Aptamer-modified Magnetic Nanosensitizer untuk pencitraan MR in vivo Kanker yang mengekspresikan HER2
Abstrak
Tujuan dari penelitian ini adalah pengembangan agen kontras yang dapat ditargetkan reseptor faktor pertumbuhan epidermal 2 (HER2) manusia untuk pencitraan resonansi magnetik (MRI) dengan sensitivitas magnetik yang tinggi. Nanosensitizer magnetik anti-HER2 yang dimodifikasi aptamer (AptHER2 -MNS) disiapkan dengan konjugasi dengan aptamers yang dimodifikasi 5′-tiol dan nanocrystals magnetik maleimidilasi (MNCs). Karakteristik fisikokimia dan kemampuan penargetan AptHER2 -MNS dikonfirmasi, dan afinitas yang mengikat (Kd ) ke protein HER2 dari AptHER2 -MNS adalah 0,57 ± 0,26 nM. Kemampuan peningkatan kontras MRI in vivo juga diverifikasi pada model tikus sel kanker HER2+ (NIH3T6.7)-xenograft (n = 3) pada instrumen MRI klinis 3T. Eksperimen kontrol dilakukan dengan menggunakan MNC yang tidak berlabel. Hasilnya menunjukkan bahwa peningkatan kontras hingga 150% dicapai di wilayah tumor pada gambar MR berbobot T2 setelah injeksi AptHER2 -Agen MNS pada tikus yang menerima sel NIH3T6.7.
Latar Belakang
Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2), yang termasuk dalam famili epidermal growth factor receptor (EGFR), memainkan peran kunci dalam keganasan manusia dan diekspresikan secara berlebihan pada sekitar 30% kanker payudara manusia [1] dan pada banyak jenis kanker lainnya. , termasuk karsinoma lambung, kandung kemih, ovarium, dan paru-paru [1,2,3,4]. Pasien dengan kanker payudara yang diekspresikan HER2 cenderung memiliki tingkat kelangsungan hidup yang jauh lebih rendah daripada pasien dengan kanker yang tidak mengekspresikan HER2 [5]. Selain itu, ekspresi berlebih dari HER2 menyebabkan peningkatan metastasis kanker payudara [6,7,8]. Untuk alasan ini, HER2 berfungsi sebagai biomarker penting dalam diagnosis kanker. Dalam pengaturan klinis, HER2 digunakan sebagai penanda biologis yang khas, bersama dengan reseptor estrogen (ER) dan reseptor progesteron (PR), untuk mendiagnosis kanker payudara. Dengan demikian, pasien kanker payudara menerima diagnosis pasti setelah verifikasi histologis tingkat ekspresi HER2, ER, dan PR. Namun, verifikasi histologis bersifat invasif dan hanya dilakukan pada sejumlah lesi yang terbatas. Untuk alasan ini, berbagai penelitian telah dilakukan untuk memvisualisasikan penanda diagnostik non-invasif melalui pemeriksaan radiologis sebelum verifikasi histologis berdasarkan computed tomography [9, 10], positron emission tomography [11,12,13], single-photon emission computed tomography [14,15,16], magnetic resonance imaging (MRI) [17,18,19,20], dan alat pencitraan multimodal [21,22,23].
Nanopartikel besi oksida (IONPs) digunakan dalam berbagai pemeriksaan radiologi non-invasif untuk pengamatan biomarker yang relevan secara klinis [24, 25]. IONP kompatibel dengan pencitraan molekuler karena memiliki sensitivitas atau biokompatibilitas magnetik yang lebih tinggi daripada agen kontras MRI berbasis logam berat lainnya seperti agen kontras berbasis gadolinium (GBCA) atau agen kontras yang mengandung nikel atau kobalt. Secara khusus, meskipun agen kontras MRI yang dikomersialkan dan GBCA dikaitkan dengan masalah yang terkait dengan toksisitas in vivo karena pelepasan Gd
3+
ion, agen kontras MRI berbasis IONP memiliki keamanan in vivo yang lebih tinggi daripada GBCA karena mereka dapat terdegradasi menjadi besi, diserap, atau dihilangkan [26, 27].
Untuk menerapkan IONP untuk pencitraan molekuler, bagian penargetan sangat penting dan dapat berupa bahan kimia, karbohidrat, protein, antibodi, atau aptamers [25, 28, 29]. Di antara molekul-molekul ini, aptamer memiliki struktur tiga dimensi yang stabil dari asam nukleat untai tunggal yang memiliki afinitas dan spesifisitas pengikatan yang tinggi pada molekul tertentu. Afinitas pengikatan Aptamers yang tinggi disebabkan oleh teknik mereka yang berkembang dan evolusi sistematis ligan dengan pengayaan eksponensial (SELEX) [30]. SELEX menggunakan perpustakaan oligonukleotida urutan acak yang sangat besar (~ 10
15
) dapat disediakan oleh sintesis kimia dan disaring secara paralel untuk menemukan aptamer yang memiliki afinitas pengikatan tinggi pada molekul target. Sebagai hasil dari SELEX, aptamers dapat dikembangkan dengan afinitas pengikatan tinggi pada tingkat konsentrasi picomolar secara umum sedangkan biomolekul lain berkisar dari mikromol hingga subnanomole [31, 32]. Dalam kasus aptamers generasi ketiga yang baru dikembangkan, mereka juga memiliki stabilitas in vitro dan in vivo karena peningkatan ketahanannya terhadap DNase atau RNase dengan menggunakan asam nukleat yang dimodifikasi [33, 34]. Untuk alasan ini, aptamers muncul sebagai bagian yang disukai dalam penelitian pencitraan molekuler [35].
Tujuan dari penelitian ini adalah pengembangan agen kontras T2 yang dimodifikasi aptamer berdasarkan nanocrystals magnetik (MNCs) dengan spesifisitas tinggi untuk sel kanker yang mengekspresikan HER2 secara berlebihan. Untuk mencapai tujuan ini, MNC, yang memiliki sensitivitas magnetik tinggi, disiapkan dengan metode dekomposisi termal dan aptamer spesifik HER2 (Kd = 0.42 nM) digunakan. Zat kontras yang disintesis dikarakterisasi dengan menganalisis morfologi, sifat magnetisasi, dan relaksivitas magnet. Selain itu, kami melakukan uji penargetan in vitro dan in vivo terhadap protein HER2 dalam model hewan xenograft tumor yang masing-masing ditanamkan dengan garis sel kanker yang mengekspresikan HER2.
Metode
Materi
TWEEN® 80 (T80), 4-(dimetilamino)piridin, N ,T -dicyclohexylcarbodiimide, triethylamine, dichloromethane anhydrous, iron(III) acetylacetonate, 1,2-hexadecanediol, dodecanoic acid, dodecylamine, dan benzyl ether dibeli dari Sigma-Aldrich (AS), dan 3-maleimidopropionic acid (MPA) dibeli dari TCI Amerika (AS). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco, serum janin sapi, dan larutan antibiotik-antimikotik Gibco® dibeli dari Life Technologies (AS). NIH3T6.7 dibeli dari American Tissue Type Culture (USA). Air yang diolah dengan dietil pirokarbonat (DEPC) dibeli dari Biosesang Inc. (Korea). Aptamer anti-HER2 thiolated [AptHER2 , urutan:5′-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3′ (6:NapdU), modifikasi 5′-SH, 40-mer] dibeli dari Aptamer Science Inc. (Korea).
Sintesis MNC
Nanopartikel oksida besi magnetik monodisperse disintesis menggunakan metode dekomposisi termal Sun [36]. Nanopartikel magnetik ini disebut MNC karena prekursor besi(III) asetilasetonat dan asam oleatnya. Secara singkat, campuran besi(III) asetilasetonat (2 mmol), asam oleat (6 mmol), 1-oktadesen (6 mmol), 1,2-hexadecanediol (10 mmol), dan benzil eter (20 mL) dimasukkan ke dalam labu alas bulat leher tiga dan diaduk secara mekanis. Untuk menghilangkan sisa molekul oksigen dan air, campuran dipanaskan terlebih dahulu hingga 100 °C selama 30 menit. Campuran yang telah dipanaskan sebelumnya dipanaskan hingga 200 °C selama 2 jam dan direfluks pada 300 °C selama 30 menit di bawah aliran nitrogen. Setelah reaktan didinginkan sampai suhu kamar dengan menghilangkan sumber panas, reaktan dimurnikan dengan etil alkohol berlebih. Sentrifugasi dilakukan dalam rangkap tiga untuk memisahkan produk dari residu yang tidak terdispersi. Fe3 O4 produk nanopartikel kemudian didispersikan kembali dalam 5 mL heksana. Produk akhir disintesis dengan mengulangi prosedur yang dijelaskan di atas dengan 100 mg Fe3 O4 dan prekursornya. Morfologi MNC dievaluasi menggunakan mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Jepang). Saturasi magnetisasi dievaluasi menggunakan magnetometer sampel bergetar (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, USA) pada suhu kamar. Kuantitas MNCs dalam produk dianalisis dengan mengukur berat menggunakan thermo-gravimetric analyzer (SDT-Q600, TA Instrument), dan MNCs dicuci sampai kandungan Fe3 O4 mencapai sekitar 80%.
Sintesis Maleimidyl-TWEEN
®
80
Untuk pembuatan maleimidyl T80 (Tm80), 15,3 mmol MPA dan 22,9 mmol N ,T -dicyclohexylcarbodiimide masing-masing dilarutkan dalam 10 mL diklorometana, dan kemudian dicampur. Campuran kemudian ditambahkan ke dalam 20 mL diklorometana yang mengandung 7,6 mmol T80, diikuti dengan penambahan 3,2 mL trietilamina ke dalam campuran. Akhirnya, 22,9 mmol 4-(dimetilamino) piridin dilarutkan dalam 10 mL diklorometana, dan semua reagen dicampur dalam botol 70 mL. Campuran akhir diaduk menggunakan magnet selama 48 jam. Warna campuran berubah dari aprikot menjadi warna anggur merah. Setelah bereaksi selama 48 jam, urea yang mengkristal dihilangkan dengan penyaringan. Untuk menghilangkan diklorometana, reaksi disaring dengan penguapan dalam rotavapor (N-1100, EYELA, Jepang). Produk yang dihasilkan disuspensikan dalam air deionisasi, dan reagen tak terkonjugasi dihilangkan dengan dialisis (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). Produk akhir disiapkan dengan pengeringan beku. Tm80 yang disintesis dikonfirmasi dengan perbandingan dengan MPA dan T80 menggunakan spektrometer UV–vis (UV-1800, Shimadzu, Jepang), spektrometer Fourier-transform infrared (FT-IR) (PerkinElmer, spektrum dua), dan
1
Spektrometer resonansi magnetik nuklir-H (NMR) (Bruker Biospin, Advance II, lihat File tambahan 1:Gambar S1).
Persiapan MNC Maleimidyl
Maleimidyl MNCs (mWMNCs) yang dapat terdispersi dalam air dibuat menggunakan metode nanoemulsi [37]. Secara singkat, 100 mg Tm80 dilarutkan sepenuhnya dalam 20 mL air deionisasi, dan 4 mL n-heksana yang mengandung 20 mg MNC disuntikkan dengan cepat ke dalam air terlarut Tm80 dengan ultrasonikasi (190 W) dan pengadukan (1200 rpm). Proses emulsi dilanjutkan selama 10 menit dengan penangas es. Pelarut organik yang tersisa diuapkan selama 12 jam pada suhu kamar, dan produk dimurnikan dengan dialisis (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) untuk menghilangkan kelebihan surfaktan selama 3 hari. mWMNCs kemudian dipekatkan menggunakan filter sentrifugal (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Jerman) menjadi 1,25 mgFe /mL dalam air yang diolah DEPC. T80-enveloped MNCs (WMNCs) juga disiapkan menggunakan metode yang sama.
Persiapan AptHER2 -MNS
Sebelum konjugasi antara mWMNCs dan aptamer anti-HER2, dilakukan langkah reduksi dari aptamer yang dimodifikasi tiol. Secara singkat, 1 nmol aptamer dilarutkan dalam 0,3 mL air deionisasi, dan ditambahkan larutan trietilamina asetat dan 1,4-ditiltretol dengan konsentrasi akhir masing-masing 50 dan 25 mM. Campuran ini dikocok pada suhu kamar selama 1,5 jam, dan dimurnikan dan dihilangkan garamnya dengan presipitasi etanol. Untuk menyiapkan AptHER2 -MNS, probe MRI spesifik HER2, berat molekul MNC dihitung secara teoritis (lihat File tambahan 1:Gambar S2) dan rasio campuran mWMNC dan aptamer ditetapkan sebagai 1:7. Oleh karena itu, 100 μg (Fe) mWMNCs (sebagai Fe3 O4 , 45 pmol) dilarutkan dalam PBS (1 mL) dan ditambahkan 5 g (0,35 nmol) aptamer. Campuran diaduk pada suhu kamar selama 5 menit dan diinkubasi pada 4 °C selama 2 jam. Distribusi diameter hidrodinamik AptHER2 -MNS kemudian dianalisis menggunakan penganalisis hamburan laser dinamis (ELS-Z, Otsuka Electronics, Jepang). Untuk mengkonfirmasi kemampuan AptHER2 -MNS sebagai agen kontras MRI, analisis relaksivitas T2 (R2) dilakukan dengan instrumen MRI klinis 1,5 T dengan kumparan permukaan mikro-47 (Intera, Philips Medical System, Belanda) menggunakan berbagai hantu terkonsentrasi AptHER2 -MNS. R2 dari AptHER2 -MNS diukur menggunakan urutan Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) pada suhu kamar:TR = 10 s, 32 gema dengan ruang gema genap 12 md, jumlah akuisisi = 1, resolusi titik = 156 μm × 156 μm, dan ketebalan bagian = 0.6 mm. R2 didefinisikan sebagai 1/T2 dengan s
−1
unit.
AptHER2 -MNS Binding Affinity Assay
Untuk validasi spesifisitas HER2 dari AptHER2 -MNS, metode pengikatan filter nitroselulosa digunakan [38]. AptHER2 yang telanjang dan AptHER2 -MNS difosforilasi menggunakan alkaline phosphatase (New England Biolabs, MA, USA). Ujung aptamers 5′ atau 3′ diberi label oleh T4 polinukleotida kinase dan [
32
P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) [39]. Uji pengikatan dilakukan dengan menginkubasi
32
Aptamers berlabel P pada konsentrasi 10 pM dengan protein HER2 pada konsentrasi mulai dari 100 hingga 10 pM dalam buffer pilihan (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 pada 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2-mercaptoethanol, 1 mM Na3 EDTA, 10% v /v gliserol) pada 37 °C selama 30 menit. Campuran
32
Aptamers berlabel P dan protein HER2 disaring oleh kolom G-50 (GE Heathcare Life Science, UK) untuk menghilangkan radioisotop bebas. Campuran yang disaring dikembangkan pada film yang dapat digunakan kembali, dan fraksi aptamers yang terikat protein HER2 diukur menggunakan phosphorimager (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Tokyo, Jepang). Untuk menghilangkan efek pengikatan latar belakang nonspesifik dari aptamer berlabel radio ke filter nitroselulosa, data pengikatan mentah dikoreksi dengan melakukan percobaan menggunakan
32
Hanya aptamers berlabel P.
In Vivo MRI
Semua percobaan hewan dilakukan di bawah persetujuan Asosiasi untuk Penilaian dan Akreditasi Laboratorium Perawatan Hewan Internasional. Pemindaian MRI in vivo dilakukan menggunakan model tumor tikus syngeneic, yang dihasilkan oleh implantasi sel NIH3T6.7 (1.0 × 10
7
sel) ke dalam paha tikus telanjang BALB/c betina berumur 5 minggu. Setelah 2 minggu, ukuran tumor dievaluasi dengan MRI. Saat ukuran tumor mencapai sekitar 500 mm
3
, 100 μg (5 mg/kg) AptHER2 -MNS disuntikkan ke vena ekor. Eksperimen MRI in vivo dilakukan menggunakan instrumen MRI klinis 3.0 T dan kumparan pergelangan tangan manusia 8 saluran. Untuk T2-weighted MRI pada 3,0 T, parameter berikut diadopsi:TR/TE = 1054/70 md, jumlah akuisisi = 2, resolusi titik = 400 × 319 mm, dan ketebalan irisan = 1 mm faktor TSE = 8. percobaan kontrol dilakukan menggunakan WMNCs dengan metode yang sama. Semua intensitas sinyal T2 dihitung dengan rata-rata kira-kira lima region of interest (ROI) yang digambar pada gambar MRI berbobot T2 dari setiap model tikus (n = 3), dan nilai R2 (atau R2*), nilai terbalik dari T2, digunakan dalam analisis intensitas sinyal. Perubahan intensitas sinyal relatif dari waktu ke waktu dinormalisasi oleh intensitas sinyal awal (pra-injeksi). Analisis histogram juga dilakukan pada intensitas sinyal R2 voxel di ROI.
Analisis Histologi
Pewarnaan Prussian blue, dapat digunakan untuk mendeteksi ion Fe pada jaringan tumor, dilakukan untuk mengkonfirmasi AptHER2 -MNS menargetkan kanker yang mengekspresikan HER2 setelah pengambilan jaringan tumor dari setiap model tumor setelah MRI in vivo. Jaringan tumor yang dipanen difiksasi dalam larutan formalin 10% selama 24 jam dan ditanam dalam parafin setelah dehidrasi dalam meningkatkan konsentrasi etanol dan klarifikasi dalam Histo-Clear® (National Diagnotics, USA). Pewarnaan Prusia blue dilakukan dengan memasang irisan jaringan (ketebalan = 5 μm) pada slide kaca diikuti dengan deparafinasi dan hidrasi masing-masing menggunakan Histo-Clear® dan etanol pekat. Setelah itu, slide ditempatkan dalam larutan kerja biru Prusia (10% kalium ferrosianida dan larutan asam klorida 20% = 1:1) selama 1 jam. Inti diwarnai menggunakan pewarnaan Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, USA). Setelah mencuci sampel tisu tiga kali selama 30 menit, kami menambahkan 2-3 tetes larutan pemasangan ke slide dan kemudian menutupi slide dengan kaca penutup. Bagian jaringan yang diwarnai diamati menggunakan perangkat lunak Olympus BX51 dan Olympus (Olympus, Jepang).
Hasil dan Diskusi
AptHER2 -MNS dirancang sebagai agen penargetan molekul tunggal berdasarkan IONP untuk pencitraan molekuler tumor yang mengekspresikan HER2 menggunakan MRI. Oleh karena itu, AptHER2 -MNS diperlukan untuk memiliki spesifisitas yang tinggi untuk molekul target dan kerentanan magnetik yang besar. Untuk mendapatkan sensitivitas magnet yang tinggi terlebih dahulu, MNCs, monodisperse Fe3 O4 nanopartikel, disintesis menggunakan dekomposisi termal dan metode pertumbuhan benih [36]. Prosedur eksperimental persiapan dan aplikasi in vivo AptHER2 -MNS dijelaskan pada Gbr. 1. Pertama, ukuran dan bentuk MNC dikonfirmasi oleh HR-TEM (Gbr. 2a, b). Pada Gambar. 2c, ukuran rata-rata MNC diukur dengan pemilihan acak 130 MNC dari gambar TEM, dan distribusi ukuran yang sangat sempit (10,49 ± 1,74 nm) dan bentuk bola diamati. Sifat superparamagnetik MNC juga dievaluasi oleh VSM, yang menghasilkan nilai magnetisasi saturasi MNC sebesar 98,8 emu/gFe (Gbr. 2d). Agen kontras T2, yang saat ini tersedia melalui injeksi intravena, didasarkan pada oksida besi superparamagnetik (SPIO) atau oksida besi superparamagnetik ultrasmall (USPIO) [40]. SPIO atau USPIO juga memiliki sifat superparamagnetik, tetapi memiliki nilai magnetisasi saturasi kurang dari 70 emu/gFe [40,41,42,43]. Sifat superparamagnetik diperlukan untuk menggunakan IONP sebagai zat kontras intravena karena menyebabkan IONP memiliki sifat magnetik hanya ketika berada di medan magnet, dan mencegah IONP beragregasi. Selain itu, nilai magnetisasi saturasi yang lebih tinggi dari MNC dapat membantu mengurangi dosis injeksi daripada agen kontras berbasis SPIO atau USPIO.
Ilustrasi skema yang menunjukkan prosedur eksperimental untuk preparasi nanosensitizer magnetik termodifikasi aptamer (AptHER2 -MNS) dan penilaian kemampuan pencitraan in vivo mereka
Hasil karakterisasi morfologi dan magnetik MNC. a gambar TEM. b Gambar TEM yang diperbesar. c Distribusi ukuran diukur dari citra TEM (jumlah total 100). d Grafik magnetisasi
Untuk menggunakan MNCs untuk percobaan in vivo, WMNCs dan mWMNCs disiapkan dengan metode nanoemulsi menggunakan T80 atau Tm80, masing-masing. Karakteristik fisikokimia Tm80 yang disiapkan dan prekursornya, MPA dan T80, dikonfirmasi oleh absorbansi, FT-IR,
1
Analisis spektral H-NMR (lihat File tambahan 1:Gambar S1). Seperti yang diterbitkan sebelumnya [44], mWMNCs yang dibuat dengan metode nanoemulsi menggunakan Tm80 terdispersi secara stabil dalam air. Lebih lanjut, gugus maleimidil dari mWMNCs dapat dengan mudah dikonjugasi dengan molekul yang memiliki gugus tiol pH netral dan konjugasi ini tidak menghasilkan produk samping apa pun. Selanjutnya, aptamer termodifikasi NapdU digunakan untuk meningkatkan waktu paruh in vivo, dan waktu paruhnya adalah 151 jam dalam serum manusia (lihat File tambahan 1:Gambar S3). AptHER2 -MNS disiapkan dengan konjugasi antara mWMNCs dan AptHER2 -SH, dan sifat hidrodinamik AptHER2 -MNS dievaluasi menggunakan hamburan laser dinamis dan analisis relaksivitas MR (Gbr. 3). Diameter WMNC dan AptHER2 -MNS masing-masing adalah 28.8 ± 7.2 dan 34.1 ± 8.2 nm (Gbr. 3a). Karena AptHER2 terdiri dari oligonukleotida 40-mer dan panjangnya kira-kira 5-10 nm, adanya AptHER2 dapat menyebabkan perbedaan diameter hidrodinamik. Relaksivitas WMNC dan AptHER2 -MNS adalah 265.7 dan 257,2 mM
−1Biaya s
−1
, masing-masing (Gbr. 3b), yang dievaluasi untuk mengkonfirmasi sensitivitas magnetiknya sebagai agen kontras MRI. Dalam kasus agen kontras T2 berdasarkan SPIO atau USPIO, yang disetujui FDA, mereka hampir disintesis dengan metode co-presipitasi. Karena alasan ini, kristalinitasnya menurun, yang menyebabkan relaksivitas rendah (di bawah 190 mM
−1Biaya s
−1
) di bawah medan magnet [40]. Dengan menggunakan MNC dalam penelitian ini, AptHER2 -MNS memiliki 35 ~ 500%-meningkatkan relaksivitas magnetik daripada agen kontras T2 berbasis SPIO atau USPIO.
Karakterisasi WMNCs dan AptHER2 -MNS untuk digunakan sebagai agen kontras MRI in vivo. a diameter hidrodinamik (n = 5, WMNCs 28.8 ± 7.2 nm, AptHER2 -MNS 34.1 ± 8.2 nm). b Grafik analisis relaksasi (n = 3, WMNCs R
2
= 265.7 mM
−1
s
−1
, R
2
= 0.99 dan AptHER2 -MNS R
2
= 257.2 mM
−1
s
−1
, R
2
= 0.99)
Afinitas pengikatan AptHER2 -MNS untuk protein HER2 dievaluasi menggunakan uji pengikatan filter (Gbr. 4a), dan menghasilkan Kd nilai AptHER2 -SH dan AptHER2 -MNS diukur masing-masing sebagai 26,88 ± 8,24 dan 0,57 ± 0,26 nM (Gbr. 4b, c). AptHER2 -OH memiliki spesifisitas yang sangat tinggi untuk protein HER2 dengan Kd nilai 0,42 ± 0,05 nM, dan afinitas pengikatan ini kira-kira 10 kali lipat lebih tinggi dari 5 nM Herceptin® [45]. Namun, afinitas pengikatan dari AptHER2 naked yang telanjang dapat diubah dengan konjugasi dengan bahan kimia, molekul, atau nanopartikel. Oleh karena itu, afinitas pengikatan AptHER2 untuk protein HER2 harus dievaluasi setelah konjugasi dengan mWMNCs. Afinitas pengikatan AptHER2 -SH untuk HER2 direduksi dengan adanya gugus tiol daripada oleh AptHER2 telanjang karena gugus tiol dapat terikat dengan residu tiol lain dalam protein atau aptamer termodifikasi tiol lainnya. Namun, afinitas pengikatan AptHER2 -MNS diukur mirip dengan AptHER2 , hasil ini berarti bahwa tidak ada cukup AptHER2 un yang tidak terikat -SH yang dapat mengganggu interaksi antara aptamer dan protein HER2 atau mWMNCs tidak memiliki atau sangat sedikit pengaruh pada afinitas pengikatan aptamer.
Mengikat data afinitas aptamer anti-HER2 (AptHER2 -OH) aptamer anti-HER2 tertiolasi (AptHER2 -SH) dan AptHER2 -MNS ke protein HER2 dengan mengukur uji pengikatan filter. a Ilustrasi skematis yang menunjukkan proses pengujian pengikatan filter dari aptamers. b Grafik aptamer terikat fraksi terhadap konsentrasi HER2. cKd grafik nilai AptHER2 -OH (0,42 ± 0,05 nM, R
2
= 0,99, p < 0,0001), AptHER2 -SH (26,88 ± 8,24 nM, R
2
= 0,98, p < 0,0001), dan AptHER2 -MNS (0,57 ± 0,26 nM, R
2
= 0,91, p = 0,001) dihitung dari b . Bilah kesalahan diwakili oleh y . positif -sumbu saja
Eksperimen MRI in vivo dilakukan menggunakan model tumor tikus syngeneic untuk mengevaluasi kemampuan AptHER2 -MNS untuk menargetkan tumor yang mengekspresikan HER2 secara berlebihan. Menggunakan model tumor yang dihasilkan oleh implantasi sel NIH3T6.7 ke paha, eksperimen MRI dilakukan dari pra-injeksi hingga 120 menit setelah injeksi WMNCs atau AptHER2 -MNS (Gbr. 5, lihat juga File tambahan 1:Gambar S4). Efek peningkatan kontras T2 oleh agen kontras berbasis IONP diamati sebagai gambar yang lebih gelap karena mereka menginduksi efek pemendekan T2 di sekitar proton. Oleh karena itu, dalam analisis intensitas sinyal, nilai T2 atau T2* diwakili oleh R2 atau R2*. R2, nilai terbalik dari T2, digunakan untuk membandingkan intensitas sinyal dengan nilai positif. Dalam kasus WMNCs, intensitas sinyal R2 tertinggi diamati 30 menit setelah injeksi WMNCs setelah itu secara bertahap menurun (Gbr. 5a, b). Pada 120 menit setelah injeksi WMNCs, intensitas sinyal T2 menyerupai status pra-injeksi. Tingkat perubahan nilai rata-rata intensitas sinyal R2 kurang dari 10%; dengan demikian, sulit untuk mengenali MR dengan pembobotan T2 dengan mata telanjang. Dalam penelitian sebelumnya, ditunjukkan bahwa nanopartikel besi oksida berselubung T80 terakumulasi di sekitar jaringan tumor meskipun tidak ada bagian penargetan [46]. Namun, dalam penelitian tersebut, dosis agen kontras 1,4 mgFe per tikus digunakan dalam T2-weighted MRI, yang 14 kali lipat lebih tinggi dari dosis yang digunakan dalam penelitian ini. Ini berarti bahwa WMNCs tidak dapat menunjukkan kemanjuran peningkatan kontras yang efektif dalam percobaan dengan dosis 0,1 mgFe per mouse (5 mgFe /kg). Perubahan deret waktu intensitas sinyal R2* juga kurang dari 10%, dan tidak ada signifikansi statistik. Sebaliknya, 120 menit setelah injeksi, AptHER2 -MNS menyebabkan peningkatan intensitas sinyal 130% lebih tinggi daripada sebelum injeksi AptHER2 -MNS meskipun menggunakan dosis injeksi yang sama dengan WMNCs (Gbr. 5c, d). Dosis injeksi ini 2 sampai 30 kali lipat lebih rendah dibandingkan penelitian lain tentang agen kontras berbasis nanopartikel magnetik yang dimodifikasi aptamer [44, 47, 48]. Hasil ini menunjukkan bahwa AptHER2 -MNS memiliki kemampuan penargetan yang lebih tinggi daripada WMNCs atau agen kontras lain yang dimodifikasi aptamer, dan juga menyarankan bahwa efek peningkatan kontras tinggi dari AptHER2 -MNS mungkin diharapkan meskipun dosisnya lebih rendah daripada WMNCs. Peningkatan kontras terutama muncul di pembuluh perifer dan di tengah jaringan tumor. Meskipun pembuluh perifer menjadi gelap segera setelah injeksi AptHER2 -MNS, peningkatan kontras di bagian tengah lesi tumor pertama kali muncul pada menit ke-60 dan cenderung meningkat hingga menit ke 120.
Gambar MR in vivo dari model tikus tumor HER2+ menggunakan WMNCs (n = 3) atau AptHER2 -MNS (n = 3). a Gambar MR berbobot T2 dan T2* pada pra atau pasca injeksi WMNC. b Grafik intensitas sinyal relatif diukur dari a . c Gambar MR berbobot T2 dan T2* pada sebelum atau sesudah injeksi AptHER2 -MNS. d Grafik intensitas sinyal relatif dan e histogram intensitas daerah tumor diukur dari c . f Data analisis histologis diperoleh setelah pencitraan MR. Bilah kesalahan diwakili oleh y . positif -sumbu saja. Intensitas sinyal relatif b , d , dan e diukur dari ROI garis-padat merah a , c , dan File tambahan 1:Gambar S4
Untuk menekankan perubahan yang terlihat pada efek peningkatan kontras sebelum dan sesudah injeksi AptHER2 -MNS, analisis histogram intensitas sinyal R2 dilakukan di ROI pada gambar MRI berbobot T2 (Gbr. 5e). Karena sinyal T2 terlihat sebagai peningkatan negatif pada gambar MRI dengan pembobotan T2, sinyal tersebut diwakili oleh R2. Setelah injeksi AptHER2 -MNS, bagian tengah histogram digeser ke sisi kanan. Peningkatan kontras sekitar 10% diamati ketika perbedaan pusat histogram dihitung.
Untuk mengonfirmasi keberadaan AptHER2 -MNS dalam tumor secara histologis, dilakukan pewarnaan biru Prusia (Gbr. 5f). Dalam jaringan bernoda biru Prusia, nukleus dan sitoplasma diwarnai sebagai warna merah muda tua atau merah muda, dan beberapa titik berwarna biru diamati di sekitar sel tumor. Kami berasumsi bahwa jaringan tumor berwarna biru jika AptHER2 -MNS menargetkan tumor. Pada hasil pewarnaan Prussian blue, terlihat titik-titik biru pada jaringan tumor, dan slide jaringan AptHER2 -MNS memiliki sekitar 3 kali lipat jumlah titik biru seperti yang dimiliki WMNC. Pewarnaan biru Prusia dapat mendeteksi ion Fe dalam jaringan; dengan demikian, ini digunakan untuk mengkonfirmasi akumulasi agen kontras berdasarkan IONP di jaringan tumor [44, 49, 50].
Kesimpulan
Sebagai kesimpulan, kami mengonfirmasi bahwa AptHER2 -MNS bekerja sebagai agen kontras MRI yang dapat ditargetkan HER2 in vivo dengan karakterisasi fisikokimia dan eksperimen MRI in vivo dalam model tumor tikus yang mengekspresikan HER2. AptHER2 -MNS memiliki relaksivitas dan spesifisitas yang tinggi terhadap HER2, dan menunjukkan efek peningkatan kontras yang nyata meskipun dosis pemberian lebih rendah daripada agen kontras T2 lainnya, karena nanopartikel oksida besi. Agen kontras ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai ekspresi kanker HER2 pada pasien kanker dan dapat digunakan untuk memantau pasien kanker HER2+ selama kemoterapi menggunakan obat target HER2. Kami berharap bahwa hasil pekerjaan ini akan menawarkan strategi yang menjanjikan untuk diagnosis kanker yang diekspresikan HER2 dan untuk perawatan pasien.
