Optimasi Citroflowometri untuk Kuantifikasi Kinetika dan Spesifikitas Pengambilan Vesikula Ekstrakular HEK293T
Abstrak
Vesikula ekstrakular (EV) adalah vesikula berukuran nano yang dibungkus lapis lipid dan secara alami dikeluarkan dari sebagian besar tipe sel sebagai mekanisme komunikasi untuk mengirimi protein, lipid, dan materi genetik. Meski memiliki potensi terapeutis, informasi terbatas mengenai kinetika dan spesifikitas pengambilan EV. Di sini, kami mengoptimalkan platform berbasis citroflowometri (IFC) untuk menilai secara kuantitatif efek dosis, waktu, dan spesifitas sel penerima terhadap internalisasi vesikula ekstrakular sel ginjal embrio manusia (HEK293T) dengan cara high-throughput. Kami menemukan bahwa pengambilan EV HEK293T adalah proses aktif yang bergantung pada dosis dan waktu. Selanjutnya, selektivitas pengambilan EV dikuantifikasi in vitro, dan kami menemukan bahwa EV HEK293T diinternalkan dalam jumlah yang lebih besar oleh sel dengan asal yang sama. Terakhir, sel saraf stem internalkan secara signifikan lebih banyak EV HEK293T dibandingkan neuron matang, yang menunjukkan bahwa sel stem atau progenitur, yang lebih aktif secara metabolik dibandingkan sel yang sudah bediferensiasi terminal, mungkin memiliki laju internalisasi EV aktif yang lebih tinggi. Karakterisasi pengambilan EV, terutama spesifitas, ketergantungan dosis dan waktu, dan uji kinetik akan membantu menginformasikan dan mengembangkan terapeutik berbasis EV yang target dan efisien.
Pendahuluan
Penelitian vesikula ekstrakular adalah bidang yang berkembang pesat karena utilitas terapeutik dan diagnostik dari vesikula ekstrakular alami dan rekayasa (EV). EV berkisar dari 50 hingga 1000 nm diameter, dihasilkan dari semua tipe sel, dan kaya akan protein transmembran, termasuk CD63, CD81, dan CD9; lipid; protein; dan DNA, RNA, mRNA, dan microRNA [1,2,3,4,5]. Isi EV, terutama mRNA dan miRNA aktif, telah dikaitkan dengan modulasi sel penerima melalui translasi de novo dan regulasi post translasi target sel [4, 6]. Memahami dan kemudian memodifikasi kinetik pengambilan dan internalisasi EV akhirnya akan mengarah pada pengiriman isi EV yang dioptimalkan ke sel target dengan konsentrasi yang cukup tinggi untuk memberikan manfaat terapeutik.
Dulu dianggap sebagai "sampah sel", EV telah dimanfaatkan sebagai alternatif untuk terapi sel karena banyak keuntungan termasuk kompatibilitas biologis, imunogenisitas dan toksisitas rendah, kemampuan untuk dosing berulang, berbagai rute administrasi, dan potensi untuk mengirimi obat dan terapi genetik [3]. Kelompok kami sebelumnya telah melaporkan efek positif dari EV berasal dari sel saraf stem pada stroke dan cedera otak traumatic. Dalam model stroke tikus dan babi, EV meningkatkan pemulihan jaringan dan fungsi pasca stroke [3, 7, 8]. Kami juga telah menunjukkan EV sebagai neuroprotektif dengan manfaat fungsi dalam model cedera otak traumatic tikus [9]. Meski efek yang diamati dan potensi masa depan EV, ada sedikit pemahaman tentang spesifitas dan kinetik pengambilan EV, yang mungkin menghambat translasi terapeutik EV ke klinik.
EV juga telah dirancang sebagai vektor transfer dan dimuat dengan agen terapeutik termasuk terapi genetik dan senyawa kimia sebagai alternatif untuk vektor pengiriman nanoparticle dan terapeutik [4, 10,11,12]. Sel HEK293T telah banyak digunakan sebagai sel produsen EV karena proliferasi cepat inherent, rendemen EV tinggi, dan kemudahan manipulasi genetik [13,14,15,16,17]. EV HEK293T telah mengirimi terapi genetik termasuk terapi miRNA untuk kanker payudara [12] dan telah digunakan untuk mengirimi kimoterapi dan konstruk protein terapeutik dalam model schwannoma [18]. Mirip dengan studi nanoparticle sintetis yang menilai sitotoksisitas in vitro, uji toksisitas MTT menunjukkan toksisitas rendah dari EV HEK293T yang tidak dimuat dan kemudian sitotoksisitas tinggi saat dimuat dengan kimoterapi [10, 18,19,20,21]. Karena penggunaan yang melimpah dari EV HEK293T, kami menganalisis kinetik dan spesifikitasnya dalam studi ini.
Pengambilan selektif atau spesifik merujuk pada kemampuan alami EV untuk menargetkan tipe sel tertentu. Ada banyak bukti mengenai mekanisme internalisasi EV dengan sedikit konsensus tentang spesifitas pengambilan [22]. Sering kali EV menunjukkan pengambilan selektif oleh sel penerja yang mirip dengan sel induknya, sel epitel internalkan lebih banyak EV berasal dari epitel dibandingkan sel penerja lain [23, 24], dan sel saraf stem (MSC) internalkan jumlah yang jauh lebih besar dari EV berasal dari MSC dibandingkan sel garis lain in vitro [24]. Namun, studi lain menemukan bahwa EV diinternalkan oleh semua tipe sel dan menampilkan distribusi bio non-selektif saat diwakili in vivo [22, 25]. Meski potensi terapeutik dan minat yang besar terhadap EV, ada kekurangan dalam pemahaman spesifitas pengambilan EV. Dengan memahami lebih baik spesifitas pengambilan EV, kami dapat dengan tepat memilih sel produsen EV yang internalkan secara selektif oleh sel penerja yang diinginkan dan sehingga meningkatkan aplikabilitas terapeutik EV.
Salah satu alasan potensial untuk hasil pengambilan EV yang bertentangan adalah kurangnya standarisasi platform pengukuran, termasuk analisis efek dosis dan waktu. Baru-baru ini, kelompok ahli dari International Society for Extracellular Vesicles (ISEV) melepaskan paper posisi yang menekankan kebutuhan untuk analisis dosis dan waktu, di antara faktor bingung lainnya pada pengambilan EV [26]. Kelompok menyatakan bahwa "satu dosis tidak cocok untuk semua" dan bahwa dosis dapat mempengaruhi pengambilan atau selektivitas EV [26]. Peningkatan dosis EV HEK293T mengubah pola distribusi bio in vivo [27]. Profil pengambilan EV serum berubah secara signifikan oleh dosis [28]. Selain itu, waktu co-incubasi EV dengan sel penerja yang bervariasi dari 15 menit hingga 48 jam [24, 29,30,31,32,33] dapat mengubah ukuran pengambilan. Jika diadopsi oleh peneliti dan industri EV, proses yang dapat diukur dan andal untuk menentukan kurva dosis dan waktu standar untuk membantu mengidentifikasi dosis minimum efektif dapat mengarah pada studi yang lebih kuat dan berguna.
Sebelumnya, peneliti telah menggunakan citroflowometri standar bersama dengan berbagai bentuk mikroskopi rendah-throughput termasuk mikroskopi konfokal untuk menganalisis pengambilan EV [32,33,34]. Namun, teknologi ini memiliki beberapa keterbatasan. Mikroskopi konfokal dapat memakan waktu dan subjektif. Citroflowometer tradisional telah dirancang untuk mengukur partikel biologis dalam rentang sel, tidak dapat membedakan gerombolan atau kebetulan EV, dan memiliki kebisingan yang meningkat karena triggering [35,36,37,38]. Seperti yang disebut oleh kelompok ISEV, ada kesadaran yang tumbuh tentang keterbatasan fisik citroflowometri tradisional dan menekankan permintaan akan citroflowometri khusus dengan batas deteksi dalam rentang 100 nm [26, 38]. Citroflowometri citra (IFC) menggabungkan sifat kuantitatif high-throughput dari citroflowometri bersama dengan teknologi citra fluoresensi yang dapat mempartikel fluoresens inheren kecil, hingga 100 nm diameter [38]. Kemampuan IFC mengarah pada kebisingan/latar belakang rendah, gerombolan yang berkurang, dan perangkat charged coupled untuk kejelasan citra [37, 39]. Karakteristik ini membantu dalam mengembangkan strategi gating untuk mengkarakterisasi EV dan pengambilan dengan konfirmasi citra secara visual secara high-throughput sebagai platform pengambilan EV yang akurat dan dapat diukur [36, 37, 40].
Dalam studi ini, sel HEK293T yang mengekspresi CD63-eGFP digunakan sebagai garis sel donor untuk produksi EV karena penggunaan umum dalam pengembangan terapeutik. EV fluorescent yang terisolasi dikultur bersama dengan garis sel penerja termasuk sel saraf dan endotel. Pengambilan diukur menggunakan IFC, menghasilkan platform standar untuk mengukur fitur kinetik pengambilan dan internalisasi EV penting untuk sistem sel in vitro. Selanjutnya, kami menyediakan data tentang proses untuk mengukur pengambilan EV fluorescent dalam kondisi yang berbeda dan garis sel yang dibudidayakan untuk menjelaskan pengambilan EV selektif.
Bahan dan Metode
Budidaya Sel
Sel ginjal embrio manusia (HEK293T) dibeli dari ATCC dan dibudidayakan dalam DMEM yang mengandung 10% serum sapi fetus, 100 U/mL penitsilin, dan 100 μg/mL streptomisin. Sel saraf stem manusia (hNSC), sel saraf SH-SY5Y, sel epitel hati C3A, sel endotel vena tali tali manusia (HUVEC), dan neuron semuanya dibudidayakan dalam kondisi standar pada 37 °C, 5% CO2 sebelum uji pengambilan vesikula ekstrakular.
Labeling dan Isolasi EV
DNA plasmide CD63-eGFP diperoleh dari Addgene (#62964). CD63-pEGFP C2 adalah hadiah dari Paul Luzio (plasmid Addgene #62964). Sel HEK293T dibudidayakan hingga 70% kekenyamanan dalam piring 10-cm, dan 10 μg DNA plasmide ditransfeksi menggunakan Lipofectamine 2000 sesuai dengan instruksi produsen. Dua puluh empat jam pasca transfeksi, media diganti dengan media standar HEK293T tanpa serum sapi fetus dan dikumpulkan selama 3 hari berturut-turut. Seperti yang dijelaskan sebelumnya [3], media HEK293T difilter melalui filter 0,22-μm dan dikaya dengan ultrafiltasi menggunakan unit sentrifugal selulosa regenerasi 100-kDa Amicon dan dicuci dua kali dengan PBS++. EV dikonsentrasi menjadi 1 mL, dan konsentrasi serta distribusi ukuran diukur pada Nanosight NS300 sesuai protokol produsen (Malvern, UK). EV diisolasi dari berbagai wadah budaya HEK293T, setiap wadah dianggap sebagai replikasi biologis terpisah, dengan tiga replikasi teknis dalam setiap replikasi biologis (minimum sembilan sampel total untuk setiap kondisi).
Uji Pengambilan
Garisan sel penerja ditanam pada 60% kekenyamanan dalam piring 6-wel selama 24 jam dalam kondisi budaya standar pada 37 °C. Media standar diganti dengan media tanpa serum sapi fetus (FBS−) sebelum co-culture vesikula ekstrakular. EV yang ditandai dengan protein fluoresen hijau (GFP) diberikan pada sel pada dosis dan titik waktu yang bervariasi. Setelah co-culture, sel dire-suspend dalam tripsin 5% dan dikonsentrasi ke sekitar satu juta sel per 50 μL untuk citroflowometri. Tiga puluh tujuh derajat Celsius adalah standar untuk uji pengambilan EV dalam tes kami karena telah menjadi standar yang digunakan baik untuk budaya sel maupun platform pengambilan EV in vitro [31, 41,42,43,44].
Uji Inhibitor
Uji Dingin
EV dikultur bersama dengan sel penerja pada 4 °C untuk secara efektif "menjeda" pertumbuhan budaya sel dan menghambat proses aktif [45]. Empat derajat Celsius menghambat semua bentuk aktif pengambilan EV [31, 41,42,43,44].
Uji Tetap
Sel penerja tetap dalam paraformaldehida 4% selama 30 menit di es dan dicuci dengan PBS segera sebelum co-culture dengan EV untuk menghambat semua bentuk aktif pengambilan EV.
Pengambilan ImageStreamX
Pengambilan dilakukan pada ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) menggunakan perangkat lunak INSPIRE. Minimal 5000–10.000 peristiwa sel diambil. Setiap sampel biologis direplikasi dalam tiga wel replikasi teknis dan diambil secara individual pada ISx. Citra bright field dikumpulkan pada channel satu dan side scatter (785 nm) pada channel enam. Protein fluoresen hijau (GFP) diangsang oleh laser argon 488 nm pada 200 mW, dan fluoresensi dikumpulkan pada channel dua (480-560 nm). Pembesaran 60× digunakan pada setiap sampel bersama dengan laju pengambilan rendah untuk sensitivitas tinggi.
Analisis IDEAS
Analisis data dan citra dilakukan menggunakan perangkat lunak IDEAS (Luminex). Strategi gating adalah sebagai berikut:
Focus gate ditentukan untuk menghilangkan sel yang tidak dalam bidang fokus menggunakan nilai Gradient RMS.
Sel yang difokuskan digate untuk menghilangkan doblet dan sisa menggunakan area bright field vs. aspek rasio bright field. Data yang digate digunakan untuk membuat histogram dan menghasilkan referensi statistik yang mengukur intensitas fluoresensi (jumlah semua piksel dalam citra), intensitas piksel maksimum (intensitas piksel terang dalam citra), beserta nilai hitung spot melalui algoritma internal untuk setiap sampel. Fitur hitung spot dihasilkan menggunakan Wizard IDEAS yang berlaku. Hitung spot, intensitas rata-rata, dan rasio piksel maksimum dihitung oleh rumus (Nilai output dengan EV/Nilai output tanpa EV).
Statistika
Semua data kuantitatif dianalisis melalui GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) dan dilakukan dalam triplikasi. Data disajikan sebagai mean ± standar error dari mean (SEM). Signifikansi statistik ditentukan menggunakan uji T tidak berpasangan atau analisis variansi satu arah (ANOVA) dengan perbandingan post hoc Tukey atau Dunnett dibandingkan dengan kontrol ketika sesuai. p < 0,05 dianggap signifikan.
Hasil
Properti Vesikula Ekstrakular HEK293T yang Ditandai CD63-eGFP
Untuk menghasilkan EV yang dilabeli fluoresens untuk menganalisis kinetik dan pengambilan vesikula ekstrakular, sel HEK293T ditransfeksi dengan plasmide yang membawa protein fusi CD63-eGFP. CD63 adalah protein tetraspanin yang biasanya terkaya dalam membrane ekson menjadikannya target optimal untuk labeling fluorescent EV [46, 47]. Media yang habis dikumpulkan dari budaya sel HEK293T, dan EV diisolasi seperti yang dilaporkan sebelumnya [8]. Kami membandingkan ukuran dan distribusi EV yang diisolasi dari sel HEK293T yang ditransfeksi CD63-eGFP dengan sel HEK293T yang tidak ditransfeksi. Kontrol dan EV HEK293T yang ditransfeksi CD63-eGFP menampilkan diameter median rata-rata 110,28 nm dan 103,616 nm, masing-masing, seperti yang diukur oleh perangkat lunak nanotracking (Gambar 1a), yang konsisten dengan ukuran yang dilaporkan dari EV HEK293T [13, 15, 27, 48]. Tidak ada perbedaan yang signifikan dalam diameter median (p = 0,1615) dan distribusi (p = 0,4225) EV yang diisolasi dari sel HEK293T yang tidak ditransfeksi dan yang ditransfeksi CD63-eGFP. Labeling eGFP tidak mengubah ukuran EV HEK293T (Gambar 1b).
Karakterisasi EV HEK293T yang ditandai dengan CD63-eGFP. EV diisolasi dari media budaya sel HEK293T (kontrol) dan HEK293T yang mengekspresi CD63-eGFP. a Citra representatif distribusi ukuran EV yang dicatat melalui perangkat lunak nanotracking. b Kuantifikasi distribusi diameter rata-rata dari EV HEK293T yang ditransfeksi vs. yang tidak ditransfeksi. c Citra IFC dari kontrol negatif, EV HEK293T kontrol, dan EV yang ditandai CD63-eGFP. BF berarti bright field, GFP berarti protein fluoresen hijau (laser eksitasi 488 nm), dan SSC berarti side scatter. eGFP positif pada channel GFP berarti EV HEK293T fluorescent. d Ekspresi penanda permukaan berbasis citroflowometri MACSPlex dari EV HEK293T yang tidak ditransfeksi dan EV HEK293T CD63-eGFP. Kedua sumber EV positif untuk CD29, CD9, CD63, dan CD81, seperti yang diukur dalam fluoresensi relatif (ditelakomi dengan X untuk positif). Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; uji T tidak berpasangan. n.s. berarti p > 0,05
Uji IFC dilakukan untuk menentukan apakah CD63-eGFP terkait dengan EV. Sebagai kontrol negatif fluoresen, 1,34 μM bead dalam larutan penyangkal (Gambar 1 c, atas) tidak memiliki fluoresensi ketika diekspos pada panjang gelombang eksitasi 488-nm, tetapi terlihat dalam bright field (BF) dan side scatter (SSC). EV HEK293T yang tidak ditandai negatif dalam BF, GFP, dan SSC, yang menunjukkan ukuran yang kecil di bawah ambang BF dan kurangnya fluoresensi (Gambar 1d, tengah). Ketidakhadiran dalam BF berarti ukuran EV lebih kecil dari 300 nm, yang menunjukkan gerombolan EV yang minimal. Terakhir, EV yang ditandai CD63-eGFP negatif dalam BF dan positif pada channel GFP yang menunjukkan fluoresensi positif dari EV HEK293T (Gambar 1c, bawah). Sinyal positif pada channel GFP dapat menunjukkan satu EV atau sekelompok EV fluorescent. Secara kolektif, hasil ini menunjukkan bahwa EV HEK293T yang terisolasi memiliki ukuran dan profil penanda protein standar yang konsisten dengan laporan sebelumnya tentang ekson HEK293T, dan labeling eGFP tidak mengubah ukuran EV HEK293T [5, 27].
Menggunakan metode berbasis citroflowometri yang tersedia secara komersial untuk mengukur penanda EV umum, kami menentukan profil tetraspanin EV keseluruhan [5]. EV HEK293T yang terisolasi dari sel HEK293T kontrol dan yang mengekspresi CD63-eGFP positif untuk penanda EV standar termasuk CD9, CD63, dan CD81 seperti yang diukur dalam unit fluoresensi relatif (Gambar 1d). Seperti yang dilaporkan sebelumnya, CD29 juga ditemukan pada permukaan EV HEK293T dan EV HEK293T yang ditransfeksi CD63-eGFP [5]. Hasil ini menunjukkan bahwa metode isolasi dan labeling untuk EV HEK293T menghasilkan EV dengan penanda ekson HEK293T yang umum.
Pengambilan Aktif EV HEK293T
Dua uji internalisasi inhibitor dilakukan. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel penerja pada 4 °C (dingin) atau dengan sel penerja yang sebelumnya tetap dengan paraformaldehida (tetap). Perlakuan ini mengurangi kehadiran EV yang dilabeli eGFP dalam sel penerja dibandingkan sel penerja yang dikultur bersama dengan EV dalam kondisi fisiologis (Gambar 2a). Uji inhibitor dingin dan tetap mengurangi hitung spot (dingin: p = 0,0127, tetap: p = 0,0078), intensitas (dingin: p = 0,0105, tetap: p = 0,0374), dan piksel maksimum (dingin: p = 0,0159, tetap: p = 0,0149) dari sinyal fluoresensi dalam sel penerja tanpa perlakuan, yang menunjukkan inhibisi pengambilan EV. Hasil ini menyimpulkan bahwa lokasi eGFP dan peningkatan parameter output menunjukkan bahwa EV HEK293T diinternalkan untuk uji pengambilan berikutnya.
Uji inhibisi internalisasi EV. Sel HEK293T dikultur bersama dengan EV HEK293T dalam berbagai kondisi. Kontrol (37 °C) merujuk pada co-culture dalam lingkungan fisiologis 37 °C. Dingin merujuk pada co-culture dalam lingkungan 4 °C. Inhibisi tetap merujuk pada uji di mana sel penerja tetap PFA sebelum co-culture. a Citra IFC representatif dari sel penerja. Kolom 1, BF, berarti bright field. Kolom 2, GFP, berarti protein fluoresen hijau (laser eksitasi 488 nm), dan Kolom 3 adalah gabungan dari BF dan GFP. Kontrol menunjukkan GFP positif yang mewakili internalisasi EV. b–d Kuantifikasi uji inhibisi dibandingkan dengan kontrol melalui hitung spot, intensitas fluoresensi rata-rata, dan piksel maksimum. Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; satu arah ANOVA diikuti dengan uji post hoc Tukey dibandingkan dengan kontrol. *p < 0,05; ***p < 0,01
Pengambilan EV HEK293T yang Bergantung pada Dosis
Untuk mengembangkan kurva dosis standar untuk platform IFC, EV HEK293T dikultur bersama dengan sel penerja HEK293T pada dosis yang meningkat dari 0 hingga 20.000 EV per sel pada 37 °C. Citra IFC representatif menunjukkan peningkatan visual fluoresensi eGFP dengan dosis EV yang meningkat (Gambar 3a). Jumlah EV terendah yang dapat terdeteksi adalah 6000 EV per sel HEK293T yang dikultur bersama. Pada level ini, pengukuran hitung spot (p = 0,0012), intensitas (p = 0,0075), dan piksel maksimum (p = 0,0005) secara signifikan lebih besar daripada sel penerja tanpa EV (Gambar 3b–d). Oleh karena itu, dosis 6000 EV HEK293T adalah ambang rendah untuk pengambilan dalam kondisi eksperimen kami. Demikian pula, dosis 10.000 dan 20.000 EV memiliki hitung spot (10.000: p = 0,0009; 20.000: p < 0,0001), intensitas (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) dan piksel maksimum (10.000: p < 0,0001; 20.000: p < 0,0001) yang lebih tinggi dibandingkan sel tanpa EV. Membandingkan antara dosis yang lebih tinggi, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam hitung spot (6000 vs. 10.000: p = 0,999, 10.000 vs. 20.000: p = 0,0927), intensitas (6000 vs. 10.000: p = 0,8482, 10.000 vs. 20.000: p = 0,999), dan hitung piksel maksimum (6000 vs. 10.000: p = 0,6056, 10.000 vs. 20.000: p = 0,5281) antara 6000 dan 10.000, bersama dengan 10.000 vs. 20.000. Demikian pula, membandingkan antara 6000 dan 20.000, tidak ada perbedaan statistik dalam hitung spot (p = 0,0787) dan intensitas (p = 0,8083). Ada perbedaan yang signifikan dalam piksel maksimum antara 6000 dan 20.000 (p = 0,0140). Secara keseluruhan, kurva rendemen menunjukkan ketergantungan dosis yang signifikan pada semua parameter (spot, intensitas, max pixel, p < 0,0001). Hasil ini menunjukkan bahwa pengambilan EV HEK293T bergantung pada dosis dengan ambang minimum 6000 EV HEK293T per sel.
Pengambilan EV HEK293T memiliki efek dosis dengan ambang minimum 6000 EV. Sel HEK293T dikultur bersama dengan EV HEK293T pada dosis yang meningkat dari 0 hingga 20.000/sel. a Citra IFC representatif dari sel penerja dengan dosis EV masing-masing. Lokasi GFP menunjukkan pengambilan EV HEK293T. b–d Kuantifikasi uji dosis dibandingkan dengan kontrol dan setiap grup melalui hitung spot, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; satu arah ANOVA diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0,01
Pengambilan Temporal EV HEK293T
Menggunakan 6000 EV per sel, EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T untuk panjang waktu yang meningkat sebelum IFC, bervariasi dari 5 menit hingga 24 jam. Lama paparan EV memainkan peran kunci dalam jumlah fluoresensi yang terlihat dalam sel penerja, menurun setelah 12 jam (Gambar 4a). Awalnya, 30 menit co-culture menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam hitung spot (p = 0,0081) yang menunjukkan tren yang mungkin menuju pengambilan EV, tetapi tidak dalam parameter pengambilan lain (intensitas: p = 0,3073, max pixel: p = 0,0952) (Gambar 4b–d). Pada 2 jam co-culture, hitung spot (p = 0,0028), intensitas (p = 0,0420), dan piksel maksimum (p = 0,0006) yang signifikan lebih tinggi dicatat dibandingkan sel penerja tanpa EV. Lagi, pada 4 jam co-culture, semua parameter lebih besar dari kontrol (hitung spot: p = 0,0003, intensitas: p < 0,0001, max pixel: p < 0,0001). Intensitas dan piksel maksimum terus lebih tinggi dari kontrol pada 4, 12, dan 24 jam co-culture. Tidak ada perbedaan dalam parameter pengambilan apa pun antara 4 dan 12 jam co-culture (spot: p = 0,999, intensitas: p = 0,5797; piksel maksimum: p = 0,2489). Namun, intensitas (p = 0,0191), dan piksel maksimum (p = 0,0027) menurun antara 12 dan 24 jam co-culture (Gambar 4 c,d). Mirip dengan kurva dosis, pengambilan EV HEK293T bergantung pada waktu dengan pengambilan EV yang konsisten pada 4 jam inkubasi dan puncak pada 12 jam. Secara kolektif, dosis 6000 EV per sel yang ditanam dan co-culture selama 4 jam telah distandardisasi untuk uji pengambilan berikutnya.
Pengambilan EV HEK293T bergantung pada waktu. Sel HEK293T dikultur bersama dengan 6000 EV HEK293T/sel untuk panjang waktu yang meningkat. a Citra IFC representatif dari sel penerja, masing-masing. Lokasi GFP menunjukkan pengambilan EV HEK293T yang meningkat. b–d Kuantifikasi uji deret waktu dibandingkan dengan kontrol dan setiap grup melalui hitung spot, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; satu arah ANOVA diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0,01
Pengambilan Komparatif EV HEK293T oleh Beberapa Garis Sel
Hipotesis bahwa pengambilan EV adalah proses selektif di mana EV diambil secara prioritas oleh sel dengan asal yang sama diuji menggunakan IFC. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T atau garis sel lain: epitel (sel hati C3A), endotel (sel endotel vena tali tali manusia), dan saraf (sel glioblastoma SH-SY5Y). Fluoresensi eGFP lebih banyak dalam sel HEK293T dibandingkan dengan tipe sel lain (Gambar 5a). Dibandingkan dengan C3A dan HUVEC, sel HEK293T memiliki intensitas fluoresensi yang signifikan lebih tinggi (C3A: p = 0,0321; HUVEC: p = 0,0055) (Gambar 5c), saat dikultur bersama dengan EV HEK293T. Selain itu, sel HEK293T memiliki piksel maksimum yang lebih tinggi (C3A: p = 0,0221; HUVEC: p = 0,0079; SH-SY5Y: p = 0,0486) (Gambar 5d) dibandingkan dengan semua garis sel penerja lain (Gambar 5b). Mengenai intensitas, sel SH-SY5Y signifikan lebih tinggi daripada HUVEC saat dikultur bersama dengan EV HEK293T (p = 0,0304). Hasil ini mendukung pengambilan selektif EV HEK293T oleh sel HEK293T dibandingkan dengan garis sel lain in vitro.
EV HEK293T menampilkan preferensi pengambilan ke sel HEK293T. EV HEK293T dikultur bersama dengan sel HEK293T, sel epitel C3A, sel endotel vena tali tali manusia (HUVEC), dan sel saraf SY5Y. a Citra IFC representatif dari sel penerja yang dikultur bersama dengan EV HEK293T. b–d Kuantifikasi uji preferensi pengambilan EV dibandingkan dengan kontrol dan satu sama lain melalui hitung spot, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; satu arah ANOVA diikuti dengan uji post hoc Tukey. *p < 0,05; ***p < 0,01
Status Diferensiasi Sel Saraf dan Internalisasi EV HEK293T
Karena EV telah dikaitkan dengan tujuan terapeutik dan pengiriman yang menargetkan penyakit saraf, sel saraf stem manusia (hNSCs) dan neuron manusia matang digunakan sebagai garis sel penerja dalam sistem kami untuk memeriksa apakah status diferensiasi sel penerja memainkan peran dalam pengambilan selektif EV. Citra representatif dari IFC menunjukkan bukti visual pengambilan dalam kedua tipe sel, tetapi dengan lokasi eGFP terbesar dalam hNSCs (Gambar 6a). hNSCs yang dikultur bersama dengan EV HEK293T memiliki hitung spot (p = 0,0082) dan piksel maksimum (p = 0,0083) yang lebih tinggi dibandingkan neuron matang. Bersama-sama, hasil ini menunjukkan bahwa status diferensiasi sel saraf memengaruhi pengambilan EV HEK293T.
Status diferensiasi saraf memengaruhi pengambilan EV HEK293T. EV HEK293T dikultur bersama dengan neuron manusia matang dan sel saraf stem manusia. a Citra IFC representatif dari sel penerja yang dikultur bersama dengan EV HEK293T. b–d Kuantifikasi uji preferensi pengambilan EV dibandingkan dengan kontrol dan satu sama lain melalui hitung spot, intensitas fluoresensi rata-rata, dan rasio piksel maksimum. Bar mewakili mean ± SEM; N = 3; uji T tidak berpasangan. *p < 0,05; ***p < 0,01 dibandingkan dengan 0 EV (kontrol)
Diskusi
Proses Standarisasi Pengambilan EV in vitro
Sebuah kelompok ahli internasional tentang EV menekankan kebutuhan untuk secara efektif menentukan dosis minimum efektif EV untuk uji pengambilan, dan di sini kami telah mengembangkan sistem yang dapat secara efektif diadopsi oleh bidang [26]. Ada tantangan saat menganalisis pengambilan EV. Misalnya, seperti yang kami dan yang lain amati, hasil dapat berbeda jika dosis dan waktu paparan EV diubah [26]. Kami menangani dosis dan konsentrasi EV HEK293T sebagai variabel kinetik. Juga, dosis minimum efektif in vitro mungkin lebih seragam memprediksi distribusi bio in vivo dari EV dan dapat digunakan untuk mengembangkan parameter dosing in vivo yang lebih konsisten untuk terapeutik dan pengiriman EV. Dalam studi distribusi bio EV tikus in vivo, peningkatan dosis EV HEK293T mengubah distribusi relatif EV dalam organ [27]. Mirip dengan temuan dalam studi in vitro sebelumnya menggunakan EV kanker kandung kemih [39], EV HEK293T menampilkan ketergantungan dosis yang kuat dengan dosis minimum efektif pada 6000 EV dalam studi kami. Kami adalah yang pertama menggunakan partikel per sel sebagai ukuran dosis yang sensitif in vitro, yang lebih berkaitan dengan model in vivo menggunakan partikel per berat badan. Data kami juga menunjukkan batas saturasi dosis setelah 6000 EV, yang mungkin memberikan informasi untuk studi rentang dosis in vivo masa depan dengan menunjukkan bahwa dosis yang lebih tinggi mungkin memiliki manfaat yang terbatas.
Variabel bingung lain dalam pengukuran pengambilan EV adalah efek temporal potensial pada pengambilan EV. Dalam sistem kami, kami menemukan ketergantungan waktu yang kuat dengan pengambilan sejak 2 jam dengan potensi penurunan antara 12 dan 24 jam. Mirip dengan temuan kami, ketergantungan waktu telah dilaporkan dalam beberapa studi menggunakan sel kanker kandung kemih, sel tumor, dan lainnya dengan pengambilan sejak 15 menit hingga 24 jam [29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. Seperti yang terlihat dengan EV HEK293T, nilai yang lebih rendah pada 24 jam co-culture mungkin merupakan hasil dari pembelahan sel atau daur ulang/degradasi EV yang diinternalkan pada titik waktu awal [50]. Secara khusus, karena EV telah ditunjukkan diinternalkan lalu dipecah atau diinternalkan lalu dirilis setelah 24 jam, inkubasi yang lebih lama mungkin menghasilkan bacaan internalisasi yang tidak akurat [31, 50]. Studi kami adalah yang pertama menggunakan IFC untuk memberikan bukti visual dan kuantitatif dari kurva rendemen yang bergantung pada waktu pada pengambilan EV HEK293T.
Seperti yang disarankan oleh paper posisi ISEV, pilihan label EV dapat mempengaruhi pengambilan, yang memerlukan teknik yang kurang mengganggu seperti metode tagging GFP yang digunakan dalam studi kami. Secara spesifik, 72% peneliti yang berpartisipasi dalam survei klaim bahwa eksperimen pewarna lipid tidak andal kecuali kontrol yang tepat digunakan [26]. Pewarna EV tidak secara andal berkaitan dengan isi EV kecil dan bahkan dapat meningkatkan ukuran vesikula. Kontaminasi lipoprotein dan konten protein yang salah label serta agregasi pewarna berkontribusi pada false positive [51, 52]. Oleh karena itu, kami menggabungkan CD63 dengan eGFP untuk melabeli EV HEK293T. Mirip dengan laporan lain tentang protein tagging, EV HEK293T positif GFP tanpa perbedaan yang diamati dalam diameter dan mempertahankan komposisi protein permukaan EV standar [38, 46]. Meski demikian, penting untuk diperhatikan bahwa labeling EV dengan protein EV tertentu mungkin membatasi pelacakan hanya pada beberapa subtype EV yang mengekspresi penanda yang masing-masing. Keterbatasan potensi lain mungkin adalah bahwa intensitas fluoresensi bergantung pada tingkat ekspresi protein, efisiensi labeling membrane EV, dan kekuatan eksitasi sumber cahaya [53]. Namun, IFC sensitif, mendeteksi intensitas fluoresensi rendah dengan visualisasi yang akurat partikel CD63-GFP dalam rentang 100 nm [38, 54].
Pengambilan Selektif
EV menampilkan protein dan sinyal lain yang dapat memberikan pengambilan selektif [22, 23, 55]. Sejak langkah pertama biogenesis EV adalah invaginasi plasma membrane, membrane EV mengandung protein yang sama, reseptor, molekul adhesi, dan integrin ketika dibandingkan dengan membrane sel donor [22, 24, 55]. Komposisi lipid dan protein tetraspanin pada membrane EV yang diatur oleh sel donor mungkin berkontribusi pada tropisme EV dengan sel penerja [23, 34, 56]. EV MSC secara selektif mengirimi konten ke dalam MSC, meskipun lebih dekat dengan monocyte [24]. Sebaliknya, yang lain melaporkan bahwa EV alami diinternalkan sama oleh semua tipe sel, terlepas dari asal EV [11, 22, 25, 57] saat menggunakan uji citra atau knockdown fungsional. Menggunakan platform IFC, kami menemukan bahwa vesikula ekstrakular HEK293T diinternalkan dalam jumlah yang lebih besar oleh sel HEK293T dibandingkan garis sel lain yang dilaporkan, yang menunjukkan spesifitas pengambilan EV yang inherent. Melalui hasil ini dan kemampuan IFC yang serbaguna, sumber EV dapat dengan tepat dipilih dan dianalisis untuk menargetkan sel penerja tertentu. Menurut pengetahuan kami, ini adalah studi pertama yang menggunakan citroflowometri citra untuk menganalisis spesifitas EV HEK293T.
Selain selektivitas sendiri, status diferensiasi sel penerja telah dihipotesahkan memainkan peran dalam pengambilan EV [32, 58, 59]. Seperti yang telah ditunjukkan oleh kelompok kami dan yang lain, EV memiliki efek terapeutik pada sistem saraf pusat dan diketahui memodulasi fungsi sel dalam perkembangan neuron dan dewasa [3, 7,8,9, 60]. Di sini untuk pertama kalinya, status diferensiasi neuron mempengaruhi pengambilan EV, di mana sel saraf stem manusia memiliki pengambilan yang signifikan lebih besar dari EV HEK293T dibandingkan neuron matang. hNSC yang tidak matang lebih aktif internalkan EV eksogen dibandingkan neuron matang yang sepi. Karena hNSC adalah sel yang proliferasi tinggi dalam kultur, mereka mungkin secara non-spesifik internalkan nutrisi dan EV. Demikian pula, sel dendritik yang tidak matang internalkan EV pada level yang lebih tinggi daripada sel dendritik matang [32, 59]. Namun, studi lain dengan sel prekursor mieloid menemukan bahwa sel dendritik matang dan makrofag internalkan lebih banyak EV daripada sel dendritik yang tidak matang dan monocyte [58]. Perbedaan yang diamati dapat dikaitkan dengan aktivitas fagositik dari sel mieloid yang lebih bediferensiasi. Karena bukti in vitro yang mendukung pengambilan selektif, EV HEK293T dapat digunakan untuk memodulasi neuron yang tidak bediferensiasi dalam aplikasi terapeutik masa depan.
Kesimpulan
Dalam rangkuman, kami telah mengembangkan platform kuantitatif dan high-throughput untuk mengukur kinetik pengambilan EV HEK293T. Platform ini dapat diperluas ke EV donor lain dan tipe sel penerja serta uji untuk liposom dan vektor pengiriman nanoparticle sintetik. Secara signifikan, kami menemukan bahwa pengambilan EV HEK293T adalah proses selektif, dengan spesifitas terhadap sel HEK293T. Uji IFC yang dikembangkan di sini dapat digunakan untuk lebih baik mendefinisikan parameter yang digunakan dalam studi eskalasi dosis dan distribusi bio in vivo dan memberikan informasi instrumen untuk model prediktif dari hasil pengambilan EV in vivo.
Ketersediaan Data dan Bahan
Data yang dihasilkan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis yang bertanggung jawab atas permintaan yang wajar.
