Materi Keluarga Grafena dalam Regenerasi Jaringan Tulang:Perspektif dan Tantangan
Abstrak
Kami telah menyaksikan banyak terobosan dalam penelitian tentang bio-aplikasi bahan keluarga graphene di tahun-tahun ini. Karena ukurannya yang berskala nano, luas permukaan spesifik yang besar, sifat fotoluminesensi, dan aktivitas antibakteri, bahan keluarga graphene memiliki potensi besar untuk rekayasa jaringan tulang, pengiriman obat/gen, dan aplikasi penginderaan/pencitraan biologis. Dalam ulasan ini, kami meninjau kembali kemajuan dan pencapaian terkini dalam penelitian graphene, serta menganalisis secara kritis dan mendiskusikan keamanan hayati dan kelayakan berbagai aplikasi biomedis dari bahan keluarga graphene untuk regenerasi jaringan tulang.
Pengantar
Korban infeksi maksilofasial berat, trauma, tumor, dan deformitas kongenital yang menderita defek tulang rahang, biasanya memerlukan pemulihan yang lama. Tidak seperti banyak jaringan lain, tulang memiliki kemampuan luar biasa untuk beregenerasi ketika rusak [1, 2]. Namun, kapasitas regenerasi kerangka manusia yang terbatas membuat rekonstruksi defek tulang yang cukup besar atau berukuran kritis menjadi tantangan yang signifikan untuk terapi klinis [3]. Dalam beberapa kasus, pasien yang parah bahkan memerlukan operasi pembesaran tulang yang ekstensif. Terapi regenerasi tulang saat ini terdiri dari autograft, allograft, dan xenograft [4]. Tulang autologus dianggap sebagai bahan pencangkokan tulang “standar emas”, dengan kemampuan osteokonduksi, osteoinduksi, dan osteogenesis, tanpa imunogenisitas juga. Namun alasan mengapa autograft masih terbatas untuk digunakan di klinik adalah risiko infeksi donor dan waktu pemulihan yang lama [5]. Allograft, yang diperoleh dari individu lain, sering dianggap sebagai pilihan terbaik berikutnya. Tetapi penggunaan allograft menghadirkan risiko potensial, seperti peningkatan risiko infeksi dan penolakan kekebalan secara dramatis [4, 6]. Bahan xenograft, seperti matriks tulang demineralisasi asam-dicerna dan kolagen sapi, mudah diperoleh dan diproduksi. Sekarang, xenograft adalah pendekatan utama dalam praktik klinis. Tetapi ia memiliki kapasitas osteoinduktif yang rendah [7]. Saat ini, dibandingkan dengan tulang, tidak tersedia pengganti tulang heterolog atau sintetik yang memiliki sifat biologis atau mekanik yang lebih unggul atau bahkan sama [5]. Meskipun terapi ini telah terbukti bermanfaat, mereka menderita tantangan yang melekat. Oleh karena itu, terapi regenerasi tulang yang memadai masih perlu diteliti dan dikembangkan. Diakui, rekayasa jaringan tulang dan penelitian kedokteran regeneratif membuka jalan untuk meningkatkan hasil dan mempercepat pemulihan pasien dengan cacat tulang [8]. Konstruksi tulang yang direkayasa jaringan memiliki potensi untuk mengurangi permintaan yang timbul dari kekurangan bahan autograft dan allograft yang sesuai untuk meningkatkan penyembuhan tulang [9]. Untuk meningkatkan volume tulang di daerah cacat tulang, berbagai metode untuk regenerasi tulang telah dikembangkan, termasuk scaffolds [1, 6], pelapis [10], dan membran penghalang untuk regenerasi tulang terpandu (GBR) [11, 12].
Saat ini, potensi bahan keluarga graphene telah menarik perhatian luar biasa sebagai pelapis planar 2D atau perancah berpori 3D untuk diferensiasi berbagai jenis sel induk menuju neurogenik [13,14,15], kondrogenik [16, 17], miogenik [18] , adipogenic [19], dan garis keturunan osteogenik [20, 21]. Dengan demikian, bahan keluarga graphene lebih mungkin menjadi kandidat pilihan untuk bahan regenerasi tulang berikutnya. Grafena, didefinisikan sebagai satu atau beberapa lapisan sp
2
atom karbon hibridisasi, pertama kali diisolasi dari grafit oleh Novoselov dan Geim pada tahun 2004 [22]. Dengan meningkatnya minat penelitian, bahan-bahan dari keluarga graphene, termasuk graphene oxide (GO), carboxyl graphene (CXYG), graphene oxide (rGO), dan graphene quantum dots (GQDs), dipelajari secara ekstensif. Grafena memiliki sifat mekanik, konduktif, termal, dan optik yang luar biasa [23,24,25], yang telah banyak diterapkan dalam elektronik, bioteknologi, dan ilmu polimer [26]. Diakui bahwa bahan konduktif dengan konduktivitas yang menjanjikan meningkatkan aktivitas seluler dan merangsang perbaikan jaringan tulang [27, 28], menunjukkan aktivitas antibakteri yang baik juga [29]. Graphene oxide (GO) dan carboxyl graphene (CXYG) keduanya merupakan turunan dari graphene. Karena adanya gugus fungsi teroksigenasi (gugus epoksida, karboksil, dan hidroksil), GO dan CXYG memiliki dispersi yang lebih baik dalam pelarut hidrofilik, yang penting untuk aplikasi biomedis [30, 31]. Grafena oksida tereduksi (rGO) dapat disintesis dengan mereduksi GO dengan zat pereduksi spesifik dalam kondisi tertentu. Berkat pengurangan beberapa interaksi kimia -π khusus, rGO memiliki sifat fisik dan kimia tertentu yang lebih baik daripada graphene dan GO [32, 33]. Bahan baku graphene quantum dots (GQDs) adalah GO. GQDs memiliki kurungan kuantum yang kuat dan sifat photoluminescence [34]. Fluoresensi kuat dari GQD membuatnya berguna dalam pencitraan seluler. Karena sifat luar biasa bahan keluarga graphene, mereka memiliki potensi besar untuk pengiriman obat / gen, aplikasi penginderaan / pencitraan biologis, dan rekayasa jaringan [35,36,37,38,39]. Namun, tantangan masih ada untuk keamanan hayati jangka panjang dan kemampuan untuk menginduksi diferensiasi sel osteogenik dari bahan keluarga graphene. Di sini kami meninjau kemajuan dan pencapaian terkini secara komprehensif dalam graphene dan turunannya. Secara bersamaan, kami secara kritis menganalisis keamanan hayati in vitro dan in vivo dan mendiskusikan kelayakan berbagai aplikasi biomedis dari bahan keluarga graphene untuk regenerasi jaringan tulang.
Tantangan dalam Menentukan Keamanan Hayati Bahan Keluarga Grafena
Tantangan dalam Menentukan Keamanan Hayati In Vitro
Sebelum bahan keluarga graphene dipertimbangkan untuk uji klinis, mereka harus dievaluasi secara ketat oleh sitotoksisitas dan biokompatibilitasnya [38]. “Apakah graphene merupakan bahan biokompatibel?” Jawabannya masih kontroversial. Grafena mentah tanpa fungsionalisasi apa pun bersifat hidrofobik dan mudah menggumpal dalam media berair [34, 40]. Pada permukaan hidrofobik, lapisan padat protein nonspesifik dapat menggantikan air dari permukaan dan segera terakumulasi pada bahan, menghasilkan pengenalan imunologis nanopartikel [41]. Dengan demikian, fungsionalisasi kimia, termasuk oksidasi, reduksi, dan pengenalan gugus fungsi, merupakan prasyarat untuk graphene yang digunakan dalam aplikasi biomedis, yang meningkatkan hidrofilisitas graphene. Bahan keluarga graphene dengan fungsi yang berbeda, memiliki sifat kimia yang berbeda, memberikan toksisitas yang berbeda [13]. Soumen dkk. menemukan bahwa rGO kurang toksik dibandingkan GO. Sangat menarik untuk melihat bahwa stres oksidatif didorong dengan peningkatan tingkat kepadatan gugus fungsi oksigen pada permukaan rGO. Mereka menyimpulkan bahwa kepadatan gugus fungsi pada lembar GO adalah salah satu faktor kunci dalam memediasi sitotoksisitas seluler [31]. Terlepas dari fungsionalisasi permukaan, sitotoksisitas bahan keluarga graphene dipengaruhi oleh banyak faktor, termasuk konsentrasi, ukuran, dan bentuknya [42].
Pertama, beberapa penelitian menunjukkan bahwa bahan keluarga graphene memiliki sitotoksisitas tergantung dosis dengan atau tanpa sitotoksisitas tergantung waktu. Misalnya, Chang et al. melaporkan bahwa sedikit hilangnya viabilitas sel diamati pada konsentrasi tinggi GO (≥ 50 μg/mL) dan GO dapat menginduksi akumulasi intraseluler dan menyebabkan stres oksidatif tergantung dosis pada garis sel epitel karsinoma paru (A549) [43]. Wei dkk. menunjukkan bahwa GO murni menghambat proliferasi sel punca mesenkim tulang (BMSC) pada konsentrasi tinggi 10 g/mL, sementara meningkatkan proliferasi BMSC pada konsentrasi rendah 0,1 g/mL [44]. Demikian pula, penurunan jumlah sel diamati dengan jelas dengan 200 g/mL GO dan efek sitotoksisitas yang lebih besar dilaporkan dengan 300 g/mL GO [45]. Terlebih lagi, Kim dkk. menemukan bahwa viabilitas preosteoblas (MC3T3-E1) sedikit dipengaruhi oleh rGO pada konsentrasi < 62,5 μg/mL, tetapi secara signifikan (p < 0,05) berkurang pada konsentrasi yang lebih tinggi (≥ 100 μg/mL) [23]. Selain itu, CXYG, GQDs keduanya menunjukkan sedikit potensi sitotoksik bila diterapkan pada konsentrasi rendah [34, 46]. Sederhananya, bahan keluarga graphene bersifat sitokompatibel pada konsentrasi rendah dengan sedikit pengaruh negatif pada morfologi sel, viabilitas, dan proliferasi, tetapi konsentrasi bukanlah satu-satunya faktor yang relevan.
Kedua, ditunjukkan bahwa bentuk yang beragam, seperti lapisan, lembaran nano dan serpihan, pita, dan titik, juga berkontribusi pada kompleksitas sitotoksisitas keluarga graphene [40]. Talukdar dkk. mengevaluasi sitotoksisitas graphene nano-onions (GNOs), GO nanoribbons (GONRs), dan GO nanoplatelets (GONPs). CD50 nilai mengikuti tren GNO> GONR> GONP, menunjukkan bahwa GONR lebih sitotoksik dibandingkan dengan GONP [47]. Dengan demikian, bentuk nanomaterial keluarga graphene juga merupakan komponen kunci dalam memediasi sitotoksisitas. Misalnya, graphene dan karbon nanotube multi-dinding (MWNTs) memiliki bentuk yang berbeda (lembaran atom datar untuk graphene dan tabung untuk nanotube), tetapi komposisi kimia dan struktur kristalnya serupa. GO tidak menunjukkan aktivitas penghambatan pertumbuhan sel sel SK-N-SH sampai pada 50 μg/mL. Sebagai perbandingan, MWCNTs menghambat proliferasi sel pada konsentrasi rendah (6,7 g/mL), yang menunjukkan sitotoksisitas akutnya. Untuk sel HeLa, GO menunjukkan aktivitas penghambatan pertumbuhan kecil bahkan pada konsentrasi hingga 50 g/mL, sedangkan MWCNT memiliki sitotoksisitas sedang pada sel HeLa [48]. Mereka bergantung fenomena ini pada bentuk yang berbeda dan perilaku fisik / kimia yang bervariasi. Bahan keluarga graphene diharapkan memiliki interaksi kecil dengan membran seluler karena bentuknya yang datar. Bentuk tabung MWCNTs mendorong penetrasi membran, menghasilkan sitotoksisitas [48,49,50]. Informasi penting lainnya adalah bahwa sitotoksisitas turunan graphene berstruktur nano juga bergantung pada tipe sel selain ketergantungan fungsionalisasi, konsentrasi, ukuran, dan bentuk. Sebagai garis sel saraf, sel SK-N-SH menunjukkan sensitivitas yang lebih dibandingkan sel HeLa terhadap efek merugikan dari turunan graphene berstruktur nano [48].
Ketiga, ukuran juga memainkan peran penting pada keamanan hayati bahan keluarga graphene. Yoon dkk. mengevaluasi bahwa efek sitotoksik tergantung ukuran dari graphene nanoflakes melalui biosensor impedansi elektrokimia berbasis sel. Mereka menemukan bahwa nanoflakes graphene yang lebih kecil (30,9 ± 5,4 nm) menginduksi apoptosis karena penyerapan yang lebih tinggi oleh sel sedangkan nanoflakes graphene yang lebih besar (80,9 ± 5,5 nm) yang sebagian besar terkumpul pada membran sel menyebabkan toksisitas yang lebih rendah [51]. Telah diketahui dengan baik bahwa sifat serapan seluler dari bahan nano dapat mempengaruhi proliferasi sel, diferensiasi, dan ekskresi partikel nano [52]. Mu dkk. menguraikan kemungkinan mekanisme penyerapan yang bergantung pada ukuran dari nanosheet GO berlapis protein dan mengamati bahwa nanosheet yang lebih besar (860 ± 370 nm) pertama kali menempel ke permukaan sel diikuti oleh invaginasi membran, memperluas pseudopodia dan akhirnya memasuki sel terutama melalui fagositosis, sementara nanosheet yang lebih kecil ( 420 ± 260 nm) memasuki sel terutama melalui endositosis yang dimediasi clathrin [33]. Das dkk. benih sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVEC) dalam 10 g/mL GO dan rGO dengan lembaran ukuran berbeda (800 nm dan 400 nm). Hasilnya menunjukkan bahwa lembaran berukuran lebih kecil lebih beracun daripada yang lebih besar dalam uji MTT. Kemudian, GO dan rGO yang berukuran lebih besar (800 nm) diultrasonikasi untuk dipecah menjadi ukuran yang lebih kecil (70 nm). Peningkatan sitotoksisitas diamati setelah ultrasonikasi, menunjukkan bahwa GO dan rGO yang berukuran lebih kecil menunjukkan lebih banyak toksisitas [31]. Demikian pula, sel MCF7 diekspos ke empat sampel berukuran GO (744 ± 178 nm, 323 ± 50 nm, 201 ± 28 nm, dan 100 ± 10 nm). Dibandingkan dengan sel yang tidak diobati, tidak ada sitotoksisitas yang diamati secara in vitro bahkan setelah 72 jam paparan dispersi GO berukuran lebih besar (744 ± 178 nm) sedangkan pengobatan dengan dispersi GO berukuran 100 ± 10 nm menghasilkan penurunan proliferasi sel sekitar 50% dari sel yang tidak diobati [53]. Dari hasil di atas, berbagai ukuran bahan keluarga graphene diteliti, dari 30 hingga 860 nm. Dan kami tampaknya mendapatkan kesimpulan bahwa bahan keluarga graphene berukuran lebih kecil lebih beracun daripada yang berukuran lebih besar. Tetapi tim yang berbeda memiliki standar yang berbeda untuk menentukan skala ukuran graphene dan turunannya. Dengan demikian, kesimpulan ini mungkin bisa diperdebatkan. Sementara itu, dilaporkan bahwa material keluarga graphene berukuran nano jauh lebih aman untuk aplikasi biomedis [54]. Sintesis kontrol ukuran bahan keluarga graphene perlu dipertimbangkan dengan hati-hati dalam penelitian selanjutnya.
Disimpulkan bahwa sitotoksisitas graphene sangat terkait dengan keragaman keluarga graphene, fungsionalisasi kimia, konsentrasi, bentuk, dan ukuran. Di masa depan, kami bertujuan untuk membuat perangkat biokompatibel dengan interaksi yang lebih baik dengan sel, jaringan, atau organisme dengan kontrol konsentrasi dan ukuran yang lebih baik, dengan memodifikasi keluarga graphene dengan berbagai jenis kelompok fungsional.
Tantangan dalam Menentukan Keamanan Hayati dan Distribusi Hayati di Vivo
Untuk mendeteksi lebih lanjut apakah bahan keluarga graphene adalah bahan biokompatibel dan untuk meningkatkan penggunaan yang diusulkan dalam aplikasi luas, eksperimen in vivo adalah metode yang sangat diperlukan. Banyak penelitian tentang biokompatibilitas dan biodistribusi bahan keluarga graphene in vivo hampir konsisten dengan studi seluler mereka. Chowdhury dkk. menerapkan embrio ikan zebra pada dispersi GO berukuran lebih besar dan tidak menemukan peningkatan mortalitas embrio dibandingkan dengan kelompok kontrol, sementara penurunan viabilitas embrio diamati pada dispersi GO berukuran lebih kecil [53]. GO tidak menyebabkan peningkatan yang signifikan dari apoptosis pada embrio sementara MWCNTs mengakibatkan cacat morfologi yang serius dalam mengembangkan embrio bahkan pada konsentrasi yang relatif rendah dari 25 mg/L [48]. Studi-studi ini lebih lanjut menunjukkan bahwa toksisitas in vivo sangat terletak pada ukuran, konsentrasi, dan bentuk graphene dan turunannya. Selain itu, bahan keluarga graphene biasanya terpapar pada model hewan melalui injeksi intravena, inhalasi, atau implantasi subkutan. Dengan demikian, perubahan toksisitas, histologi umum, dan biodistribusi bervariasi. Li dkk. mengevaluasi toksikologi GO skala nano pada tikus melalui injeksi intravena dan menemukan bahwa GO sebagian besar disimpan di hati, paru-paru, dan limpa dan kerusakan yang diinduksi, hepatitis kronis, dan fibrosis paru. Lapisan polietilen glikol (PEG) dari GO (GO-PEG) dapat mengurangi retensi GO di hati, paru-paru, dan limpa dan meringankan cedera jaringan akut [55]. Duch dkk. mengeksplorasi strategi untuk mengurangi efek toksik dari bahan nano graphene di paru-paru karena mereka menemukan bahwa GO memiliki toksisitas yang lebih tinggi daripada graphene agregat dan graphene yang tersebar Pluronic ketika diberikan langsung ke paru-paru tikus, menyebabkan cedera paru-paru yang parah dan persisten. Toksisitas secara signifikan dimoderasi oleh pembuatan graphene murni melalui pengelupasan fase cair dan selanjutnya diminimalkan ketika didispersikan dengan blok kopolimer Pluronic [56]. Zha dkk. mengidentifikasi toksisitas in vivo jangka pendek (2 minggu pertama pasca-implantasi) dan jangka panjang (7 bulan) dan kinerja busa graphene 3D (GF) atau busa graphene oxide (GOF) pada model tikus implantasi subkutan. Analisis darah menunjukkan bahwa GF dan GOF tidak menyebabkan toksisitas hematologi, hati, atau ginjal yang cukup besar setelah implantasi dan tidak ada degradasi signifikan yang diamati setelah setidaknya 7 bulan implantasi. Hanya granuloma yang ada untuk waktu yang lama di tempat implantasi yang diamati. Gambar yang diwarnai HE menunjukkan biokompatibilitas in vivo yang lebih baik (Gbr. 1) [40]. Alasan mengapa Zha et al. mencapai hasil yang lebih positif daripada penelitian lain seperti yang disebutkan di atas mungkin adalah rute pemberian yang berbeda. Eksperimen subkutan adalah cara yang sangat langsung dan efektif untuk menilai biokompatibilitas in vivo dari bahan implan [57], yang dapat memberikan efek pada pola kontak, lokasi deposit, bahkan jalur degradasi nanomaterial keluarga graphene in vivo [58]. Mengontrol degradasi komposit sangat penting dalam rekayasa jaringan,
Gambar organ utama yang diwarnai dengan HE representatif (wilayah implantasi, hati, dan ginjal yang dikumpulkan dari tikus) ditanamkan dengan busa graphene, busa GO, atau tidak sama sekali pada hari ke 14 pasca-implantasi. Tidak ada kerusakan organ yang jelas atau lesi yang diamati. Direproduksi dari ref. [40] dengan izin dari Journal of Nanoparticle Research
Umumnya, penelitian seluler luar biasa untuk analisis sitotoksisitas awal, pemahaman tentang kemungkinan mekanisme interaksi dengan sel. Tetapi ini adalah lingkungan mikro in vivo yang jauh lebih rumit. Memahami bagaimana bahan keluarga graphene berperilaku dalam lingkungan mikro korosif yang lembab juga sangat penting. Biokompatibilitas material famili graphene tidak terlepas dari konsentrasi, jenis gugus fungsi, jenis famili graphene, ukuran, dan bentuk. Namun mekanismenya masih perlu diteliti lebih lanjut secara detail dan menyeluruh. Namun, penilaian bio-safety in vivo relatif tidak banyak, terutama biokompatibilitas dan biodistribusi jangka panjang, yang perlu kita perhatikan lebih lanjut. Meskipun beberapa makalah mengangkat kekhawatiran tentang keamanan hayati, potensi keserbagunaan yang ditawarkan oleh keluarga graphene secara unik telah menjadikannya kandidat pilihan yang kompetitif untuk aplikasi biomedis.
Aktivitas Antibakteri Bahan Keluarga Grafena
Pembentukan kembali tulang dan pembentukan tulang baru tidak dapat sepenuhnya berhasil tanpa lingkungan mikro yang steril dari defek tulang. Faktanya, pengobatan defek tulang infektif masih menjadi tantangan besar [59]. Karena cacat tulang yang besar dan masalah infeksi, pengobatannya sulit dan pasien membutuhkan masa pemulihan jangka panjang. Dengan demikian, kemampuan penghambatan bakteri bahan keluarga graphene sangat membantu. Bahan famili graphene diyakini memiliki kemampuan antibakteri (Tabel 1). Liu dkk. mengusulkan mekanisme antimikroba tiga langkah, termasuk (1) deposisi sel awal pada bahan berbasis graphene, (2) stres membran yang disebabkan oleh kontak langsung dengan nanosheet yang tajam, dan (3) oksidasi independen anion superoksida berikutnya [60]. Namun, Mangadlao et al. berpikir bahwa permukaan graphene terutama bertanggung jawab untuk aktivitas antimikroba dan bukan tepinya. Ketika kontak dengan bakteri, graphene berfungsi sebagai akseptor elektron yang memompa elektron menjauh dari membran bakteri menciptakan stres oksidatif independen [61]. Sementara itu, Li dkk. memberikan wawasan baru untuk pemahaman yang lebih baik tentang tindakan antibakteri film graphene. Mereka berpendapat bahwa aktivitas antibakteri bahan keluarga graphene tidak berasal dari kerusakan yang dimediasi spesies oksigen reaktif (ROS), tetapi melalui interaksi transfer elektron dari membran mikroba ke graphene [62], sedangkan Panda et al. membuktikan bahwa pengaruh sinergis mekanisme transfer elektron nonoksidatif dan stres oksidatif yang dimediasi ROS pada bakteri menginduksi peningkatan aktivitas antimikroba dari film GO-metal yang diturunkan secara alami [63].
Meskipun masih belum pasti bagaimana sifat fisikokimia lembaran berbasis graphene mempengaruhi aktivitas antimikrobanya, kemampuan antibakteri dari bahan keluarga graphene layak untuk dipelajari dan dimanfaatkan lebih lanjut.
Materi Keluarga Grafena Memediasi Sel Menjadi Diferensiasi Osteogenik dan Mempromosikan Regenerasi Tulang Di Vivo
Banyak ahli telah menunjukkan bahwa graphene tidak hanya memungkinkan perlekatan dan proliferasi sel (misalnya, sel punca pulpa gigi [64, 65], sel punca sumsum tulang [8, 20, 66, 67], sel punca ligamen periodontal [68] ], osteoblas manusia [69], sel fibroblas [70], sel tumor [43]) tanpa tanda-tanda sitotoksisitas yang jelas tetapi juga dapat menginduksi sel awal diferensiasi osteoblastik dan menghasilkan mineralisasi derajat tinggi [20, 64,65,66,67, 68]. Saat ini, banyak tim dengan susah payah melakukan banyak penelitian untuk merancang strategi baru dalam menerapkan nanomaterial keluarga graphene sebagai scaffold atau aditif pada scaffold, sebagai pelapis pada permukaan material substrat, sebagai panduan membran regenerasi tulang, dan sebagai pembawa obat. (Gbr. 2). Mereka mencoba menggunakan bahan keluarga graphene untuk meningkatkan sifat tertentu dari bahan substrat lebih jauh dan memberikan karakter bioaktif pada komposit berbasis substrat.
A. Bahan famili graphene sebagai scaffold atau bahan penguat pada scaffold untuk regenerasi tulang. B. Bahan keluarga graphene sebagai pelapis ditransfer ke substrat untuk regenerasi tulang. C. Keluarga Graphene sebagai aditif dalam membran tulang terpandu. D. Bahan keluarga graphene sebagai sistem penghantaran obat memfasilitasi regenerasi tulang
Material Keluarga Grafena sebagai Perancah atau Bahan Penguat di Perancah
Strategi paling umum untuk rekayasa jaringan tulang adalah mensimulasikan proses alami pembentukan kembali dan regenerasi tulang. Strategi ini dapat dipenuhi oleh scaffold tiga dimensi (3D) biokompatibel, biodegradable, dan osteokonduktif atau osteoinduktif [3]. Scaffold semacam ini dapat menawarkan lingkungan mikro yang ideal untuk meniru matriks ekstraseluler (ECM) untuk perlekatan sel osteogenik, migrasi, proliferasi, dan diferensiasi serta untuk pembawa faktor pertumbuhan [6]. Grafena sebagai scaffold biokompatibel yang menjanjikan dapat membuat luas permukaan yang besar tersedia untuk penyebaran sel dan bahkan diferensiasi osteogenik dalam substrat [20]. Misalnya, busa graphene 3D yang digunakan sebagai substrat kultur untuk sel punca mesenkim manusia (hMSC) memberikan bukti bahwa mereka mampu mempertahankan viabilitas sel punca dan mempromosikan diferensiasi osteogenik [66]. Selain itu, scaffold 3D graphene (3DGp) serta lapisan 2D graphene (2DGp) terbukti mampu menginduksi diferensiasi sel punca ligamen periodontal (PDLSC) menjadi osteoblas dewasa dengan tingkat mineralisasi yang lebih tinggi dan gen terkait tulang yang diregulasi dan protein pada graphene, dengan atau tanpa menggunakan induktor kimia [68].
Saat ini, beragam biomaterial yang berfungsi sebagai perancah bermunculan seperti jamur. Perancah sintetis yang berpotensi cocok untuk digunakan dalam regenerasi tulang termasuk kalsium fosfat, seperti hidroksiapatit (HA) [71]; -trikalsium fosfat (β-TCP) [72]; sintetis atau bio-polimer, seperti asam poli-laktat (PLA) [73], asam poli-glikolat (PLGA) [74], polikaprolakton (PCL) [75], kitosan (CS) [1], dan kolagen [76 ]; dan komposit dari bahan yang disebutkan di atas [77, 78]. Tapi sekarang, salah satu perhatian terpenting adalah sifat mekanik perancah. Karena tulang alami menunjukkan sifat biomekanik super-elastis dengan nilai modulus Young dalam kisaran 7–27 GPa [79], perancah yang ideal harus meniru kekuatan, kekakuan, dan perilaku mekanis tulang alami. Bahan family graphene dapat ditambahkan sebagai bahan perkuatan pada scaffolds yang bertujuan untuk memperkuat sifat mekanik dan meningkatkan karakterisasi fisikokimia. Misalnya, perancah PCL murni memiliki kekuatan tarik 1,61 MPa, perpanjangan 122%, dan modulus Young 7,01 MPa. Penambahan GO (2%) menghasilkan peningkatan yang cukup besar dalam kekuatan tarik hingga 3,50 MPa, perpanjangan hingga 131%, dan modulus Young hingga 15,15 MPa [80].
Dirangsang oleh keberhasilan menggunakan bahan keluarga graphene sebagai bahan penguat, banyak tim menggabungkan biokompatibilitas yang disediakan oleh sintetis atau bio-polimer dengan sifat fisik yang luar biasa dari bahan keluarga graphene. Mereka berharap untuk mencapai perancah komposit yang ideal dengan sifat mekanik yang lebih baik, porositas yang sesuai, desain struktural, dan biokompatibilitas yang sangat baik, untuk mendukung dan menginduksi pembentukan tulang baru.
Keluarga Grafena dengan Bahan Berbasis Kalsium Fosfat
Tulang manusia terdiri dari 30% bahan organik, sebagian besar kolagen, dan 70% bahan anorganik, sebagian besar hidroksiapatit (HA; Ca10 (PO4 )6 (OH)2 ) [81, 82]. Bahan berbasis kalsium fosfat sintetis seperti HA, -tricalsium phosphate (β-TCP), dan semen kalsium fosfat (CPC) adalah bahan scaffolding yang populer karena komposisi dan strukturnya yang mirip dengan fase mineral alami tulang dan pembentuk tulang yang baik. kemampuan [83,84,85]. Khususnya, karena kemampuan osteokonduksi dan osteoinduksi yang baik dari HA [86], telah lama digunakan secara luas sebagai cangkok tulang buatan dalam bedah ortopedi atau maksilofasial untuk memperbaiki area defek tulang [11, 71]. Namun, kelemahan yang melekat pada bahan HA harus diperbaiki, seperti kesulitan membentuk, kerapuhan yang khas, dan ketangguhan patah yang rendah [87, 88]. Dilaporkan bahwa komposit HA yang diperkuat material keluarga graphene dikembangkan dan secara signifikan meningkatkan ketangguhan fraktur dan kinerja biologis. Misalnya, komposit HA/graphene dibuat dengan spark plasma sintering (SPS), yang memberikan kekuatan yang dapat diterima HA [89]. Raucci dkk. menggabungkan HA dengan GO dalam dua pendekatan berbeda:pendekatan sol-gel in situ dan pendekatan biomimetik. HA–GO yang diperoleh dengan pendekatan sol-gel in situ meningkatkan viabilitas sel hMSC dan menginduksi diferensiasi osteoblastik tanpa menggunakan faktor osteogenik. HA-GO yang dibentuk melalui pendekatan biomimetik mempertahankan viabilitas dan proliferasi sel [90]. Selain itu, graphene oxide (rGO) tereduksi juga dapat digunakan sebagai bahan penguat untuk HA. Ketangguhan patah komposit HA–rGO mencapai 3,94 MPa m
1/2
, peningkatan 203% dibandingkan dengan HA murni. HA-rGO meningkatkan proliferasi sel dan diferensiasi osteoblastik, yang dinilai oleh aktivitas alkaline phosphatase (ALP) dari sel-sel osteoblas manusia [91]. Selain itu, Nie et al. berhasil mensintesis perancah komposit berpori 3D rGO dan nano-hidroksiapatit (nHA) (nHA@rGO) melalui perakitan sendiri. Solusi GO dicampur dengan suspensi air nHA yang dipanaskan untuk menginduksi proses perakitan sendiri. Akhirnya, produk reaksi dikeringkan-beku untuk mendapatkan perancah berpori 3D. Perancah nHA@rGO dapat secara signifikan memfasilitasi proliferasi sel, aktivitas ALP, dan ekspresi gen osteogenik dari sel punca mesenkim tulang tikus (rBMSCs). Dan percobaan in vivo menjelaskan bahwa perancah berpori 20% nHA-incorporated rGO (nHA@rGO) dapat mempercepat penyembuhan cacat calvarial melingkar pada kelinci [92]. Selain itu, tidak hanya komponen ganda tetapi juga trikomponen memiliki kinerja yang sangat baik dengan sitokompatibilitas yang baik dan peningkatan sifat hidrofilik dan mekanik [93,94,95].
Trikalsium fosfat, analog kalsium fosfat, adalah kalsium fosfat tersier yang juga dikenal sebagai abu tulang [Ca3 (PO4 )2 ]. Ini berfungsi sebagai sumber kalsium dan fosfor yang melimpah, yang dapat dengan mudah diserap. Beta-tricalsium phosphate (β-TCP) sangat biokompatibel dan menciptakan jaringan interlocking yang dapat diserap kembali di dalam lokasi defek untuk mempercepat penyembuhan [96]. Wu dkk. berhasil mensintesis disk 2D -TCP-GO dan perancah 3D -TCP-GO. Dibandingkan dengan -TCP dan kontrol kosong, disk 2D -TCP-GO secara signifikan meningkatkan proliferasi, aktivitas ALP, dan ekspresi gen osteogenik hBMSC dengan mengaktifkan jalur pensinyalan terkait-Wnt, yang menunjukkan sifat osteostimulasi in vitro yang sangat baik dari GO- modifikasi -TCP [85]. Diketahui bahwa jalur pensinyalan kanonik Wnt memainkan peran nontrivial dalam mengatur aktivitas seluler seperti proliferasi sel, diferensiasi, dan morfogenesis [97, 98]. Studi in vivo menunjukkan bahwa perancah 3D -TCP-GO memiliki pembentukan tulang baru yang lebih besar pada defek calvarial daripada perancah TCP murni (Gbr. 3) [85]. Perancah baru, semen kalsium fosfat yang menggabungkan perancah nanokomposit GO-Cu (CPC/GO-Cu) memfasilitasi adhesi dan diferensiasi osteogenik rBMSC, yang dikonfirmasi bahwa mereka dapat meningkatkan regulasi ekspresi Hif-1α dalam rBMSC dengan mengaktifkan Erk1/2 jalur pensinyalan dan menginduksi sekresi faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF) dan protein BMP-2. Selanjutnya, perancah CPC/GO-Cu ditransplantasikan ke tikus dengan cacat calvarial berukuran kritis dan hasilnya menunjukkan bahwa perancah (CPC/GO-Cu) secara signifikan mempromosikan angiogenesis dan osteogenesis di daerah cacat [99].
Ilustrasi skema untuk perancah -TCP dan -TCP-GO merangsang osteogenesis in vivo. Analisis mikro-CT dan analisis histologis kemampuan pembentukan tulang in vivo untuk perancah -TCP dan -TCP-GO setelah ditanamkan dalam cacat tulang tengkorak kelinci selama 8 minggu. Direproduksi dari ref. [85] dengan izin dari Journal of Carbon
Graphene Family with Chitosan
Chitosan (CS), a highly versatile biopolymer, derived from the shells of crustaceans [1, 87], has a hydrophilic surface that promotes cell adhesion and proliferation and its degradation products are nontoxic. Chitosan is biocompatible, osteoconductive, hemostatic, and can be easily converted into the desired shapes [2]. Besides, chitosan can promote bone matrix of mineralization [1] and minimize the inflammatory response after implantation [100]. All properties above make chitosan especially attractive as a bone scaffold material. But the most challenging part is the obtainment of CS-based scaffolds with good mechanical properties and processability [101]. Interestingly, CS/GO scaffolds have high water-retention ability, porosity, and hydrophilic nature [101, 102]. The CS-based 3D materials were enriched with GO in different proportions (0.5 wt% and 3 wt%). The new developed CS/GO 3 wt% scaffold was expected to be ideally designed for bone tissue engineering applications in terms of biocompatibility and properties to promote cell growth and proliferation [103]. Another CHT/GO scaffold with 0, 0.5, and 3 wt.% GO were prepared by freeze-drying method. Similarly, the CS/GO 3 wt% scaffolds significantly enhanced the ALP activity in vitro and the new bone formation in vivo, suggesting a positive contribution of 3 wt% GO to the efficiency of osteogenic differentiation process (Fig. 4) [3]. All results proved that CS/GO scaffolds could be a feasible tool for the regeneration of bone defects, and the addition of a 3 wt% of GO to material composition could have a better impact on cell osteogenic differentiation.
a ALP activity in mice calvaria defects implanted with CHT/GO and b histomophometric analysis of Masson Goldner trichrome-stained sections. ###p < 0.001 vs CHT; **p < 0.01 vs control; ***p < 0.001 vs control. Reproduced from ref. [3] with permission from the Journal of Scientific Reports
Moreover, some tricomponent composites, such as CS, GO, and HA can release more Ca and P ions compared to the pure HA nanoparticles, displaying a high bioactivity of the composite scaffold [87]. Ravichandran et al. fabricated a unique composite scaffold, GO–CS–HA scaffold, and the incorporation of GO enhanced the tensile strength of CS up to 8.2 MPa and CS–HA to 10 MPa. And the results demonstrated that GO–CS–HA scaffolds facilitated cell adhesion and proliferation, meanwhile showed improved osteogenesis in in vitro tests [2]. Another tricomponent composite scaffold, containing CS, gelatin (Gn), and different concentrates of graphene oxide (0.1%, 0.25%, 0.5%, and 1% (w /v ) GO) showed better physic-chemical properties than CS/Gn scaffolds. The addition of GO at the concentration of 0.25% to CS/Gn scaffolds exhibited enhanced absorption of proteins, extensive apatite deposition. The 0.25% GO/CS/Gn scaffolds were cyto-friendly to rat osteoprogenitor cells, and they enhanced differentiation of mouse mesenchymal stem cells into osteoblasts in vitro (Fig. 5). The tibial bone defect filled with 0.25% GO/CS/Gn scaffolds showed the growth of new bone and bridging the defect area, indicating their biocompatible and osteogenic nature [104]. Thus, no matter bicomponent or tricomponent composites scaffolds, the addition of graphene family materials to chitosan can favorably improve the mechanical properties and regulate the biological response of osteoblasts, promoting osteogenic differentiation.
a MTT assay after incubation of CS/Gn scaffolds and 0.25% GO/CS/Gn scaffolds with media for 48 h. The asterisk indicates a significant increase versus control, and the pound sign indicates a significant decrease versus control (p < 0,05). b , c Expression of osteogenic-related genes (RUNX2, ALP, COL-1, and OC) in mMSCs cultured on CS/Gn scaffolds and 0.25% GO/CS/Gn scaffolds for 7 and 14 days measured by quantitative RT-PCR. Reproduced from ref. [104] with permission from the Journal of International Journal of Biological Macromolecules
Graphene Family with Other Synthetic or Bio-polymers
Sponge scaffolds of type I collagen, the major organic component of bone [81], have been clinically applied as scaffolds to regenerate bone tissue [105, 106]. Because collagen scaffolds (elastic moduli:14.6 ± 2.8 kPa) are relatively soft, the combination with GO is expected to enhance the elastic modulus of collagen scaffolds and to improve the osteogenic differentiation of MSCs for bone regeneration. The covalent conjugation of GO flakes to 3D collagen scaffolds (elastic moduli:38.7 ± 2.8 kPa) increased the scaffold stiffness by threefold and did not negatively affect the viability of BMSCs. The enhanced osteogenic differentiation observed on the stiffer scaffolds were likely mediated by BMSCs mechanosensing because the molecules involved in cell adhesion to stiff substrates were either upregulated or activated [107]. Moreover, the development of new biomaterials utilizing graphene family materials with high osteogenic capacity is urgently pursued (Table 2).
Up to now, these improved tricomponent systems for bone tissue engineering scaffolds possess good biocompatibility, which can promote cell attachment, proliferation, and have been reported mechanical properties matchable to those of natural bone. But the response to specific biological signals expressing, as well as the capabilities of enhancing cell differentiation and finally bone tissue regeneration, still needs to be explored further. Moreover, it has been reported that the pore structure (pore size, pore morphology, and pore orientation) and the elasticity of scaffolds were manipulated to regulate osteogenesis [108,109,110]. However, due to the complicated structure of porous and different elasticity accurately controlled of the scaffolds, it remains a major challenge to individually design specific pore architectures and elasticity 3D porous scaffolds that can stimulate bone regeneration. With the rapidly development of the science and technology, the emerging of the 3D-printing method may overcome this problem and open an avenue for bone tissue regeneration [85]. The in vitro bioactivity and excellent in vivo bone-forming ability of graphene family nanomaterials present a new prospect of developing a broad new type of multifunctional scaffolds for biomedical applications. Thus, we believe that the unraveled the molecular mechanisms behind will be revealed soon and graphene family materials still have attractive potential of applications in bone regeneration waiting us to explore.
Graphene Family Materials as Coating
Graphene family materials have been widely applied in diverse forms of medical applications for bone regeneration. As a coating, graphene family materials can be transferred on two dimensional (2D) flat non-metal or metal substrates to induce spontaneous osteogenic differentiation of several types of mesenchymal stem cells (MSCs) [64]. Nayak et al. transferred graphene to four 2D non-metal substrates (polydimethylsiloxane (PDMS), polyethylene terephthalate (PET), glass slide, and silicon wafer with 300 nm SiO2 (Si/SiO2 ).) and investigated the influence of graphene on BMSCs differentiation. They summarized that the graphene coating was cytocompatible and contributed to enhance the osteogenic differentiation of BMSCs at a rate comparable to differentiation under the influence of BMP-2 in the osteogenic medium [20]. Similarly, Elkhenany et al. found that goat BMSCs, seeded on 2D graphene-coated plates underwent osteoblastic differentiation in culture medium without the addition of any specific growth factors [8]. Simultaneously, Lee et al. tried to explain the origin of how graphene coating could accelerate stem cell renewal and differentiation. They deemed that the strong noncovalent binding abilities of graphene allowed it to serve as a preconcentration platform for osteoblastic inducers, which facilitated BMSCs osteogenic differentiation [67]. The capability of graphene in modulating osteogenic differentiation is evident. How about its derivatives? GO coatings and rGO coatings all showed favorable cytocompatibility and enhanced spontaneous osteogenic differentiation by upregulating levels of ALP activity [111, 112].
Since titanium (Ti) and medical-grade Ti alloy have been extendedly applied in the orthopedic and dental fields [113,114,115], satisfactory osseointegration for titanium and its alloys is still a major challenge and need to be explored deeply in order to help the clinicians to promote the success or survive rate of implants and diminish the likely complications encountered after their placement [114, 116, 117]. Graphene family materials coated titanium and its alloys, serving as a new method to improve their capabilities of osseointegration at the tissue-implant interface, attracted widespread attention. For example, GO-coated titanium enhanced cell proliferation, upregulated levels of ALP activity and gene expression level of osteogenesis-related markers, and promoted the protein expression of BSP, Runx2, and OCN [117]. Qiu et al. made different thickness GO coatings on the pure titanium surfaces respectively by cathodal electrophoretic deposition. Interestingly, with the increasing thickness of GO, the ALP-positive areas improved, ECM mineralization increased [118]. Moreover, Zeng et al. firstly fabricated GO/HA composite coatings by electrochemical deposition technique on Ti substrate. The addition of GO facilitated both the crystallinity of deposited apatite particles and the bonding strength of the as-synthesized composite coatings [119]. It is well known that hydrophilic surface is biocompatible compared to hydrophobic surface. In the case of rGO coating, the rapid adsorption of serum protein improves hydrophilia of graphene surface and enhances cell adhesion. Jia et al. used evaporation-assisted electrostatic assembly and one-pot assembly to fabricate 2D GO-coated Ti and rGO-coated Ti, with tailored sheet size and surface properties. Compared to the contact angle of titanium (60.4°), the contact angle of GO-coated Ti and rGO-coated Ti were 20° and 14.2°, respectively, indicating the successful interfacial assembly of graphene and excellent wettability properties. The rGO-coated Ti elicited better cell adhesion and growth than bulk GO, while the latter evoked higher activity of osteogenic differentiation [120].
Osseointegration is a complicated biological process determined by the surface properties of implants [114]. The graphene-based coatings above all lack 3D morphology. The 3D porous surface structure of coating can mimic the special macrostructures of the nature bone tissues [115]. Qiu et al. first synthesized 3D porous graphene-based coating on the pure titanium plates (GO@Ti and rGO@Ti). Water contact angles showed super hydrophilic surfaces of GO@Ti and rGO@Ti. Surface wettability exerts great effect on the biocompatibility of materials, which is strongly related to biomolecules adsorption [121]. GO@Ti and rGO@Ti both showed the excellent cytocompability and the optimal capability of osteoinduction [39]. Morin and his co-workers even transferred single or double chemical vapor deposition (CVD) grown graphene coatings onto 3D objects with differences in 3D geometries and surface roughness, such us dental implant, locking compression plate and mandible plate (Fig. 6) [64]. CVD is a very stable coating fabrication method, with substrate-independent properties and versatile surface functionalization. Besides, surface active CVD coatings are good platforms for immobilizing biomolecules, which is very important to bone regeneration [122].
a The calvarial defects of rats were enclosed with a GO-Ti membrane. b New bone formation of the rat calvarial defects after the implantation of Ti or GO-Ti membrane at postoperative week 8. *p < 0.05 vs control; #p < 0.05 vs Ti. c Images of HE staining of the rat calvarial defects after the implantation of Ti or GO-Ti membrane at postoperative week 8. Reproduced from ref. [128] with permission from the Journal of Applied Spectroscopy Reviews
Overall, the strategy of applying graphene family materials as coating onto a surface is charming. Through currently available techniques or methods, such as CVD [123], electrochemical deposition [119], with diverse substrates (e.g. polymers, metals), graphene, and its derivatives can be obtained efficiently, with dimensions ranging from nanometer to macroscopic scales [120]. Then, graphene family nanomaterials can be transferred onto the substrate, either as 2D coatings/films/sheets or 3D porous structures of coating, to enable the binding of biomolecules, absorb the serum protein, and facilitate osteogenic differentiation of stem cells. But the different physical and chemical properties of the substrates and the type or frequent use of chemical inducers for osteogenic differentiation (e.g., dexamethasone, bone morphogenetic protein-2) that may cover up the effects exerted by graphene family materials alone [65]. Therefore, these methods still require to be well-directly improved and further studied.
Graphene Family as an Additive in Guided Bone Membrane
Barrier membranes are standardly used in oral surgical procedures, applying in guided tissue regeneration (GTR) and guided bone regeneration (GBR), for the treatment of periodontal bone defects and peri-implant defects, as well as for bone augmentation [124, 125]. GBR is considered to be one of the most promising methods for bone tissue regeneration. The concept of GBR is using a non-resorbable or absorbable membrane serving as a barrier to prevent the ingrowth of soft connective tissue into the bone defect and offer a space to “guide” the bone reconstruction [126, 127]. An ideal GBR membrane should have excellent biocompatibility and mechanical property to promote the regeneration of bone tissues and prevent soft-tissue ingrowth. Ti membrane is a non-resorbable membrane with excellent mechanical properties for the stabilization of bone grafts. Park et al. fabricated GO-coated Ti (GO-Ti) membranes, with increased roughness and higher hydrophilicity. GO endowed the pure Ti membranes better biocompatibility and enhanced the attachment, proliferation, and osteogenesis of MC3T3-E1 in vitro. Moreover, GO-Ti membranes were implanted into rat calvarial defects (Fig. 6) and new bone formation significantly in full-thickness calvarial defects without inflammatory responses was observed [128].
However, non-resorbable membranes need to be removed by a second operation. Thus, a resorbable membrane is recommended owing to avoid a second intervention during operation, which can diminish the risk of infection and the loss of the regenerated bone. But the resorbable membranes made of collagen or chitosan usually has poor mechanical property. The addition of graphene family materials improves the weaknesses of resorbable membrane. For instance, De et al. attempted to prepare absorbable collagen membranes enriched with different concentrations of GO. The presence of GO on the membrane altered the mechanical features of the membrane, by conferring lower deformability, improving stiffness, and increasing roughness [129]. Tian et al. made 3D rGO (3D-rGO) porous films, which can accelerate cell viability and proliferation, as well as significantly enhanced ALP activity and osteogenic-related gene expressions [130].
Although pristine graphene is basically incompatible with organic polymer to form homogeneous composite, and even decrease the cell viability in some cases if the amount of graphene is excessive [131]. The incorporation of graphene family materials can enhance the bioactivity and mechanical properties of composite membranes. Because of the potent effects on altering mechanical drawbacks, stimulating osteogenic differentiation, and exhibiting superior bioactivity, graphene family material-modified membranes can be applied effectively to GBR.
Graphene Family Materials as Drug Delivery System (DDS)
Due to their small size, intrinsic optical properties, large specific surface area, low cost, and useful noncovalent interactions with aromatic drug molecules, graphene family materials exhibit excellent efficacy as delivery vehicles of genes and biomolecules. Moreover, simple physisorption via π-π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interaction is able to assist in high drug loading of hydrophobic drugs without compromising potency or efficiency [38]. The therapeutic efficacy of drugs is always related to the drug delivery carrier, which should enable the loading of large doses, controlled release, and retention of the bioactivity of the therapeutic proteins [132]. At present, anticancer drugs, including doxorubicin [133,134,135,136,137], paclitaxel [138, 139], cisplatin [140], and methotrexate [141, 142] loaded by graphene family nanomaterials showed amazing cancerous effect for the selective killing of cancer cells.
For better bone regeneration, we sometimes need the help of osteogenic drug or macromolecular osteogenic protein. It was reported that the adsorbed drugs or loaded growth factors on graphene or its derivatives could enhance the osteogenic differentiation of cells due to the increased local concentration [143]. For example, simvastatin (SIM) chosen as a model drug was loaded on the 3D porous scaffolds, which were made of silk fibroin (SF) and GO. SIM is an inhibitor of the competitive 3-hydroxy-3-methyl coenzyme A (HMG-CoA) reductase [144]. The effects of SIM on bone formation are associated with an increase in the expression of bone morphogenetic protein-2 (BMP-2) mRNA and enhanced the vascular endothelial growth factor (VEGF) expression [145, 146]. SIM can release sustainedly (30 days), and the release rate was relevant to the GO content within the scaffolds. In vitro, compared with the blank scaffolds, the SF/GO/SIM showed better biocompatibility, and the cells cultured on them exhibited faster proliferation rate [147]. Dexamethasone (DEX) is an osteogenic drug for which can facilitate osseointegration. Jung et al. firstly loaded DEX on rGO-coated Ti by π-π stacking. The loading efficiency of DEX on rGO-Ti was 31% after drug loading for 24 h and only 10% of total loaded DEX was released for 7 days, indicating that the drug delivery system can induce a long-term stimulation of stem cells for osteogenic differentiation. The DEX/rGO-Ti significantly facilitated MC3T3-E1 cells growth and differentiation into osteoblasts [143]. Similarly, Ren et al. also employed the GO-Ti and rGO-Ti as drug vehicles to absorb DEX. The presence of DEX-GO and DEX-rGO helped to promote the cell proliferation and largely enhanced osteogenic differentiation [115]. The graphene family materials coating on Ti alloys with controlled drug delivery can stimulate and enhance cellular response around implant surface to reduce the osseointegration time, expected to be applied for various dental and biomedical applications [143].
Not only small molecular osteogenic drug, but also macromolecular proteins can be loaded by graphene family materials for bone regeneration. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are the most potent osteoinductive protein for bone regeneration. Thus, BMP-2 was loaded on the surface of Ti/GO through π-π stacking and the interaction between negatively charged carboxylic groups at the edges of GO and positively charged amino acid residues of BMP-2 [132]. Ti/GO/BMP-2 exhibited the high loading and the sustained release of BMP-2 with preservation of its 3D conformational stability and bioactivity. In vitro, the capability of Ti/GO/BMP-2 is to enhance osteogenic differentiation of hBMSCs. In a mouse calvarial defect model, compared to Ti/BMP-2 implants, Ti/GO/BMP-2 implants around had much more extensive bone formation [132]. Xie et al. used GO-modified hydroxyapatite (HA) and GO-modified tricalcium phosphate (TCP) as an anchor for adsorbing BMP-encapsulated BSA- nanoparticles (NPs) respectively. The charge balance and BMP-2 sustained release capability of the new scaffolds synergistically improved BMSCs proliferation, differentiation, and bone regeneration in vivo [148]. Poor osteointegration and infection are the most serious complications leading to failures of Ti implantation [10]. Han et al. incorporated GO onto polydopamine (PDA)-modified Ti scaffolds. Then, BMP-2 and vancomycin (Van) were separately encapsulated into gelatin microspheres (GelMS). After that, drug-containing GelMS were loaded on GO/Ti scaffolds and anchored by the functional groups of GO (Fig. 7). The new scaffolds were endowed with dual functions of inducing bone regeneration and preventing bacterial infection [149]. Substance P (SP) is a highly conserved 11 amino acid neuropeptide [150], involved in many processes, such as the regulation of inflammation, wound healing, and angiogenesis, and it is expected to promote MSC recruitment to the implants [151]. Therefore, apart from BMP-2, La et al. added this peptide, SP, on the surface of GO-coated Ti. The dual delivery system via GO-coated Ti showed sustained release of BMP-2 and SP and the potential of SP for inducing migration of MSCs. In vivo, Ti/GO/SP/BMP-2 group showed the greater new bone formation in the mouse calvaria than Ti/GO/BMP-2 group may be due to the MSCs recruitment by SP to the implants [152].
Schematics and scanning electron micrographs of the preparation the new GO/Ti scaffold:BMP2- and Van-loaded CGelMS were immobilized on the GO/Ti scaffold through electrostatic interactions between the functional groups of GO and CGelMS. Reproduced from ref. [149] with permission from the Journal of Biomaterials Science
Currently, more and more teams get down to designing new drug delivery system to improve the practical applications. The loading of large doses, controlled release, and retention of the bioactivity of the therapeutic proteins are still difficulty in research on drug delivery system.
Conclusions
Studies on the graphene family materials on biological applications is emerging rapidly, especially their potential applications for bacteria inhibition and inducing stem cell osteogenic differentiation. Before their biological applications are considered for clinical trial, the biocompatibility of graphene family materials is of vital importance. However, the challenges exist and must be overcome. These challenges include a thorough understanding of the graphene-cell (or tissue, organ) interaction and cellular uptake mechanism as well as mechanism(s) of potential toxicity. We summarize and analyze several articles and conclude that the cytotoxicity and in vivo biocompatibility of graphene family materials are influenced by numerous factors, including surface functionalization, concentration, size, and shape. At low concentration, graphene family materials are cytocompatible, with little negative influence on cell morphology, viability, and proliferation. Furthermore, it was reported that graphene family materials with flat shapes having better biocompatibility, because the flat shape materials were expected to have minor interaction with the cellular membranes [47]. Although the different criteria were used to define the size scale and shape of graphene and its derivatives, it was true that nano-sized graphene family materials were much safer for biomedical applications [54]. Size-control synthesis of graphene family materials needs to be considered prudently in subsequent researches. Moreover, the major challenge for researchers lies in understanding how graphene family materials behave in complicated microenvironment and establishing the long-term biocompatibility of graphene and its derivatives. Thus, researchers should spare no efforts to keeping studying the bio-safety of graphene family materials in vivo, as well as in vitro, to further understand the intricate interaction between cells and the materials. Although some papers raise concerns about bio-safety, after better control of the modifying of graphene family materials during synthesis, the potential versatility that graphene family uniquely offers has made it a competitive candidate of option for biomedical applications.
On the one hand, a lot of researches have pointed out that graphene family materials possess the capability of bacteria inhibition, due to their functional chemical groups, sharp edges, and synergistic effect with other drugs. Besides, bone remolding and regenerating successfully in an infective bone defect area is challenging. Peri-implant infection and poor osseointegration are also major challenges we confront. The use of graphene family materials in the design and development of antimicrobial bone regeneration application will capture tremendous attention in the future.
On the other hand, lots of teams painstakingly did researches to design and fabricate the new strategies of applying graphene family materials in bone tissue engineering. 3D graphene-based scaffold is a promising biocompatible scaffold, which can enhance pre-osteoblasts or stem cells osteoblastic differentiation. Graphene family materials also can be added as a reinforced material aiming to strengthen the composite scaffold mechanical properties and improve physicochemical characterization. In addition, the strategy of applying graphene or its derivatives as coating onto a surface is charming, which is expected to possess the antibacterial activity and better osseointegration, especially the 3D coating. It has been generally hypothesized that the surface characteristics of graphene family materials including nanostructures, surface roughness, protein absorption ability, electrostatic interactions, and surface hydrophilicity, exert an enormous effect on the molecular pathways which control the fate of stem cells [39, 115]. The 3D structure of scaffold or coating allows nutrients to be freely delivered, which influences the biocompatibility of the graphene family. But the manufacturing method of 3D scaffold or coating is relatively difficult and complicated. However, with the rapidly development of the science and technology, the emerging of the 3D-printing method may overcome this problem and open an avenue for bone tissue regeneration.
Moreover, graphene family materials show great potential in GBR and DDS as well. Graphene family materials improve poor mechanical property of the resorbable membranes made of collagen or chitosan without compromising their intrinsic property. Osteogenic drug or macromolecular osteogenic protein can be adsorbed on graphene or its derivatives via π-π stacking, hydrogen bonding, and electrostatic interaction with high loading and good efficiency. Taking the varied merits into consideration, graphene family materials hold great potential to bone tissue regeneration.
Considering that many supreme properties graphene and its derivatives have, especially in vitro osteogenesis enhancing ability and excellent in vivo bone-forming ability, although they still have drawbacks, graphene family materials still are promising candidates used for bone regeneration applications.
