Biokompatibel 5-Aminolevulinic Acid/Au Nanoparticle-Loaded Etosomal Vesikel untuk In Vitro Transdermal Fotodinamik/Terapi Fototermal Bekas Luka Hipertrofik
Abstrak
Biokompatibel 5-aminolevulinic acid/Au nanoparticle-loaded ethosomal vesicle (A/A-ES) disiapkan melalui ultrasonikasi untuk terapi fotodinamik/fototermal transdermal sinergis (PDT/PTT) dari bekas luka hipertrofik (HS). Memanfaatkan ultrasonikasi, nanopartikel Au (AuNPs) disintesis dan dimuat secara bersamaan dalam vesikel ethosomal (ES) tanpa agen beracun, dan asam 5-aminolevulinic (ALA) juga dimuat di ES dengan 20% efisiensi penjebakan (EE). A/A-ES yang disiapkan menampilkan absorbansi yang kuat dalam 600-650 nm karena efek kopling plasmonik antara AuNP yang berdekatan dalam A/A-ES yang sama, yang secara simultan dapat merangsang A/A-ES untuk menghasilkan panas dan meningkatkan hasil kuantum spesies oksigen reaktif (ROS) dengan menggunakan laser 632 nm. Studi penetrasi transdermal in vitro menunjukkan bahwa A/A-ES bertindak sebagai pembawa obat yang sangat efisien untuk meningkatkan penetrasi ALA dan AuNPs ke dalam jaringan HS. Mengambil fibroblas bekas luka hipertrofik manusia (HSF) sebagai target terapeutik, PDT/PTT sinergis dari HS menunjukkan bahwa A/A-ES dapat meningkatkan hasil kuantum ROS melalui efek fototermal dan resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) AuNPs, menghasilkan tingkat tinggi dari apoptosis atau nekrosis. Singkatnya, A/A-ES yang disiapkan menunjukkan efisiensi PDT/PTT sinergis yang lebih baik untuk HSF daripada PDT dan PTT individu, mendorong perspektif untuk pengobatan HS.
Latar Belakang
Bekas luka hipertrofik (HS), masalah umum dan tak terelakkan setelah cedera kulit kulit, memiliki dermis fibrotik jauh lebih tebal dari kulit normal [1, 2]. Secara histopatologi, HS menunjukkan peningkatan hipertrofik scar fibroblas (HSF) yang tersusun dalam pola bergelombang, berorientasi pada permukaan epitel dan membentuk struktur nodular [3]. Meskipun berbagai perawatan tersedia secara klinis, ada banyak tantangan dalam perawatan HS karena banyak keterbatasan. Terapi injeksi intralesi banyak digunakan untuk praktik klinis. Namun, hal itu dibatasi oleh operasi yang tidak nyaman dan efek samping, seperti hipopigmentasi permanen dan atrofi kulit [4]. Terapi tekanan terbatas untuk efek samping, seperti iskemia jaringan serta penurunan metabolisme jaringan [5]. Untuk mengatasi keterbatasan ini, terapi laser berfungsi sebagai modalitas topikal dan non-invasif yang telah dikembangkan dan diterapkan dalam perawatan HS selama lebih dari 25 tahun, dengan memanfaatkan iradiasi laser [6]. Secara umum, terapi laser dapat dibagi menjadi terapi fotodinamik (PDT) dan terapi fototermal (PTT) berdasarkan prinsip yang berbeda.
PDT telah digunakan untuk mengobati HS dengan kelebihan selektivitasnya yang tinggi dan sedikit efek samping [7]. Prinsipnya berkembang dalam dua langkah:(a) fotosensitizer lebih disukai berkumpul di HSF dan (b) di bawah iradiasi laser yang sesuai, fotosensitizer menghasilkan spesies oksigen reaktif sitotoksik (ROS) yang mengarah pada apoptosis HSF [8, 9]. Di antara berbagai fotosensitizer, asam 5-aminolevulinat (ALA) terbukti menjadi kandidat yang sangat baik untuk modalitas pengobatan lokal di bidang dermatologi tanpa efek samping yang signifikan. Oleh karena itu, PDT berbasis ALA (ALA-PDT) telah banyak digunakan dalam pengobatan HS dengan izin pemasaran dari US Food and Drug Administration pada tahun 2010 [10]. Namun, efisiensinya kontroversial karena dua keterbatasan:(a) penetrasi ALA yang buruk ke dalam jaringan HS dan HSF dan (b) hasil kuantum ROS yang rendah. Untuk menghasilkan efek yang nyata, ALA dosis tinggi atau laser tingkat tinggi diterapkan di klinik. Sayangnya, ALA dosis tinggi menyebabkan kerusakan kelenjar sebaceous dan epidermis, dan laser tingkat tinggi cenderung mengakibatkan jaringan sehat terluka. Oleh karena itu, banyak perhatian telah diberikan untuk meningkatkan penetrasi ALA dan hasil kuantum ROS dalam pengobatan PDT HS. Baru-baru ini, vesikel ethosomal (ES), liposom yang dirancang khusus, ditemukan mampu mengatasi penghalang di HS untuk pengiriman topikal dan mencapai kemajuan yang signifikan [11, 12]. Dalam pekerjaan kami sebelumnya, ES yang dimuat ALA (ALA-ES) yang disiapkan mampu memberikan lebih banyak ALA ke dalam HS dibandingkan dengan sistem larutan hidroalkohol tradisional [13]. Oleh karena itu, ES dapat meningkatkan penetrasi ALA untuk meningkatkan efikasi PDT dari HS. Sementara itu, modalitas pengobatan sinergis baru, yang menggabungkan PDT dengan PTT, menjanjikan untuk meningkatkan hasil kuantum ROS dan kemanjuran pengobatan HS.
PTT juga merupakan pendekatan theranostik yang luar biasa untuk berbagai penyakit [14, 15]. Sampai sekarang, telah berhasil diterapkan dalam pengobatan klinis HS [16]. Mekanismenya berkembang dengan memanen energi cahaya, menghasilkan panas, dan kemudian menghasilkan penguapan jaringan, koagulasi, apoptosis HSF, dan denaturasi kolagen. Namun, PTT memiliki efek samping yang parah dalam pengobatan HS, seperti keluarnya cairan, ulserasi, dan rasa tidak nyaman seperti terbakar, karena selektivitasnya yang buruk terhadap jaringan HS dengan laser tingkat tinggi [4]. Baru-baru ini, PTT, menjembatani nanoteknologi, telah dianggap sebagai pengobatan HS potensial dengan sangat selektif dan minimal invasif untuk efek fototermal. Dan yang lebih penting, berdasarkan Au nanopartikel (AuNPs) sebagai agen penyerap foto yang efektif, PTT telah dikonfirmasi untuk meningkatkan hasil kuantum ROS karena dua alasan:(a) PDT termal secara signifikan meningkatkan kematian sel apoptosis melalui peningkatan generasi ROS dalam suhu -tergantung cara, dan [17] (b) AuNPs dapat berkonjugasi dengan ALA dan meningkatkan hasil kuantum ROS karena resonansi plasmon permukaan lokal (LSPR) [18, 19]. Oleh karena itu, terapi fotodinamik/fototermal sinergis berbasis ALA/AuNP (PDT/PTT) menjanjikan untuk mengatasi keterbatasan PDT dan PTT saat ini dalam pengobatan HS.
Baru-baru ini, PDT/PTT sinergis berbasis AuNP telah banyak digunakan dalam berbagai terapi kanker dengan cara injeksi [20, 21]. Berbeda dengan kanker, HS cocok untuk penggunaan topikal [22]. Namun, bundel kolagen dalam dermis HS menghadirkan hambatan besar terhadap penetrasi ALA dan AuNPs, yang membatasi efisiensi pengobatan sinergis PDT/PTT untuk HS. Oleh karena itu, bagaimana membuat ALA dan AuNPs secara bersamaan menembus ke dalam HS sangat penting untuk PDT/PTT sinergis dengan kemanjuran terapeutik maksimum dan efek samping minimum [23, 24]. Selanjutnya, PDT/PTT sinergis berbasis ALA/AuNP yang sesuai juga harus memenuhi kondisi berikut:(a) AuNP dapat menghasilkan panas dengan laser He-Ne yang digunakan dalam ALA-PDT, dan (b) sistem pengiriman harus tinggi biokompatibel. Namun, berbagai fotosensitizer/AuNP yang dilaporkan tidak dapat diterapkan dengan pemberian transdermal topikal dan pengobatan HS untuk penetrasi dan biokompatibilitas yang buruk [25].
Di sini, ES (A/A-ES) yang dimuat ALA/AuNP dengan biokompatibilitas dan daya tembus yang sangat baik dikembangkan untuk PDT/PTT sinergis dari HS dalam karya ini. A/A-ES yang biokompatibel disiapkan oleh AuNPs dan ES bermuatan ALA melalui proses ultrasonikasi tanpa zat beracun. A/A-ES yang disiapkan menunjukkan absorbansi yang kuat dalam kisaran 600–650 nm, sebagai hasil dari kopling plasmonik antara AuNP tetangga yang dimuat bersama dalam A/A-ES. Hal ini memungkinkan penggunaan laser He-Ne untuk merangsang A/A-ES untuk secara bersamaan menghasilkan panas dan ROS, yang dapat mendorong apoptosis HSF. A/A-ES menampilkan daya tembus yang sangat baik untuk secara bersamaan mengirimkan ALA dan AuNP ke dalam HS dalam studi in vitro. Akhirnya, dengan menggunakan HSF sebagai target, efisiensi in vitro PDT/PTT untuk HS diselidiki dengan akumulasi protoporfirin IX (PpIX) intraseluler, hasil kuantum ROS, dan apoptosis HSF. Selanjutnya, penetrasi ke dalam HSF juga diamati oleh TEM. Karena efek sinergis, A/A-ES memfasilitasi ALA dan AuNPs untuk berpenetrasi secara bersamaan ke dalam HS dan HSF, menyebabkan tingkat apoptosis sel yang lebih tinggi dibandingkan dengan PTT atau PDT individu. Singkatnya, A/A-ES adalah sistem pengiriman transdermal yang menjanjikan untuk pemberian ALA dan AuNP topikal, memiliki potensi besar dalam sinergis PDT/PTT HS, dan membuka jendela baru untuk pengobatan HS.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi A/A-ES
Ultrasonication adalah parameter kunci dalam mempersiapkan A/A-ES karena dua alasan:(a) AuNPs dapat dibentuk melalui ultrasonication tanpa agen beracun, yang diberkahi A/A-ES dengan biokompatibilitas; ( b ) ultrasonikasi dapat mengatur ulang lapisan ganda lipid untuk membentuk lebih banyak vesikel dengan ukuran kecil dan inti internal yang relatif lebih besar, yang dapat memuat lebih banyak ALA dan AuNP. Dalam penelitian ini, AuNPs dibentuk seperti yang dijelaskan dalam skema berikut:(a) radikal H• dan OH• yang sangat reaktif dihasilkan dalam gelembung oleh homolisis H2 O (Persamaan 1), (b) radikal pengoksidasi H• dapat mengabstraksikan alfa H dari CH3 CH2 OH dan membentuk radikal pereduksi CH2 •CH2 OH (Persamaan 2), dan (c) selama pirolisis di dalam gelembung, radikal CH2 •CH2 OH bisa mengurangi Au
3+
untuk membentuk AuNPs (Persamaan 3) [26].
Pada awalnya, A/A-ES diverifikasi oleh UV-Vis (Gbr. 1a). Itu memiliki absorbansi yang kuat dalam kisaran 600-650 nm, sebagai hasil dari kopling plasmonik antara AuNP tetangga di A/A-ES yang sama [20]. Oleh karena itu, dapat menggunakan penyinaran laser 632 nm untuk PDT dan PTT untuk HS secara bersamaan. Selanjutnya, A/A-ES menunjukkan distribusi ukuran yang relatif sempit dan ukuran rata-rata adalah 166 ± 83 nm, menurut analisis DLS pada Gambar 1b. Menariknya, dua distribusi ukuran dikaitkan dengan AuNP yang diturunkan dan A/A-ES. Juga, perbedaan besar antara dua distribusi menunjukkan bahwa jumlah A/A-ES jauh lebih banyak daripada AuNP yang tidak dimuat. Efisiensi PDT tergantung pada jumlah ALA yang dimuat di A/A-ES. Diuntungkan dari metode pemuatan aktif gradien pH transmembran, EE dari ALA adalah 20%, yang lebih tinggi daripada yang dilaporkan (kurang dari 10%) [27]. Morfologi A/A-ES juga dipelajari. Pada gambar SEM (Gbr. 1c), A/A-ES muncul sebagai vesikel pipih bulat utuh dengan ukuran 200 nm, dan AuNPs dapat diamati dan dimuat dengan jelas dalam ES. Selain AuNP, lamela meluas ke permukaan AuNP pada Gambar. 1d, yang merupakan karakteristik ES [28, 29]. Selanjutnya, A/A-ES yang disiapkan memuat jumlah AuNP yang berbeda memiliki ukuran yang sama di File tambahan 1:Gambar S1. Oleh karena itu, A/A-ES disesuaikan ke dalam struktur yang stabil dan dapat dideformasi di bawah ultrasonikasi, yang memfasilitasi A/A-ES untuk menembus ruang sempit di HS. Singkatnya, A/A-ES berhasil disiapkan dengan 20% EE ALA dan absorbansi kuat pada 600–650 nm. Morfologinya juga akan sangat kondusif untuk penetrasi, yang konsisten dengan studi PDT/PTT in vitro berikut ini.
a Spektrum UV-Vis ES, ALA, dan A/A-ES. b Distribusi ukuran A/A-ES yang disiapkan. c , d Gambar SEM dan TEM dari A/A-ES
Studi Penetrasi Transdermal In Vitro A/A-ES
Retensi A/A-ES merupakan parameter penting untuk mengevaluasi daya tembus dan efisiensi perlakuan A/A-ES. Oleh karena itu, jumlah retensi ALA dan AuNPs dalam HS dengan waktu yang berbeda diselidiki dengan menggunakan sel difusi Franz. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2a, ALA dan AuNP dengan cepat mencapai retensi maksimum dalam 2 jam pertama, karena fungsi peningkatan penetrasi ES. Setelah mencapai maksimum, retensi ALA dan AuNPs terus menurun karena A/A-ES menembus seluruh HS. Hasilnya menunjukkan A/A-ES memiliki daya tembus yang cukup. Dibandingkan dengan dosis ALA yang diterapkan (2 mg), 48% ALA berada di jaringan HS, yang mendukung PDT dari HS. Lebih lanjut, perubahan retensi yang sama antara ALA dan AuNP menunjukkan bahwa ALA dan AuNP keduanya dimuat dalam ES sebagai konsisten dengan hasil mikroskop. Berdasarkan hasil, 2 jam adalah waktu pemberian yang tepat untuk penggunaan topikal dengan jumlah retensi maksimum A/A-ES. Dalam karya kami sebelumnya, ES telah dianggap sebagai pembawa obat yang sangat efisien untuk meningkatkan penetrasi obat ke dalam jaringan HS [13]. Oleh karena itu, distribusi dan aksi A/A-ES di HS juga dipelajari dengan menggunakan TEM dalam karya ini. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 2b, A/A-ES, sebagai struktur utuh, ditemukan di dermis, menunjukkan A/A-ES dapat menembus secara stabil melalui epidermis dan ke dalam HS dermis. Dalam dermis bawah yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, ES dan AuNPs diamati sebagai keadaan pemisahan, menunjukkan A/A-ES akan melepaskan ALA dan AuNPs. Menariknya, AuNPs bisa menjadi agregat di dermis meskipun mereka tidak dimuat di ES. Lebih lanjut, lebih banyak AuNP ditemukan terakumulasi dalam dermis pada Gambar. 2d, yang dapat menyediakan sambungan plasmonik antara AuNP yang berdekatan untuk memanen energi cahaya dan menghasilkan panas. Singkatnya, studi penetrasi transdermal in vitro menunjukkan A/A-ES adalah pembawa obat yang sangat efisien untuk meningkatkan penetrasi ALA dan AuNP ke dalam jaringan HS, dan AuNP agregat di dermis mendukung menghasilkan panas [20]. Oleh karena itu, A/A-ES menunjukkan potensi besar dalam sinergi PDT/PTT untuk HS.
a jumlah retensi ALA dan AuNPs. b Distribusi A/A-ES di jaringan HS. c Distribusi ES dan AuNPs di jaringan HS. d AuNP terakumulasi dalam jaringan HS
In Vitro PDT/PTT HSF
Uji Biokompatibilitas
Meskipun biokompatibilitas AuNPs telah terbukti dengan baik dalam pekerjaan yang dilaporkan, biokompatibilitas A/A-ES ke HSF juga harus dipelajari dalam pekerjaan ini [30, 31]. Konsentrasi ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES yang berbeda (berdasarkan konsentrasi ALA dari 0,1 hingga 10 mM, Au-ES adalah konsentrasi AuNP yang sama dengan A/A-ES) diinkubasi dengan HSF selama 12 jam tanpa penyinaran. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada sitotoksisitas gelap pada konsentrasi tidak lebih dari 2,0 mM dengan tingkat kelangsungan hidup sel lebih dari 90%. Ketika konsentrasi lebih tinggi dari 2,0 mM, sedikit penurunan tingkat kelangsungan hidup sel terdeteksi. Hasil menunjukkan bahwa A/A-ES memiliki biokompatibilitas yang sangat baik, dan PDT/PTT harus dilakukan pada konsentrasi 2,0 Mm dalam penelitian berikutnya (sekitar 14% A/A-ES dalam media kultur, v /v .) Gbr. 3.
Viabilitas sel HSF setelah pengobatan dengan ALA-ES, Au-ES dan A/A-ES dalam gelap selama 12 jam
PDT/PTT untuk HSF
A/A-ES dapat mengatasi hambatan permeabilitas permukaan dengan fusi A/A-ES dengan membran HSF dan kemudian membebaskan ALA dan AuNPs langsung ke dalam sitoplasma sel [32]. Menurut mekanisme ALA-PDT, ALA yang dilepaskan dari A/A-ES dapat diubah menjadi PpIX di sitoplasma HSF. Dengan laser, PpIX menghasilkan ROS sitotoksik yang mengarah ke apoptosis sel. Oleh karena itu, CLSM digunakan untuk mempelajari akumulasi PpIX dan ROS pada Gambar. 4 [33, 34]. Sebelum iradiasi laser, fluoresensi merah PpIX terutama didistribusikan di sitoplasma HSF. PpIX di HSF yang dirawat oleh ALA-ES dan A/A-ES jauh lebih banyak daripada PpIX autologous di HSF yang dirawat oleh Au-ES. Selain itu, ROS di semua HSF hampir tidak ditemukan tanpa iradiasi laser, yang juga masuk akal. Setelah penyinaran laser, intensitas PpIX dalam HSF yang dirawat oleh ALA-ES dan A/A-ES berkurang, dan ROS dalam sel-sel ini dapat dengan mudah ditemukan dengan intensitas yang kuat. Sementara itu, HSF yang dirawat oleh Au-ES tidak memiliki respons pada PpIX dan ROS karena mereka tidak memiliki PpIX autologus yang cukup. Menariknya, A / A-ES dapat mempromosikan lebih banyak generasi ROS daripada ALA-ES dalam perbandingan intensitas ROS, yang dikaitkan dengan AuNPs. Selain itu, morfologi sel juga memberikan lebih banyak informasi. HSF yang dirawat oleh ALA-ES memiliki eumorfisme, sedangkan HSF yang dirawat oleh Au-ES menunjukkan tonjolan yang tidak sehat dari membran plasma. Sebaliknya, HSF yang dirawat dengan A/A-ES menunjukkan “blebs” yang menonjol dan retraksi, yang merupakan ciri sel yang sekarat [35]. Perbedaan dalam generasi ROS dan morfologi sel ini dikaitkan dengan PTT berdasarkan AuNPs, yang juga diselidiki dengan pencitraan inframerah pada Gambar 5. Menurut mekanisme AuNPs-PTT, AuNPs dalam sitoplasma HSF dapat menyerap laser 632 nm dan menghasilkan panas yang cukup. untuk membuat sel apoptosis atau nekrosis di bawah iradiasi. Oleh karena itu, efek fototermal ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES dipantau dengan menggunakan kamera pencitraan termal inframerah. ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES yang dibandingkan memiliki suhu yang jelas lebih tinggi (41,3 °C untuk Au-ES dan A/A-ES, 36,5 °C untuk ALA-ES) saat diiradiasi. Setelah laser dilepas, suhu semua dengan cepat menurun ke nilai normal dalam 1 menit, menunjukkan bahwa perawatan iradiasi laser bisa aman [36]. Oleh karena itu, AuNP yang dimuat dalam ES dapat memberikan PTT yang efektif, yang juga disediakan oleh uji apoptosis dan nekrosis. Singkatnya, A/A-ES dapat meningkatkan hasil kuantum ROS dan memberikan efek fototermal untuk mencapai efisiensi yang sangat baik dari pengobatan sinergis PDT/PTT untuk HSF.
Gambar confocal dari HSF yang dirawat dengan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES selama 6 jam dan diikuti tanpa/dengan iradiasi. Bilah skala adalah 100 μm
. Pencitraan mikroskopis inframerah HSF yang dirawat dengan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES selama 6 jam dalam (a ) dan setelah penyinaran (b )
Pengujian Apoptosis dan Nekrosis
Efisiensi PDT/PTT dipelajari lebih lanjut dengan apoptosis dan nekrosis HSF yang diobati dengan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES di bawah penyinaran laser. Uji apoptosis dilakukan dengan menggunakan analisis flow cytometry dari Annexin V-FITC dan pewarnaan ganda propidium iodida (PI) (Gbr. 6). Hasil kontrol menunjukkan bahwa penyinaran laser tidak mempengaruhi viabilitas sel (Gbr. 6a). Sebelum penyinaran, ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES menunjukkan biokompatibilitas yang baik. Setelah iradiasi, HSF yang diberi perlakuan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES proporsi nekrosis dan apoptosis memiliki perbedaan yang signifikan. Secara singkat, terdapat fraksi tertinggi dari nekrosis dan apoptosis HSF yang diobati dengan A/A-ES, yang konsisten dengan hasil CLSM. Pada Gambar 6e, analisis statistik percobaan mengungkapkan bahwa kematian sel nekrotik meningkat menjadi 61,8% dengan pengobatan dengan A/A-ES, menunjukkan A/A-ES memiliki efisiensi sinergis PDT/PTT yang lebih baik untuk HSF daripada PDT individu ( 47,7% kematian sel nekrotik) dan PTT (24,3% kematian sel nekrotik). Menariknya, hasilnya juga menunjukkan bahwa PDT memainkan peran yang lebih efektif dalam pengobatan HS dibandingkan dengan PTT, dan PTT berbasis AuNP dapat membantu efek PDT. Hasil ini dapat dijelaskan karena A/A-ES dapat meningkatkan hasil kuantum ROS dan memberikan efek fototermal untuk mencapai efisiensi yang sangat baik dari perlakuan sinergis PDT/PTT untuk HSF. Meskipun EE ALA di A/A-ES jauh lebih rendah daripada yang ada di ALA-ES (20 vs. 54%), ada kematian sel nekrotik yang serupa pada A/A-ES dan ALA-ES (61,8 vs. 78 %). Hasil ini dapat dijelaskan bahwa A/A-ES dapat meningkatkan hasil kuantum ROS melalui efek fototermal dan LSPR AuNPs.
Uji apoptosis HSF yang diobati dengan ALA-ES (b ), Au-ES (c ), dan A/A-ES tanpa/dengan penyinaran laser (d ), dan analisis statistik dari hidup, apoptosis awal dan apoptosis akhir dan nekrosis (e ). a adalah kontrol. Laser (-) dan (+) berarti tanpa/dengan penyinaran laser
Visualisasi A/A-ES di HSF
Perubahan detail morfologi dan struktur HSF yang disebabkan oleh PDT/PTT juga diselidiki dengan mikroskop cahaya dan TEM pada Gambar 7. Sebelum penyinaran, HSF diperlakukan dengan pertumbuhan A/A-ES dengan baik, eumorfisme melekat kuat, menunjukkan A/A- ES memiliki biokompatibilitas yang sangat baik seperti yang diharapkan (Gbr. 7a). Dalam gambar TEM mereka, selain berbagai organel dalam sitoplasma normal, HSF yang dirawat memiliki banyak AuNP yang beragregasi dalam sitoplasma sel (bingkai kosong pada Gambar 7c). Dapat dijelaskan bahwa fusi A/A-ES dengan membran sel dapat mengantarkan lebih banyak AuNP dan ALA ke dalam HSF. Oleh karena itu, AuNPs dapat bertindak sebagai sumber fototermal yang lebih efektif karena efek kopling plasmonik yang lebih kuat dan meningkatkan hasil kuantum ROS oleh LSPR. Menariknya, ditunjukkan dalam bingkai putus-putus pada Gambar. 7c, beberapa AuNPs keluar dari HSF karena eksositosis, yang menunjukkan biokompatibilitas yang sangat baik dari A/A-ES sekali lagi. Setelah iradiasi, HSF menampilkan fitur sel yang sekarat, yaitu tonjolan dari membran plasma (Gbr. 7b) [37]. Karena ROS dan efek fototermal, mitokondria yang membengkak dan membran luar yang pecah, sebagai indikator lain dari kematian HSF, ditemukan di sitoplasma HSF (Gbr. 7d) [35]. Selanjutnya, ES juga ditemukan dengan karakteristik struktur membrannya (bingkai merah pada Gambar 7d). Singkatnya, A/A-ES dapat memfasilitasi penetrasi ALA dan AuNP ke HSF dan menghancurkan HSF dengan PDT/PTT yang sinergis.
Gambar mikroskop cahaya HSF diperlakukan dengan A/A-ES sebelumnya (a ) dan setelah penyinaran (b ). Gambar TEM dari HSF yang diobati dengan A/A-ES sebelumnya (c ) dan setelah penyinaran (d )
Kesimpulan
Biokompatibel A/A-ES disiapkan dengan mudah untuk PDT/PTT sinergis in vitro dari HS dengan meresap ke dalam HS dan menghancurkan HSF. Memanfaatkan ultrasonikasi, AuNPs disintesis dan dimuat secara bersamaan tanpa adanya agen beracun. A/A-ES memiliki absorbansi yang kuat dalam 600–650 nm sebagai efek kopling plasmonik antara AuNP yang berdekatan di ES dengan EE tinggi untuk ALA (ca. 20%). Studi penetrasi transdermal in vitro menunjukkan bahwa A/A-ES adalah pembawa obat yang sangat efisien untuk meningkatkan penetrasi ALA dan AuNP ke dalam jaringan HS. PDT/PTT in vitro untuk HSF menunjukkan bahwa A/A-ES dapat meningkatkan hasil kuantum ROS melalui efek fototermal dan LSPR AuNPs, yang menyebabkan tingkat apoptosis atau nekrosis sel yang tinggi. Singkatnya, A/A-ES biokompatibel memiliki efisiensi PDT/PTT sinergis yang lebih baik untuk HSF daripada PDT dan PTT individu, mendorong perspektif untuk pengobatan HS. Pekerjaan lebih lanjut akan fokus pada studi in vivo PDT/PTT sinergis untuk HS dalam model bekas luka, dan pekerjaan yang relevan sedang berlangsung.
Eksperimen dan Metode
Persiapan A/A-ES
Seratus delapan puluh miligram fosfatidilkolin (PC, 95,8% lesitin kedelai, Lipoid GmbH, Jerman) dilarutkan dalam 1,8 mL CH3 CH2 OH, 0,6 mL HAuCl4 (10 mM, Aladdin, Shanghai, China), dan 3,6 mL larutan buffer ALA-sitrat (CBS, 0,01 M, 12 mg ALA, pH 4,0), secara bergantian, ditambahkan ke dalam larutan PC secara tetes demi tetes. Campuran diaduk pada 700 rpm selama 10 menit untuk menyiapkan larutan prekursor. Seperti yang ditunjukkan pada Skema 1, larutan prekursor dimasukkan ke dalam lingkungan ultrasonik pada 200 W selama 30 menit, sampai warnanya merah anggur cemerlang. Kemudian larutan reaksi dilakukan dengan sentrifus (8000 rpm, 20 menit) untuk menghilangkan sisa HAuCl4 dan komputer. Terakhir, deposisi didispersikan kembali dalam larutan hidroalkohol ALA 3 ml (ALA-HA, 2 mg/ml ALA, 30% etanol) dan diinkubasi dengan metode pemuatan aktif gradien pH transmembran sesuai dengan pekerjaan kami sebelumnya [13]. Dalam inkubasi, banyak ALA terionisasi eksterior menyebar melalui bilayer ES ke dalam inti berair asam internal ES, dan kemudian, mereka terprotonasi dan terperangkap dalam ES. Setelah inkubasi, A/A-ES telah disiapkan. Dalam pekerjaan ini, ALA-ES disiapkan sesuai dengan pekerjaan kami sebelumnya dengan konsentrasi ALA yang sama dengan A/A-ES. ES yang dimuat AuNP (Au-ES) disiapkan sebagai A/A-ES tanpa ALA dengan konsentrasi AuNP yang sama dengan A/A-ES.
Diagram skema persiapan A/A-ES
Karakterisasi A/A-ES
A/A-ES diwarnai negatif dengan asam fosfotungstat (1,5% berat) dan kemudian diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEOL, Jepang, tegangan akselerasi 120 kV). A/A-ES juga diperiksa dengan mikroskop elektron pemindaian (SEM, JEOL, Jepang, tegangan percepatan 10 kV). Distribusi ukuran A/A-ES ditentukan oleh analisis hamburan cahaya dinamis (DLS) dalam sistem inspeksi NiComp 380ZLS (Nicomp, USA). ALA ditentukan dengan pendekatan derivatisasi fluoresceamine, dan detailnya ditunjukkan di File tambahan 1. Efisiensi penjebakan (EE) ALA yang ditentukan dengan metode ultrafiltrasi ditunjukkan di File tambahan 1. Terakhir, spektrum UV-Vis dilakukan pada Spektrofotometer UV-Vis Varian Cary 50 (Perkin Elmer, AS).
Studi Penetrabilitas In Vitro oleh Sel Difusi Franz
Studi penetrasi A/A-ES dilakukan dengan menggunakan sel difusi Franz dengan 2,8 cm
2
daerah permeasi efektif. Sel-sel reseptor termasuk kompartemen donor dan reseptor dipertahankan pada suhu 37°C dengan penangas air yang bersirkulasi. Jaringan HS dikumpulkan dengan persetujuan di Rumah Sakit Rakyat Shanghai Kesembilan dan pedoman etika Deklarasi Helsinki 1975 yang disetujui oleh Rumah Sakit Rakyat Shanghai Kesembilan. Jaringan HS segar tanpa jaringan lemak (kurang dari 24 jam setelah eksisi) dipasang pada kompartemen reseptor dengan stratum korneum ke atas ke kompartemen donor. Satu mililiter A/A-ES ditambahkan ke dalam kompartemen donor, kemudian kompartemen donor ditutup dengan parafilm untuk mencegah penguapan. Setelah penetrasi dengan waktu yang berbeda, jaringan HS segera dicuci untuk menghilangkan sisa A/A-ES pada permukaan HS. Untuk mengakumulasi jumlah retensi ALA dan AuNPs di HS, jaringan HS dipotong kecil-kecil, dan ALA di jaringan HS diekstraksi dengan dialisis di PBS selama 24 jam. Solusi ekstrak dianalisis untuk jumlah retensi ALA dalam jaringan HS. Jaringan HS yang disimpan dalam tas dialisis juga dianalisis untuk jumlah retensi AuNP dengan spektrometri massa plasma (ICP-MS) yang digabungkan secara induktif. Setelah diresapi oleh ALA-ES selama 2 jam, jaringan HS dicuci, diprefiksasi, didehidrasi, diinfiltrasi, dan difiksasi. Setelah tertanam dalam resin epoksi, mereka dipotong sebagai ultrasection (ketebalan 50 nm, tegak lurus epidermis) dan diamati dengan menggunakan TEM pada tegangan akselerasi 120 kV.
PDT/PTT In Vitro untuk HSF
Budaya Sel
HSF diisolasi dan dikultur dengan metode umum sebagai berikut:Potongan jaringan HS segar (1 mm
3
, kurang dari 6 jam setelah eksisi) dicerna dengan menggunakan kolagenase tipe I (Invitrogen, USA) untuk mencapai suspensi sel tunggal. HSF tumbuh di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, USA) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Gibco, USA) pada 37 °C dan 5% CO2 . Media kultur harus diganti setiap 3 hari, dan sel-sel dilewatkan ketika 80% konfluen. Melewati dua dan tiga sel digunakan dalam eksperimen berikut.
Uji Biokompatibilitas
Dalam evaluasi biokompatibilitas A/A-ES, HSF diunggulkan di pelat 96-sumur pada 2 × 10
3
sel / sumur. Media kultur diganti dengan media bebas FBS dan ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES yang baru disiapkan dalam konsentrasi yang berbeda, masing-masing. Setelah 12 jam, viabilitas sel diukur menggunakan kit penghitung sel-8 (CCK-8, Dojindo, Jepang) dengan mengikuti petunjuk pabrik.
Prosedur PDT/PTT
HSF diunggulkan di pelat 12-sumur pada 4 × 10
4
sel / sumur. Setelah 12 jam, media kultur, masing-masing, mengandung ALA-ES, Au-ES, dan A/A-ES yang baru disiapkan (14%, v /v ), diganti dengan media bebas FBS selama 6 jam. Setelah perlakuan, HSF dicuci dengan PBS dan diinkubasi dalam media kultur selama 1 jam. Kemudian, disinari dengan laser He-Ne (panjang gelombang 632 nm, 40 mW/cm
2
, Institut Teknologi Laser Shanghai, China) dengan 20 mnt. Kemudian, media kultur diganti dengan DMEM segar yang mengandung 10% FBS selama 24 jam lagi sebagai persiapan untuk eksperimen berikutnya. Selanjutnya, HSF diobati dengan A/A-ES dan penyinaran diawali, didehidrasi, dan disematkan untuk mempersiapkan ultraseksi untuk pemeriksaan TEM.
Pengujian Generasi PpIX dan ROS Intraseluler
Akumulasi PpIX intraseluler dan pembentukan ROS di HSF dideteksi dengan menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM, Leica TCS SP5, Jerman). Pengujian generasi ROS dilakukan menggunakan DCFH-DA dan mengikuti instruksi pabrik. Coverslip dengan sel dipasang pada slide kaca dan diamati pada emisi 405 nm/635 nm untuk PpIX dan 488 nm eksitasi/560 nm emisi untuk ROS. Semua data dianalisis dengan perangkat lunak LAS AF.
Pengujian Apoptosis dan Nekrosis
Apoptosis dan nekrosis HSF dianalisis dengan flow cytometry setelah pewarnaan ganda Annexin V-FITC dan pewarnaan ganda propidium iodida (PI). Sampel disiapkan sesuai dengan protokol kit deteksi apoptosis Annexin V-FITC/PI dan kemudian dianalisis dengan BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, USA). Analisis data dilakukan dengan perangkat lunak FlowJo 7.6.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± SD kecuali dinyatakan lain. Signifikansi statistik ditentukan dengan menggunakan tes siswa dua sisi (P < 0.05) kecuali dinyatakan lain.
Singkatan
A/A-ES:
Asam 5-Aminolevulinat/vesikel etosom bermuatan nanopartikel Au
ALA:
Asam 5-Aminolevulinat
ALA-ES:
ES yang dimuat ALA
ALA-PDT:
PDT berbasis ALA
Au-ES:
ES yang dimuat AuNP
AuNP:
Au nanopartikel
CLSM:
Mikroskop pemindaian laser confocal
DLS:
Hamburan cahaya dinamis
DMEM:
Medium Elang Modifikasi Dulbecco
EE:
Efisiensi jebakan
ES:
Vesikel etosomal
FBS:
Serum janin sapi
HS:
Bekas luka hipertrofik
HSF:
Fibroblas bekas luka hipertrofik
ICP-MS:
Spektrometri massa plasma yang digabungkan secara induktif
