Kinetika dan Spesifisitas Serapan Vesikel Ekstraseluler HEK293T menggunakan Imaging Flow Cytometry
Abstrak
Vesikel ekstraseluler (EVs) adalah vesikel terikat lipid bilayer berukuran nano yang secara alami disekresikan dari sebagian besar jenis sel sebagai mekanisme komunikasi untuk mengirimkan protein, lipid, dan materi genetik. Terlepas dari potensi terapeutik EV, ada informasi terbatas tentang kinetika dan spesifisitas serapan EV. Di sini, kami mengoptimalkan platform berbasis imaging flow cytometry (IFC) untuk menilai dosis, waktu, dan efek spesifisitas sel penerima secara kuantitatif pada internalisasi EV sel ginjal embrionik manusia (HEK293T) dengan cara throughput tinggi. Kami menemukan bahwa penyerapan HEK293T EV adalah proses aktif yang bergantung pada dosis dan waktu. Selanjutnya, selektivitas penyerapan EV diukur in vitro , dan kami menemukan bahwa HEK293T EV diinternalisasi dalam jumlah yang lebih tinggi oleh sel dari asal yang sama. Terakhir, sel punca saraf menginternalisasi lebih banyak HEK293T EV secara signifikan dibandingkan dengan neuron dewasa, menunjukkan bahwa sel punca atau nenek moyang, yang lebih aktif secara metabolik daripada sel yang terdiferensiasi secara terminal, mungkin memiliki tingkat internalisasi EV aktif yang lebih tinggi. Karakterisasi penyerapan EV, terutama spesifisitas, ketergantungan dosis dan waktu, dan uji kinetik akan membantu menginformasikan dan mengembangkan terapi berbasis EV yang ditargetkan dan efisien.
Pengantar
Penelitian vesikel ekstraseluler adalah bidang yang sedang berkembang karena utilitas terapeutik dan diagnostik dari vesikel ekstraseluler alami dan rekayasa (EV). EV berkisar dari 50 hingga 1000 nm dengan diameter, diproduksi dari semua jenis sel, dan diperkaya dengan protein transmembran, termasuk CD63, CD81, dan CD9; lemak; protein; dan DNA, RNA, mRNA, dan microRNA [1,2,3,4,5]. Konten EV, terutama mRNA dan miRNA aktif, telah terlibat dalam modulasi sel penerima melalui translasi de novo dan regulasi pasca translasi sel target [4, 6]. Memahami dan kemudian memodifikasi penyerapan dan internalisasi EV kinetik pada akhirnya akan mengarah pada pengiriman konten EV yang dioptimalkan ke sel target dengan konsentrasi yang cukup tinggi untuk mendapatkan manfaat terapeutik.
Pernah dianggap sebagai "sampah sel", EV telah dimanfaatkan sebagai alternatif terapi sel karena banyak keuntungan termasuk biokompatibilitasnya, imunogenisitas dan toksisitas rendah, kemampuan untuk dosis berulang, berbagai rute pemberian, dan potensi untuk memberikan obat. dan terapi genetik [3]. Kelompok kami sebelumnya telah melaporkan efek positif dari EV yang diturunkan dari sel punca saraf pada stroke dan cedera otak traumatis. Pada model stroke murine dan babi, EV meningkatkan jaringan dan pemulihan fungsional pasca stroke [3, 7, 8]. Kami juga telah menunjukkan EVs menjadi neuroprotektif dengan manfaat fungsional dalam model cedera otak traumatis hewan pengerat [9]. Terlepas dari efek yang diamati dan potensi EV di masa depan, ada sedikit pemahaman tentang spesifisitas dan kinetika serapan EV, yang dapat menghambat penerjemahan terapi EV ke dalam klinik.
EVs juga telah direkayasa sebagai vektor transferensi dan sarat dengan agen terapeutik termasuk terapi gen dan senyawa kimia sebagai alternatif terapi nanopartikel dan vektor pengiriman [4, 10,11,12]. Sel HEK293T telah banyak digunakan sebagai sel penghasil EV karena proliferasinya yang cepat, hasil EV yang tinggi, dan kemudahan manipulasi genetik [13,14,15,16,17]. HEK293T EVs memberikan terapi gen termasuk terapi miRNA untuk kanker payudara [12] dan telah digunakan untuk memberikan kemoterapi dan konstruksi protein terapeutik dalam model schwannoma [18]. Mirip dengan studi nanopartikel sintetis yang menilai sitotoksisitas in vitro, uji toksisitas MTT menunjukkan toksisitas rendah dari HEK293T EV yang diturunkan dan sitotoksisitas tinggi berikutnya ketika dimuat dengan kemoterapi [10, 18,19,20,21]. Karena pemanfaatan HEK293T EV yang melimpah ini, kami menganalisis kinetika dan spesifisitasnya dalam penelitian ini.
Penyerapan selektif atau spesifik mengacu pada kemampuan alami EV untuk menargetkan jenis sel tertentu. Ada banyak bukti tentang mekanisme internalisasi EV dengan sedikit konsensus tentang spesifisitas serapan [22]. Seringkali EV menunjukkan penyerapan selektif oleh sel penerima yang sama dengan sel induknya, sel epitel menginternalisasi lebih banyak EV yang diturunkan dari epitel daripada sel penerima lainnya [23, 24], dan sel punca mesenkim (MSC) menginternalisasi EV turunan MSC dalam jumlah yang jauh lebih besar dibandingkan dengan garis sel lainnya secara in vitro [24]. Namun, penelitian lain menemukan bahwa EV diinternalisasi oleh semua jenis sel dan menampilkan biodistribusi non-selektif ketika diberikan in vivo [22, 25]. Terlepas dari potensi terapeutik dan minat EV yang sangat besar, ada kekurangan dalam pemahaman tentang spesifisitas penyerapan EV. Dengan lebih memahami spesifisitas penyerapan EV, kita dapat dengan tepat memilih sel produsen EV yang secara selektif diinternalisasi oleh sel penerima yang diinginkan dan dengan demikian meningkatkan penerapan terapeutik EV.
Alasan potensial untuk hasil penyerapan EV yang bertentangan adalah kurangnya standarisasi dalam platform pengukuran, termasuk analisis efek dosis dan waktu. Baru-baru ini, sekelompok ahli International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) merilis makalah posisi yang menekankan perlunya analisis dosis dan waktu, di antara faktor-faktor pengganggu lainnya pada penyerapan EV [26]. Kelompok tersebut menyatakan bahwa "satu dosis tidak cocok untuk semua" dan dosis tersebut dapat mempengaruhi penyerapan atau selektivitas EV [26]. Meningkatkan dosis HEK293T EVs menggeser pola biodistribusi in vivo [27]. Profil serapan EV serum yang diturunkan secara signifikan diubah oleh dosis [28]. Selain itu, waktu inkubasi bersama EV dengan sel penerima mulai dari 15 menit hingga 48 jam [24, 29,30,31,32,33] dapat mengubah pengukuran serapan. Jika diadopsi oleh peneliti dan industri EV, proses yang dapat diukur dan andal untuk menentukan dosis standar dan kurva waktu untuk membantu mengidentifikasi dosis efektif minimum dapat menghasilkan studi yang lebih kuat dan bermanfaat.
Sebelumnya, para peneliti telah menggunakan sitometri aliran standar bersama dengan berbagai bentuk mikroskopi throughput rendah termasuk mikroskop confocal untuk menganalisis serapan EV [32,33,34]. Namun, teknologi ini memiliki beberapa keterbatasan. Mikroskop confocal dapat memakan waktu dan subjektif. Sitometer aliran tradisional telah dirancang untuk mengukur partikel biologis dalam kisaran seluler, tidak dapat membedakan EV swarm atau kebetulan, dan telah meningkatkan kebisingan karena memicu [35,36,37,38]. Seperti disebutkan oleh kelompok ISEV, ada kesadaran yang berkembang akan keterbatasan fisik dari flow cytometry tradisional dan menyoroti permintaan untuk flow cytometry khusus dengan batas deteksi dalam kisaran 100 nm [26, 38]. Imaging flow cytometry (IFC) menggabungkan sifat kuantitatif throughput tinggi dari flow cytometry bersama dengan teknologi pencitraan fluoresensi yang dapat menyelesaikan partikel fluoresen kecil, hingga diameter 100 nm [38]. Kemampuan IFC menghasilkan noise/latar belakang yang rendah, penurunan swarming, dan perangkat berpasangan yang terisi daya untuk kejernihan gambar [37, 39]. Karakteristik ini membantu dalam mengembangkan strategi gating untuk mengkarakterisasi EV dan penyerapan dengan konfirmasi visual dengan cara throughput tinggi sebagai platform penyerapan EV yang akurat dan dapat diukur [36, 37, 40].
Dalam penelitian ini, sel HEK293T yang mengekspresikan CD63-eGFP digunakan sebagai garis sel donor untuk produksi EV karena penggunaannya yang umum dalam pengembangan terapeutik. EV fluoresen yang diisolasi dikultur bersama dengan garis sel penerima termasuk sel saraf dan endotel. Serapan dikuantifikasi menggunakan IFC, menghasilkan platform standar untuk mengukur serapan EV kinetik yang penting dan fitur internalisasi untuk sistem sel in vitro. Lebih lanjut, kami menyediakan data tentang proses untuk mengukur serapan EV fluoresen dalam kondisi berbeda dan garis sel yang dikultur untuk menjelaskan penyerapan EV selektif.
Bahan dan Metode
Budaya Sel
Sel ginjal embrionik manusia (HEK293T) dibeli dari ATCC dan dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi, penisilin 100 U/mL, dan streptomisin 100 μg/mL. Sel induk saraf manusia (hNSC), sel saraf SH-SY5Y, sel epitel hati C3A, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC), dan neuron semuanya dikultur dalam kondisi standar pada 37 °C, 5% CO2 sebelum tes penyerapan vesikel ekstraseluler.
Pelabelan dan Isolasi EV
DNA plasmid CD63-eGFP diperoleh dari Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 adalah hadiah dari Paul Luzio (Addgene plasmid #62964). Sel HEK293T dikultur hingga 70% pertemuan dalam piringan 10 cm, dan DNA plasmid 10 μg ditransfeksi menggunakan Lipofectamine 2000 sesuai dengan instruksi pabrik. Dua puluh empat jam pasca transfeksi, media diubah menjadi media HEK293T standar tanpa serum janin sapi dan dikumpulkan selama 3 hari berturut-turut. Seperti dijelaskan sebelumnya [3], media HEK293T disaring melalui filter 0,22-μm dan diperkaya dengan ultrafiltrasi menggunakan unit filter sentrifugal Amicon selulosa regenerasi 100-kDa dan dicuci dua kali dengan PBS++. EV dikonsentrasikan hingga 1 mL, dan konsentrasi serta distribusi ukuran diukur pada Nanosight NS300 oleh protokol pabrikan (Malvern, UK). EV diisolasi dari wadah kultur HEK293T yang berbeda, setiap wadah dianggap sebagai ulangan biologis terpisah, dengan tiga ulangan teknis dalam setiap ulangan biologis (total minimal sembilan sampel untuk setiap kondisi).
Uji Serapan
Garis sel penerima diunggulkan pada pertemuan 60% dalam pelat 6-sumur selama 24 jam di bawah kondisi kultur standar pada 37 ° C. Media standar diubah menjadi media bebas serum janin sapi (FBS−) sebelum kultur bersama vesikel ekstraseluler. EV bertanda protein fluoresen hijau (GFP) diberikan ke sel pada berbagai dosis dan titik waktu. Setelah kultur bersama, sel disuspensikan kembali dalam 5% tripsin dan dipekatkan menjadi sekitar satu juta sel per 50 μL untuk flow cytometry. Tiga puluh tujuh derajat Celcius adalah standar untuk eksperimen penyerapan EV dalam pengujian kami karena telah menjadi standar yang digunakan untuk kultur sel dan platform penyerapan EV in vitro [31, 41,42,43,44].
Pengujian Inhibitor
Uji Dingin
EV dikultur bersama dengan sel penerima pada suhu 4 °C untuk secara efektif “menghentikan” pertumbuhan kultur sel dan menghambat proses aktif [45]. Empat derajat Celcius menghambat semua bentuk aktif penyerapan EV [31, 41,42,43,44].
Pengujian Tetap
Sel penerima difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 30 menit di atas es dan dicuci dengan PBS segera sebelum kultur bersama dengan EV untuk menghambat semua bentuk aktif penyerapan EV.
Akuisisi ImageStreamX
Akuisisi dilakukan pada ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) menggunakan perangkat lunak INSPIRE. Minimal 5.000-10.000 peristiwa sel diperoleh. Setiap sampel biologis direplikasi dalam tiga sumur ulangan teknis dan diperoleh secara individual di BEI. Gambar bidang terang dikumpulkan pada saluran satu dan pencar samping (785 nm) pada saluran enam. Protein fluoresen hijau (GFP) dieksitasi oleh laser argon 488 nm pada 200 mW, dan fluoresensi dikumpulkan pada saluran dua (480-560 nm). Pembesaran 60× digunakan pada setiap sampel bersama dengan tingkat perolehan rendah untuk sensitivitas tinggi.
Analisis IDEAS
Analisis data dan gambar dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak IDEAS (Luminex). Strategi gating adalah sebagai berikut:
1.
Gerbang fokus ditentukan untuk menghilangkan sel yang tidak berada di bidang fokus menggunakan nilai Gradient RMS.
2.
Sel-sel fokus digerbang untuk menghilangkan doublet dan puing-puing menggunakan bidang cerah area vs. rasio aspek bidang cerah. Data terjaga keamanannya digunakan untuk membuat histogram dan menghasilkan referensi statistik yang mengukur intensitas fluoresensi (jumlah semua piksel dalam suatu gambar), intensitas piksel maksimum (intensitas piksel paling terang dalam suatu gambar), bersama dengan nilai penghitungan titik melalui algoritme internal untuk setiap sampel. Fitur penghitungan titik dihasilkan menggunakan IDEAS Wizards yang berlaku. Jumlah titik, intensitas rata-rata, dan rasio piksel maksimum dihitung dengan rumus (Nilai keluaran dengan EV/Nilai keluaran tanpa EV).
Statistik
Semua data kuantitatif dianalisis melalui GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) dan dilakukan dalam rangkap tiga. Data disajikan sebagai mean ± standard error of mean (SEM). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan T . yang tidak berpasangan uji atau analisis varians satu arah (ANOVA) dengan beberapa perbandingan post hoc Tukey atau Dunnett dibandingkan dengan kontrol bila sesuai. p < 0,05 dianggap signifikan.
Untuk menghasilkan EV berlabel fluoresensi untuk menganalisis kinetika dan penyerapan vesikel ekstraseluler, sel HEK293T ditransfusikan dengan plasmid yang membawa protein fusi CD63-eGFP. CD63 adalah protein tetraspanin yang umumnya diperkaya dalam membran eksosom sehingga menjadikannya target optimal untuk penandaan fluoresen EV [46, 47]. Media bekas dikumpulkan dari kultur sel HEK293T, dan EV diisolasi seperti yang dilaporkan sebelumnya [8]. Kami membandingkan ukuran dan distribusi EV yang diisolasi dari sel HEK293T yang ditransfeksi CD63-eGFP dengan sel HEK293T yang tidak ditransfeksi. Kontrol dan CD63-eGFP-transfected HEK293T EVs menampilkan diameter rata-rata rata-rata 110,28 nm dan 103,616 nm, masing-masing, yang diukur dengan perangkat lunak pelacakan nano (Gbr. 1a), yang konsisten dengan ukuran HEK293T EV yang dilaporkan [13, 15, 27 , 48]. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam diameter median (p = 0,1615) dan distribusi (p = 0,4225 EV yang diisolasi dari sel HEK293T yang tidak ditransfeksi dan CD63-eGFP-transfeksi diamati. Pelabelan eGFP tidak mengubah ukuran EV HEK293T (Gbr. 1b).
Karakterisasi EV HEK293T yang ditandai dengan CD63-eGFP. EV diisolasi dari HEK293T (kontrol) dan HEK293T yang mengekspresikan media kultur sel CD63-eGFP. a Distribusi ukuran EV yang representatif direkam melalui perangkat lunak pelacakan nano. b Kuantifikasi distribusi diameter rata-rata dari EV HEK293T yang ditransfeksi vs. yang tidak ditransfeksi. c Gambar IFC dari manik-manik kontrol negatif, EV kontrol HEK293T, dan EV bertanda CD63-eGFP. BF menandakan bidang terang, GFP menandakan protein fluoresen hijau (laser eksitasi 488 nm), dan SSC menandakan hamburan samping. EGFP positif di saluran GFP menandakan EV HEK293T berpendar. d Ekspresi penanda permukaan MACSPlex berbasis sitometri dari EV HEK293T yang tidak ditransfeksi dan EV HEK293T CD63-eGFP. Kedua sumber EV positif untuk CD29, CD9, CD63, dan CD81, sebagaimana diukur dalam fluoresensi relatif (dilambangkan dengan X untuk positif). Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; uji T tidak berpasangan. n.s. menandakan p> 0,05
Uji IFC dilakukan untuk menentukan apakah CD63-eGFP dikaitkan dengan EV. Sebagai kontrol negatif fluoresen, manik-manik 1,34 μM dalam larutan buffer (Gbr. 1 c, atas) tidak memiliki fluoresensi ketika terkena panjang gelombang eksitasi 488-nm, tetapi terlihat di bidang terang (BF) dan hamburan samping (SSC). EV HEK293T yang tidak ditandai negatif pada BF, GFP, dan SSC, menunjukkan ukuran kecil di bawah ambang BF dan kurangnya fluoresensi (Gbr. 1d, tengah). Tidak adanya di BF menandakan ukuran EV lebih kecil dari 300 nm, yang menunjukkan swarming minimal EV. Terakhir, EV yang ditandai CD63-eGFP negatif di BF dan positif di saluran GFP yang menandakan fluoresensi positif dari EV HEK293T (Gbr. 1c, bawah). Sinyal positif di saluran GFP mungkin menunjukkan EV tunggal atau sekelompok EV fluoresen. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa EV HEK293T yang diisolasi memiliki ukuran standar dan profil penanda protein yang konsisten dengan laporan eksosom HEK293T sebelumnya, dan pelabelan eGFP tidak mengubah ukuran HEK293T EV [5, 27].
Menggunakan metode berbasis aliran sitometri yang tersedia secara komersial untuk mengukur penanda EV umum, kami menentukan profil tetraspanin EV secara keseluruhan [5]. EV HEK293T yang diisolasi dari kontrol dan sel HEK293T yang mengekspresikan CD63-eGFP positif untuk penanda EV standar termasuk CD9, CD63, dan CD81 yang diukur dalam unit fluoresensi relatif (Gbr. 1d). Seperti yang dilaporkan sebelumnya, CD29 juga ditemukan pada permukaan HEK293T EVs dan CD63-eGFP-transfected HEK293T EVs [5]. Hasil ini menunjukkan bahwa metode isolasi dan penandaan untuk HEK293T EV menghasilkan EV dengan penanda eksosom HEK293T yang umum.
Serapan Aktif EV HEK293T
Dua tes internalisasi penghambatan dilakukan. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel penerima pada 4 ° C (dingin) atau dengan sel penerima yang sebelumnya difiksasi dengan paraformaldehyde (diperbaiki). Perlakuan tersebut menurunkan keberadaan EV berlabel eGFP dalam sel penerima dibandingkan dengan sel penerima yang dikultur bersama dengan EV dalam kondisi fisiologis (Gbr. 2a). Uji penghambatan dingin dan tetap mengurangi jumlah spot (dingin:p = 0.0127, diperbaiki:p = 0,0078), intensitas (dingin:p = 0.0105, diperbaiki:p = 0.0374), dan piksel maksimum (dingin:p = 0.0159, diperbaiki:p = 0,0149) sinyal fluoresensi dalam sel penerima tanpa perawatan, menunjukkan penghambatan penyerapan EV. Hasil ini menyimpulkan bahwa lokalisasi eGFP dan peningkatan parameter output menandakan bahwa EV HEK293T diinternalisasi untuk pengujian serapan berikut.
Tes penghambatan internalisasi EV. Sel HEK293T dikultur bersama dengan HEK293T EV dalam berbagai kondisi. Kontrol (37 °C) mengacu pada kultur bersama dalam lingkungan fisiologis 37 °C. Dingin mengacu pada budaya bersama dalam lingkungan 4 °C. Penghambatan tetap mengacu pada pengujian di mana sel-sel penerima diperbaiki PFA sebelum kultur bersama. a Gambar IFC representatif dari sel penerima. Kolom 1, BF, menandakan medan terang. Kolom 2, GFP, menandakan protein fluoresen hijau (laser eksitasi 488 nm), dan Kolom 3 menandakan penggabungan BF dan GFP. Kontrol menunjukkan GFP positif yang mewakili internalisasi EV. b –d Kuantifikasi uji penghambatan dibandingkan dengan kontrol melalui jumlah titik, intensitas fluoresensi rata-rata, dan piksel maksimum. Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey dibandingkan dengan kontrol. *p < 0,05; ***p < 0.01
Serapan EV HEK293T Tergantung Dosis
Untuk mengembangkan kurva dosis standar untuk platform IFC, EV HEK293T dikultur bersama dengan sel penerima HEK293T pada dosis yang meningkat mulai dari 0 hingga 20.000 EV per sel pada 37 °C. Gambar IFC representatif menunjukkan peningkatan visual fluoresensi eGFP dengan peningkatan dosis EV (Gbr. 3a). Jumlah EV terendah yang dapat dideteksi adalah 6000 EV per sel HEK293T yang dikultur bersama. Pada level ini, jumlah spot (p = 0,0012), intensitas (p = 0,0075), dan piksel maksimum (p = 0,0005) pengukuran secara signifikan lebih besar dari sel penerima tanpa EV (Gbr. 3b-d). Oleh karena itu, dosis 6000 HEK293T EV adalah ambang batas rendah untuk penyerapan dalam kondisi eksperimental kami. Demikian pula, dosis 10.000 dan 20.000 EV memiliki jumlah titik yang lebih tinggi (10.000:p = 0,0009; 20.000:p < 0,0001), intensitas (10,000:p < 0,0001; 20.000:p < 0.0001) dan piksel maksimum (10.000:p < 0,0001; 20.000:p < 0,0001) dibandingkan dengan sel tanpa EV. Membandingkan antara dosis yang lebih tinggi, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam jumlah spot (6000 vs. 10.000:p = 0,999, 10.000 vs. 20.000:p = 0.0927), intensitas (6000 vs. 10.000:p = 0.8482, 10.000 vs. 20.000:p = 0.999), dan jumlah piksel maksimum (6000 vs. 10.000:p = 0,6056, 10.000 vs. 20.000:p = 0.5281) antara 6000 dan 10.000, bersama dengan 10.000 vs. 20.000. Demikian pula, membandingkan antara 6000 dan 20.000, tidak ada perbedaan statistik dalam jumlah spot (p = 0,0787) dan intensitas (p = 0.8083). Ada perbedaan yang signifikan dalam piksel maksimum antara 6000 dan 20.000 (p = 0,0140). Secara keseluruhan, kurva hasil menampilkan ketergantungan dosis yang signifikan di semua parameter (titik, intensitas, piksel maks, p < 0,0001). Hasil ini menunjukkan bahwa penyerapan HEK293T EV bergantung pada dosis dengan ambang batas minimum 6000 HEK293T EV per sel.
Serapan HEK293T EV memiliki efek dosis dengan ambang batas minimum 6000 EV. Sel HEK293T dikultur bersama dengan HEK293T EVS pada dosis yang meningkat dari 0 menjadi 20.000/sel. a Gambar IFC representatif dari sel penerima dengan dosis EV masing-masing. Lokalisasi GFP menandakan penyerapan HEK293T EV. b –d Kuantifikasi uji dosis dibandingkan dengan kontrol dan masing-masing kelompok melalui jumlah titik, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01
Serapan Temporal EV HEK293T
Menggunakan 6000 EV per sel, EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T untuk meningkatkan durasi waktu sebelum IFC, mulai dari 5 menit hingga 24 jam. Lama paparan EV memainkan peran kunci dalam jumlah fluoresensi yang terlihat dalam sel penerima, menurun setelah 12 jam (Gbr. 4a). Awalnya, budaya bersama selama 30 menit menunjukkan peningkatan jumlah spot yang signifikan (p = 0,0081) menunjukkan kemungkinan tren ke arah penyerapan EV, tetapi tidak dalam parameter penyerapan lainnya (intensitas:p = 0,3073, piksel maks:p = 0.0952) (Gbr. 4b-d). Pada 2 jam co-culture, jumlah spot secara signifikan lebih tinggi (p = 0,0028), intensitas (p = 0,0420), dan piksel maksimum (p = 0,0006) dicatat dibandingkan dengan sel penerima tanpa EV. Sekali lagi, pada 4 jam kokultur, semua parameter lebih besar daripada kontrol (jumlah titik:p = 0,0003, intensitas:p < 0,0001, piksel maksimum:p < 0,0001). Intensitas dan piksel maksimum terus lebih tinggi daripada kontrol pada 4, 12, dan 24 h dari kultur bersama. Tidak ada perbedaan dalam parameter serapan antara 4 dan 12 jam kultur bersama (tempat:p = 0,999, intensitas:p = 0,5797; piksel maksimum:p = 0,2489). Namun, intensitas (p = 0,0191), dan piksel maksimum (p = 0,0027) menurun antara 12 dan 24 h co-kultur (Gbr. 4 c, d). Mirip dengan kurva dosis, serapan EV HEK293T bergantung pada waktu dengan penyerapan EV yang konsisten pada 4 jam inkubasi dan puncak pada 12 jam. Secara kolektif, dosis 6000 EV per sel yang diunggulkan dan kultur bersama 4 jam telah distandarisasi untuk uji serapan berikut.
Serapan HEK293T EV bergantung pada waktu. Sel HEK293T dikultur bersama dengan 6000 HEK293T EVs/sel untuk waktu yang lebih lama. a Gambar IFC representatif dari sel penerima, masing-masing. Lokalisasi GFP menandakan peningkatan penyerapan EV HEK293T. b –d Kuantifikasi tes kursus waktu dibandingkan dengan kontrol dan setiap kelompok melalui jumlah titik, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01
Pengambilan Komparatif EV HEK293T oleh Beberapa Garis Sel
Hipotesis bahwa penyerapan EV adalah proses selektif di mana EV secara istimewa diambil oleh sel asalnya diuji menggunakan IFC. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T atau garis sel lainnya:epitel (sel hati C3A), endotel (sel endotel vena umbilikalis manusia), dan saraf (sel glioblastoma SH-SY5Y.). fluoresensi eGFP lebih melimpah di sel HEK293T dibandingkan dengan tipe sel lainnya (Gbr. 5a). Dibandingkan dengan C3A dan HUVECs, sel HEK293T memiliki intensitas fluoresensi yang jauh lebih tinggi (C3A:p = 0.0321; HUVEC:p = 0,0055) (Gbr. 5c), saat dikultur bersama dengan HEK293T EV. Selain itu, sel HEK293T memiliki piksel maksimum yang lebih tinggi (C3A:p = 0.0221; HUVEC:p = 0,0079; SH-SY5Y:p = 0.0486) (Gbr. 5d) dibandingkan dengan semua garis sel penerima lainnya (Gbr. 5b). Mengenai intensitas, sel SH-SY5Y secara signifikan lebih tinggi daripada HUVEC ketika dikultur bersama dengan HEK293T EV (p = 0.0304). Hasil ini mendukung pengambilan selektif HEK293T EV oleh sel HEK293T dibandingkan dengan garis sel lainnya secara in vitro.
EV HEK293T menampilkan preferensi penyerapan ke sel HEK293T. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T, sel epitel C3A, sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC), dan sel saraf SY5Y. a Gambar IFC representatif dari sel penerima yang dikultur bersama dengan HEK293T EVs. b –d Kuantifikasi uji preferensi penyerapan EV dibandingkan dengan kontrol dan satu sama lain melalui penghitungan titik, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; ANOVA satu arah diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0.01
Status Diferensiasi Sel Saraf dan Internalisasi HEK293T EV
Karena EV telah terlibat untuk tujuan terapeutik dan pengiriman yang menargetkan penyakit saraf, sel induk saraf manusia (hNSCs) dan neuron manusia dewasa digunakan sebagai garis sel penerima dalam sistem kami untuk memeriksa apakah status diferensiasi sel penerima berperan dalam penyerapan selektif dari EV. Gambar representatif dari IFC menunjukkan bukti visual penyerapan di kedua jenis sel, tetapi dengan lokalisasi eGFP terbesar di hNSC (Gbr. 6a). hNSC yang dikultur bersama dengan HEK293T EV memiliki jumlah titik yang lebih tinggi (p = 0,0082) dan piksel maksimum (p = 0,0083) dibandingkan dengan neuron dewasa. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa status diferensiasi sel saraf memengaruhi penyerapan HEK293T EV.
Status diferensiasi saraf memengaruhi penyerapan HEK293T EV. EV HEK293T dikultur bersama dengan neuron manusia dewasa dan sel induk saraf manusia. a Gambar IFC representatif dari sel penerima yang dikultur bersama dengan HEK293T EVs. b –d Kuantifikasi uji preferensi penyerapan EV dibandingkan dengan kontrol dan satu sama lain melalui penghitungan titik, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Batang mewakili mean ± SEM; T = 3; tidak berpasangan T tes. *p < 0,05; ***p < 0.01 dibandingkan dengan 0 EV (kontrol)
Diskusi
Proses Standarisasi Penyerapan EV in vitro
Sekelompok pakar internasional tentang EV menekankan kebutuhan untuk secara efektif menentukan dosis efektif minimal EV untuk uji serapan, dan di sini kami telah mengembangkan sistem yang dapat diadopsi secara efektif oleh lapangan [26]. Ada tantangan saat menganalisis penyerapan EV. Misalnya, seperti yang kami dan orang lain amati, hasil dapat berbeda jika dosis EV dan waktu pemaparan diubah [26]. Kami membahas dosis dan konsentrasi EV HEK293T sebagai variabel kinetik. Juga, dosis efektif minimum in vitro dapat lebih seragam memprediksi biodistribusi EV in vivo dan digunakan untuk mengembangkan parameter dosis in vivo yang lebih konsisten untuk terapi dan pengiriman EV. Dalam studi biodistribusi EV tikus in vivo, peningkatan dosis EV HEK293T menghasilkan pergeseran distribusi EV relatif di organ [27]. Mirip dengan temuan dalam penelitian in vitro sebelumnya menggunakan EV kanker kandung kemih [39], EV HEK293T menunjukkan ketergantungan dosis yang kuat dengan dosis efektif minimal pada 6000 EV dalam penelitian kami. Kami adalah yang pertama menggunakan partikel per sel sebagai pengukuran dosis sensitif secara in vitro, yang berkorelasi lebih baik dengan model in vivo yang menggunakan partikel per berat badan. Data kami juga menunjukkan batas saturasi dosis setelah 6000 EV, yang berpotensi menginformasikan studi rentang dosis in vivo di masa depan dengan menunjukkan bahwa dosis yang lebih tinggi mungkin memiliki manfaat yang terbatas.
Variabel pengganggu lain dalam mengukur serapan EV adalah efek temporal potensial pada serapan EV. Dalam sistem kami, kami menemukan ketergantungan waktu yang kuat dengan penyerapan sedini 2 h dengan potensi penurunan antara 12 dan 24h. Mirip dengan temuan kami, ketergantungan waktu dilaporkan dalam beberapa penelitian menggunakan sel kanker kandung kemih, sel tumor, dan lainnya dengan serapan sedini 15 menit sampai 24 jam [29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. Seperti yang terlihat dengan EV HEK293T, nilai yang lebih rendah pada 24 jam kultur bersama mungkin merupakan hasil dari pembelahan sel atau daur ulang/degradasi EV yang terinternalisasi pada titik waktu awal [50]. Secara khusus, karena EV telah terbukti diinternalisasi kemudian dipecah atau diinternalisasi kemudian dilepaskan setelah 24 jam, inkubasi yang lebih lama dapat menghasilkan pembacaan internalisasi yang tidak akurat [31, 50]. Studi kami adalah yang pertama menggunakan IFC untuk memberikan bukti visual dan kuantitatif dari kurva hasil yang bergantung waktu pada penyerapan HEK293T EV.
Seperti yang disarankan oleh makalah posisi ISEV, pilihan label EV dapat memengaruhi penyerapan, yang memerlukan teknik yang tidak terlalu mengganggu seperti metode penandaan GFP yang digunakan dalam penelitian kami. Secara khusus, 72% peneliti yang berpartisipasi dalam survei mengklaim bahwa eksperimen pewarna lipid tidak dapat diandalkan kecuali jika kontrol yang tepat digunakan [26]. EV dyes do not reliably correlate with small EV content and may even increase vesicle size. Contamination of mislabeled lipoproteins and protein content and dye aggregation contributed to false positives [51, 52]. Therefore, we fused CD63 with an eGFP to label the HEK293T EVs. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].
Selective Uptake
EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.
In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.
Kesimpulan
In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.
Ketersediaan Data dan Materi
The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
