Studi Eksperimental Etosom Terenkapsulasi 5-fluorouracil Dikombinasikan dengan Laser Fraksi CO2 untuk Mengobati Bekas Luka Hipertrofik
Abstrak
Tujuan
Penelitian ini dirancang untuk mengeksplorasi permeabilitas etosom yang dienkapsulasi dengan 5-florouracil (5-FU) yang dimediasi oleh CO2 laser fraksional pada jaringan parut hipertrofik. Selain itu, efek terapeutik dan durasi CO2 laser fraksional yang dikombinasikan dengan etosom terenkapsulasi 5-FU dalam model bekas luka hipertrofik telinga kelinci akan dievaluasi.
Metode
Jumlah meresap 5-FU dan isi retensi 5-FU keduanya ditentukan oleh kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Intensitas fluoresensi dari etosom yang dikemas dengan 5-FU (5E) berlabel Rodanmin 6GO (Rho) diukur dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM). Promosi permeabilitas 5E berlabel Rho pada bekas luka hipertrofik telinga kelinci yang dimediasi oleh CO2 laser fraksional dievaluasi pada 0 jam, 6 jam, 12 jam, 24 jam, 3 hari dan 7 hari setelah iradiasi. Tingkat pembukaan saluran mikro dihitung menurut CLSM. Efek terapeutik 5EL dievaluasi pada bekas luka hipertrofik telinga kelinci secara in vivo. Ketebalan relatif bekas luka hipertrofik telinga kelinci sebelum dan sesudah perlakuan diukur dengan metode jangka sorong. Indeks elevasi bekas luka (SEI) bekas luka hipertrofik telinga kelinci diukur menggunakan pewarnaan H&E.
Hasil
Data menunjukkan bahwa jumlah penetrasi grup 5EL lebih tinggi dari grup 5E (4,15 ± 2.22 vs. 0.73 ± 0.33; p < 0.05) setelah 1 jam pengobatan. Selain itu, jumlah penetrasi 5EL lebih tinggi daripada grup 5E (107,61 ± 13,27 vs. 20,73 ± 3,77; p < 0,05) setelah perawatan 24 jam. Konten retensi kelompok 5EL juga menunjukkan tingkat yang lebih tinggi daripada kelompok 5E (24,42 ± 4,37 vs.12,25 ± 1,64; p < 0,05). Intensitas fluoresensi Rho dalam jaringan parut hipertrofik kelompok 5EL lebih tinggi daripada kelompok 5E pada titik waktu yang berbeda (1, 6, dan 24 jam). Laju pembukaan saluran mikro menurun secara bertahap dalam 24 jam, dan saluran mikro ditutup sepenuhnya 3 hari setelah iradiasi oleh CO2 laser pecahan. Ketebalan relatif dan SEI bekas luka hipertrofik telinga kelinci setelah 7 hari pengobatan pada kelompok 5EL secara signifikan lebih rendah daripada kelompok 5E.
Kesimpulan
CO2 laser fraksional yang dikombinasikan dengan 5E topikal dapat efektif dalam pengobatan bekas luka hipertrofik in vivo dan menyediakan metode terapi baru untuk bekas luka hipertrofik manusia.
Latar Belakang
Bekas luka hipertrofik adalah kondisi kulit yang ditandai dengan penimbunan kolagen dalam jumlah berlebihan yang menimbulkan bekas luka yang terangkat, tetapi tidak mencapai tingkat keloid yang diamati [1]. Sebanyak 100 juta pasien mengembangkan bekas luka di negara maju setiap tahun, sebagai akibat dari 55 juta operasi elektif dan 25 juta operasi setelah trauma [2]. Setelah operasi bedah, sekitar 60% pasien mengalami bekas luka hipertrofik pascaoperasi, biasanya selama 3 bulan pertama. Sebagian besar bekas luka hipertrofik masih hipertrofik dalam 12 bulan setelah operasi bedah [3]. Saat ini, metode pengobatan yang umum meliputi perawatan bedah dan non-bedah. Tekanan, terapi radiasi, kemoterapi, dan perawatan bedah obat lainnya adalah perawatan terapi utama. Sejauh ini, terapi ini tidak dapat mencapai efek terapeutik yang diinginkan karena cacat mereka [4, 5]. Terapi obat adalah salah satu perawatan non-bedah yang paling umum untuk bekas luka patologis hingga pengecatan eksternal berdasarkan suntikan lokal. Karena efek samping obat, suntikan lokal seringkali terbatas pada pengobatan skala kecil dan dosis rendah. Selain itu, karena waktu paruh obat yang pendek, suntikan obat lokal selalu gagal untuk mempertahankan konsentrasi tinggi yang tahan lama pada bekas luka; oleh karena itu, suntikan berulang sering diperlukan [6]. Mengingat kepadatan jaringan parut dan rasa sakit yang parah, injeksi umumnya tidak dapat diterima untuk pasien. Terlepas dari keuntungannya termasuk tidak menimbulkan rasa sakit, tidak ada efek samping pada hati, dan nyaman untuk penggunaan luar jangka panjang [7, 8], obat-obatan tidak dapat masuk ke dalam bekas luka karena struktur organisasi khusus dari bekas luka patologis. Laporan terbaru juga menunjukkan bahwa obat topikal sulit menembus jaringan parut [9]. Jadi penggunaan luar untuk obat saat ini terbatas.
Etosom adalah pembawa lipid baru yang digunakan oleh Touitou pada tahun 2000 [10], efektif dalam menghantarkan obat melalui kulit. Komponen utama etosom adalah etanol, yang dapat mengubah susunan molekul lipid kutikula yang rapat, meningkatkan fluiditas lipid, dan meningkatkan fleksibilitas dan mobilitas membran liposom etanol. Etanol dari etosom juga dapat mempercepat deformasi stratum korneum dan meningkatkan kemampuan membawa dan penetrasi obat melalui stratum korneum yang tidak teratur di kulit [11,12,13]. Namun, berbeda dengan jaringan kulit normal, jaringan parut memiliki struktur khusus. Dalam penelitian kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa etosom adalah pembawa yang sangat efisien untuk obat di bekas luka manusia [14]. Sangat diperlukan bahwa obat di jaringan parut tidak terdistribusi dengan baik, tetapi berkurang secara signifikan dari luar ke dalam kulit. Obat terutama terakumulasi di epidermis dan lapisan superfisial dermis tetapi tidak di semua lapisan dermis, yang mengurangi efek anti-jaringan parut.
Terapi laser fraksional ablatif, sebuah teknologi kosmetik, adalah modalitas yang sangat populer dan diterima secara luas saat ini dan terutama digunakan untuk perawatan klinis kerutan wajah, bekas luka superfisial, gangguan pigmentasi, dan memperbaiki tekstur kulit [15,16,17]. Berdasarkan teori fototermolisis dot matrix [18], laser fraksional ablatif menghasilkan susunan seperti susunan sinar laser kecil dan mengganggu penghalang kulit dengan menciptakan saluran vertikal mikroskopis ablatif yang dikelilingi oleh zona kerusakan termal, menginduksi respons penyembuhan luka pada kulit sedang. penampilan [19,20,21,22]. Telah dilaporkan bahwa penghalang utama penyerapan obat perkutan adalah stratum korneum [23, 24]. Studi terbaru menunjukkan bahwa, salah satu laser fraksional ablatif klinis yang paling umum digunakan, CO2 laser fraksional dapat memecah stratum korneum dan membentuk saluran mikro yang padat, sehingga merusak penghalang utama yang menghambat penyerapan obat perkutan dan memberikan prospek penetrasi obat transdermal yang baik [25,26,27,28].
Dalam studi ini, kami mengeksplorasi CO2 gel etosomal yang dimediasi laser fraksional yang membawa obat anti-jaringan parut 5-florouracil (5-FU) dalam sampel bekas luka manusia dan model bekas luka hipertrofik telinga kelinci. Dengan menggunakan pendekatan baru ini, kami berfokus pada peningkatan efisiensi pemberian obat anti-jaringan parut untuk mempersingkat proses perawatan bekas luka yang lama. Untuk pertama kalinya, model bekas luka hipertrofik telinga kelinci telah diterapkan untuk menentukan CO2 etosom skala nano yang dimediasi laser fraksional yang membawa 5-FU pada bekas luka hipertrofik dan efek penetrasi obat. Bersama-sama, telah disarankan bahwa CO2 laser fraksional yang dikombinasikan dengan obat topikal menyediakan metode terapi baru untuk bekas luka hipertrofik manusia.
Metode
Etosom Terenkapsulasi 5-FU
Metode Touitou [10] digunakan sebagai persiapan untuk etosom terenkapsulasi 5-FU. Distribusi ukuran partikel 25 °C dan indeks polidispersitas (PDI) ditentukan menggunakan penganalisis ukuran partikel laser (λ = 632,8 nm). PDI < 0.1 menunjukkan distribusi ukuran partikel yang merata, dan PDI> 0.3 menunjukkan distribusi ukuran partikel yang tidak homogen. Mikroskop elektron transmisi (TEM) digunakan untuk pengamatan morfologi etosom. Metode ultrasentrifugasi [29] digunakan untuk mengukur efisiensi enkapsulasi (EE) etosom dalam penelitian ini.
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Konsentrasi 5-FU dalam kompartemen reseptor sel Franz ditentukan oleh sistem HPLC Waters 2695 (Meadows Instrumentation, Illinois) dan detektor ultraviolet 2487 dengan kolom Diamonsil TM C18 fase terbalik (250 mm × 4.6 mm, 5 μm ). 5-FU terdeteksi pada 265 nm dengan fase gerak metanol–H2 O (5:95 v /v ) pada laju aliran 1 ml/menit. Data dianalisis berdasarkan luas puncak dan metode standar eksternal, menggunakan Sistem Pemberdayaan Perairan.
Mikroskopi Pemindaian Laser Confocal
Jaringan parut hipertrofik manusia dianalisis dengan mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM) dengan peningkatan 10 m. Intensitas fluoresensi dianalisis menggunakan Mikroskop Pemindaian Laser LSM 510 (Zeiss, Jena, Jerman) dengan lensa objektif aperture Fluar 10×, 0,5 numerik. Eksitasi optik dilakukan dengan laser HeNe 543-nm, dan emisi fluoresensi terdeteksi di atas 560 nm untuk rhodamin 6GO (Rho). Gambar dianalisis dengan perangkat lunak analisis gambar Release Version 4.0 SP2 untuk menghitung distribusi fluoresensi dan intensitas fluoresensi jaringan parut. Dalam 10 × 10 kali bidang pandang, ukuran dan distribusi nilai piksel untuk menentukan rentang penetrasi 5-FU EG (diberi label Rho) dan dengan metode semi-kuantitatif.
Uji Permeabilitas Etosom 5-FU pada Jaringan Bekas Luka Manusia
Spesimen bekas luka hipertrofik manusia dari Rumah Sakit Bedah Plastik yang Berafiliasi dengan Universitas Shanghai Jiaotong berasal dari eksisi bekas luka pada pasien dengan tiga kasus, semua wanita, berusia 21–35 tahun; bekas luka terletak di bahu dan punggung; perjalanan bekas luka hipertrofik dari 6 bulan hingga 1 tahun; integritas jaringan parut; tidak ada ulserasi; tidak ada lesi infeksi; dan bekas luka yang paling bawah juga harus lebih tinggi dari kulit, dan pasien belum menerima pengobatan apapun sejak sakit. Anestesi umum digunakan untuk menghilangkan efek anestesi lokal pada jaringan parut. Spesimen yang diperoleh segera dikeluarkan dari jaringan subkutan, dilindungi epidermis, dibuat dengan ketebalan 4,0 mm, luas sampel jaringan parut 3 cm × 3 cm, dicuci dengan saline pada suhu kamar, dikeringkan dengan kasa kering permukaan lembab, dibungkus dengan aluminium foil, dan disimpan dalam lemari es pada suhu 20°C. Jaringan parut hipertrofik manusia telah dibuang dan disimpan dalam freezer 20 °C sebelum digunakan. Jaringan parut hipertrofik manusia direndam dalam pH 7,4 PBS pada suhu 25 °C selama 2 jam, dan air pada permukaan jaringan dihilangkan secara perlahan dengan kain kasa kering. Semua daerah jaringan epidermis dari jaringan parut hipertrofik adalah CO2 laser fraksional disinari. Parameter laser segera diikuti oleh mode DeepFX, kepadatan energi 25 mj, cakupan 20%, frekuensi emisi 300 Hz, pada ukuran titik ke-10, dan tanpa tumpang tindih. Semua sampel yang diiradiasi dikumpulkan dengan menggunakan deteksi HPLC, untuk menentukan kandungan jaringan parut 5-FU. Bagian histopatologi segera digunakan untuk uji CLSM.
Model Bekas Luka Hipertrofik Telinga Kelinci
Metode model skar hipertrofi telinga kelinci dijelaskan secara singkat di bawah ini:12 ekor kelinci New Zealand white, jantan, dan berat 2 kg (SLAC, Shanghai) dikandangkan secara terpisah selama 2 minggu. Untuk anestesi kelinci, luminning dicampur dengan 1,5 mg ketamin per 100 g berat melalui injeksi intramuskular. Semua luka dikelilingi oleh titik pusat telinga kelinci. Setiap luka bundar dengan diameter 1 cm rusak, kemudian perikondrium diangkat. Dua puluh delapan hari setelah operasi, telinga kelinci mengelupas dari luka dan sembuh total, dengan diameter yang terlihat sekitar 0,9 cm bekas luka hipertrofik. Bekas lukanya berwarna merah cerah, ada benjolan di kulit di sekitar hiperplasia yang terlihat jelas, dan bekas lukanya tebal dan keras.
Penentuan Tarif Pembukaan Saluran Mikro
Titik waktu yang berbeda setelah CO2 perawatan laser fraksional pada model bekas luka hipertrofik telinga kelinci, fluoresensi merah Rodanmin 6GO dengan etosom diterapkan pada jaringan parut. Tiga jam kemudian, CLSM digunakan untuk penentuan laju pembukaan saluran. Tingkat pembukaan saluran =nomor saluran terbuka/(nomor saluran terbuka + nomor saluran tertutup) × 100%. Persentase tingkat pembukaan saluran mencerminkan efek CO2 efektivitas penetrasi laser fraksional.
Pewarnaan H&E
Umumnya kelinci dikorbankan menggunakan pentobarbital 10% i.v. injeksi (dosis 5 kali dosis normal untuk anestesi, 35 mg/kg). Segera lepaskan spesimen dan lanjutkan ke langkah pewarnaan H&E. Metode pewarnaan hematoxylin dan eosin sesuai dengan protokol pewarnaan standar H&E.
Indeks Elevasi Bekas Luka dan Penentuan Ketebalan Relatif
Dua puluh delapan hari setelah induksi skar hipertrofi telinga kelinci, empat kelompok intervensi dilakukan:Kelompok 5EL:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU dikombinasikan dengan CO2 laser fraksional; Grup 5E:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU; CO2 grup:CO2 perawatan laser fraksional; dan kelompok kontrol. Kami mendefinisikan A sebagai ketebalan bagian paling tebal dari jaringan parut hipertrofik telinga kelinci, dan B sebagai ketebalan 1,0 cm dari bagian paling tebal dari jaringan parut hipertrofik telinga kelinci (dekat dengan titik tengah). Ketebalan relatif dihitung dengan A/B. Hipertrofi bekas luka dermal diilustrasikan oleh SEI. SEI =area dermis yang baru terbentuk/area dermis yang tidak terluka. SEI> 1.5 menggambarkan bekas luka hipertrofik.
Statika
Semua percobaan diulang sebanyak tiga kali. Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS versi 19.0 (SPSS Inc., Chicago, USA). t Student siswa tes digunakan untuk menghitung signifikansi. *p nilai <0,05 dianggap signifikan secara statistik; **p nilai <0,01 dianggap sangat signifikan secara statistik; ***p nilai < 0,001 dianggap sangat signifikan secara statistik, dan ****p nilai < 0,0001 dianggap sangat signifikan secara statistik.
Hasil
Penilaian Kualitas Etosom yang Dienkapsulasi dengan 5-florouracil(5E)
Pertama-tama, untuk memvalidasi kualitas gel etosom yang dienkapsulasi dengan 5-florouracil (5E), morfologi dan diameter dideteksi dengan pengamatan mikroskop elektron transmisi (TEM). Etosom dalam keadaan suspensi membentuk lingkaran lengkap berukuran universal atau vesikel oval-bola, yang kurang dari 100 nm di bawah mikroskop (Gbr. 1a-b). Setelah formulasi gel, etosom tetap utuh (Gbr. 1c-d). Menggunakan penganalisis ukuran partikel laser, etosom dalam keadaan suspensi tampak dengan diameter 87,72 ± 9,27 nm, dan PDI adalah 0,10 ± 0,01. Sedangkan ukuran partikel etosom adalah 98,78 ± 10,88 nm, dan PDI 0,11 ± 0,02. Perbandingan statika menunjukkan bahwa ukuran partikel tidak memiliki perbedaan yang signifikan (p> 0,05). Selain itu, kedua PDI tidak memiliki perbedaan yang signifikan (p> 0,05). Selain itu, data yang diperoleh dari penganalisis ukuran partikel laser dan TEM menunjukkan hasil yang sebanding. Selain itu, efikasi jebakan (EE) juga ditentukan menggunakan metode ultrasentrifugasi (Tabel 1). Hasil penelitian menunjukkan bahwa EE suspensi etosom sebesar 10,47 ± 1,47%, dan EE gel etosom sebesar 11,56 ± 1,12% (n = 6), tanpa signifikansi (p> 0,05). Kesimpulannya, tidak ada perubahan morfologi dan ukuran partikel yang ditemukan pada keadaan suspensi dan keadaan gel dari etosom.
Gambar mikroskop elektron transmisi dari etosom 5-FU. Etosom larutan (a dan b ) dan etosom gel (c dan d )
CO2 Laser Fractional Meningkatkan Permeabilitas 5E Melalui Bekas Luka Hipertrofik In Vitro
Setelah evaluasi kualitas etosom yang dienkapsulasi dengan 5-florouracil (5-FU), kami mengeksplorasi permeabilitasnya pada bekas luka hipertrofik manusia dengan atau tanpa CO2 laser fraksional in vitro. Jaringan parut hipertrofik manusia disinari dengan CO2 laser fraksional dan kemudian 5E diterapkan secara merata. Konsentrasi kumulatif 5-FU ditentukan pada 1, 3, 6, 10, 16, dan 24 jam dengan HPLC ( 2). Kami membandingkan konsentrasi kumulatif CO2 5-FU2 laser fraksional yang dikombinasikan dengan etosom yang dienkapsulasi dengan kelompok 5-florouracil (5EL) dan kelompok 5E pada titik waktu yang berbeda. Pada 1 jam, konsentrasi kumulatif 5-FU kelompok 5EL adalah 4,15 ± 2.22 μg/ml/cm
2
, yang lebih tinggi dari konsentrasi kelompok 5E (0,73 ± 0,33 μg/ml/cm
2
, p < 0,001). Dalam pengobatan jangka panjang (24 jam), konsentrasi permeasi kumulatif 5-FU dari kelompok 5EL (107,61 ± 13,27 μg/ml/cm
2
) juga lebih tinggi dibandingkan kelompok 5E (20,73 ± 3,77 μg/ml/cm
2
, p < 0,0001). Pada titik waktu sebelumnya, 3, 6, 10, dan 16 jam, kelompok 5EL selalu menunjukkan konsentrasi permeasi kumulatif 5-FU yang lebih tinggi daripada kelompok 5E (Gbr. 2a). Selain itu, jumlah retensi 5-FU pada kelompok 5EL adalah 24,42 ± 4,37 μg/cm
2
, yang lebih tinggi dari grup 5E (12,45 ± 1,64 μg/cm
2
, p < 0.01, n = 6) (Gbr. 2b). Hasil ini menunjukkan bahwa CO2 iradiasi laser fraksional dapat secara signifikan mempromosikan 5-FU yang terkandung liposom melalui jaringan parut hipertrofik manusia dan membantu retensi 5-FU dalam jaringan parut hipertrofik in vitro.
CO2 laser fraksional meningkatkan permeabilitas 5E melalui bekas luka hipertrofik in vitro.a Perbandingan permeasi kelompok 5E dan 5EL dalam studi 24 jam pada bekas luka hipertrofik manusia secara in vitro. Nilai dinyatakan sebagai mean ± SD. n = 6. b Retensi akumulatif 5-FU di bekas luka hipertrofik in vitro setelah aplikasi selama 24 jam. n = 6. ***p nilai < 0,001 dianggap sangat signifikan secara statistik, ****p nilai < 0,0001 dianggap secara statistik sangat sangat signifikan
Kedalaman dan tingkat penetrasi 5-FU ditentukan menggunakan 5E berlabel Rho untuk mengevaluasi efek peningkatan penetrasi CO2 laser fraksional in vitro. Uji fluoresensi digunakan untuk menunjukkan intensitas kelompok 5E dan 5EL pada 1, 6, dan 24 jam setelah perlakuan 5-FU (Gbr. 3a). Hasil penelitian menunjukkan bahwa setelah 1 jam perlakuan 5EL, fluoresensi Rho tersebar di lapisan dangkal epidermis dan dermis, terutama di sekitar CO2 zona gasifikasi yang diinduksi laser fraksional. Sebaliknya, tanpa CO2 iradiasi laser fraksional, distribusi fluoresensi Rho terbatas pada area epidermis pada kelompok 5E. Setelah perawatan 6 jam pada kelompok 5EL, fluoresensi Rho meluas ke dermis dalam dan menunjukkan lebih banyak akumulasi. Meskipun distribusi fluoresensi kelompok 5E mulai muncul di dermis, intensitas fluoresensi menurun dari dermis ke epidermis secara bertahap. Setelah perawatan 24 jam, fluoresensi dua kelompok tersebar luas di seluruh jaringan kulit, tetapi intensitas fluoresensi pada kelompok 5EL secara signifikan lebih tinggi. Selanjutnya, perangkat lunak analisis gambar Release Version 4.0 SP2 digunakan untuk analisis kuantitatif untuk menghitung intensitas fluoresensi untuk kedua kelompok. Hasil analisis kuantitatif menunjukkan peningkatan intensitas fluoresensi Rho yang signifikan pada kelompok 5EL dibandingkan kelompok 5E (1 jam:59.61 ± 6.39 vs.6.39 ± 1.64, p < 0,0001; 6 j:163,32 ± 13,23 vs. 49,89 ± 4,01, p < 0,0001; 24 jam:270,36 ± 8,73vs. 148,25 ± 16,89, p < 0,0001) (Gbr. 3b). Singkatnya, CO2 iradiasi laser fraksional secara signifikan mendorong penetrasi 5E ke dalam jaringan parut hipertrofik manusia secara in vitro.
CO2 laser fraksional meningkatkan permeabilitas melalui bekas luka hipertrofik in vitro.a Fluoresensi merah diberi label etosom menembus jaringan parut hipertrofik setelah 1, 6, dan 24 jam in vitro. b Intensitas fluoresensi Rhodamin 6GO berlabel etosom pada jaringan parut hipertrofik in vitro setelah 1, 6, dan 24 jam. ****p nilai < 0,0001 dianggap secara statistik sangat sangat signifikan
Durasi CO2 Laser Fractional Meningkatkan Penetrasi 5-FU Di Vivo
Untuk mendapatkan bukti CO yang lebih substansial2 efek laser fraksional, kami melakukan penetrasi 5-FU in vivo menggunakan model bekas luka hipertrofik kelinci. Pengaturan model bekas luka hipertrofik kelinci digambarkan sebagai Metode. Titik waktu yang berbeda (3 jam, 6 j, 12 j, 24 jam, 3 hari, dan 7 hari) setelah penerapan CO2 laser fraksional, pengobatan 5E atau 5EL dilakukan dan distribusi fluoresensi ditentukan segera oleh CLSM (Gbr. 4). Fluoresensi Rho terlihat luas dan tersebar luas di lapisan dermis bekas luka hipertrofik telinga kelinci, yang lebih dekat ke zona ablatif (Gbr. 4a). Hasil ini mungkin menunjukkan Rho dicampur dengan 5E terutama menyusup melalui saluran berpori setelah CO2 radiasi laser fraksional. Fluoresensi dapat dideteksi di zona ablatif yang mengelilingi jaringan dermal setelah 6 jam 5EL, bahkan dengan area distribusi yang kecil (Gbr. 4b). Area distribusi fluoresensi terus menyusut 12 jam setelah perawatan obat, yang menunjukkan bahwa saluran mikro secara bertahap ditutup saat luka sembuh (Gbr. 4c). Setelah 24 jam, 3 hari, dan 7 hari pengobatan CO2 radiasi laser fraksional, fluoresensi hanya dapat ditemukan di dalam pori kerak di sekitar bukaan dan tidak ada penetrasi ke dalam dermis (Gbr. 4d-f), yang menunjukkan bahwa CO2 efek penetrasi laser fraksional telah menghilang dengan re-epitelisasi lengkap epidermis. Data kami menunjukkan bahwa pembukaan saluran mikro memainkan peran penting dalam penetrasi obat dengan pengobatan 5EL. Setelah itu, kami menghitung kecepatan pembukaan saluran mikro masing-masing 3 jam, 6 jam, 12 jam, 24 jam, 3 hari, dan 7 hari setelah penyinaran laser. Pada titik waktu 3 dan 6 jam, semua saluran berpori mikro terbuka, yang menunjukkan tingkat pembukaan saluran mikro adalah 100%. Laju pembukaan saluran mikro mulai diturunkan menjadi 90,59% pada 12 jam dan 15,58% pada 24 jam. Secara khusus, saluran mikro semua ditutup pada 3 dan 7 hari setelah perawatan 5EL. Secara keseluruhan, hasil ini menunjukkan bahwa CO2 laser fraksional mengontrol penetrasi obat di jaringan parut hipertrofik kelinci in vivo.
CO2 laser fraksional mempromosikan tingkat pembukaan saluran mikro in vivo. Fluoresensi merah diberi label ethosomes menembus jaringan parut hipertrofik telinga kelinci 0 h (a ), 6 j (b ), 12 j (c ), 24 jam (h ), 3 hari (e ), dan 7 hari (f ) setelah CO2 perawatan laser fraksional in vivo
Pengaruh Terapi 5EL Terhadap Bekas Luka Hipertrofik Pada Vivo
Untuk memahami secara mendalam perawatan 5EL, kami melakukan penentuan ketebalan relatif bekas luka hipertrofik telinga kelinci. Setelah pengaturan model bekas luka hipertrofik telinga kelinci, nilai ketebalan relatif sebelum dan sesudah perawatan 5EL dihitung. Tidak ada perbedaan signifikan yang ditemukan pada kelompok sebelum perlakuan. Namun, ketebalan relatif kelompok 5EL adalah 1,27 ± 0,15, yang secara signifikan lebih rendah dari kelompok 5E (1,52 ± 0,10, p < 0,05) dan tidak diobati (1,61 ± 0,15, p < 0,0001) grup (Gbr. 5). Menariknya, tidak ada perubahan signifikan antara CO2 kelompok perawatan laser saja dan kelompok 5EL. Data ini menunjukkan bahwa CO2 laser fraksional memainkan peran dominan dalam menyembuhkan bekas luka hipertrofik telinga kelinci secara in vivo.
Perbandingan ketebalan relatif jaringan parut hipertrofik kelinci sebelum dan sesudah diberikan perlakuan yang berbeda. 5EL:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU yang dikombinasikan dengan CO2 laser pecahan, n = 14; CO2 :CO2 laser fraksional saja, n = 12; Grup 5E:gel entosom yang dikemas dengan 5-FU, n = 14; kontrol:kosong, n = 16. *p nilai < 0,001 dianggap signifikan, ****p nilai < 0,0001 dianggap secara statistik sangat sangat signifikan
Kami juga membandingkan morfologi skar hipertrofi telinga kelinci untuk mengetahui perbedaan penggunaan CO2 laser pecahan. Pada kelompok 5EL, bekas luka hipertrofik menjadi rata dan warna secara signifikan berubah menjadi merah muda terang (Gbr. 6a-b). Dalam CO2 pengobatan laser fraksional saja, ketebalan bekas luka hipertrofik menurun sampai batas tertentu dan warnanya berubah menjadi merah pucat (Gbr. 6c-d). Pada kelompok 5E, ketebalan parut hipertrofik sedikit menurun tetapi warnanya tetap merah cerah (Gbr. 6e-f). Akhirnya, tidak ada perubahan signifikan pada kelompok yang tidak diobati dibandingkan dengan sebelum pengobatan (Gbr. 6g-h). Selanjutnya, pewarnaan H&E digunakan untuk analisis patologis dalam 7 hari setelah perawatan untuk keempat kelompok ini pada jaringan parut hipertrofik telinga kelinci (Gbr. 7). Grup 5EL dan CO2 kelompok pengobatan laser fraksional saja menunjukkan penurunan ketebalan lapisan dermal dari bekas luka hipertrofik dan kerak seperti titik dengan serat kolagen dermis superfisial yang jarang berbentuk nodular atau susunan berbentuk spiral (Gbr. 7a-b). Sejumlah besar penetrasi serat kolagen dermal, susunan serat kolagen yang tidak teratur, dan susunan nodular atau spiral superfisial dermis ditemukan pada kelompok 5E dan kelompok yang tidak diobati (Gbr. 7c-d). Metode evaluasi penting lainnya untuk bekas luka hipertrofik adalah indeks elevasi bekas luka (SEI). Mirip dengan pola ketebalan relatif, SEI kelompok 5EL (1,16 ± 0,08) dan CO2 kelompok perawatan laser fraksional saja (1,22 ± 0,10) secara signifikan menurun dibandingkan dengan kelompok 5E (1,32 ± 0,13) dan kelompok yang tidak diobati (1,49 ± 0,08) (Gbr. 8). Secara keseluruhan, analisis morfologi dan data perhitungan SEI menunjukkan CO2 fungsi laser fraksional pada penyembuhan bekas luka hipertrofik telinga kelinci secara in vivo.
Pencitraan fotografi bekas luka hipertrofik kelinci sebelum dan sesudah menerapkan perawatan yang berbeda selama 7 hari. Kelompok 5EL:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU yang dikombinasikan dengan CO2 laser fraksional, sebelum (a ) dan setelah (b ) pengobatan selama 7 hari; CO2 grup:CO2 laser fraksional, sebelum (c ) dan setelah (d )perawatan selama 7 hari; 5E grup B:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU, sebelum (e ) dan setelah (f ) pengobatan selama 7 hari; dan grup kosong:kosong, sebelum (g ) dan setelah (h ) perawatan selama 7 hari
Analisis histologis H&E bekas luka hipertrofik kelinci setelah menerapkan perawatan yang berbeda selama 7 hari. Kelompok 5EL:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU yang dikombinasikan dengan CO2 laser pecahan (a ); CO2 grup:CO2 perawatan laser fraksional (b ); Grup 5E:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU (c ); dan grup kosong:kosong (d ). Perbesaran asli:× 40
Perbandingan SEI bekas luka hipertrofik kelinci setelah diberikan perlakuan yang berbeda selama 7 hari. 5EL:gel entosom yang dienkapsulasi dengan 5-FU yang dikombinasikan dengan CO2 laser pecahan, n = 14; CO2 :CO2 laser pecahan, n = 12; 5E:gel entosom yang dikemas dengan 5-FU, n = 14; kontrol:kosong, n = 16. ***p nilai < 0,001 dianggap sangat signifikan secara statistik dan ****p nilai < 0,0001 dianggap secara statistik sangat sangat signifikan
Diskusi
Perawatan obat adalah pendekatan pengobatan utama, terutama topikal atau sebagai suntikan lokal, untuk pengobatan non-bedah bekas luka hipertrofik. Karena efek samping dari berbagai obat, injeksi lokal seringkali terbatas pada dosis kecil dan dengan demikian hanya memungkinkan pengobatan dalam kisaran kecil. Juga, karena waktu paruh obat yang pendek, konsentrasi tinggi yang persisten di bekas luka memerlukan suntikan berulang [6, 30, 31]. In addition, because of the scar tissue is very concentrated and with severe pain during injections is often experienced, patients often do not accept for treatment. Although external drug usage having advantage of being convenient, painless, with long-term stability, low side effects, avoiding to affection of the gastrointestinal environment [7, 8], there are several limitations. First of all, topical and injected drugs availability is limited by special pathological scar tissue structure, which presents with a thickening of the stratum corneum and hyperplasia of the dermis, which hinders the penetration of the drug and achieving an effective therapeutic concentration. Recent reports have proven this and described how external use of drugs inefficiently penetrates the scar tissue [4, 9]. Ethosomes, proposed by Touitou et al. [10] in 2000 as a transdermal drug carrier, have been widely reported [11, 12, 32]. In this study, we improved the ethosomes preparation process to nano-level (particle size 70~90 nm). This change of a new nanoscale dimensions and the spatial conformation of the ethosomes allow them to penetrate into the scar tissue through a narrowly tightly connected cell gap not only due to the small size, but also by the similarity to the cell membrane of scar tissue cells. Based on such penetration mechanisms, ethosomes become a convenient transdermal drug carrier [14, 33, 34]. However, the anti-scar drug 5-FU encapsulated with ethosomes is mainly concentrated in the epidermis and dermis, which is not conducive to fibroblasts in deeper layers of the dermis. Therefore, our purpose is to explore a method that would allow to increase the penetration of drugs and would promote the uniform dispersion of drugs in scar tissue.
So far, commonly used methods to promote the penetration are divided into two categories:the promotion of chemical substances and physical methods to enhance permeability. The physical enhancement techniques include electroporation, iontophoresis, laser, microdermabrasion, microneedle, pressure, radiofrequency induction, and sonography [35]. There are many different types of lasers that have been shown to promote percutaneous administration, and ablative fractional lasers become the most popular laser in recent years for promoting drug penetration into the skin [20]. Ablative fractional laser can not only extremely reduce drug dosage, but also be conducive to drug penetration into deep skin and achieve high local concentrations to obtain a therapeutic effect. CO2 fractional laser, Erbium-doped Yttrium Aluminum Garnet (Er:YAG) fractional laser, and Erbium-doped Yttrium Scandiu Gallium Garnet (Er:YSGG) fractional laser can produce ablative zone or microporous channels on the surface of the skin. Compared with Er:YAG fractional laser (2940 nm wavelength) and Er:YSGG fractional laser (2790 nm wavelength), CO2 fractional laser (10,600 nm wavelength) has lower water absorption coefficient, larger thermal damage, and greater destruction effect of stratum corneum of the epidermis, which is more conducive to promote penetration effect [36].
In this study, 5-FU retention in the 5EL group (24.42 ± 4.37 μg / cm
2
) was significantly higher than in the 5E group (12.45 ± 1.64 μg/cm
2
) in scar tissue of 24 h treatment in vitro. Additionally, in Rho-labeled assay, 5EL group has shown higher fluorescence intensity than 5E group at 1-, 6-, and 24-h treatment time points. Image analysis showed that fluorescence can be found distributed in the gasification zone and surrounding dermal tissue matrix after 1-h CO2 laser treatment in the 5EL group, and the fluorescence in 5E group is only distributed in the epidermis. After 6- and 24-h treatment, diffuse fluorescence range is wider and fluorescence intensity is higher in the 5EL group than in the 5E group. CO2 fractional laser-induced gasification zone provided an effective way for drug penetration through the skin scar tissue, enlarge range of dermis penetration depth, and retention content in scar tissue. There are three different forms of thermal effect damage by CO2 fractional laser acting on the skin or scar tissue, from center to outliner, the gasification zone, thermal coagulation necrosis zone, and thermal denaturation zone [37]. Fluorescence data showed that Rho fluorescence was distributed from more concentrated gasification zone to diffused tissue, suggesting that there is no effect for permeation of drugs in thermal coagulation necrosis zone and thermal denaturation zone, which also confirmed the feasibility of CO2 fractional laser for the promotion of topical anti-scarring drug penetration. Together, CO2 fractional laser is conducive to more anti-scarring drugs 5-FU retention in scar tissue and achieve high drug concentration required to strengthen the anti-scarring effect.
The duration of CO2 fractional laser enhancing 5E was evaluated by CLSM on rabbit ear hypertrophic scar in vivo. The opening rates of microporous channels for drug permeation were 100% (0 h), 100% (6 h), 90.59% (12 h), and decreased to 15.58% (24 h) after CO2 fractional laser treatment of hypertrophic scar. Moreover, microporous channel opening rates dropped to zero on 3 and 7 days, and the drug can no longer penetrate into the skin through these channels. These results were consistent with that of epidermal re-epithelialization after ablative fractional laser irradiation, which is the skin wound around the keratinocytes to the wound defect migration and proliferation, covering the wound to form a complete layer of cells formed by the epidermis. When the dermal layer of skin was wound, the repair process will immediately start and quickly rebuild the skin barrier [38, 39]. The whole skin tissue trauma repair process can be divided into four continuous and overlapping steps:coagulation, inflammation, re-epithelialization, and remodeling [40]. Human skin after ablation of the fractional laser irradiation injury area (including the gasification area and coagulation necrosis area) complete epidermal re-epithelialization in 2 to 3 days and dermal remodeling for at least 4 weeks [41]. Thus, although the lesion in the dermis does not heal within 24 h after the CO2 laser treatment, the epidermis has completed the complex epithelization, including the formation of the stratum corneum, where the topical drug could not penetrate through channels. Taken together, epidermis, especially the stratum corneum, is still the main barrier for drug penetration through the skin.
In addition, our CLSM data showed both in in vitro human hypertrophic scar skin and in vivo rabbit ear hypertrophic scar skin, Rho-labeled 5E can penetrate the necrotic coagulation layer and the formation of crust on the surface after the CO2 fractional laser irradiation. It suggested that the skin under the crust but not the coagulation necrotic layer and crust tissue can impede the penetration of drug. Therefore, 24 h is the critical time-point for the effect of CO2 fractional laser on the penetration effect of hypertrophic scar in rabbits.
It has been reported that the clinical application of exfoliative fractional laser is an effective method to treat various skin diseases (such as solar keratosis, basal cell carcinoma, Bowen’s disease, etc.) [25,26,27,28]. However, the clinical efficacy of CO2 fractional laser in combination with drugs has not been explored in the treatment of hypertrophic scars [42, 43]; in particular, there are no reports of combined CO2 fractional laser (physical technique) with anti-scar drug nano-level ethosomes (chemical substances promoting scar penetration) for the treatment of hypertrophic scars. Using in vivo study, we performed a rabbit hypertrophic scar model for validation of CO2 fractional laser protocol. On the seventh day after intervention, the relative thickness of the four groups of hypertrophic scar was measured:experimental group (CO2 fractional laser combined with 5-FU EG):1.27 ± 0.15 2 fractional laser irradiation only):1.35 ± 0.09 2 fractional laser had a leading role in the intervention of hypertrophic scars. This finding was mainly manifested in three aspects. First of all, CO2 fractional laser generated micro-channels for the promotion of scar drugs penetration. Secondly, CO2 fractional laser itself could help in hypertrophic scar tissue’s collagen remodeling. Thirdly, 5E itself could directly influence hypertrophic scars. From H&E staining data, we found that processes of collagen fiber bundle remodeling, from disordered, different-direction collagen fibers into a consistent, paralleled direction collagen beam take place. In the experimental group of rabbit ear hypertrophic scar, there was a significant reduction in scar thickness, but also color change of hypertrophic scar, from bright red to light red, which may be induced by vascular proliferation of the scar tissue.
The toxicity of the ethosomes should be a big concern in this study. Nevertheless, after reviewing literature, there are no results exhibiting the toxicity of ethosomes in vitro or in vivo study [44,45,46]. The permeability mechanism of ethosomes is mainly as follows:high concentration of ethosomes, the flexibility, and fluidity of ethanol liposome membrane, makes ethosomes deform in the process of transmission, and enhances the permeability in scar tissue [47].
Although the difference between the experiment group and control group A was not statistically significant, the relative thickness and SEI of the experimental group was smaller than that in the control group A. Both groups were treated with CO2 fractional laser, with or without 5E. This finding suggests that CO2 fractional laser may have the dominant role, which overtakes the minor effect of 5E drug in the final anti-scar effect.
Conclusion
CO2 fractional laser can rapidly and significantly promote 5-fluorouracil encapsulated ethosomes’ permeability through hypertrophic scars in vitro. CO2 fractional laser is a potentially efficient method of promoting drug permeation in hypertrophic scars’ treatment. Our hypertrophic scar model (rabbit) showed that CO2 fractional laser combined with external-loaded 5-fluorouracil encapsulated ethosomes can effectively cure hypertrophic scars. Also, CO2 fractional laser itself can facilitate collagen remodeling in hypertrophic scar of rabbit ears. CO2 fractional laser can significantly promote the permeation of 5-fluorouracil encapsulated ethosomes, but the effect begins to relinquish 24 h after CO2 fractional laser irradiation, which indicates that 24 h is a critical period.
