Nanopartikel PLGA-Lipid Berlabel 131I untuk Pengiriman Terpacuan Paclitaxel dan Citra Terapi Melanoma

Latar Belakang

Salah satu kanker kulit paling agresif, melanoma, berasal dari transformasi ganas dari melanosit [1, 2]. Karena kemungkinan rekidiva yang mudah dan potensi metastasis yang tinggi, kelangsungan hidup 5 tahun pasien melanoma yang tersebar hanya 10%. Hingga saat ini, pengobatan paling umum untuk pasien melanoma adalah kemoterapi, yang diiringi oleh efek samping berat yang tidak diinginkan, biodisponibilitas rendah, selektivitas tumor yang buruk, dan toksisitas sistemik yang membatasi dosis, yang menantang dalam kemoterapi tumor [3, 4].

Paklitaksel (PTX), ekstrak alami dari akar, cabang, daun, dan kulit pohon taxus, sebuah genus pohon conifer [5, 6], menunjukkan aktivitas antitumor yang efektif terhadap beberapa jenis tumor, termasuk kanker ovarium dan kanker paru [7,8,9]. Selain itu, PTX juga telah dilaporkan sebagai efisien terhadap melanoma manusia [10, 11]. Namun, selain kelemahan obat kemoterapi yang disebutkan di atas, campuran Cremophor EL dan alkohol dehidrasi (1:1, v/v) digunakan dalam praktik klinis saat ini sebagai medium pengenceran PTX, yang dapat mengakibatkan efek samping serius, termasuk hipersensitif [12, 13]. Oleh karena itu, pengembangan strategi baru untuk meningkatkan keterlarutan dalam air dan akumulasi tumor agen kemoterapi untuk mengurangi paparan perifer dan meminimalkan toksisitas in vivo adalah hal yang terpenting. Pengembangan nanokarrier obat yang kompatibel biologis baru-baru ini menyediakan potensi untuk meningkatkan stabilitas fisiologis PTX [14,15,16]. Selain itu, konjugasi molekul target pada nanokarrier ini akan memungkinkan pengiriman selektif agen kemoterapi ke situs tumor dengan mengurangi paparan perifer melalui efek target yang diarahkan oleh reseptor permukaan sel tumor [17,18,19].

Di sini, kami menyiapkan komposit PLGA-lipid yang kovalen mengonjugasi asam folat (FA: molekul target tumor) dan mengenkapsulasi PTX sebagai obat kemoterapi untuk pengobatan melanoma. Lebih jauh, 131I, penanda radioaktif, digunakan untuk meradiolabel nanopartikel PLGA-lipid untuk menilai perilaku in vivo mereka dengan jelas. Karena emisi beta negatif, umur fisik, dan berbagai properti decay, 131I biasanya digunakan sebagai radiolabel di klinik [20,21,22]. Morfologi, stabilitas, dan dispersi nanopartikel PLGA-lipid yang berlabel 131I (FA-PLP-131I) dievaluasi in vitro. Selain itu, penyerapan sel, sirkulasi darah, dan distribusi biodiversitas FA-PLP-131I diselidiki dengan mengukur radioaktivitas 131I. Lebih jauh, efensi anticancer yang terpacuan FA-PLP-131I dipelajari in vitro dan in vivo. Hasilnya menunjukkan bahwa FA-PLP-131I mungkin menjadi platform serbaguna untuk digunakan sebagai nanokarrier pengiriman obat tumor potensial untuk obat kemoterapi.

Metode

Bahan-bahan

Poly(d,l-laktoid-ko-glikolida) (PLGA, MW: 5000–15.000, laktoid:glikolida (50:50)) dan kloramin-T dibeli dari Sigma Aldrich (St. Louis, MO, AS). Na131I diperoleh dari Atomic Hitech (Beijing, Tiongkok). PTX (99%) dan 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) dibeli dari Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, Tiongkok). Lecitin kedelai yang terdiri dari 90–95% fosfatidilkolin, 1,2-distearoil-sn-glikero-3-fosfoetanolamina-N-[folat (polietilenglikol)-2000] (DSPE-PEG2000-FA), dan 1,2-distearoil-sn-glikero-3-fosfoetanolamina-N-[karboksi (polietilenglikol)-2000] (DSPE-PEG2000-COOH) diperoleh dari Avanti (Alabaster, AL, AS). Semua reagen kultur sel dibeli dari Sigma Aldrich.

Persiapan Nanopartikel FA-PLP

Nanopartikel FA-PLP disintesis dengan metode nanoprecipitasi perakitan mandiri [23]. Secara rinci, 10 mg PTX dilarutkan dalam 1 mL etanol dan 2 mg PLGA dilarutkan dalam 1 mL diklorometana. Setelah dicampur, larutan akuetik lecitin/DSPE-PEG2000-FA (4:1) (4 wt%) ditambahkan secara bertitik-titik ke dalam larutan campuran selama 4 jam diaduk dengan lembut pada 25 °C. Larutan difilter dan dicuci tiga kali dengan air deion menggunakan tabung sentrifugasi ultrafiltrasi Millipore untuk menghilangkan obat yang tidak terenkapsulasi dan pelarut organik. Sebagai kontrol, nanopartikel tanpa FA yang di-graft disiapkan melalui metode yang sama, mengganti DSPE-PEG2000-FA dengan DSPE-PEG2000-COOH. Nanopartikel FA-PLP yang telah difilter disimpan pada 4 °C hingga digunakan lebih lanjut.

Persiapan Nanopartikel FA-PLP Berlabel 131I

Nanopartikel FA-PLP radioaktif (FA-PLP-131I) disiapkan melalui metode oksidasi kloramin-T [24]. Campuran 1 mL FA-PLP (1 mg/mL), 500 μCi Na131I (yang merupakan radioaktivitas maksimum yang dapat di-graft pada FA-PLP), dan 100 μL kloramin-T 5 mg/mL bereaksi dalam buffer fosfat pH 7,5 selama 10 menit pada suhu kamar. Reaksi kemudian dihentikan dengan menambahkan 200 μL natrium metabisulfit (5 mg/mL). PLP dan PTX yang berlabel 131I disiapkan mengikuti prosedur yang sama. Mereka difilter menggunakan tabung sentrifugasi (Millipore) untuk menghilangkan Na131I bebas yang tersisa hingga tidak ada aktivitas gamma yang terdeteksi dalam larutan filtrat. Hasil radiolabeling dan kemurnian nanopartikel yang dilabeli dianalisis menggunakan counter gamma (LKB gamma 1261; LKB Instruments).

Karakterisasi

Spektrum absorpsi UV-vis direkam menggunakan spektrofotometer UV-vis (UV7502, Shanghai Advanced Photoelectric Technology Co., Ltd., Shanghai, Tiongkok). Gambar TEM dikumpulkan pada Zeiss LIBRA 120 TEM. Ukuran, potensi zeta, dan indeks polidispersi (PDI) nanopartikel terdeteksi oleh analisis pencaran cahaya dinamis (DLS) menggunakan Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments). Foto optik diambil dengan kamera digital Nikon D3200.

Kultur Sel

Baris sel melanoma tikus B16F10 diperoleh dari Bank Sel Koleksi Tipe Culture dari Akademi Ilmu Pengetahuan Tiongkok (Shanghai, Tiongkok) dan dikultur dalam DMEM yang mengandung 10% serum sapi fetus dan 100 U/mL penicilin/streptosim in atmosfer 5% CO2 yang lembap pada 37 °C.

Uji Incorporasi In Vitro

Uji incorporasi in vitro yang bergantung pada waktu dilakukan untuk menentukan waktu efisiensi binding sel yang optimal untuk senyawa yang berlabel 131I [25]. Sel B16F10 disebar dalam plate 24-lubang pada 1 × 10⁵ sel per lubang dan dikultur hingga konfluensi. Sampel yang diradiolabel (131I, PL-131I, FA-PL-131I, PLP-131I, FA-PLP-131I) disiapkan dalam media DMEM dan ditambahkan ke lubang kultur sel, secara terpisah. Setelah inkubasi selama 0,5, 1, 2, 4, dan 6 jam, sel dicuci dengan PBS tiga kali dan radioaktivitasnya diukur dengan counter gamma (Science and Technology Institute of China, Jia Branch Innovation Co., Ltd.). Nilai incorporasi (%) dihitung seperti yang dijelaskan dalam literatur sebelumnya [25]. Selain itu, nanopartikel dilabeli dengan warna floresen fluorescein isothiocyanate (FITC, Sigma) dan kemudian diinkubasi dengan sel B16F10. Gambar fluresensi sel diambil menggunakan mikroskop konfokal laser komersial (FV1200, Olympus, Tokyo, Jepang).

Uji Sitotoksisitas In Vitro

Uji kelayakan sel MTT digunakan untuk mempelajari sitotoksisitas PL-131I dan FA-PL-131I, serta PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I, terhadap sel B16F10. Secara singkat, sel B16F10 ditempel dalam plate 96-lubang selama 24 jam dan diekspose kepada PL-131I dan FA-PL-131I (dengan 0–100 μg/mL PLGA-lipid), atau PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I (pada berbagai konsentrasi 0–40 μg/mL) selama 24 jam. Eksperimen dilakukan secara triplikasi. Semua data diekspresikan sebagai rata-rata ± SD.

Model Hewan

Tikus Balb/c berusia 3–5 minggu dibeli dari Shanghai Slack Laboratory Animal Co., Ltd. (Shanghai, Tiongkok). Semua eksperimen hewan disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Fudan, yang mematuhi Panduan NIH untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium.

Sel B16F10 (1 × 10⁶) dalam PBS disuntik subkutan pada pinggir kanan tikus. Volume tumor yang tumbuh diukur menggunakan spidi, dan volume tumor dihitung menggunakan rumus: volume = (panjang × lebar²)/2. Ketika volume tumor mencapai sekitar 80 mm³, tikus diacak ke dalam grup eksperimen.

Studi Sirkulasi Darah dan Distribusi Biodiversitas

Tikus Balb/c sehat disuntik intravena dengan PTX-131I dan FA-PLP-131I (100 μL dari 10 μCi per tikus, 5 mg/kg). Sirkulasi darah diukur dengan mengambil sekitar 10 μL darah dari ekor tikus. Radioaktivitas dalam darah diukur menggunakan counter gamma. Untuk mendeteksi distribusi biodiversitas nanopartikel, tikus yang menderita tumor B16F10 disuntik dengan PTX-131I, FA-PL-131I, PLP-131I, dan FA-PLP-131I pada dosis yang sama dan dibunuh 24 jam setelah injeksi. Organ utama ditimbang dan dikumpulkan untuk perhitungan gamma.

Pengobatan Kemoterapi Tumor In Vivo

Tikus Balb/c yang menderita tumor B16F10 disuntik dengan 150 μL salin, PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I (pada konsentrasi PTX yang sama, 5 mg/kg). Ukuran tumor dan bobot badan diukur dengan spidi setiap 4 hari. Volume tumor relatif dihitung sebagai V/V₀ (V₀ adalah volume tumor saat pengobatan dimulai). Setelah sekitar 40 hari pengobatan, tikus dibunuh dan organ utama dikumpulkan, dikonsentrasi dalam formalin 4%, diinclusion parafin dan difeksi, diwarnai hematoxylin dan eosin, dan diperiksa di bawah mikroskop digital.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan dan Karakterisasi Nanopartikel FA-PLP Berlabel 131I

Skema sintesis nanopartikel FA-PLP-131I ditunjukkan pada Gambar 1. Singkatnya, nanopartikel FA-PLP disintesis melalui metode nanoprecipitasi perakitan mandiri dan FA-PLP radioaktif (FA-PLP-131I) disiapkan menggunakan metode oksidasi kloramin-T [23, 24]. PTX dienkapsulasi oleh komposit PLGA-lipid, yang kemudian di-graft dengan FA yang dikonjugasi kovalen pada permukaan cangkang melalui PEGylation. Terakhir, 131I di-graft pada permukaan luar nanopartikel. Gambar TEM menunjukkan bahwa nanopartikel FA-PLP-131I memiliki morfologi bolastik dengan distribusi ukuran yang sempit (165,6 hingga 181,2 nm), yang dikonfirmasi oleh pencaran cahaya dinamis (Gambar 2a, b). Potensi zeta bervariasi dari −39,1 hingga −3,2 mV (Gambar 2c). Spektrum UV-vis PTX bebas dan FA-PLP-131I (dengan konsentrasi PTX yang sama) menunjukkan puncak fitur yang sama pada 233 nm (Gambar 2d), yang menunjukkan bahwa PTX telah dienkapsulasi dalam FA-PLP-131I dan enkapsulasi tidak mempengaruhi intensitas absorpsi PTX. Setelah perhitungan, efisiensi enkapsulasi PTX dalam FA-PLP-131I ditunjukkan sebesar 56,35 ± 1,6%. Hasil radiolabeling dari PTX-131I, PL-131I, FA-PL-131I, PLP-131I, dan FA-PLP-131I adalah 45,6 ± 2,3, 52,1 ± 4,1, 48,9 ± 1,9, 56,3 ± 2,5, dan 54,8 ± 2,7, masing-masing.

Sintesis nanopartikel FA-PLP-131I

a Gambar TEM dari FA-PLP-131I. b Ukuran partikel dan c potensi zeta dari FA-PLP-131I dianalisis oleh pencaran cahaya dinamis. d Spektrum absorpsi PTX bebas dan FA-PLP-131I

Stabilitas esensial untuk aplikasi biomedis nanopartikel [26]. Setelah 4 minggu penyimpanan, FA-PLP-131I yang dilarutkan dalam air, media sel, serum sapi fetus, dan PBS tidak menunjukkan perubahan pada ukuran rata-rata, potensi zeta, indeks PDI (Gambar 3a–c), yang menunjukkan stabilitas dan dispersi yang bagus. Selain itu, stabilitas radiolabeling FA-PLP-131I terdeteksi dalam plasma tikus pada 37 °C (Gambar 3d), yang menunjukkan kurang dari 15% de-iodinasi dalam 7 hari.

a, b Stabilitas koloid dan c uji PDI dari FA-PLP-131I dalam berbagai media, termasuk air, DMEM, PBS, dan serum sapi fetus (FBS). d Kurva stabilitas radiolabeling FA-PLP-131I dalam plasma tikus pada 37 °C selama 2 minggu penyimpanan

Penyerapan Sel In Vitro

Gambar 4 menunjukkan incorporasi yang bergantung pada waktu dari 131I, PL-131I, FA-PL-131I, PLP-131I, dan FA-PLP-131I di sel B16F10 yang diukur oleh counter gamma. FA-PLP-131I, serta FA-PL-131I, menunjukkan nilai incorporasi yang lebih tinggi dari semua titik waktu yang diuji, meningkat seiring waktu. Nilai incorporasi FA-PLP-131I pada 6 jam adalah 3,12- dan 23,4 kali lebih tinggi daripada 131I dan PLP-131I, sepakat dengan hasil gambar mikroskopi konfokal laser dari sel B16F10 yang diinkubasi dengan nanopartikel FA-PLP-131I dan PLP-131I yang dilabeli fluorescein isothiocyanate (berkas tambahan 1: Gambar S1). Hasil ini menunjukkan penyerapan sel yang tinggi dari FA-PLP-131I, kemungkinan karena efek target yang diarahkan oleh FA pada sel B16F10.

Incorporasi yang bergantung pada waktu dari 131I, PL-131I, FA-PL-131I, PLP-131I, dan FA-PLP-131I pada sel B16F10

Sitotoksisitas In Vitro

Sitotoksisitas kontrol nanokarrier, PL-131I, dan FA-PL-131I diuji dengan uji MTT. Sel yang diobati dengan PL-131I dan FA-PL-131I selama 24 jam memiliki kelayakan yang sama dengan kontrol (Gambar 5a), yang menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik. Selain itu, FA-PLP-131I jauh lebih efektif dalam menekan proliferasi sel B16F10 dibandingkan PTX bebas dan PLP-131I pada konsentrasi PTX yang sama (Gambar 5b), yang menunjukkan kemoterapi sel yang target dengan baik. Hasilnya menunjukkan bahwa FA-PLP-131I memiliki efek kemoterapi yang tinggi tanpa toksisitas radio dan sitotoksisitas.

a Kelayakan sel B16F10 setelah perawatan dengan PL-131I dan FA-PL-131I selama 24 jam. b Kelayakan sel B16F10 setelah inkubasi dengan berbagai konsentrasi PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I selama 24 jam

Studi Sirkulasi Darah dan Distribusi Biodiversitas

Radiolabeling telah dilaporkan sebagai lebih andal daripada citra fluresensi untuk pelacakan in vivo nanopartikel yang kuantitatif dan akurat [27, 28]. Nanopartikel FA-PLP yang berlabel 131I disiapkan untuk menyelidiki perilaku in vivo mereka, termasuk sirkulasi darah dan distribusi biodiversitas, yang diukur oleh counter gamma. Setengah hayat sirkulasi darah PTX bebas (t₁/₂ = 5,4 ± 0,23 j) diperpanjang menjadi 18,5 ± 0,5 j oleh FA-PLP-131I (Gambar 6a) karena enkapsulasi nanopartikel, yang menguntungkan untuk akumulasi tumor target [29,30,31]. Selanjutnya, distribusi biodiversitas PTX-131I bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I pada tikus yang menderita tumor B16F10 pada 1 hari setelah injeksi diselidiki (Gambar 6b). FA-PLP-131I, serta FA-PL-131I, menunjukkan peningkatan yang jelas pada penyerapan tumor, yang 4,41- dan 12,8 kali daripada PLP-131I dan PTX-131I bebas, masing-masing, kemungkinan karena sirkulasi darah yang panjang dari FA-PLP-131I, FA-PL-131I, dan efek target FA-nya. Selain itu, hati dan limpa juga menunjukkan penyerapan yang relatif tinggi karena metabolisme nanopartikel, yang merupakan organ metabolisme normal [32, 33].

a Kurva sirkulasi darah FA-PLP-131I setelah injeksi intravena. b Distribusi biodiversitas PTX-131I, FA-PL-131I, FA-PLP-131I, dan PLP-131I pada tikus yang menderita tumor B16F10

Pengobatan Kemoterapi Tumor In Vivo

Tikus yang diobati dengan PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I menunjukkan inhibisi pertumbuhan tumor dibandingkan grup kontrol salin (Gambar 7a). Secara keseluruhan, FA-PLP-131I paling efektif dalam menekan pertumbuhan tumor tanpa rekidiva dibandingkan semua grup yang diobati setelah sekitar 40 hari pengobatan. Hasil ini seperti yang diharapkan mengingat sirkulasi darah yang sangat panjang dari FA-PLP-131I dan oleh karena itu kemampuannya untuk mempromosikan akumulasi tumor yang diarahkan oleh FA. Lebih jauh, akumulasi tumor yang diarahkan juga mengarah pada pengurangan paparan perifer PTX, sehingga meminimalkan toksisitas sistemik. Seperti yang diharapkan, selama seluruh proses pengobatan, tidak ada penurunan yang mencolok pada bobot badan (Gambar 7b), dan organ utama, termasuk hati, limpa, paru-paru, dan ginjal, tidak menunjukkan lesi histology yang jelas dalam grup mana pun (Gambar 7c).

a Volume tumor relatif dan b bobot badan tikus yang menderita tumor setelah injeksi vena ekor dengan salin (kontrol), PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I. b Bobot badan tikus yang menderita tumor setelah injeksi vena ekor dengan salin (kontrol), PTX bebas, PLP-131I, dan FA-PLP-131I. c Gambar representatif pewarnaan hematoxylin dan eosin dari organ utama termasuk hati, limpa, paru-paru, dan ginjal. Skala bar = 100 μm

Kesimpulan

Ringkasnya, kami telah menyintesis nanopartikel PLGA-lipid yang berlabel 131I sebagai carrier pengiriman obat untuk kemoterapi melanoma yang diarahkan. Dengan mengukur radioaktivitas 131I, perilaku in vitro dan in vivo nanopartikel FA-PLP-131I telah dipelajari. FA-PLP-131I yang diperoleh menunjukkan dispersi yang bagus dan stabilitas koloid dan radiolabeling. Kontrol nanokarrier, PL-131I, dan FA-PL-131I juga menunjukkan kompatibilitas biologis yang baik. Setelah enkapsulasi PTX, FA-PLP-131I paling efektif dalam menekan proliferasi sel B16F10 tanpa sitotoksisitas, yang dikaitkan dengan efek target FA. Lebih jauh, FA-PLP-131I terbukti secara signifikan memperpanjang sirkulasi darah PTX dan secara efektif mengakumulasi di wilayah tumor target. Oleh karena itu, FA-PLP-131I memiliki inhibisi pertumbuhan tumor yang utmung dan kompatibilitas biologis in vivo yang utmung. Hasilnya menyoroti potensi menjanjikan dari nanokarrier serbaguna FA-PLP-131I ini sebagai agen pelacakan obat yang andal serta aplikasinya dalam terapi tumor yang diarahkan.