Anti-Epcam Aptamer (Syl3c)-Liposome yang Difungsikan untuk Pengiriman Doksorubisin yang Ditargetkan:Studi Antitumor In Vitro Dan In Vivo pada Tikus yang Mengandung C26 Karsinoma Usus Besar
Abstrak
Dalam penelitian ini, kami memiliki PEGylated-nanoliposomal doxorubicin (DOX) yang difungsikan permukaan dengan aptamer anti-EpCAM (molekul adhesi sel epitel) melalui pasca-penyisipan anti-EpCAM aptamer-conjugated DSPE-mPEG2000 ke dalam Caelyx® (ED-bibir). Ukuran, muatan, profil pelepasan, dan sitotoksisitas dan serapan seluler dari formulasi ditentukan. Karakterisasi ED-bibir menunjukkan sedikit peningkatan ukuran dan PDI seiring dengan penurunan potensi zeta yang menunjukkan bahwa pasca-insersi dilakukan secara efisien. Hasil flow cytometry dan fluorescent microscopy menunjukkan bahwa ED-lip meningkatkan kecepatan pengambilan sel pada garis sel C26 dibandingkan dengan Caelyx®. ED-bibir juga memiliki efek sitotoksik yang lebih banyak dibandingkan Caelyx® yang menunjukkan efikasi aptamer anti-EpCAM sebagai ligan penargetan. Farmakokinetik dan biodistribusi jaringan dari formulasi pada tikus yang mengandung tumor C26 menunjukkan bahwa ED-bibir tidak mempengaruhi profil distribusi DOX dibandingkan dengan Caelyx® pada model hewan. Selain itu, ED-lip secara efektif meningkatkan akumulasi tumor DOX dan meningkatkan kelangsungan hidup hewan dibandingkan dengan Caelyx®. Hasil ini menunjukkan bahwa fungsionalisasi Caelyx® dengan aptamer anti-EpCAM menjanjikan dalam pengobatan kanker dan memerlukan penyelidikan lebih lanjut.
Pengantar
Sistem penghantaran obat nano (NDDS) dengan ukuran 100-200 nm secara pasif terakumulasi dalam lingkungan mikro tumor melalui efek permeabilitas dan retensi (EPR) yang ditingkatkan. Ini terjadi melalui lapisan endotel yang longgar dan drainase limfatik yang lemah. Namun, data terbaru menunjukkan bahwa hanya kurang dari 1% obat yang diberikan dapat mencapai lokasi tumor [1]. Kurangnya kemampuan untuk menembus matriks ekstra seluler padat (ECM) tumor, kembalinya obat yang dilepaskan ke sirkulasi dan heterogenitas tumor adalah alasan yang bertanggung jawab atas kegagalan ini [2]. Strategi yang berbeda telah digunakan untuk meningkatkan akumulasi tumor NDDS menggunakan rangsangan endogen dan eksogen [3]. NDDS ini dapat merespon rangsangan eksogen seperti cahaya dan memiliki kapasitas untuk digunakan dalam pencitraan tumor [4]. Ada banyak nanomaterial anorganik yang berbeda yang memiliki kemampuan untuk digunakan sebagai agen antikanker [5, 6]. Namun dalam hal nanomaterial anorganik, perhatian harus diberikan pada toksisitas dan keamanan lingkungan mereka [7,8,9,10,11].
Pengiriman bertarget aktif adalah pendekatan penting yang membantu NDDS untuk memberikan agen terapeutik lebih efisien ke tumor dan meminimalkan paparan jaringan non-target [12, 13]. Agen penargetan yang ideal untuk pengiriman yang ditargetkan adalah molekul yang memiliki afinitas terhadap protein permukaan sel atau reseptor yang diregulasi oleh sel atau komponen jaringan tertentu [14].
Molekul adhesi sel epitel (EpCAM) adalah glikoprotein transmembran yang dianggap sebagai kandidat ligan untuk penargetan aktif. Temuan terbaru menunjukkan bahwa EpCAM memiliki ekspresi normal sel epitel sehat yang rendah, sedangkan pada sel kanker ekspresinya menjadi lebih tinggi (hingga 1000 kali lipat) [15,16,17]. Selama perkembangan kanker pola ekspresi EpCAM berubah dari membran basal dan basolateral pada epitel normal ke permukaan apikal pada sel epitel tumor [18]. Ekspresi diferensial ini menjadikan EpCAM sebagai ligan yang sangat menarik untuk penghantaran obat yang dapat meningkatkan indeks terapeutik obat [19].
EpCAM ditunjukkan sebagai penanda sel punca kanker (CSC) atau tumor initiating cell (TIC), yang ekspresinya pada kanker terkait dengan prognosis yang buruk [20]. CSC atau TIC adalah sel yang memiliki self-renewal, kemampuan untuk menghasilkan lebih banyak sel dari jenis yang sama, yang memiliki peran kunci dalam perkembangan tumor dan metastasis [21]. Ekspresi berlebihan dari EpCAM telah dilaporkan di CSC dari berbagai tumor padat [22]. Baru-baru ini, aptamers telah menarik banyak perhatian dalam berbagai penyelidikan dan muncul sebagai molekul yang berpotensi kuat yang dapat digunakan dalam NDDS sebagai ligan penargetan [23, 24]. Aptamer adalah sekuens oligonukleotida berbasis DNA atau RNA yang memiliki struktur sekunder dan tersier yang memiliki afinitas terhadap targetnya seperti reseptor permukaan sel [23, 24]. Aptamers juga memiliki beberapa keunggulan dibandingkan misalnya, mereka tidak imunogenik dan memiliki berat molekul rendah (8–25 kDa) dengan stabilitas kimia dan termal. Selain itu, sintesis dan modifikasi kimianya berbiaya rendah dan terukur [25]. Penargetan selektif NDDS melalui aptamer spesifik anti-EpCAM dapat dianggap sebagai opsi penargetan yang efektif untuk memberikan agen kemoterapi ke dalam lingkungan mikro tumor [19, 26]. Dalam hal ini, penelitian yang berbeda menunjukkan bahwa anti-EpCAM aptamer yang difungsikan sebagai nanocarrier dapat secara efektif meningkatkan pengiriman obat antikanker ke sel tumor [15, 27, 28].
Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan anti-EpCAM DNA aptamer (SYL3C)-PEGylated-nanoliposom yang sarat dengan doxorubicin (DOX) (ED-lip) sebagai model NDDS. Fungsionalisasi tersebut dilakukan oleh kimia kopling EDC/NHS antara gugus amina aptamer dan gugus karboksil DSPE-mPEG2000 , yang setelah dimasukkan ke dalam liposom seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1. Bibir ED dicirikan untuk ukuran, potensi zeta, dan persentase enkapsulasi doksorubisin, profil pelepasan dan sitotoksisitas. Kemudian, kami mengevaluasi apakah ED-lip ini dapat meningkatkan penyerapan sel secara in vitro dan mengirimkan DOX ke tumor dengan melalui penargetan pada tikus yang membawa tumor karsinoma usus besar C26.
Persiapan Caelyx® (ED-lip) yang difungsikan anti-EpCAM. a Menautkan aptamer anti-EpCAM ke DSPE-mPEG2000 melalui ikatan kovalen amina primer (-NH2) dari aptamer anti-EpCAM ke gugus karboksil (-COOH) dari DSPE-mPEG2000 . b Metode pasca pemasangan untuk persiapan Caelyx® (ED-lip) yang difungsikan anti-EpCAM
Hasil dan Diskusi
Caelyx®, PEGylated liposomal doxorubicin adalah salah satu agen kemoterapi yang paling banyak digunakan dan merupakan nanopartikel pertama yang disetujui FDA yang telah diindikasikan untuk pengobatan kanker ovarium, sarkoma Kaposi terkait AIDS dan multiple myeloma. Caelyx® secara pasif menembus ke lokasi tumor melalui efek EPR [29]. Meskipun, Caelyx® secara signifikan telah meningkatkan farmakokinetik dan waktu paruh DOX; namun, keterbatasan utama Caelyx® adalah serapan seluler yang tidak mencukupi dan tingkat pelepasan obat yang rendah di lokasi tumor [29]. Di sini, kami menggunakan SYL3C aptamer sebagai ligan penargetan untuk memfungsikan liposomal doxorubicin (ED-lip) untuk menargetkan molekul EpCAM di permukaan sel kanker, yang memungkinkan pengiriman DOX ke situs target tertentu melalui proses penargetan aktif.
Konjugasi DSPE-mPEG2000 ke Aptamer
Dalam penelitian ini, kami menggunakan kimia kopling EDC/NHS untuk konjugasi aptamers anti-EpCAM yang difungsikan amina menjadi gugus karboksilat aktif DSPE-mPEG2000 -COOH. Keuntungan dari reaksi kopling ini menggunakan kimia kopling EDC/NHS dan pembentukan ikatan amida adalah stabilitasnya dan mengurangi interaksi nonspesifik antar aptamers [30]. Aptamers dapat dimodifikasi dengan gugus amina atau tiol primer dan terkonjugasi secara kovalen untuk mengaktifkan gugus karboksil atau pirol maleimida [31]. Aptamers yang dimodifikasi dengan gugus tiol dikonjugasikan ke gugus fungsi maleimida dari DSPE-PEG2000 . Kemudian, DSPE-PEG2000 -aptamer pasca-dimasukkan ke dalam struktur liposom untuk menghiasi permukaan luar liposom [32]. Salah satu batasan penting dengan kimia tiol maleimida adalah bahwa selama penyimpanan gugus tiol dari aptamers dapat dipengaruhi oleh oksidasi dan mengarah pada pembentukan ikatan disulfida (S-S) antara dua aptamer yang dimodifikasi tiol. Aptamer dimer ini tidak dapat berpartisipasi dalam reaksi konjugasi dengan gugus fungsi maleimida dari DSPE-PEG2000 [30]. Oleh karena itu, penggunaan reaksi EDC/NHS meningkatkan hasil produk dan meningkatkan metode pasca penyisipan.
Aptamer memiliki beberapa keunggulan dibandingkan antibodi termasuk kemudahan sintesis dan peningkatan skala, toksisitas sistemik rendah dan kurangnya imunogenisitas [33]. Di sini, setelah konjugasi aptamer ke lipid, metode pasca-penyisipan direkrut untuk membuat anti-EpCAM aptamer dihiasi Caelyx® (ED-bibir). Secara umum, teknik pasca insersi merupakan metode yang sederhana dan efektif untuk menempelkan aptamer ke permukaan liposom dan memberikan tingkat inkorporasi aptamer yang lebih tinggi ke dalam liposom [34].
Kami menggunakan uji pergeseran mobilitas elektroforesis gel untuk evaluasi pasca penyisipan aptamer anti-EpCAM pada liposom. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, aptamers bermuatan negatif bermigrasi dalam gel dan pita mereka diamati sementara tidak ada pita lawan untuk formulasi ED-lip, karena ED-bibir terperangkap di garis sumur dan tidak dapat bergerak melalui gel. Hasil ini menunjukkan bahwa misel terkonjugasi aptamers berhasil dimasukkan ke dalam permukaan liposom.
Agarose gel-elektroforesis formulasi ED-bibir. Sampel dimasukkan ke dalam gel agarosa. Sinar UV memvisualisasikan gel. Sumur yang sesuai dengan tangga, aptamer bebas dan aptamer terkonjugasi PL ditunjukkan. Kurangnya pita yang sesuai di liposom-Aptamer menunjukkan konfirmasi pasca-penyisipan
Karakterisasi Fisikokimia ED-bibir
Karakterisasi fisikokimia Caelyx® dan ED-lip ditunjukkan pada Tabel 1. Ukuran dan muatan formulasi yang disiapkan mengungkapkan bahwa modifikasi Caelyx® dengan aptamer anti-EpCAM tidak berpengaruh signifikan terhadap ukuran partikel (p> 0,05). Ukuran liposom sebelum penyisipan aptamer (Caelyx®) adalah sekitar 96 nm dengan PDI 0,11, setelah pasca-penyisipan (ED-bibir) ukuran liposom meningkat sebagian menjadi 117 nm dengan PDI 0,14 yang memiliki ukuran yang diinginkan untuk pengiriman ke tumor. Hasil penelitian sebelumnya juga menunjukkan bahwa penggabungan ligan penargetan menyebabkan peningkatan ukuran dan PDI liposom [35, 36]. Selain itu, potensi zeta dari ED-bibir (− 19,25) menjadi lebih negatif daripada Caelyx® (− 12). Hal ini menunjukkan bahwa konjugasi RNA-aptamer ke dalam liposom mengakibatkan penurunan potensi zeta dari liposom [37]. Peningkatan ukuran dan potensi zeta negatif dari ED-bibir bisa menjadi bukti keberhasilan pasca penyisipan aptamers terkonjugasi pada permukaan liposom [38]. Hasil ini konsisten dengan penelitian kami sebelumnya yang menunjukkan perlekatan aptamer ke permukaan Caelyx® yang menyebabkan sedikit peningkatan ukuran partikel dan potensi zeta yang lebih negatif pada Caelyx® yang difungsikan aptamer [38, 39]. Namun, efikasi pasca pemasangan harus diuji dalam hal waktu inkubasi dan suhu untuk mencapai liposom pasca pemasangan yang lebih efisien dengan ukuran dan PDI yang lebih baik. Efisiensi enkapsulasi Caelyx® dan ED-lip adalah 100% (lihat Tabel 1).
Jumlah aptamer pasca-dimasukkan ke permukaan liposom ditentukan seperti yang dijelaskan [6]. Jumlah total kandungan fosfolipid formulasi liposom yang ditentukan dengan uji fosfat adalah 14 mM. Karena, jumlah rata-rata molekul lipid dalam liposom dengan ukuran rata-rata 100 nm adalah 8× 10
4
jumlah liposom dalam setiap mililiter hampir 10
14
[38]. Berat molekul aptamer adalah g/mol. Jumlah DSPE-mPEG2000 -aptamer ditentukan berdasarkan metode uji fosfat di mana mol molekul fosfat berhubungan dengan mol molekul terkonjugasi. Berdasarkan data tersebut, jumlah molekul aptamer per setiap ml larutan alikuot adalah 10
15
.
Profil Rilis DOX
Penyisipan misel terkonjugasi aptamer ke permukaan luar Caelyx® dapat mempengaruhi profil pelepasan DOX. Oleh karena itu, kami mengevaluasi pelepasan DOX bentuk ED-bibir dibandingkan dengan Caelyx® dalam dekstrosa 5% dengan 50% FBS. Media ini bisa meniru perilaku pelepasan formulasi dalam plasma [40]. Gambar 3 menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dalam pelepasan DOX dari Caelyx® dan formulasi ED-lip selama 24 jam penelitian dan hanya jumlah DOX yang dilepaskan dalam jumlah yang dapat diabaikan. Hal ini sesuai dengan penelitian kami sebelumnya yang menunjukkan bahwa penyisipan aptamer ke permukaan liposom tidak mempengaruhi stabilitas membran dan profil pelepasan DOX [38, 39]. Hal ini terutama karena stabilitas formulasi Caelyx® yang diformulasikan menggunakan metode pemuatan jarak jauh berbasis gradien pH [41].
Studi rilis. Profil kebocoran konten DOX dari Caelyx® dan ED-lip pada 37 °C dengan adanya 50% FBS dalam dekstrosa selama 24 jam penelitian. Data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SEM) (n =3)
Interaksi Sel dan Pengambilan Sel dengan Mikroskop Fluoresen
Interaksi sel dan serapan sel dari formulasi liposom dievaluasi pada suhu 4 °C dan 37 °C dan telah ditunjukkan pada Gambar. 4. Evaluasi kemanjuran penargetan ED-bibir menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan antara intensitas fluoresen rata-rata (MFI) sel CHO-K1 yang diobati dengan Caelyx® dan ED-lip pada 4 °C dan 37 °C (Gbr. 4a, c). Namun, data menunjukkan bahwa ED-bibir yang ditargetkan jauh memiliki serapan lebih tinggi oleh sel C26 dibandingkan dengan Caelyx® pada 4 ° dan 37 °C (Gbr. 4b, d) yang signifikan secara statistik pada 37 °C (p <0,0001). ED-bibir memiliki penyerapan yang signifikan dibandingkan dengan Caelyx® (p <0,001). Hasil ini menunjukkan bahwa spesifisitas target yang ditingkatkan ED-bibir karena aptamer anti-EpCAM memiliki afinitas lebih terhadap garis sel C26 dibandingkan dengan sel CHO-K1. DOX bebas bebas melewati lapisan ganda lipid dan memasuki sel sehingga memiliki serapan sel tertinggi di antara formulasi dan karenanya memiliki sitotoksisitas tertinggi. Dalam kasus Caelyx®, PEGylation membatasi laju endositosis dan mengakibatkan penurunan sitotoksisitas. Namun, kehadiran aptamer anti-EpCAM pada permukaan liposom (ED-bibir) meningkatkan laju internalisasi formulasi ke dalam sel dan meningkatkan sitotoksisitasnya dibandingkan dengan Caelyx® [38]. Data mikroskop fluoresen menunjukkan bahwa perbedaan antara serapan seluler ED-bibir dan DOX bebas dalam garis sel C26 pada 37 ° C tidak signifikan (Gbr. 5). Namun, penskalaan berdasarkan intensitas DOX terinternalisasi yang digambarkan pada Tabel 2 di mana ED-bibir dan DOX telah menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik dengan Caelyx® dalam serapan seluler C26 (p <0,001). Meskipun sel C26 mengekspresikan tingkat rendah EpCAM pada permukaannya [42], data penelitian ini menunjukkan bahwa kehadiran aptamer anti-EpCAM dapat meningkatkan laju proses internalisasi liposom [43].
Interaksi sel dan serapan sel dari formulasi liposom dievaluasi pada suhu 4 °C dan 37 °C. a Interaksi sel CHO-K1 dari formulasi pada 4 °C dan 37 °C. b Interaksi formulasi dengan sel C26 pada suhu 4 °C dan 37 °C. c Grafik menunjukkan MFI rata-rata formulasi pada sel CHO-K1 dan C26. Data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SEM) (n =3). ****p <0,0001
Mikroskop fluoresen. Hasil internalisasi sel DOX pada garis sel C26 divisualisasikan dengan mikroskop fluoresen. Sel diwarnai dengan DAPI. Baik DOX gratis dan ED-lip memiliki tingkat internalisasi DOX yang lebih tinggi dibandingkan dengan Caelyx®. Sel diperiksa dengan perbesaran × 200
Studi Sitotoksisitas
Efek sitotoksisitas dari formulasi DOX, Caelyx®, dan ED-bibir bebas ditunjukkan pada Gambar. 6. Konsentrasi formulasi yang berbeda digunakan untuk merawat sel selama 1, 3, dan 6 jam dan dibiarkan diinkubasi selama 72 jam berikutnya. Data menunjukkan bahwa semua formulasi memiliki efek pada sel dalam waktu dan cara tergantung dosis. Kelangsungan hidup sel C26 yang diobati dengan formulasi ED-bibir menurun dibandingkan dengan sel yang diobati dengan Caelyx®. Karena sel CHO-K1, sebagai sel negatif EpCAM, menunjukkan respons yang lebih rendah terhadap ED-bibir dibandingkan dengan sel C26, tampaknya aptamer anti-EpCAM meningkatkan pengiriman spesifik Caelyx® ke sel yang ditargetkan. Hasil ini dapat mengkonfirmasi serapan seluler spesifik ED-bibir oleh sel C26. Hasil ini menekankan pentingnya penggunaan penghantaran obat yang ditargetkan dengan agen penargetan spesifik untuk penghantaran obat yang selektif ke sel target dengan mengurangi efek samping obat dengan menghindari off-target [44]. Seperti yang dilaporkan sebelumnya, penargetan aktif Caelyx® dengan ligan penargetan spesifik seperti aptamer dan antibodi yang mengarah pada peningkatan penargetan tumor aktif dan penghantaran obat spesifik ke sel target yang pada gilirannya meningkatkan kemanjuran terapeutik DOX [35, 39].
Efek sitotoksisitas in vitro (IC50) dari ED-lip, Caelyx®, dan doxorubicin bebas terhadap sel CHO dan sel C26 setelah waktu pemaparan yang berbeda. Data direpresentasikan sebagai g/ml ± standar deviasi (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001
Biodistribusi dan Farmakokinetik
Untuk mengevaluasi bagaimana aptamer anti-EpCAM mempengaruhi biodistribusi DOX, kami menyuntikkan dosis 10 mg/kg ED-bibir dan Caelyx® pada tikus yang mengandung tumor kanker usus besar C26 subkutan. Konsentrasi DOX dalam plasma pada 3, 12, 24, 48, dan 72 jam setelah injeksi dengan Caelyx® dan ED-lip ditunjukkan pada Gambar. 7. Hasil penelitian menunjukkan bahwa perilaku konsentrasi DOX plasma pada kedua kelompok adalah serupa dan ada tidak ada perbedaan yang signifikan antara kedua formulasi. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3, konjugasi aptamer anti-EpCAM ke permukaan liposomal sedikit menurunkan waktu paruh sirkulasi dari 39,3 jam menjadi 34,2 jam dan MRT dari 47,6 menjadi 42,9 jam (lihat Tabel 3). Parameter farmakokinetik menunjukkan bahwa konjugasi aptamer anti-EpCAM pada liposom sedikit menurun t½ dan MRT yang konsisten dengan laporan sebelumnya menunjukkan bahwa konjugasi aptamer pada permukaan liposomal mempercepat pembersihan liposom [38]. Adsorpsi protein dan penghapusan konsekuen oleh sistem fagositik mononuklear (MPS) bisa menjadi alasan percepatan pembersihan darah dari nanopartikel terkonjugasi ligan [45].
kadar DOX plasma. Hasil konsentrasi terhadap waktu jumlah DOX dalam darah pada 3, 12, 24, 48, dan 72 jam pasca injeksi. Data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SEM) (n =3)
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 8, konsentrasi DOX dalam organ panen utama dalam kelompok yang menerima Caelyx® dan ED-bibir dibandingkan. Efek samping terpenting dari DOX bebas adalah kardiotoksisitas dimana Caelyx® secara signifikan mengurangi risiko efek samping ini [46]. Biodistribusi ED-bibir di hati, paru-paru dan limpa secara signifikan lebih tinggi dari Caelyx® pada waktu 3 jam. Adanya pembuluh darah yang bocor dan peningkatan ukuran dan PDI ED-bibir setelah pasca-insersi mungkin menjadi alasan untuk lebih banyak akumulasi ED-bibir di jaringan ini di masa-masa sebelumnya. Hal ini menunjukkan bahwa peningkatan ukuran nanopartikel hingga 150 nm meningkatkan akumulasi nanopartikel di hati, paru-paru dan limpa [47]. Sementara itu, hasil studi biodistribusi secara jelas menunjukkan mekanisme EPR dalam akumulasi nanopartikel pada tumor. Gambar 8 dengan jelas menunjukkan bahwa ED-lip dan Caelyx® secara bertahap terakumulasi di lokasi tumor dan mencapai maksimum sekitar 12 jam, tetap stabil hingga 24 jam dan kemudian menurun pada 48 dan 72 jam, secara bertahap. Ini menarik di semua titik waktu 3, 12, 24, 48, dan 72 jam; akumulasi ED-bibir dalam tumor secara signifikan lebih dari Caelyx®, yang mungkin disebabkan oleh kemanjuran penargetan aktif dengan aptamer anti-EpCAM. Hasil ini menunjukkan bahwa penempelan aptamer pada dosis permukaan liposom tidak mempengaruhi distribusi DOX di ginjal. Oleh karena itu, tampaknya aptamers anti-EpCAM secara efektif meningkatkan penetrasi liposom spesifik tumor yang juga dapat disebabkan oleh ekspresi berlebih molekul EpCAM dalam sel endotel pembuluh darah tumor [48]. Sebelumnya, diindikasikan bahwa aptamers anti-EpCAM dapat meningkatkan penetrasi tumor pada tumor xenograft [49]. CSC atau TIC juga merupakan target terapi anti-EpCAM. Pemberian aptamers anti-EpCAM sebagai ligan penargetan untuk menargetkan EpCAM menunjukkan efek yang menjanjikan dalam menargetkan CSC [22, 50]. Di sini, dapat disarankan bahwa bagian dari efek antitumor yang efisien dari ED-bibir dapat disebabkan oleh keberhasilan penargetan CSC.
Biodistribusi jaringan. Hasil biodistribusi DOX pada jantung, tumor, hati, limpa paru, dan ginjal. Konsentrasi (μg/g) dilaporkan pada 3, 12, 24, 48, dan 72 jam pasca injeksi untuk setiap organ. Data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SEM) (n =3). *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001, ****p <0,0001
Aktivitas Anti-Tumor Di Vivo
Kemanjuran terapi ED-bibir dievaluasi dalam model tumor karsinoma kolon C26. Ukuran tumor, berat badan, dan kelangsungan hidup dipantau selama hampir 2 bulan dan hasilnya dirangkum dalam Gambar 9 dan Tabel 4. Data menunjukkan bahwa ED-bibir tidak memiliki pengaruh yang jelas terhadap berat badan tikus serta Caelyx® (lihat Gambar 9a). ). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 9b, setelah injeksi Caelyx® dan ED-lip secara intravena, laju pertumbuhan tumor dihambat secara efisien hingga hari ke 30 pasca injeksi, dan tidak ada perbedaan yang signifikan dalam kelompok liposom. Setelah 30 hari pasca injeksi, laju pertumbuhan tumor meningkat, namun laju pertumbuhan pada kelompok penerima obat masih lebih lambat daripada kelompok penerima PBS. Perbedaan antara kelompok Caelyx® dan ED-bibir tidak signifikan selama 30 hari pasca injeksi. Hasil kelangsungan hidup direpresentasikan dalam plot Kaplan-Meier. Gambar 9c menunjukkan ED-lip meningkatkan kurva kelangsungan hidup dibandingkan dengan PBS atau Caelyx®. Indikator utama studi kelangsungan hidup dirangkum dalam Tabel 4. Tumor pada tiga tikus dari kelompok ED-bibir sembuh total sehingga MST untuk kelompok ini tidak ditentukan. Pengobatan dengan ED-bibir meningkatkan TTE dari 41,1 menjadi 49,7 hari dan menghasilkan aktivitas anti-tumor yang efektif dengan 90,27% TGD dengan MST yang tidak ditentukan karena pengangkatan tumor secara lengkap pada tiga tikus (lihat Tabel 4).
Kemanjuran terapi in vivo dari formulasi pada tikus BALB / c betina yang mengandung karsinoma usus besar C26. Tikus menerima injeksi IV formulasi dosis tunggal (10 mg/kg). a Merupakan profil persentase berat masing-masing BALB/c di setiap kelompok eksperimen. b Menggambarkan tindak lanjut ukuran tumor pada tikus BALB/c. c Menunjukkan grafik kelangsungan hidup untuk BALB/c. Data direpresentasikan sebagai mean ± SD (n =5)
Data ukuran tumor menunjukkan bahwa ED-bibir dapat secara dramatis menghambat pertumbuhan tumor. Hasil analisis kelangsungan hidup menunjukkan bahwa pengobatan dengan ED-bibir meningkatkan MST dan TTE. Kelompok yang menerima ED-bibir memiliki TGD% lebih besar dan lebih efektif dibandingkan dengan Caelyx®. Temuan kami konsisten dengan tingkat konsentrasi DOX yang tinggi dalam jaringan tumor kelompok yang diobati dengan ED-bibir. Oleh karena itu, DOX liposom terkonjugasi aptamer meningkatkan penetrasinya dan akibatnya meningkatkan akumulasi obat di lokasi tumor, yang pada gilirannya mengarah pada peningkatan kemanjuran Caelyx® dan TGD% yang lebih tinggi dalam data kelangsungan hidup. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa aptamers anti-EpCAM dapat berfungsi sebagai agen penargetan penting untuk pengiriman obat.
Kesimpulan
Di sini, kami memiliki Caelyx® yang difungsikan permukaan dengan aptamer anti-EpCAM (SYLC3) melalui post-insertion (ED-bibir). Flow cytometry dan fluorescent microscopy menunjukkan serapan DOX yang tinggi pada sel C26 yang mengindikasikan bahwa aptamer dapat meningkatkan kecepatan proses internalisasi ED-lip. Data farmakokinetik menunjukkan bahwa pasca pemasangan DSPE-mPEG-EpCAM tidak mengubah farmakokinetik DOX dibandingkan dengan Caelyx®. Namun, biodistribusi jaringan menunjukkan bahwa akumulasi tumor ED-bibir lebih banyak dibandingkan dengan Caelyx® bahkan setelah 72 jam pasca injeksi. Kami menunjukkan bahwa ED-bibir telah meningkatkan efek terapeutik pada tikus yang membawa tumor C26. Peningkatan parameter kelangsungan hidup pada tikus yang diobati dengan ED-lip, menunjukkan bahwa liposom DOX yang ditargetkan EpCAM adalah pembawa pengiriman obat yang menjanjikan untuk pengobatan kanker dan perlu diselidiki lebih lanjut.
Bahan dan Metode
Materi
Aptamer DNA 5′-Amine-anti-EpCAM (urutan 5′ -CACTACAGAGTTGCGTCTGTCCCACGTTGTCATGGGGTTGGCCTG-3′) (SYL3C) dibeli dari BIONEER (perusahaan bioteknologi, Daejeon, Korea Selatan). DSPE-mPEG2000 -COOH dibeli dari Avanti Polar Lipid (Alabaster, AL). Dowex®, 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), N-Hydroxysuccinimide (NHS), penisilin streptomisin dan Fluoroshield™ dengan DAPI dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Caelyx® yang tersedia secara komersial dibeli dari Behestan Darou Company (Tehran, Iran).
Konjugasi DSPE-mPEG2000 ke Aptamer
Aptamer Anti-EpCAM ditautkan ke DSPE-mPEG2000 melalui ikatan kovalen amina primer (-NH2) dari aptamer anti-EpCAM ke gugus karboksil (–COOH) dari DSPE-mPEG2000 (Gbr. 1). Konjugasi dilakukan melalui kimia kopling EDC/NHS [51]. Secara singkat, DSPE-mPEG2000 didispersikan dalam buffer 2-(N-morpholino)asam etanasulfonat (MES) (pH 6,5) dan EDC/NHS 400 mM EDC dan 100 mM NHS ditambahkan ke dalam dispersi. Dispersi dibiarkan diaduk selama 15 menit untuk mengaktifkan gugus karboksil lipid. Kemudian, aptamer anti-EpCAM ditambahkan ke dalam dispersi dan diaduk selama 2 jam berikutnya pada suhu kamar dalam keadaan gelap. Rasio molar aptamer lipid:anti-EpCAM adalah 1:1 dan rasio molar EDC/NHS adalah 10 kali lipat lipid.
Modifikasi Caelyx® dengan DSPE-mPEG-Anti-EpCAM Aptamer
ED-bibir disintesis dengan metode pasca-insersi. Untuk melakukan pasca penyisipan, misel aptamer DSPE-mPEG-anti-EpCAM ditambahkan ke 1 ml caelyx® selama 30 menit pada 60 °C. Jumlah aptamer DSPE-mPEG-EpCAM ditentukan menurut uji fosfat Bartlett [52]. Berdasarkan perkiraan jumlah liposom per mililiter caelyx® yaitu sekitar 10
14
, volume DSPE-mPEG-anti-EpCAM disesuaikan untuk mencapai 10 aptamer per setiap liposom [36]. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk mengkonfirmasi pasca-insersi [39].
Karakterisasi Fisikokimia
Ukuran partikel, indeks polidispersitas (PDI), dan muatan permukaan ditentukan oleh instrumen Dynamic Light Scattering (DLS) (Nano-ZS; Malvern, UK). Untuk menghilangkan DOX bebas, liposom dicampur dengan resin Dowex® dan diputar selama 60 menit dan dijalankan melalui kolom Poly-Prep (Bio-Rad Laboratories Inc.) untuk menghilangkan Dowex® [53]. Jumlah DOX dalam formulasi liposom ditentukan menggunakan spektrofotometer fluoresensi LS-45 (Perkin-Elmer, UK), (eksitasi:emisi 485:590 nm).
Studi Rilis
Untuk mengevaluasi pelepasan DOX, 1 ml formulasi ditambahkan ke 9 ml dekstrosa (dengan 50% serum janin sapi (FBS)) dan pada interval waktu tertentu (0, 1, 2, 4, 6, 12, dan 24 jam), sampel diambil. Setelah menghilangkan DOX bebas dengan resin Dowex®, jumlah obat yang tersisa dalam liposom ditentukan dengan spektrofotometer fluoresensi dan persentase pelepasannya dihitung [39].
Budaya Sel
Karsinoma usus besar C26 dan garis sel ovarium hamster Cina (CHO-K1) dibeli dari Institut Pasteur Iran. Garis sel dikultur dalam media RPMI1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS yang diperoleh dari Gibco (Thermos Fisher Scientific, USA) dan penisilin 100 IU/ml, dan streptomisin 100 mg/ml. Sel-sel diinkubasi pada suhu 37
°
C dengan 5% CO2 dan 95% atmosfer dengan kelembapan udara.
Interaksi Sel dan Uji Serapan Seluler
Interaksi sel dan penyerapan sel dari formulasi dievaluasi dalam 4 °C dan 37 °C, masing-masing. Dua garis sel, CHO-K1 dan C26, dipilih dalam tes ini. The cells seeded in each well of 12-well plates (2.5 × 10
5
per well). After overnight incubation in 37 °C, treatments added to the cells and plates were placed at 4 °C and 37 °C and incubate for another 3 h. Then cells washed with PBS, and trypsinized. The fluorescence intensity for DOX was determined using flow cytometry (BD FACSCalibur cytometer). The data were analyzed with FlowJo version 7.0 software.
Fluorescent Microscopy Evaluation
The number of 1 × 10
6
cells per well C26 Cells were seeded into 6-well plates in which sterile microscopic cover glass were already inserted. After overnight incubation in 37 °C and 5% humidity, cells were treated with free DOX, Caelyx® and ED-lip for 24 h for complete cell uptake [54]. Then cells washed with PBS and fixed with 4% formaldehyde. Cover glasses stained with Fluoroshield™ with DAPI and were mounted on the glass slides. Treatments were performed in triplicate. From each slide, six zones were selected under × 200 magnification field. Intrinsic fluorescent of DOX was used for evaluation of drug cell uptake. Scaling was performed based on the percentages of cells which shown DOX cell uptake in each microscopic filed:
1:0–20%, 2:20–40%, 3:40–60%, 4:60–80%, and 5:80–100%
Evaluation of Cytotoxicity
The IC50 values of free DOX, caelyx®, and ED-lip were determined by MTT assay. In order to do this, CHO-K1 and C26 cells were seeded at density of 5 × 10
3
cells per well in 96-well plates at 37 °C. After overnight incubation liposomal formulations and free DOX solution were serially diluted in FBS-free medium and added to cell cultures and incubated 1, 3, and 6 h at 37 °C. Then, cells were washed and allowed to incubate 72 h. The optical densities (ODs) were measured using a spectrometric absorbance of 570 nm against a background of 630 nm on Stat-Fax 2100 microplate reader (Awareness Technology Inc. USA). Then the IC50 values were calculated.
Animal Study
Female BALB/c mice (4–6 weeks, 18–20 g) were kept in separate cages at 22 ± 2 °C and maintained on standard pellet diet and water ad libitum. Intraperitoneal (i.p) injection of ketamine and xylazine (100 mg/kg ketamine and 10 mg/kg xylazine) used to anesthetize the animals [55]. The number of 3 × 10
5
C26 cells per mouse in 60 μl PBS injected at the right flank, subcutaneously. Two weeks after inoculation when tumor sizes grew about 5 mm
3
, mice were randomly divided into 3 groups (n =3 for biodistribution and n =5 for antitumor study mice per group). All of the experimental protocols were approved by the Mashhad University of Medical Sciences committee for animal ethics and were performed according to the international rules considering the animal rights.
Biodistribution and Pharmacokinetic Studies
Fourteen days after tumor inoculation, mice were treated with dose of 10 mg/kg of caelyx® and ED-lip intravenously (i.v.) via the tail vain. Control group received 200 μl PBS solution. At certain time-intervals (3, 12, 24, 48, and 72 h) post-injection mice were euthanized and blood samples and tissue samples (liver, spleen, kidney, lung, heart, and tumor) were collected. Then, the concentration of doxorubicin in each sample measured based on fluorescent intensity of each samples using LS-45 fluorescence spectrophotometer (Perkin-Elmer, UK). Doxorubicin concentration of each sample was measured and non-compartmental analysis of the pharmacokinetic parameters were calculated from blood concentration vs. time profiles. Then the parameters including under the concentration-time curve (AUC) and area under the first moment curve (AUMC), half-life (t1/2 ), volume of distribution (Vd ), Cmaks , Tmax,, mean residence time (MRT), and clearance (Cl) were calculated.
In Vivo Antitumor Activity
In order to evaluate antitumor activity, 10 days after tumor inoculation, mice with palpable tumor size were received single i.v. dose of 10 mg/kg Caelyx® and ED-lip. PBS injected in mice which considered as negative control. The parameters including time to reach the endpoint (TTE), percentage of tumor growth delay (TGD), median survival time (MST), and survival were determined. During the study, mice were observed for health and body weight changes. The tumor volume was also measured using a digital caliper and calculated as follows:
Considering ethical aspects, mice were removed in case tumor growth was> 1000 mm
3
, or> 20% weight loss or sign of weakness was observed.
Statistical Analysis
Data were analyzed using GraphPad Prism 6.0 (GraphPad software, Inc., San Diego, CA, USA). Data were demonstrated as mean ± SEM of at least three independent experiments. The t test was used in order to evaluate the results of release study, flow cytometry, and biodistribution of the formulations. ANOVA was employed to evaluate the results of fluorescent microcopy and tumor volumes. The Kaplan–Meier method used to calculate the survival parameters include TTE, MST and TGD%. P <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Ketersediaan Data dan Materi
Semua data yang mendukung kesimpulan artikel ini disertakan dalam artikel.
