Pengiriman Terarah Doxorubicin Menggunakan Nanobubuk Kitosan Biokompatibel dan Ultrasuara

Abstrak

Pengiriman nanobubuk (NB) yang diarahkan oleh ultrasuara telah muncul sebagai strategi non-invasif untuk transportasi obat yang spesifik lokasi. NB berbasis kitosan menawarkan biokompatibilitas superior dan kapasitas pemuatan tinggi untuk kemoterapeutik. Dalam studi ini kami memproduksi NB kitosan termuat hidroklorida doxorubicin (DOX), mengukur ukuran, potensial zeta, efisiensi enkapsulasi (EE = 54,18 %) dan profil pelepasan obat, dan mengevaluasi performa citra, biosafety, dan efikasi terapeutik pada sel payudara kanker MCF‑7. NB‑DOX melepaskan 46 % muatan dalam 5 jam setelah paparan ultrasuara (US) versus 9 % tanpa US, dan memberikan kadar DOX intrakelular dan tingkat apoptosis yang jauh lebih tinggi daripada DOX bebas. Hasil ini menunjukkan bahwa NB kitosan biokompatibel adalah platform yang menjanjikan untuk pengiriman doxorubicin yang diarahkan dan diinduksi oleh ultrasuara.

Latar Belakang

Kemoterapi tetap menjadi sumbang perawatan tumor ganas, namun toksisitas sistemik membatasi indeks terapeutik agen seperti doxorubicin. Pengiriman obat yang dilokalisasi dapat meningkatkan konsentrasi di lokasi tumor sambil melindungi jaringan sehat. Penghancuran mikro‑ atau nano‑bubuk yang diarahkan oleh ultrasuara (UTN/MD) menyediakan cara non-invasif yang diarahkan citra untuk meningkatkan permeabilitas dan penyerapan obat. Mikrobubuk konvensional terlalu besar untuk ekstravasasi secara efisien, sedangkan bubuk berukuran nano dapat melintasi dinding kapiler dan mencapai parenkim tumor secara lebih efektif.

Formulasi NB yang ada sering bergantung pada lipid sintetik atau polimer yang menimbulkan kekhawatiran biokompatibilitas. Kitosan, polisakarida biodegradable yang berasal dari alam, memiliki imunogenisitas rendah, aktivitas antibakteri, dan properti antitumor intrinsik. Dikombinasikan dengan lecithin dan asam palmik—keduanya surfactant yang disetujui FDA dan bertoksisitas rendah—NB kitosan dapat dirancang untuk aman dan sangat fungsional.

Material dan Metode

Bahan

Propana perfluoro (C₃F₈) berfungsi sebagai inti gas, sementara kitosan berat molekuler sedang (100–300 kDa) membentuk cangkang. Epikuron 200 (lecithin kedelai), asam palmik, dan Pluronic F68 ditambahkan untuk meningkatkan stabilitas dan mengurangi agregasi. Hidroklorida doxorubicin (Sigma‑Aldrich) adalah model kemoterapeutik.

Sel Sel

Sel kanker payudara manusia MCF‑7 (ATCC) dikultur dalam DMEM + 10 % FBS pada 37 °C, 5 % CO₂.

Persiapan NB Termuat DOX

DOX (1 mg mL⁻¹) dicampur dengan larutan kitosan, di-vortex, dan diinkubasi pada 65 °C selama 1 jam. Terpisah, campuran asam palmik–Epikuron 200 dihomogenkan dan diisi ke dalam tabung 1,5 mL, yang kemudian diganti dengan C₃F₈ dan di-oscillate selama 120 s. NB yang dihasilkan digabungkan dengan larutan DOX‑kitosan dalam mandi es, didinginkan pada –4 °C selama 30 menit, dan kemudian distabilkan dengan Pluronic F68. DOX bebas dihapus dengan dialisis 30 kDa.

Karakterisasi Fisik

Ukuran dan potensial zeta diukur oleh pencitraan cahaya dinamis (DLS) dan analyzer Delsa Nano C. Morfologi divisualkan dengan mikroskopi fluoresensi (×100 immersi minyak) dan mikroskopi elektron transmisi (TEM) setelah pewarnaan asam uranil asetat.

Stabilitas

NB disimpan pada 4 °C (48 jam) atau suhu ruang (6 jam) dan dievaluasi ulang oleh DLS dan mikroskopi optik. Stabilitas dalam serum manusia (Seronorm™) dievaluasi setelah inkubasi 6 jam pada 25 °C.

Kapasitas Pemuatan DOX

Kurva standar UV‑Vis (480 nm) mengukur DOX yang terenkapsulasi. Efisiensi enkapsulasi (EE) dihitung sebagai EE = (A/B) × 100 % (A = DOX dalam NB, B = DOX awal). Pengeringan beku dan penimbangan menghasilkan kapasitas pemuatan 64,12 mg DOX g⁻¹ NB.

Pelepasan DOX yang Diinduksi oleh Ultrasuara

Pelepasan DOX dipantau dengan dialisis (cutoff 12.000–14.000 Da) pada 37 °C dengan atau tanpa US (1,0 W cm⁻², 20 kHz, 40 s). Sampel dikumpulkan per jam selama 24 jam dan diukur dengan UV‑Vis.

Citra Ultrasuara In Vitro

Menggunakan scanner GE LOGIQ E9, kami merekam kurva intensitas‑waktu pada MI 0,10, kedalaman 4,5 cm, dan klip 60 detik. Nilai desibel diplot untuk menilai stabilitas kontras.

Toksisitas NB Kosong

Sel MCF‑7 diekpos pada berbagai konsentrasi NB (0–30 %) dengan US pada 0,5 W cm⁻² (30 detik) atau 1,0 W cm⁻² (30 detik). Kehidupan sel diukur 24 jam kemudian dengan ensai CCK‑8 (absorbansi 450 nm).

Penyerapan DOX Intrakelular

Sel dirawat dengan NB‑DOX (20 %) atau DOX bebas (konsentrasi setara) selama 1 jam, dengan atau tanpa US (0,5 W cm⁻², 30/60 detik). Setelah dicuci, sel dianalisis dengan situsometrika aliran (gate fluoresensi merah, 10.000 peristiwa).

Proliferasi Sel dan Apoptosis

Setelah perawatan 24 jam, keberadaan diukur dengan CCK‑8. Apoptosis setelah 6 jam dikuantifikasi dengan pewarnaan Annexin V‑APC dan situsometrika aliran.

Analisis Statistik

Data direpresentasikan sebagai mean ± SD dari tiga eksperimen independen (p < 0,05). Analisis dilakukan dengan SPSS 18.0.

Hasil

Karakterisasi Fisikokimia

NB‑DOX menunjukkan morfologi bola seragam (Gambar 1). DLS mengungkapkan diameter rata-rata 641 nm (P.I. 0,256) dan potensial zeta yang sangat positif +67,1 mV, yang memastikan stabilitas koloid.

Stabilitas dan Efisiensi Pemuatan

NB stabil selama 48 jam pada 4 °C; peningkatan ukuran ringan terjadi setelah 6 jam pada 25 °C dalam PBS atau serum. Efisiensi enkapsulasi adalah 54,18 % dengan kapasitas pemuatan 64,12 mg g⁻¹.

Profil Pelepasan DOX

Paparan US mempercepat pelepasan DOX: 46,5 % dilepaskan setelah 5 jam versus 9,3 % tanpa US. Setelah 24 jam, sekitar 80 % obat dilepaskan di bawah US, sedangkan hanya 19,4 % dilepaskan tanpa US.

Stabilitas Citra Ultrasuara

Kurva intensitas‑waktu (Gambar 5) mengonfirmasi peningkatan kontras yang berkelanjutan dan attenuasi lambat, yang menunjukkan bahwa NB‑DOX menyediakan citra yang andal di bawah pengaturan US klinis.

Biosafety NB Kosong

Kehidupan sel tetap >80 % pada konsentrasi NB 30 % dengan US 0,5 W cm⁻², 30 detik. Intensitas lebih tinggi atau paparan yang lebih lama secara modest mengurangi keberadaan, mengonfirmasi toksisitas rendah formulasi NB.

Pelepasan DOX yang Ditingkatkan oleh US

Situsometrika aliran menunjukkan fluoresensi DOX intrakelular yang jauh lebih tinggi pada sel yang dirawat dengan NB‑DOX + US dibandingkan DOX bebas (p < 0,01). Pulsa US yang lebih lama (60 detik) lebih meningkatkan penyerapan.

Efisiensi Antikanker yang Ditingkatkan

Ensa viabilitas mengungkapkan 21,0 % kelangsungan untuk NB‑DOX saja, menurun menjadi 3,1 % dengan 30 detik US dan 2,2 % dengan 60 detik US. DOX bebas saja menghasilkan 6,4 % kelangsungan, sementara DOX bebas + US mencapai 4,1 %. Analisis Annexin V menunjukkan 45,7 % apoptosis dengan NB‑DOX + US versus 4,4 % dengan DOX bebas.

Pembahasan

Kanker payudara tetap menjadi penyebab utama kematian kanker pada wanita. Toksisitas kardiovaskular doxorubicin memerlukan sistem pengiriman yang diarahkan. NB berbasis kitosan, dilapisi Pluronic F68, menggabungkan biokompatibilitas yang menguntungkan dengan pemuatan obat yang efisien dan pelepasan yang dipicu oleh US. Dibandingkan mikrobubuk lipid atau pendekatan gelombang kejut ekstrasor, NB kitosan yang diarahkan oleh US menawarkan kemampuan citra yang superior, toksisitas sistemik yang lebih rendah, dan penyerapan sel tumor yang ditingkatkan melalui sonoporasi.

Data kami mengonfirmasi bahwa iradiasi US mempromosikan pelepasan DOX yang cepat dari NB dan secara signifikan meningkatkan pengiriman intrakelular dan apoptosis. Potensial zeta tinggi memastikan stabilitas koloid, sementara asal alami kitosan mengurangi klarifikasi cepat dan aktivasi imun.

Kesimpulan

Kami berhasil merancang NB kitosan biokompatibel yang memuat DOX secara efisien, mempertahankan kontras ultrasuara, dan menunjukkan toksisitas intrinsik rendah. Stimulasi ultrasuara memicu pelepasan obat yang cepat dan secara signifikan meningkatkan efikasi terapeutik pada sel kanker payudara, menyoroti potensi platform ini untuk kemoterapi yang diarahkan dan non-invasif.

Singkatan

CCK‑8

Cell Counting Kit‑8

DMEM

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

DOX

Hidroklorida doxorubicin

EE

Efisiensi Enkapsulasi

NBs

Nanobubuk

US

Ultrasuara