Biokompatibel Chitosan Nanobubbles untuk Pengiriman Doksorubisin yang Dimediasi Ultrasound

Bahan dan Metode

Materi

NB yang dijelaskan dalam penelitian ini dibuat menggunakan perfluoropropana (C3F8, Pusat Litbang untuk Gas Khusus di Institut Penelitian Teknik Fisika dan Kimia Industri Nuklir, Beijing, Cina) sebagai inti dan lapisan kitosan sebagai cangkang. Selain itu, Epikuron 200 (lesitin kedelai yang mengandung 95% dipalmitoylphosphatidylcholine, Lukas Meyer, Hamburg, Jerman), etanol (kelas analitis, Hushi, Cina), doksorubisin hidroklorida (Sigma-Aldrich, Missouri, AS), kitosan (100~300 kD , Bozhihuili, Qingdao, Cina), dan asam palmitat (JINDU, Shanghai, Cina) juga digunakan dalam penelitian ini. Pluronic F68 dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).

Baris Sel

Garis sel karsinoma payudara manusia MCF-7 diperoleh dari American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) dan dikultur dalam medium Eagle's (DMEM) yang dimodifikasi Dulbecco yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (FBS) (Gibco, Carlsbad , CA, AS). Sel-sel dikultur di bawah 37 °C, 5% CO₂ , dan kelembaban 95%. Sel dalam fase pertumbuhan logaritmik dipanen untuk eksperimen.

Persiapan NB Kitosan Berisi DOX

Kami membuat NB sesuai dengan metode yang dijelaskan sebelumnya [18, 19]. Kitosan dengan berat molekul sedang (100~300 kD) digunakan untuk cangkang DOX-NB, dan perfluoropropana digunakan untuk intinya. Untuk menyiapkan larutan DOX-kitosan, dosis DOX yang sesuai dilarutkan dalam air ultra murni dan 2 ml larutan DOX (1 mg/mL) ditambahkan ke larutan air kitosan dengan mencampurkannya dengan vortex mixer selama 5 s. Larutan DOX-kitosan diinkubasi selama 1  jam pada suhu 65 °C. Secara terpisah, larutan etanol yang mengandung Epikuron 200 ditambahkan ke larutan asam palmitat berair. Setelah menambahkan volume air ultra murni yang sesuai, sistem asam palmitat-Epikuron 200 dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Selanjutnya, sistem asam palmitat-Epikuron 200 dibagi menjadi tabung Eppendorf (tabung EP) 1,5 mL, dan udara di dalam tabung diganti dengan perfluoropropana menggunakan jarum suntik 10 mL dengan jarum panjang halus. Setiap tabung berosilasi selama 120 s dalam osilator mekanis (pencampur Ag dan Hg, Xi'an, Cina). Selanjutnya, semua cairan dalam tabung EP 1,5 mL dituangkan ke dalam tabung sentrifus dan digabungkan dengan larutan DOX-kitosan dalam penangas es. Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 30 menit pada -4°C. Selanjutnya, larutan berair Pluronic F68 (0,01%, w /dengan ), zat penstabil, ditambahkan ke dalam campuran di atas sambil diaduk. Langkah pemurnian dialisis (tabung sentrifus ultrafiltrasi, Millipore, 30 kDa) kemudian dilakukan untuk menghilangkan sisa DOX bebas.

Pengamatan Sifat Fisik NB

Suspensi DOX-NB diencerkan dengan menambahkan PBS (phosphate-buffered saline) dalam jumlah yang sesuai. Bentuk DOX-NB kemudian diamati dan dicitrakan di bawah mikroskop fluoresensi yang dilengkapi dengan lensa objektif perendaman minyak × 100 (OLYMPUS BX41, Olympus Corporation, Jepang). Gambar fluoresensi dinilai menggunakan mikroskop fluoresensi (Nikon TE2000-S, Jepang). Morfologi DOX-NB juga diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM) (JEOL, Tokyo, Jepang). Suspensi berair nanobubbles yang diencerkan disemprotkan pada kisi tembaga berlapis Formvar dan diwarnai dengan 4% w /v uranil asetat selama 10 menit. Kemudian sampel divisualisasikan dan dicitrakan menggunakan TEM. Ukuran dan potensi zeta permukaan DOX-NB diukur dengan ukuran partikel Delsa Nano C dan penganalisis potensi zeta (Beckmann Instruments, USA). Semua pengukuran dilakukan dalam rangkap tiga untuk menghitung nilai rata-rata.

Stabilitas DOX-NB

Ukuran dan morfologi DOX-NB diukur dari waktu ke waktu untuk mengamati stabilitas nanobubbles ini. Beberapa bagian DOX-NB disimpan dalam lemari es pada 4 °C selama 24 h atau 48 h. Yang lain disimpan pada suhu kamar selama 6 h. Stabilitas nanobubbles pada 25 °C juga diselidiki dalam serum manusia yang diliofilisasi (Seronorm™ Human, Norwegia). Untuk tujuan ini, 1 ml suspensi berair DOX-NBs ditambahkan ke 1 ml serum dan diinkubasi selama 6 jam pada 25 °C. Kemudian, semua DOX-NB diukur dengan analisis morfologi menggunakan mikroskop optik untuk mengevaluasi integritas strukturnya. Ukuran NB diukur dengan ukuran partikel Delsa Nano C dan penganalisis potensi zeta (Beckmann Instruments, USA).

Penentuan Kapasitas Pemuatan DOX NB

Kurva standar konsentrasi DOX dibuat menggunakan pengenceran DOX serial pada konsentrasi 0,025, 0,05, 0,1, dan 0,2 mg/mL dan diukur menggunakan spektrofotometer UV (UV-2450, SHIMADZU). Selanjutnya, efisiensi pemuatan DOX dinilai pada 480 nm menggunakan NB kosong sebagai kontrol, dan konsentrasi DOX dalam DOX-NB dihitung berdasarkan kurva standar yang ditetapkan di atas. Untuk menghindari fotodegradasi DOX selama proses pemurnian dan pengukuran, semua prosedur dilakukan dengan terlindung dari cahaya. Selanjutnya, suspensi DOX-NB dibekukan-kering selama 1,5 hari dengan pengering beku pada -55 °C dan di bawah 0,080 mbar [20]. DOX-NB beku-kering kemudian ditimbang untuk menghitung kapasitas pemuatan obat dalam hal efisiensi enkapsulasi obat (EE) sebagai berikut:EE = A /B × 100%, di mana A adalah jumlah DOX yang dimuat di NB, dan B adalah jumlah awal DOX dalam larutan. Eksperimen diulang tiga kali.

Rilis DOX yang Dimediasi Ultrasound

Kinetika pelepasan in vitro DOX dari DOX-NBs ditentukan dengan ada atau tidaknya USG (US) dengan teknik kantong dialisis pada 37 °C. DOX-NB ditutup dalam membran dialisis (Spectra/Por, cutoff 12.000-14.000 Da), yang ditempatkan dalam wadah 100 ml PBS dengan pengocokan pada 100 rpm. Grup AS disonikasi oleh AS (VCX400, Sonics and Materials, USA; kerapatan daya, 1,0 W/cm2; frekuensi, 20 kHz) selama 40 s sebelum pengujian [21]. Pelepasan DOX diukur hingga 24 jam, menarik 1 ml pada setiap waktu yang ditentukan dan mengganti dengan 1 ml PBS segar. Konsentrasi DOX dalam buffer eksternal diukur pada 480 nm dengan spektrofotometer UV. Eksperimen rilis dilakukan dalam rangkap tiga.

Pencitraan Ultrasonografi In Vitro (Kurva Intensitas Waktu)

Pencitraan AS dan stabilitas DOX-NB di bawah ultrasound diverifikasi in vitro pada sistem pemindai ultrasound klinis (LOGIQ E9; GE, USA). Percobaan dilakukan dengan frekuensi tertentu, kekuatan transmisi, dan durasi paparan ultrasound. Memanfaatkan metode yang dikembangkan sebelumnya [19] (Gbr. 5a), DOX-NB mencapai peningkatan ultrasound. Stabilitas pencitraan ultrasound DOX-NB dievaluasi setelah paparan mereka terhadap stimulus ultrasound dengan indeks mekanis (MI) 0,10 dan kedalaman pencitraan 4,5 cm. Semua gambar AS dianalisis secara offline dengan Image J. Selanjutnya, analisis gambar dilakukan menggunakan perangkat lunak bawaan LOGIQ E9 untuk menghitung nilai skala abu-abu sampel. Untuk setiap klip 60 detik, yang diperoleh dari 0 hingga 15 menit, koreksi gerakan pertama kali dilakukan untuk setiap frame dan nilai desibel diperoleh. Setiap nilai desibel diplot pada kurva intensitas waktu untuk mencerminkan perubahan peningkatan kontras sebelum dan sesudah iradiasi ultrasonik. Intensitas puncak dan durasi peningkatan diekspresikan oleh kurva intensitas waktu. Selama analisis, nilai hamburan balik yang dikoreksi rentang diperoleh dengan mengurangkan sinyal latar belakang yang sesuai dengan sampel air.

Uji Sitotoksisitas untuk NB Kosong

Keamanan hayati NB kitosan kosong diuji menggunakan kit pengujian Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Sigma-Aldrich, USA). Sebelum pengujian, sel MCF-7 dilapisi dengan kepadatan 2 × 10 ³ sel/sumur di piring 96-sumur. Sel-sel menjadi sasaran pengobatan dengan memvariasikan konsentrasi NB kitosan dan kondisi ultrasound. Keamanan hayati NB kitosan dievaluasi dengan menginkubasi sel MCF-7 pada konsentrasi serial NB dari 0 hingga 30%. Peralatan stimulasi ultrasound intensitas rendah (US10, Cosmogamma Corporation, Italia) digunakan untuk melakukan stimulasi ultrasound pada frekuensi tetap 1 MHz, menggunakan siklus kerja 70% dan denyut nadi 100 Hz. Setiap kelompok diproses dengan waktu penyinaran yang berbeda dan intensitas suara yang berbeda. Untuk pertimbangan keamanan, ultrasound digunakan pada intensitas 0,5 W/cm ² atau 1,0 W/cm ² dengan panjang pulsa 30 atau 60 s (Tabel 1). Kedalaman, frekuensi, dan kondisi ultrasound lainnya tetap konsisten selama semua percobaan ultrasound [22]. Setelah perawatan, sel-sel dikultur dalam pelat 96-sumur selama 24 jam tambahan. Selanjutnya, media pemeliharaan yang mengandung 1% FCS digunakan untuk menggantikan media yang mengandung obat, dan larutan CCK-8 ditambahkan ke dalam pelat sesuai dengan instruksi pabrik. Setelah inkubasi 2,5 h tambahan pada 37 °C, absorbansi spektrofotometri di setiap sumur ditentukan menggunakan pembaca lempeng mikro (Bio-Rad, USA) pada panjang gelombang 450-nm.

Pengambilan Obat Intraseluler In Vitro

Penyerapan DOX intraseluler ditentukan oleh flow cytometry (Beckman Coulter, Miami, USA). Singkatnya, sel-sel MCF-7 dilapisi ke dalam pelat enam sumur dengan kepadatan 2,5 × 10 ⁵ sel/sumur dalam media DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS. Setelah kultur semalam, media digantikan oleh media kultur yang mengandung DOX-NBs atau DOX bebas pada konsentrasi yang sama, dan sel-sel diperlakukan dengan atau tanpa ultrasound. Dengan mempertimbangkan viabilitas sel dan efisiensi sonoporasi yang tinggi, konsentrasi DOX-NB 20% dipilih untuk eksperimen berikutnya, sedangkan perlakuan ultrasound ditetapkan pada intensitas 0,5 W/cm ² dengan panjang pulsa 30 atau 60 s. Selanjutnya, setelah inkubasi 1 jam, media sel dihilangkan, dan sel dicuci tiga kali dengan PBS segar untuk menghilangkan DOX-NB atau DOX yang bebas dan tidak terikat. Sel-sel kemudian dikumpulkan dengan sentrifugasi (5 min, 1000 rpm), disuspensikan kembali dalam 500 μL PBS sebelum penyerapan DOX intraseluler, dan dianalisis pada flow cytometer FACSCalibur. Selama analisis, gerbang ditetapkan secara sewenang-wenang untuk mendeteksi fluoresensi merah, dan 10.000 sel dianalisis untuk setiap sampel.

Pengaruh DOX-NB pada Sel MCF-7 In Vitro

Uji CCK-8 dan flow cytometry digunakan untuk melakukan evaluasi kuantitatif proliferasi sel MCF-7 dan apoptosis setelah penyerapan DOX. Singkatnya, sel MCF-7 disepuh dan diinkubasi dalam pelat 96-sumur atau pelat 6-sumur dan dirawat menggunakan prosedur yang dijelaskan di atas. Untuk uji proliferasi, sel-sel yang dirawat diinkubasi pada 37 °C selama 24 jam, diikuti dengan pewarnaan CCK-8 selama 2 jam dan pembacaan absorbansi pada pembaca lempeng mikro. Apoptosis yang diinduksi DOX ditentukan oleh uji Annexin V-APC sebagai berikut:setelah perawatan enam jam, sel-sel diwarnai dengan menambahkan 0,5 μL V-APC (Sungene Biotech, Tianjin, China) ke dalam setiap sumur, dan analisis flow cytometry (Beckman, Coulter, Fullerton, CA, USA) digunakan untuk mengukur sel-sel apoptosis.

Analisis Statistik

Semua percobaan dilakukan dalam rangkap tiga dan data dinyatakan sebagai rata-rata. Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan SPSS Versi 18.0. p nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Karakterisasi Fisiko-kimiawi DOX-NB

NB yang disiapkan menampilkan morfologi bola. Di bawah mikroskop terbalik, pencitraan NB menunjukkan garis bulat diskrit dan utuh (Gbr. 1a), yang konsisten dengan pencitraan mikroskop fluoresensi DOX-NB (Gbr. 1b). Gambar TEM representatif dari solusi DOX-NB ditunjukkan pada Gambar. 1c. Sifat fisik NB ditentukan oleh ukuran partikel dan zeta potential analyzer. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, diameter rata-rata DOX-NB adalah 641 nm, P.I. 0,256. Potensi zeta DOX-NB adalah + 67.12 ± 2.1 mV, yang cukup tinggi untuk menyebabkan mereka saling tolak, membantu dalam pencegahan agregasi NB dan mendukung stabilitas jangka panjangnya.

NB diamati di bawah mikroskop cahaya (perbesaran × 1000) (a ) dan gambar mikroskop fluoresensi dari NB yang dimuat DOX (b ) dan gambar TEM dari NB yang dimuat DOX (c )

Distribusi ukuran NB yang dimuat DOX

Stabilitas dan Efisiensi Pemuatan Obat DOX-NB

DOX-NB stabil dalam suspensi selama 48 h pada 4 °C. Setelah disimpan pada suhu kamar, ukuran DOX-NB ditemukan sedikit lebih besar baik dalam PBS maupun serum manusia (Gbr. 3). Kapasitas pemuatan akhir DOX-NB adalah 64,12 mg DOX/g DOX-NB, yang sesuai dengan EE sebesar 54,18%.

Gambar optik DOX-NB a pada suhu kamar, b setelah 6 h pada 25 °C di PBS, dan c setelah 6  jam pada 25 °C dalam serum

Rilis DOX oleh DOX-NB In Vitro

Gambar 4 menunjukkan profil pelepasan DOX in vitro dari DOX-NB di PBS dengan ada atau tidak adanya pengobatan AS untuk menilai efek sonikasi pada pelepasan DOX. Jumlah DOX yang dilepaskan dari DOX-NB berbeda secara signifikan antara kelompok AS dan kelompok non-AS. Setelah 5 h, DOX-NB di grup AS telah melepaskan 46,45% dari DOX yang dienkapsulasi dibandingkan dengan hanya 9,3% yang dirilis di grup non-AS. Kelompok non-AS hanya merilis 19,4% DOX setelah 24 jam. Sebaliknya, hampir 80% DOX dikeluarkan di grup AS. Hasilnya menunjukkan bahwa iradiasi AS dapat mendorong pelepasan DOX dari DOX-NB karena efek kavitasi.

Pelepasan doksorubisin dari DOX-NB dengan atau tanpa iradiasi ultrasonik (2 kHz, 1,0 W/cm ² )

Stabilitas Ultrasound DOX-NB

DOX-NB mencapai peningkatan ultrasound in vitro, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b. Atenuasi nilai desibel ultrasonik ditunjukkan pada Gambar 5c. Hasil menunjukkan bahwa DOX-NB mencapai peningkatan ultrasound yang baik, dan kurva halus menunjukkan bahwa proses redaman ultrasound dalam suspensi NB relatif lambat. Ini menunjukkan bahwa sinyal ultrasound DOX-NB mungkin cukup stabil untuk pencitraan dan peningkatan kontras.

Ilustrasi skema pengaturan eksperimental in vitro (a ), gambar ultrasound dari NB yang dimuat DOX (0, 5, 10, dan 15 min) menggunakan probe 9,0-MHz (b ) dan pengukuran intensitas waktu kontras ultrasonik dan NB bermuatan DOX (c )

Keamanan Hayati NB Kosong

Viabilitas sel MCF-7 diukur dengan kultur dengan NB kosong (tanpa DOX) selama 24 jam setelah ultrasound. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, NB kosong tidak secara signifikan memengaruhi viabilitas sel di bawah intensitas ultrasonik tertentu. Saat menggunakan intensitas ultrasonik 0,5 W/cm ² dan waktu penyinaran 30 s, 99,53% dan> 80% sel MCF-7 masing-masing hidup dalam suspensi NB 10% dan 30% (kelompok 1), dan penurunan viabilitas sel MCF-7 bergantung pada dosis. Selain itu, intensitas ultrasonik dan waktu penyinaran merupakan dua faktor lain yang mempengaruhi viabilitas sel MCF-7. Khususnya, ketika konsentrasi NB kosong adalah 30%, sel MCF-7 diperlakukan pada 0,5 W/cm ² selama 30-an menunjukkan viabilitas yang lebih tinggi daripada yang diobati pada 0,5 W/cm ² untuk 60 s atau 1 W/cm ² selama 30 detik (0,84% vs 0,75% vs 0,63%). Oleh karena itu, intensitas ultrasound 0,5 W/cm ² dan waktu penyinaran 30 s/60 s digunakan untuk eksperimen serapan sel.

Sitotoksisitas in vitro dari berbagai konsentrasi NB dan intensitas suara dalam sel MCF-7

Peningkatan Pengiriman DOX In Vitro yang Dimediasi oleh DOX-NB dan Iradiasi Ultrasound

Sel MCF-7 yang diobati dengan DOX-NB atau DOX bebas (pada konsentrasi DOX yang sama) diperbaiki, dan intensitas fluoresensinya diukur dengan flow cytometry. Sel yang tidak menerima pengobatan DOX digunakan sebagai kontrol kosong. Serapan seluler DOX pada kelompok DOX-NB dibandingkan dengan DOX bebas dan kelompok kontrol. Pada Gambar. 7, intensitas fluoresensi rata-rata sel MCF-7 yang diinkubasi dengan DOX-NB jauh lebih rendah daripada autofluoresensi sel yang diinkubasi dengan DOX bebas, yang menggambarkan bahwa enkapsulasi DOX dalam NB kitosan dapat melindungi sel dari serapan DOX dan DOX- cedera yang disebabkan.

Analisis sitometri aliran pengiriman DOX dalam sel MCF-7 oleh NB yang memuat DOX (US1 0,5 W/cm ² 30 detik, US2 0,5 W/cm ² 60-an)

Namun, iradiasi ultrasound menghasilkan peningkatan yang nyata dalam pengambilan DOX dalam sel MCF-7 yang diinkubasi dengan DOX-NB; DOX-NB dapat mengirimkan lebih banyak DOX ke dalam sel MCF-7 dengan bantuan iradiasi ultrasonik. Sebaliknya, penyerapan DOX dalam sel MCF-7 yang diinkubasi dengan DOX bebas hanya sedikit meningkat di bawah iradiasi ultrasonik. Hasilnya menunjukkan bahwa penyerapan DOX dalam sel MCF-7 yang diinkubasi dengan DOX-NB jauh lebih tinggi daripada sel yang diinkubasi dengan DOX bebas di bawah iradiasi ultrasonik.

Selain itu, serapan DOX dalam sel MCF-7 yang diinkubasi dengan DOX-NB sedikit meningkat pada waktu penyinaran yang lebih lama. Ini mungkin karena peningkatan pecahnya DOX-NB, menghasilkan pori-pori sementara pada membran sel MCF-7.

Peningkatan Proliferasi dan Apoptosis Sel Tumor yang Diinduksi DOX dengan Iradiasi Ultrasound

Untuk menyelidiki efek anti-kanker dari pengiriman DOX-NB yang dibantu ultrasound, kelangsungan hidup sel MCF-7 diukur menggunakan uji CCK-8 dan flow cytometry. Hasil penelitian menunjukkan bahwa viabilitas sel MCF-7 pada kelompok DOX-NBs lebih tinggi dibandingkan pada kelompok DOX tanpa ultrasound. Sementara itu, viabilitas sel MCF-7 pada kelompok DOX-NBs secara signifikan lebih rendah dibandingkan dengan kelompok DOX dengan penyinaran ultrasonik lokal. Rasio viabilitas sel dalam kelompok DOX-NB (21,0 ± 2,2%, p < 0,01) jauh lebih tinggi daripada kelompok DOX bebas tanpa iradiasi ultrasonik (6,4 ± 0,7%), menunjukkan bahwa sebagai vektor penghantaran obat, NB memperbaiki penurunan proliferasi sel yang diinduksi DOX dalam sirkulasi darah.

Selain itu, rasio viabilitas sel secara signifikan menurun pada sel yang diobati dengan DOX-NBs + US (3,1 ± 0,8%, 2,2 ± 0,9%) dibandingkan dengan mereka yang diobati dengan DOX-NB saja (21,0 ± 2,2%, p < 0,01), DOX gratis saja (6,4 ± 0,7%), dan DOX + USG gratis (4,1 ± 0,8%, 3,8 ± 0,6%) (Gbr. 8). Data menunjukkan bahwa DOX-NBs + US secara signifikan meningkatkan efek sitotoksik DOX dalam sel MCF-7. Kelompok DOX-NBs + US juga menunjukkan sitotoksisitas yang lebih besar dalam sel MCF-7 daripada kelompok DOX gratis dan DOX + ultrasound gratis.

Perbandingan viabilitas sel dalam kelompok yang berbeda

Rasio viabilitas sel pada kelompok DOX + ultrasound bebas (4,1 ± 0,8%) lebih rendah dibandingkan dengan kelompok DOX bebas (6,4 ± 0,7%). Oleh karena itu, ultrasound juga mengurangi viabilitas sel MCF-7 yang diobati dengan DOX gratis. Rasio viabilitas sel adalah 2,2 ± 0,9% ketika sel diperlakukan dengan DOX-NB + ultrasound (60 s), yang lebih rendah daripada ketika diobati dengan DOX-NBs + ultrasound (30 s) (3,1 ± 0,8%), menunjukkan bahwa panjang pulsa yang lebih panjang (60 s) lebih efisien dalam pengiriman DOX-NB.

Selanjutnya, apoptosis sel MCF-7 dinilai dengan pewarnaan Annexin V 6 h setelah pengobatan DOX atau DOX-NB gratis, dengan atau tanpa iradiasi ultrasound. Persentase sel MCF-7 yang mengalami apoptosis dengan adanya DOX bebas adalah 4,4 ± 0,9%, sedangkan rasio yang sama diamati pada sel yang diobati dengan DOX bebas dan ultrasound (30 s, 60s). Pengiriman DOX-NB yang dibantu ultrasound secara signifikan meningkatkan persentase sel apoptosis dibandingkan dengan kelompok DOX gratis (45,7 ± 1,1% vs. 4,4 ± 0,9%, p < 0,01). Selain itu, persentase sel apoptosis pada kelompok DOX-NBs tanpa iradiasi ultrasound lebih rendah dibandingkan dengan kelompok perlakuan DOX gratis (3,2 ± 0,9% vs 4,4 ± 0,9%). Konsisten dengan uji viabilitas sel, data ini menunjukkan bahwa pengiriman DOX-NB yang dibantu ultrasound meningkatkan efek anti-kanker DOX.

Diskusi

Kanker payudara telah menarik perhatian karena tingginya insiden dan tingkat kematian. Menurut laporan dari Globocan, kanker payudara merupakan penyebab kematian akibat kanker yang paling sering pada wanita di daerah yang kurang berkembang [23]. DOX adalah agen anti kanker mammae yang populer karena dapat menginduksi kerusakan DNA [24]. Namun, juga dapat menyebabkan efek samping yang parah, seperti kardiotoksisitas, dalam aplikasi klinis [25]. Untuk mengatasi efek toksik tersebut, diperlukan sistem penghantaran obat yang efisien yang hanya menargetkan sel kanker, sehingga meningkatkan konsentrasi obat di tempat targetnya dan menguranginya di jaringan non-target [26]. Dalam karya ini, NB kitosan biologis yang memuat DOX dirancang, yang bila digunakan bersama dengan ultrasound, dapat secara terarah mengangkut DOX ke dalam sel kanker payudara.

NB kitosan biologis yang terdiri dari lesitin dan asam palmitat telah diformulasikan dan digunakan untuk deteksi MRI/USG, pengiriman gen, dan pengiriman oksigen [13, 18, 27]. Namun, kapasitas pemuatan obat dan efisiensi pengiriman NB kitosan biologis jauh dari optimal. Marano dkk. menggabungkan DOX-loaded glycol chitosan NBs dan extracorporeal shockwaves (ESWs) untuk meningkatkan aktivitas antitumor DOX [28]. Tetapi ESW tidak memiliki kemampuan pencitraan untuk menilai ukuran tumor dan secara akurat mendeteksi lokasinya. Selanjutnya, meskipun efek samping yang parah dari ESWs jarang terjadi, mereka dapat menyebabkan aritmia jantung sementara [29]. Metabolit glikol termasuk glikolat dan pengendapan kalsium oksalat juga dapat menyebabkan asidosis metabolik yang parah [30]. Dibandingkan dengan ESW, ultrasound memiliki keunggulan yang lebih besar karena kemampuan pencitraannya, non-invasif, dan keamanannya.

Dalam penelitian ini, DOX-NB baru disiapkan menggunakan perfluoropropana sebagai inti dan kitosan sebagai cangkang. Kitosan dapat mengaktifkan makrofag dan juga dapat meningkatkan fungsi pro-inflamasinya [31]. Perlu dicatat bahwa DOX-NB yang bermuatan positif dapat berinteraksi kuat dengan komponen darah, menghasilkan pembersihan yang cepat dari darah dan akumulasi target suboptimal di lokasi tumor [32]. To overcome this problem, the surface of DOX-NBs was coated with Pluronic F-68, an amphiphilic and non-ionic block copolymer formed by propylene oxide and ethylene units, which may also prevent the aggregation of nanobubbles by steric stabilization [13, 33].

Ensuring the biosafety of NBs is fundamental to their clinical application. In this study, the safety of chitosan NBs was monitored via cell viability, which showed no obvious effect on cell viability with a chitosan NB concentration of 10% and ultrasound treatment (0.5 W/cm ² , 30 s), suggesting low cytotoxicity of chitosan NBs. Indeed, even treatment with a high dosage (30%) of chitosan NBs resulted in less than 20% observable cell death. The results showed that cell viability in chitosan NBs was much higher than that in lipid-coated nanobubbles [19], indicating that chitosan NBs were highly biocompatible with MCF-7 cells and that the cell death observed in this study may be due to the energy released by ultrasound-induced NB disruption. The high safety profile of biocompatible chitosan NBs renders them suitable for loading other drugs in the future.

Our research shows that US irradiation can effectively promote the release of DOX from DOX-NBs and subsequent cellular uptake of DOX in vitro. Exposure of cells to DOX-NBs and ultrasound resulted in near instantaneous cellular entry of DOX. The reason for this is that sonoporation is a process by which ultrasonically activated ultrasound contrast agents pulsate near biological barriers (cell membranes or endothelial layers), increasing their permeability and thereby enhancing the extravasation of external substances. In this way, drugs and genes can be delivered inside individual cells [34]. Our data showed that the cellular uptake of DOX was significantly higher in the DOX-NBs group than in the free DOX group when ultrasound-assisted delivery was applied. Meanwhile, without ultrasound, MCF-7 cells in the free DOX group showed increased DOX uptake than those in the DOX-NBs group, indicating that the chitosan NBs could reduce cellular uptake of DOX in normal tissues and protect them in the absence of ultrasonic irradiation.

Chen dkk. showed that the carrier-free HCPT/DOX nanoparticles enhanced synergistic cytotoxicity against breast cancer cells in vitro [35], but they could not reduce DOX cytotoxicity and its toxicity in the circulation. A biophysical research group from Vytautas Magnus University proposed combining DOX-liposomes with microbubbles and US to enhance targeting [36]. Their results showed that the cell survival rate of DOX-liposomes decreased by 60~70% when microbubbles and ultrasound were present. By comparison, the cell survival rate of the DOX-NBs + US group in our study was 85.3% or 89.5% ((21–3.1 or 21–2.2)/21) lower than that of the DOX-NBs group. This proves that the combination of DOX-NBs and US are more effective in transporting DOX than DOX-liposomes combined with microbubbles and US. We also found that the cells in the DOX-NBs + US group showed a higher rate of apoptosis than those in the free DOX and DOX-NBs only groups. This finding was not unexpected as greater accumulation of DOX in cancer cells can increase cell death, consistent with a previous report [37].

Kesimpulan

In summary, DOX-loaded biocompatible chitosan NBs were successfully prepared using a combination of biological surfactants. The prepared NBs possessed a good ability to achieve ultrasound enhancement and excellent biosafety. The in vitro results demonstrated that DOX­NBs are an innovative drug delivery system that may be useful in obtaining efficient ultrasound­assisted DOX delivery for the treatment of mammary cancer.

Singkatan

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DOX:

Doxorubicin hydrochloride

EE:

Encapsulation efficiency

EP tubes:

Eppendorf tubes

ESWs:

Extracorporeal shock waves

MCF-7:

Human breast adenocarcinoma cell line

NBs:

Nanobubbles

US:

Ultrasound

UTN/MD:

Ultrasound-targeted nano/microbubble destruction

Perlakuan Permukaan TiO2 yang Efisien Menggunakan Cs2CO3 untuk Sel Surya Sb2S3 Tipe Planar yang Diproses dengan Solusi CRD Pemblokiran Terbalik AlGaN/GaN Akurasi Tinggi (RB-CRD) dengan Hybrid Trench Cathode