Nanosensitizer Magnetik yang Ditargetkan HER2 Meningkatkan MRI In Vivo untuk Kanker Positif HER2

Latar Belakang

Reseptor faktor pertumbuhan epidermis manusia 2 (HER2), yang termasuk dalam keluarga reseptor faktor pertumbuhan epidermis (EGFR), memainkan peran kunci dalam kanker manusia dan diekspresi berlebih pada sekitar 30% kanker payudara manusia [1] dan pada banyak jenis kanker lain, termasuk kanker lambung, kandung kemih, ovarium, dan paru [1,2,3,4]. Pasien dengan kanker payudara yang overexpressed HER2 cenderung memiliki tingkat kelangsungan hidup yang jauh lebih rendah dibandingkan pasien dengan kanker payudara yang tidak overexpressed HER2 [5]. Selain itu, overexpressed HER2 menyebabkan metastasis kanker payudara yang meningkat [6,7,8]. Oleh karena itu, HER2 berfungsi sebagai biomarker penting dalam diagnosis kanker. Dalam setting klinis, HER2 digunakan sebagai penanda biologis tipikal, bersama dengan reseptor estrogen (ER) dan reseptor progesteron (PR), untuk diagnosis kanker payudara. Dengan demikian, pasien kanker payudara menerima diagnosis pasti setelah verifikasi histologis tingkat ekspresi HER2, ER, dan PR. Namun, verifikasi histologis bersifat invansif dan hanya dilakukan pada sejumlah terbatas lesi. Oleh karena itu, berbagai penelitian telah dilakukan untuk memvisualisasikan penanda diagnosis secara non‑invasif melalui pemeriksaan radiologis sebelum verifikasi histologis berdasarkan tomografi komputasi [9, 10], tomografi emisi pozitron [11,12,13], tomografi komputasi sinar tunggal [14,15,16], resonansi magnetik (MRI) [17,18,19,20], dan alat citra multimodal [21,22,23].

Nanopartikel oksida besi (IONP) digunakan dalam berbagai pemeriksaan radiologis non‑invasif untuk pengamatan biomarker yang relevan klinis [24, 25]. IONP kompatibel dengan citra molekular karena mereka memiliki sensivitas magnetik atau kecekatan biologis yang lebih tinggi dibandingkan agen kontras MRI berbasis logam berat lain seperti agen kontras berbasis gadolinium (GBCA) atau agen kontras yang mengandung nikel atau kobalt. Secara khusus, meskipun agen kontras MRI komersial dan GBCA terkait dengan masalah keamanan in vivo akibat pelepasan ion Gd³⁺, agen kontras MRI berbasis IONP memiliki keamanan in vivo yang lebih tinggi daripada GBCA karena mereka dapat diurai menjadi besi, diserap, atau dibuang [26, 27].

Untuk menerapkan IONP untuk citra molekular, moiety target sangat penting dan dapat berupa kimia, karbohidrat, protein, antibodi, atau aptamer [25, 28, 29]. Di antara molekul ini, aptamer memiliki struktur tiga dimensi yang stabil dari asam nukleat rentatan tunggal yang memiliki affinitas ikatan dan spesifisitas yang tinggi pada molekul spesifik. Affinitas ikatan tinggi aptamer disebabkan oleh teknik pengembangannya dan evolusi sistematik dari ligan dengan pengayaan eksponensial (SELEX) [30]. SELEX menggunakan perpustakaan sangat besar dari oligonukleotida acak (~ 10¹⁵) yang dapat disediakan oleh sintesis kimiawi dan disaring secara paralel untuk menemukan aptamer yang memiliki affinitas ikatan tinggi pada molekul target. Sebagai hasil SELEX, aptamer dapat dikembangkan dengan affinitas ikatan yang biasanya pada tingkat konsentrasi pikomolar sementara affinitas biomolekul lain bervariasi dari mikromole hingga submikromole [31, 32]. Dalam kasus aptamer generasi ketiga yang baru dikembangkan, mereka juga memiliki stabilitas in vitro dan in vivo karena resistensi yang ditingkatkan terhadap DNase atau RNase dengan menggunakan asam nukelat yang dimodifikasi [33, 34]. Untuk alasan ini, aptamer sedang muncul sebagai moiety yang dipilih dalam penelitian citra molekular [35].

Tujuan studi ini adalah pengembangan agen kontras T2 berbasis aptamer yang dimodifikasi berdasarkan kristal nano magnetik (MNC) dengan spesifisitas tinggi terhadap sel kanker yang overexpressed HER2. Untuk mencapai tujuan ini, MNC, yang memiliki sensivitas magnetik tinggi, disintesis dengan metode dekomposisi termal dan aptamer spesifik HER2 (K_d = 0,42 nM) digunakan. Agen kontras yang disintesis dikarakterisasi dengan menganalisis morfologi, properti magnetisasi, dan relaksivitas magnetik. Selain itu, kami melakukan uji target in vitro dan in vivo terhadap protein HER2 dalam model hewan xenograft tumor yang diimplantasi dengan baris sel kanker yang mengekspresi HER2, masing-masing.

Metode

Bahan

TWEEN® 80 (T80), 4-(dimethylamino)pyridine, N,N′-dicyclohexylcarbodiimide, triethylamine, klorida metilena anhidra, asetilasetonat besi(III), 1,2‑heksadekanediol, asid dodekanat, amina dodekil, eter benzil dibeli dari Sigma‑Aldrich (USA), dan 3‑maleimidopropionat asid (MPA) dibeli dari TCI America (USA). RPMI‑1640, medium Dulbecco yang dimodifikasi, serum sapi fetal, dan larutan antibiotik‑antimikotik Gibco® dibeli dari Life Technologies (USA). NIH3T6.7 dibeli dari American Tissue Type Culture (USA). Air yang dirawati DEPC dibeli dari Biosesang Inc. (Korea). Aptamer anti‑HER2 yang dimodifikasi tiol [Apt_HER2, urutan: 5′‑6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A‑3′ (6: NapdU), modifikasi 5′‑SH, 40‑mer] dibeli dari Aptamer Science Inc. (Korea).

Sintesis MNC

Nanopartikel oksida besi magnetik yang monodisperse disintesis menggunakan metode dekomposisi termal Sun [36]. Nanopartikel magnetik ini disebut MNC karena prekursor asetilasetonat besi(III) dan asid oleat mereka. Secara singkat, campuran asetilasetonat besi(III) (2 mmol), asid oleat (6 mmol), 1‑oktasena (6 mmol), 1,2‑heksadekanediol (10 mmol), dan eter benzil (20 mL) dimuat dalam kolong bundar tiga leher dan diaduk secara mekanis. Untuk menghilangkan molekul oksigen dan air yang tersisa, campuran dipanaskan sebelumnya pada 100 °C selama 30 menit. Campuran yang dipanaskan sebelumnya kemudian dipanaskan ke 200 °C selama 2 jam dan direfluks pada 300 °C selama 30 menit di bawah aliran nitrogen. Setelah reaktan didinginkan ke suhu ruangan dengan menghilangkan sumber panas, reaktan difurnir dengan alkohol etil berlebih. Sentrifugasi dilakukan tiga kali untuk memisahkan produk dari sisa yang tidak terdisperse. Produk nanopartikel Fe₃O₄ kemudian diredisperse dalam 5 mL heksana. Produk akhir disintesis dengan mengulangi prosedur yang dijelaskan di atas dengan 100 mg Fe₃O₄ dan prekursornya. Morfologi MNC dievaluasi menggunakan mikroskop transmisi elektron resolusi tinggi (HR‑TEM, JEM‑2100, JEOL Ltd., Jepang). Saturasi magnetisasi dievaluasi menggunakan magnetometer sampel getaran (VSM, MODEL‑7300, Lakeshore, USA) pada suhu ruangan. Kuantitas MNC dalam produk dianalisis dengan mengukur berat menggunakan analyzer termogravimetri (SDT‑Q600, TA Instrument), dan MNC dicuci hingga konten Fe₃O₄ mencapai sekitar 80%.

Sintesis Maleimidyl‑TWEEN® 80

Untuk persiapan maleimidyl T80 (Tm80), 15,3 mmol MPA dan 22,9 mmol N,N′‑dicyclohexylcarbodiimide dilarutkan dalam 10 mL klorida metilena, masing-masing, dan kemudian dicampur. Campuran kemudian ditambahkan ke dalam 20 mL klorida metilena yang mengandung 7,6 mmol T80, diikuti dengan penambahan 3,2 mL trietilamina ke dalam campuran. Akhirnya, 22,9 mmol 4‑(dimetilamino) piridin dilarutkan dalam 10 mL klorida metilena, dan semua reagen dicampur dalam vial 70 mL. Campuran akhir diaduk menggunakan magnet selama 48 jam. Warna campuran berubah dari aprikot menjadi merah anggur. Setelah bereaksi selama 48 jam, kristal urea yang kristal dihilangkan melalui filterasi. Untuk menghilangkan klorida metilena, reaksi difilter melalui avaporasi dalam evaporator rotary (N‑1100, EYELA, Jepang). Produk akhir disuspendi dalam air deion, dan reagen yang tidak dikonjugasi dihilangkan melalui dialisis (Spectra/Por®, 1 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA). Produk akhir disiapkan dengan free‑drying. Tm80 yang disintesis dikonfirmasi dengan membandingkan dengan MPA dan T80 menggunakan spektrometer UV–vis (UV‑1800, Shimadzu, Jepang), spektrometer infra‑merah transformasi Fourier (FT‑IR) (PerkinElmer, spectrum two), dan spektrometer resonansi magnetik nuklear 1H (NMR) (Bruker Biospin, Advance II, lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S1).

Persiapan MNC Maleimidyl

MNC maleimidyl yang dapat disperdi air (mWMNC) disiapkan menggunakan metode nanoemulsi [37]. Secara singkat, 100 mg Tm80 sepenuhnya dilarutkan dalam 20 mL air deion, dan 4 mL n‑heksana yang mengandung 20 mg MNC dengan cepat diinjeksi ke dalam air Tm80 yang dilarutkan dengan ultrasonikasi (190 W) dan pengadukan (1200 rpm). Proses emulsi berlanjut selama 10 menit dengan mandi es dingin. Sisa pelarut organik diavapori selama 12 jam pada suhu ruangan, dan produk difurnir melalui dialisis (Spectra/Por®, 3,5 kDa MWCO, Spectrum Laboratory Inc., USA) untuk menghilangkan tensioaktif berlebih selama 3 hari. mWMNC kemudian dikonsentrasi menggunakan filter sentrifugal (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Jerman) menjadi 1,25 mg_Fe/mL dalam air DEPC yang dirawati. MNC yang dilapisi T80 (WMNC) juga disiapkan menggunakan metode yang sama.

Persiapan Apt_HER2‑MNS

Sebelum konjugasi antara mWMNC dan aptamer anti‑HER2, langkah reduksi aptamer yang dimodifikasi tiol dilakukan. Secara singkat, 1 nmol aptamer dilarutkan dalam 0,3 mL air deion, dan asetat trietilamina dan larutan 1,4‑ditiotreitol ditambahkan sehingga konsentrasi akhir adalah 50 dan 25 mM, masing-masing. Campuran ini diayuh pada suhu ruangan selama 1,5 jam, dan difurnir serta didealkan melalui pengendapan etanol. Untuk menyiapkan Apt_HER2‑MNS, sond MRI spesifik HER2, bobot molekul MNC dihitung secara teoritis (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S2) dan rasio campuran mWMNC dan aptamer ditetapkan sebagai 1:7. Oleh karena itu, 100 μg (Fe) mWMNC (sebagai Fe₃O₄, 45 pmol) dilarutkan dalam PBS (1 mL) dan 5 μg (0,35 nmol) aptamer ditambahkan. Campuran diaduk pada suhu ruangan selama 5 menit dan diinkubasi pada 4 °C selama 2 jam. Distribusi diameter hidrodinamik Apt_HER2‑MNS kemudian dianalisis menggunakan analyzer pencaran laser dinamis (ELS‑Z, Otsuka Electronics, Jepang). Untuk mengonfirmasi kemampuan Apt_HER2‑MNS sebagai agen kontras MRI, analisis relaksivitas T2 (R2) dilakukan dengan instrumen MRI klinis 1,5 T dengan koil permukaan mikro‑47 (Intera, Philips Medical System, Belanda) menggunakan fantom Apt_HER2‑MNS dengan konsentrasi yang berbeda. R2 Apt_HER2‑MNS diukur menggunakan urutan Carr‑Purcell‑Meiboom‑Gill (CPMG) pada suhu ruangan: TR = 10 s, 32 echo dengan spasi echo genap 12 ms, jumlah akuisisi = 1, resolusi titik = 156 μm × 156 μm, dan ketebalan potongan = 0,6 mm. R2 didefinisikan sebagai 1/T2 dengan unit s⁻¹.

Uji Afinitas Ikat Apt_HER2‑MNS

Untuk validasi spesifisitas HER2 dari Apt_HER2‑MNS, metode ikatan filter nitroselulosa digunakan [38]. Apt_HER2 polos dan Apt_HER2‑MNS difosforilasi menggunakan fosfatase alkaline (New England Biolabs, MA, USA). Ujung 5′ atau 3′ aptamer dilabeli oleh kinase polinukleotida T4 dan [³²P]‑ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, USA) [39]. Uji ikatan dilakukan dengan menginkubasi aptamer yang dilabeli ³²P pada konsentrasi 10 pM dengan protein HER2 pada konsentrasi yang bervariasi dari 100 hingga 10 pM dalam buffer seleksi (20 mM Tris·HCl, pH 7,5 pada 4 °C, 6 mM NaCl, 5 mM 2‑merkaptoetanol, 1 mM Na₃EDTA, 10% v/v gliserol) pada 37 °C selama 30 menit. Campuran aptamer yang dilabeli ³²P dan protein HER2 difilter melalui kolom G‑50 (GE Heathcare Life Science, UK) untuk menghilangkan radioisotop bebas. Campuran yang difilter dikembangkan pada film yang dapat digunakan kembali, dan fraksi aptamer yang terikat protein HER2 dikuantifikasi menggunakan fosforimager (Fuji FLA‑5100 Image Analyzer, Tokyo, Jepang). Untuk menghilangkan efek latar belakang ikatan non‑spesifik aptamer yang dilabeli radiasi ke filter nitroselulosa, data ikatan mentah dikoreksi dengan melakukan eksperimen menggunakan aptamer yang dilabeli ³²P saja.

MRI In Vivo

Semua eksperimen hewan dilakukan dengan persetujuan Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Pemeriksaan MRI in vivo dilakukan menggunakan model tikus tumor sinyegenik, yang dihasilkan dengan implantasi sel NIH3T6.7 (1,0 × 10⁷ sel) ke dalam paha tikus BALB/c nude betina berusia 5 minggu. Setelah 2 minggu, ukuran tumor dievaluasi oleh MRI. Ketika ukuran tumor mencapai sekitar 500 mm³, 100 μg (5 mg/kg) Apt_HER2‑MNS diinjeksi ke dalam vena ekor. Eksperimen MRI in vivo dilakukan menggunakan instrumen MRI klinis 3,0 T dan koil pergelangan tangan manusia 8‑channel. Untuk MRI T2‑berbobot pada 3,0 T, parameter berikut diadopsi: TR/TE = 1054/70 ms, jumlah akuisisi = 2, resolusi titik = 400 × 319 mm, dan ketebalan potongan = 1 mm TSE factor = 8. Eksperimen kontrol dilakukan menggunakan WMNC dengan metode yang sama. Semua intensitas sinyal T2 dihitung dengan merata‑rata sekitar lima daerah minat (ROI) yang digambar pada citra MRI T2‑berbobot dari setiap model tikus (n = 3), dan nilai R2 (atau R2*), nilai invers dari T2, digunakan dalam analisis intensitas sinyal. Perubahan seiring waktu dari intensitas sinyal relatif dinormalisasi oleh intensitas sinyal awal (sebelum injeksi). Analisis histogram juga dilakukan pada intensitas sinyal R2 voxel dalam ROI.

Analisis Histologis

Pewarnaan biru Pruzia, yang dapat digunakan untuk mendeteksi ion Fe dalam jaringan tumor, dilakukan untuk mengonfirmasi target Apt_HER2‑MNS pada sel kanker yang mengekspresi HER2 setelah penambahan jaringan tumor dari setiap model tumor setelah MRI in vivo. Jaringan tumor yang diambil dikonservasi dalam larutan formalin 10% selama 24 jam dan diembeding dalam parafin setelah dehidrasi dalam konsentrasi etanol yang meningkat dan klarifikasi dalam Histo‑Clear® (National Diagnotics, USA). Pewarnaan biru Pruzia dilakukan dengan memasang irisan jaringan (ketebalan = 5 μm) pada kaca objek diikuti deparafinasi dan hidrasi menggunakan Histo‑Clear® dan etanol konsentrat, masing-masing. Setelah itu, kaca diletakkan dalam larutan kerja biru Pruzia (10% kalium ferroksianida dan 20% asid klorida = 1:1) selama 1 jam. Inti diwarnai menggunakan Nuclear Fast Red stain (Sigma Aldrich, USA). Setelah mencuci sampel jaringan tiga kali selama 30 menit, kami menambahkan 2–3 tetes larutan mounting pada kaca dan kemudian menutup kaca dengan selaput kaca. Irisan jaringan yang diwarnai diamati menggunakan Olympus BX51 dan Olyvia software (Olympus, Jepang).

Hasil dan Pembahasan

Apt_HER2‑MNS dirancang sebagai agen target satu‑molekul berdasarkan IONP untuk citra molekular tumor yang mengekspresi HER2 menggunakan MRI. Oleh karena itu, Apt_HER2‑MNS perlu memiliki spesifisitas yang tinggi terhadap molekul target dan sensitivitas magnetik yang besar. Untuk mendapatkan sensitivitas magnetik yang tinggi, terlebih dahulu MNC, nanopartikel Fe₃O₄ monodisperse, disintesis menggunakan metode dekomposisi termal dan pertumbuhan benih [36]. Prosedur eksperimental persiapan dan aplikasi in vivo Apt_HER2‑MNS dijelaskan dalam Gambar 1. Pertama, ukuran dan bentuk MNC dikonfirmasi oleh HR‑TEM (Gambar 2a, b). Dalam Gambar 2c, ukuran rata‑rata MNC diukur dengan pemilihan acak 130 MNC dari citra TEM, dan distribusi ukuran yang sangat sempit (10,49 ± 1,74 nm) dan bentuk bola diamati. Properti superparamagnetik MNC juga dievaluasi oleh VSM, yang menghasilkan nilai saturasi magnetisasi MNC sebesar 98,8 emu/g_Fe (Gambar 2d). Agen kontras T2, yang saat ini tersedia melalui injeksi intravena, berdasarkan oksida besi superparamagnetik (SPIO) atau oksida besi superparamagnetik ultrakecil (USPIO) [40]. SPIO atau USPIO juga memiliki properti superparamagnetik, tetapi mereka memiliki nilai saturasi magnetisasi kurang dari 70 emu/g_Fe [40,41,42,43]. Properti superparamagnetik diperlukan untuk menggunakan IONP sebagai agen kontras intravena karena hal ini menyebabkan IONP memiliki properti magnetik hanya ketika mereka berada dalam medan magnet, dan mencegah IONP dari aglomerasi. Selain itu, nilai saturasi magnetisasi yang lebih tinggi dari MNC dapat membantu mengurangi dosis injeksi dibandingkan agen kontras berbasis SPIO atau USPIO.

Untuk menggunakan MNC untuk eksperimen in vivo, WMNC dan mWMNC disiapkan melalui metode nanoemulsi menggunakan T80 atau Tm80, masing-masing. Karakteristik fisikokimia Tm80 yang disiapkan dan prekursornya, MPA dan T80, dikonfirmasi melalui analisis spektrum absorpsi, FT‑IR, dan ¹H‑NMR (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S1. Seperti yang telah dipublikasikan sebelumnya [44], mWMNC yang disiapkan oleh metode nanoemulsi menggunakan Tm80 stabil disperdi dalam air. Selain itu, grup maleimidyl mWMNC dapat dengan mudah dikonjugasi dengan molekul yang memiliki grup tiol netral pH dan konjugasi ini tidak menghasilkan produk samping. Selain itu, aptamer yang dimodifikasi NapdU digunakan untuk meningkatkan setengah hayat in vivo, dan setengah hidupnya adalah 151 jam dalam serum manusia (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S3). Apt_HER2‑MNS disiapkan melalui konjugasi antara mWMNC dan Apt_HER2‑SH, dan properti hidrodinamik Apt_HER2‑MNS dievaluasi menggunakan pencaran laser dinamis dan analisis relaksivitas MR (Gambar 3). Diameter hidrodinamik WMNC dan Apt_HER2‑MNS adalah 28,8 ± 7,2 dan 34,1 ± 8,2 nm, masing-masing (Gambar 3a). Karena Apt_HER2 terdiri dari 40‑mer oligonucleotide dan memiliki panjang sekitar 5–10 nm, kehadiran Apt_HER2 mungkin menyebabkan perbedaan diameter hidrodinamik. Relaksivitas WMNC dan Apt_HER2‑MNS adalah 265,7 dan 257,2 mM⁻¹_Fe s⁻¹, masing-masing (Gambar 3b), yang dievaluasi untuk mengonfirmasi sensitivitas magnetik mereka sebagai agen kontras MRI. Dalam kasus agen kontras T2 berbasis SPIO atau USPIO, yang disetujui FDA, mereka hampir semua disintesis oleh metode pengendapan. Untuk alasan ini, kristalinitas mereka menurun, yang menyebabkan relaksivitas rendah (di bawah 190 mM⁻¹_Fe s⁻¹) di bawah medan magnet [40]. Dengan menggunakan MNC dalam studi ini, Apt_HER2‑MNS memiliki relaksivitas magnetik yang meningkat 35 ~ 500% dibandingkan agen kontras T2 berbasis SPIO atau USPIO.

Afinitas ikatan Apt_HER2‑MNS untuk protein HER2 dievaluasi menggunakan uji ikatan filter (Gambar 4a), dan nilai K_d yang dihasilkan dari Apt_HER2‑SH dan Apt_HER2‑MNS diukur sebesar 26,88 ± 8,24 dan 0,57 ± 0,26 nM, masing-masing (Gambar 4b, c). Apt_HER2‑OH memiliki spesifisitas yang sangat tinggi untuk protein HER2 dengan nilai K_d sebesar 0,42 ± 0,05 nM, dan affinitas ikatan ini sekitar 10 kali lebih tinggi dari 5 nM Herceptin® [45]. Namun, affinitas ikatan Apt_HER2 polos dapat berubah oleh konjugasi dengan kimia, molekul, atau nanopartikel. Oleh karena itu, affinitas ikatan Apt_HER2 untuk protein HER2 harus dievaluasi setelah konjugasi dengan mWMNC. Affinitas ikatan Apt_HER2‑SH untuk HER2 berkurang karena kehadiran grup tiol daripada oleh Apt_HER2 polos karena grup tiol dapat terikat dengan residu tiol lain dalam protein atau aptamer lain yang dimodifikasi tiol. Namun, affinitas ikatan Apt_HER2‑MNS diukur sebagai serupa dengan affinitas ikatan Apt_HER2, hasil ini berarti bahwa tidak ada cukup Apt_HER2‑SH yang tidak terikat yang dapat mengganggu interaksi antara aptamer dan protein HER2 atau mWMNC tidak memiliki atau hanya memiliki sedikit pengaruh pada affinitas ikatan aptamer.

Eksperimen MRI in vivo dilakukan menggunakan model tikus tumor sinyegenik untuk mengevaluasi kemampuan Apt_HER2‑MNS untuk menargetkan tumor yang overexpressed HER2. Menggunakan model tumor yang dihasilkan dengan implantasi sel NIH3T6.7 ke dalam paha, eksperimen MRI dilakukan dari sebelum injeksi hingga 120 menit setelah injeksi WMNC atau Apt_HER2‑MNS (Gambar 5, lihat juga Berkas Tambahan 1: Gambar S4). Efek peningkatan kontras T2 oleh agen kontras berbasis IONP diamati sebagai gambar gelap karena mereka menginduksi efek pendekatan T2 sekitar proton. Oleh karena itu, dalam analisis intensitas sinyal, nilai T2 atau T2* direpresentasikan oleh R2 atau R2*. R2, nilai invers dari T2, digunakan untuk membandingkan intensitas sinyal dengan nilai positif. Dalam kasus WMNC, intensitas sinyal R2 tertinggi diamati 30 menit setelah injeksi WMNC setelah itu berangsur‑angsur menurun (Gambar 5a, b). Pada 120 menit setelah injeksi WMNC, intensitas sinyal T2 mirip dengan keadaan sebelum injeksi. Tingkat perubahan dalam nilai rata‑rata intensitas sinyal R2 kurang dari 10%; sehingga sulit untuk dikenali pada citra MR T2‑berbobot dengan mata telanjang. Dalam studi sebelumnya, telah ditunjukkan bahwa nanopartikel oksida besi yang dilapisi T80 menumpuk di sekitar jaringan tumor meskipun tidak ada moiety target [46]. Namun, dalam studi tersebut, dosis agen kontras sebesar 1,4 mg_Fe per tikus digunakan pada MRI T2‑berbobot, yang 14 kali lebih tinggi dari dosis yang digunakan dalam studi ini. Ini berarti bahwa WMNC tidak dapat menunjukkan efektivitas peningkatan kontras dalam eksperimen dengan dosis 0,1 mg_Fe per tikus (5 mg_Fe/kg). Perubahan seiring waktu dari intensitas sinyal R2* juga kurang dari 10%, dan tidak ada signifikansi statistik. Sebaliknya, 120 menit setelah injeksi, Apt_HER2‑MNS menyebabkan peningkatan intensitas sinyal sebesar 130% dibandingkan sebelum injeksi Apt_HER2‑MNS meskipun menggunakan dosis injeksi yang sama dengan WMNC (Gambar 5c, d). Dosis injeksi ini 2‑ hingga 30‑kali lebih rendah dari studi lain tentang agen kontras nanopartikel magnetik yang dimodifikasi aptamer [44, 47, 48]. Hasil ini mengindikasikan bahwa Apt_HER2‑MNS memiliki kemampuan target yang lebih tinggi daripada WMNC atau agen kontras lainnya yang dimodifikasi aptamer, dan juga mengindikasikan bahwa efek peningkatan kontras yang tinggi dari Apt_HER2‑MNS mungkin diharapkan meskipun dengan dosis yang lebih rendah daripada WMNC. Peningkatan kontras terutama muncul di pembuluh darah perifer dan di pusat jaringan tumor. Meskipun pembuluh darah perifer menjadi gelap segera setelah injeksi Apt_HER2‑MNS, peningkatan kontras di pusat lesi tumor pertama kali muncul pada 60 menit dan cenderung meningkat hingga 120 menit.

Untuk menekankan perubahan yang terlihat dalam efek peningkatan kontras sebelum dan setelah injeksi Apt_HER2‑MNS, analisis histogram dari intensitas sinyal R2 dilakukan dalam ROI pada citra MRI T2‑berbobot (Gambar 5e). Karena sinyal T2 terlihat sebagai peningkatan negatif pada citra MRI T2‑berbobot, ini direpresentasikan oleh R2. Setelah injeksi Apt_HER2‑MNS, pusat histogram bergeser ke sisi kanan. Peningkatan peningkatan kontras sekitar 10% diamati ketika perbedaan pusat histogram dihitung.

Untuk mengonfirmasi kehadiran Apt_HER2‑MNS dalam tumor secara histologis, pewarnaan biru Pruzia dilakukan (Gambar 5f). Dalam jaringan yang diwarnai biru Pruzia, inti dan sitoplasma diwarnai warna merah muda gelap atau terang, dan beberapa titik biru diamati di sekitar sel tumor. Kami mengasumsikan bahwa jaringan tumor diwarnai biru jika Apt_HER2‑MNS menargetkan tumor. Dalam hasil pewarnaan biru Pruzia, titik biru diamati dalam jaringan tumor, dan slide jaringan Apt_HER2‑MNS memiliki sekitar 3 kali lebih banyak titik biru dibandingkan slide jaringan WMNC. Pewarnaan biru Pruzia dapat mendeteksi ion Fe dalam jaringan; oleh karena itu, digunakan untuk mengonfirmasi akumulasi agen kontras berbasis IONP dalam jaringan tumor [44, 49, 50].

Kesimpulan

Ringkasnya, kami telah mengonfirmasi bahwa Apt_HER2‑MNS bekerja sebagai agen kontras MRI in vivo yang dapat ditargetkan HER2 melalui karakterisasi fisikokimia dan eksperimen MRI in vivo dalam model tikus tumor yang mengekspresi HER2. Apt_HER2‑MNS memiliki relaksivitas yang tinggi dan spesifisitas terhadap HER2, dan telah menunjukkan efek peningkatan kontras yang signifikan meskipun dengan dosis administrasi yang lebih rendah dibandingkan agen kontras T2 lainnya, karena nanopartikel oksida besi. Agen kontras ini diharapkan memberikan informasi mengenai ekspresi kanker HER2 pada pasien kanker dan dapat digunakan untuk memantau pasien kanker HER2+ selama kemoterapi menggunakan obat target HER2. Kami harap bahwa hasil karya ini akan menawarkan strategi yang menjanjikan untuk diagnosis kanker yang overexpressed HER2 dan perawatan pasien.