antar molekul DNA untuk memudahkan reaksi hibridisasi DNA. Gambar 5b menggambarkan efek beberapa kation pada respon hibridisasi DNA. Respon hibridisasi DNA terlihat meningkat dengan adanya ion bermuatan positif dalam urutan Na
+
> K
+
> Fe
3+
> Ca
2+
. Keduanya Ca
2+
dan Fe
3+
ion ditemukan sangat mengurangi respon hibridisasi DNA karena interaksi ionik Ca
2+
dan Fe
3+
ion dengan ion fosfat dari larutan buffer, yang menyebabkan pembentukan senyawa fosfat yang tidak larut. Ini telah mengurangi kandungan ionik media, sehingga meningkatkan tolakan elektrostatik antara molekul DNA. Arus hibridisasi DNA tertinggi diperoleh dengan adanya Na
+
karena ukurannya yang lebih kecil dan afinitas yang lebih kuat terhadap tulang punggung gula-fosfat DNA dibandingkan dengan K
+
ion untuk mengatasi hambatan sterik dan tolakan elektrostatik antara gugus fosfat DNA yang bermuatan negatif.
Pengaruh pH (a ) berbagai kation (b ), konsentrasi buffer (c ), dan kekuatan ion (d ) pada respon hibridisasi DNA dari elektrokimia V. kolera biosensor DNA. Hibridisasi dilakukan dengan 5 M cDNA dan reporter probe diikuti dengan interkalasi dengan 1 mM AQMS
Selain itu, kekuatan ionik larutan juga akan mempengaruhi respon biosensor DNA. Gambar 5c, d menunjukkan kapasitas buffer optimum, dan kekuatan ionik dicapai dengan menggunakan 0,05 M buffer natrium fosfat dengan pH tetap pada pH 7,0 dan NaCl 2,0 M, masing-masing. Dalam kondisi ini, reaksi hibridisasi DNA lebih disukai; karenanya, respons DPV tinggi dihasilkan. Pada kapasitas buffer optimum dan kekuatan ionik larutan, tolakan elektrostatik antara molekul DNA menurun dan dengan demikian meningkatkan reaksi hibridisasi DNA. Sebaliknya, ketika kandungan ionik yang digunakan terlalu rendah atau terlalu tinggi, halangan sterik dan tolakan elektrostatik menjadi dominan dan membatasi hibridisasi molekul DNA.
Pendirian V. kolera Kurva Kalibrasi Biosensor DNA
Dari hasil yang ditunjukkan pada Gambar 6a, respon biosensor DNA meningkat secara proporsional dengan meningkatnya konsentrasi cDNA dari 1,0 × 10
−21
hingga 1.0 × 10
−8
M (R
2
=0,99) dengan batas deteksi 1,0 × 10
−21
M. Batas deteksi dihitung berdasarkan tiga kali standar deviasi dari respons biosensor pada kurva respons yang mendekati batas deteksi dibagi dengan kemiringan kalibrasi linier. Rentang deteksi linier yang luas dari biosensor DNA disebabkan oleh partikel lateks PSA yang sangat monodispersi dan berbentuk bola dalam rentang ukuran submikron yang digunakan sebagai matriks pembawa untuk imobilisasi DNA. Lapisan kaya asam akrilat pada permukaan partikel lateks menawarkan tempat pengikatan yang besar untuk penempelan probe penangkap DNA untuk menciptakan permukaan tertutup maksimal oleh lapisan reseptif DNA. Selain itu, penggabungan AuNPs pada SPE yang dimodifikasi PSA semakin memperkuat sinyal analitik dari respons hibridisasi DNA, dan ini menghasilkan sensitivitas tinggi dari biosensor DNA (Gbr. 6b).
Differential pulse voltammograms (a ) and DNA biosensor linear range (b ) obtained using various cDNA concentrations from 1.0 × 10
−15
to 1.0 × 10
−1
μM V. cholerae target DNA and 5 μM signal probe
DNA Probe Immobilisation and Hybridization Times
It took about 8 h for the capture probe to be immobilised on the PSA copolymer particles surface, as illustrated by the DNA biosensor response in Fig. 7a, which showed a current increment from 1.0 to 8.0 h of capture probe immobilisation time, after which no obvious change in the DPV current was observed. Longer immobilisation time resulted in a higher amount of DNA probes immobilised onto the latex. After 8.0 h of exposure to the DNA probes, the hydrophilic functional latex with reactive carboxyl groups at the surface was presumably fully attached with the DNA probes. DNA hybridisation time, on the other hand, is the rate limiting step, which determines the response time of the DNA biosensor. Based on the DNA biosensor response trend in Fig. 7b, the response time of the V. cholerae DNA biosensor developed in this study was estimated to be about 60 min for the dual hybridisation processes to complete.
DNA probe immobilisation duration on the immobilised PSA latex colloidal particles (a ) and DNA hybridization duration of the DNA biosensor (b ) in 0.05 M potassium phosphate buffer at pH 7.0 containing 5 μM target DNA and reporter probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength
Long-Term Stability and Regeneration of V.cholerae DNA Biosensor
Figure 8 shows the shelf life of the V. cholerae DNA biosensor. The DNA biosensor showed the highest response to the detection of 5 μM of V. cholerae cDNA for the first month of the experimental period. The electrochemical DNA biosensor was able to retain 95% of its initial DPV current after 58 days of storage period. The DNA hybridisation response was then gradually decreased to about 75% of its original response on the 75th day and exhibited 40% of its initial performance on the 100th operational day. The bioactivity of the immobilised capture probe was finally declined to 30% after 3 months of storage period. The reproducibility of each calibration point, which was repeated on five replicate DNA electrodes, gave satisfactory relative standard deviation (RSD) between 2.4 and 4.5% (n =5).
The life span profile of the fabricated V. cholerae DNA sensing electrode. The electrode was stored in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0) at 4 °C after every DPV measurement was taken
Regeneration of biosensor indicates whether the biosensor is reusable for a series of consecutive analyses. The regeneration method used in this study was conducted based on previously reported protocol in other studies [11, 21] with slight modifications. In this study, 0.1 M of NaOH solution was used as the regeneration solution to break the hydrogen bonds between base pairs of hybridised dsDNA. With the result from Fig. 9, it is notable that the DNA biosensor response declined significantly after incubation in 0.1 M of NaOH and the percentage of the DNA biosensor response reduced from 35.1 to 5.2% relative to the DNA biosensor initial response after incubation in 0.1 M of NaOH solution from 30 to 240 s. The DNA biosensor response decreased with the increasing incubation time signifies the hydrogen bonds between hybridised dsDNA were broken up by the alkaline regeneration solution. However, rehybridisation of the DNA biosensor was able to attain almost 100% of its initial response for a consecutive six DNA analyses with a reversibility RSD of 5%.
Repeatability of V. cholerae DNA biosensor using 0.1 M NaOH regeneration solution and rehybridization solution containing 5 μM cDNA and detection probe and 1 mM AQMS at 2.0 M ionic strength in 0.05 M potassium phosphate buffer (pH 7.0)
Determination of V. cholerae Bacteria with the Developed DNA Biosensor
The optimised DNA biosensor has been applied to quantify the V. cholerae DNA extracted from various V. cholerae bacterial strains. Table 3 presents the results acquired from DNA tests carried out with the hybridisation medium spiked with different strains of V. cholerae DNAs and other bacterial species at a concentration within the calibration range of the DNA biosensor. The DNA biosensor showed superior selectivity towards V. cholerae J3324–I, V. cholerae J3324–II, and V. cholerae UVC1324 with high DPV current response and low current signals were obtained for the evaluation of both Citrobacter freundii (CF-I) and Citrobacter freundii (CF-II).
Recovery of V. cholerae J3324 and V. cholerae UVC1324 DNAs at three different concentrations spiked into the hybridisation buffer demonstrated 91.4 ± 2.2% to 108.9 ± 4.8% (n =3) of recoveries percentage (Table 4). This result suggests that the proposed PSA-AuNPs-based electrochemical DNA biosensor could be adopted for highly reliable and accurate detection of V. cholerae DNA in environmental and clinical samples.
Performance Comparison with Other Reported V. cholerae DNA Biosensors
Based on the data summarised in Table 5, the proposed electrochemical DNA biosensor based on PSA-AuNPs immobilisation material shows an exceptional broad linear quantification range compared to other planar two-dimensional electrodes as the DNA supporters. This clearly demonstrates the advantage of the micro-sized latex particles where the polymeric PSA is capable to intensify the probe binding capacity with a simple loading method via the classical EDC/NHS coupling compared to avidin-biotin technology [24, 26] and ultra-low detection limit in zeptomolar range with reasonable assay time.
Conclusions
This study reports the development of an electrochemical DNA biosensor for the detection of one of the most devastating high-risk V. cholerae pathogens. The PSA-AuNPs-modified DNA biosensor can be used for direct detection of DNA of interest from the extracted DNA without the need of amplification reaction via conventional PCR method, which is commonly used in those previously reported V. cholerae DNA biosensors. In addition, no further dilution of the extracted DNA is needed as the high-capacity AuNPs-doped latex microspheres-based DNA biosensor is highly sensitive for the quantitation of DNA at extremely low level in sub zeptomolar range. Therefore, the electrochemical DNA biosensor is greatly suitable as a surveillance and diagnostic tool to control the epidemic of the fatal intestinal infection.
