Penyembuhan luka normal adalah proses yang sangat kompleks yang membutuhkan interaksi berbagai faktor pertumbuhan dan jenis sel. Meskipun kemajuan dalam biomaterial, hanya sedikit pembalut luka bioaktif yang mencapai pengaturan klinis. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi kelayakan electrospinning scaffold nanofibrous chitosan (CS)-fibrinogen (Fb) baru yang mampu mempertahankan pelepasan platelet-derived growth factor (PDGF) untuk mempromosikan migrasi fibroblas dan penyembuhan luka. Scaffold CS-Fb berhasil di-electrospun menggunakan electrospinner dual-spinneret dan dievaluasi langsung untuk karakteristik fisik, kimia, dan biologisnya. Scaffold CS-polyethylene/Fb menunjukkan diameter serat yang lebih tipis daripada nanofibers electrospun dari masing-masing komponen sambil menunjukkan sifat mekanik yang memadai dan distribusi polimer yang homogen. Selain itu, perancah menunjukkan kecepatan transfer air yang dapat diterima untuk aplikasi penyembuhan luka. PDGF berhasil dimasukkan ke dalam perancah dan mempertahankan aktivitas fungsional selama proses electrospinning. Lebih lanjut, PDGF yang dilepaskan efektif dalam mendorong migrasi fibroblas yang setara dengan dosis tunggal PDGF 50 ng/mL. Studi saat ini menunjukkan bahwa scaffold nanofibrous CS-Fb bermuatan PDGF memiliki karakteristik yang akan sangat bermanfaat sebagai dressing bioaktif baru untuk peningkatan penyembuhan luka.
Meskipun banyak kemajuan yang dibuat di bidang manajemen luka, beberapa pembalut bioaktif telah dikomersialkan dengan kapasitas untuk meningkatkan proses penyembuhan. Kurangnya produk yang berhasil dapat dikaitkan dengan kompleksitas proses penyembuhan luka, yang melibatkan banyak mediator terlarut, sel darah, sel parenkim, dan komponen matriks ekstraseluler (ECM). Faktor pertumbuhan memainkan peran sentral dalam proses penyembuhan luka dengan mempromosikan proliferasi sel, migrasi, dan diferensiasi. Namun, eliminasi yang cepat dan waktu paruh yang pendek dalam tubuh [1,2,3] telah membatasi adopsi klinis terapi faktor pertumbuhan untuk promosi penyembuhan dan regenerasi jaringan [4, 5]. Saat ini, pemberian faktor pertumbuhan in vivo berulang diperlukan untuk mencapai efek terapeutik (misalnya, rekrutmen dan diferensiasi seluler). Pengembangan pembalut luka yang mampu memberikan faktor pertumbuhan lokal yang berkelanjutan akan secara signifikan meningkatkan hasil pengobatan dan mempercepat adopsi klinis.
Platelet-derived growth factor (PDGF) memainkan peran penting sebagai inisiator dan mediator penyembuhan luka; bertindak sebagai agen kemotaktik untuk neutrofil, monosit, dan fibroblas [6] dan membantu mengatur deposisi matriks. Selain itu, PDGF dapat menghambat diferensiasi fibroblas menjadi miofibroblas, yang dapat berdampak pada kontraksi luka dan mengurangi pembentukan jaringan parut [6]. PDGF, dijual dengan merek Regranex®, adalah satu-satunya faktor pertumbuhan yang saat ini disetujui oleh FDA dan ditujukan untuk pengobatan ulkus diabetik ekstremitas bawah. Aplikasi topikal Regranex® gel sekali sehari (2.2 μg/cm 2 ulkus) telah terbukti menghasilkan waktu penyembuhan 30% lebih cepat dengan efek samping yang minimal. Namun, aplikasi topikal harian dan penghapusan Regranex® tidak nyaman dan dapat berdampak buruk pada kualitas hidup pasien.
Electrospinning telah ditetapkan sebagai teknik penting dalam pembuatan scaffold nanofibrous biomimetik menggunakan polimer yang signifikan secara biologis. Banyak biodegradable sintetis (misalnya, polikaprolakton) dan polimer alami (misalnya, kolagen) telah electrospun menjadi perancah nanofibrous non-anyaman yang menunjukkan rasio luas permukaan-ke-volume tinggi dan karakteristik porositas, yang penting untuk pengiriman obat dan aplikasi pembalut luka. Polimer alami (misalnya, kolagen, elastin, dan fibrinogen) adalah bahan pembalut luka yang sangat menarik karena bioaktivitasnya, biokompatibilitasnya, dan kemampuan uniknya untuk mengikat faktor pertumbuhan spesifik, seperti PDGF. Fibrinogen (Fb), protein plasma globular 340-kDa, memainkan peran utama dalam pembentukan bekuan melalui bentuk aktifnya, fibrin, yang berfungsi sebagai matriks sementara untuk perbaikan dan regenerasi jaringan. Tidak adanya Fb dan fibrin telah berkorelasi dengan cacat penyembuhan luka [7]. Produk berbasis Fb menunjukkan biodegradabilitas, non-imunogenisitas, dan promosi migrasi seluler dan sebelumnya telah dikembangkan sebagai hidrogel [8,9,10] dan kabel ekstrusi basah [11, 12]; namun, sifat fisik dan struktural dari bahan-bahan ini membatasi adopsi klinisnya. Hidrogel tidak memiliki integritas struktural dan mekanik untuk penggunaan jangka panjang, dan serat ekstrusi basah menunjukkan ukuran diameter yang lebih besar secara eksponensial (200–250 μm) daripada ECM asli (200–500 nm). Wnek dkk. menunjukkan bahwa electrospinning, bagaimanapun, menawarkan kemampuan untuk membuat perancah Fb yang sangat mirip dengan struktur ECM alami [13]. Meskipun nanofibers yang dihasilkan menunjukkan sifat mekanik yang lebih baik dibandingkan hidrogel, strukturnya masih kurang memiliki sifat mekanik yang optimal untuk aplikasi pembalut luka [14].
Untuk meningkatkan sifat mekanik scaffold fibrinogen electrospun, polimer tambahan dapat diperkenalkan untuk memperkuat nanofibers [15]. Secara khusus, kitosan (CS), sebuah N -Deasetilasi turunan kitin, telah terbukti menghasilkan sifat antimikroba yang diinginkan dalam aplikasi pembalut luka [16, 17]. Selain menjadi antimikroba yang kuat, CS telah di-electrospun untuk berbagai aplikasi biomedis termasuk regenerasi tulang terpandu [18, 19], penghantaran obat transdermal [20], diferensiasi sel induk terarah [21], dan hemostat [22]. Karena sifat polikationik kitosan, ada kesulitan yang signifikan dalam elektrospinning menggunakan pelarut umum. Untuk mengatasi kesulitan tersebut dan meningkatkan elektrospinninabilitas, CS telah dicampur dengan berbagai polimer lain seperti poli(vinil pirolidon) [23], poli(etilen oksida) (PEO) [16], dan poli(vinil alkohol) [24]. Demikian pula, sifat polikationik CS telah membatasi kombinasi sukses dengan Fb menjadi perancah tunggal karena interaksi elektrostatik yang kuat. Dalam karya ini, keterbatasan ini diatasi dengan memanfaatkan sistem electrospinning dual-nozzle serbaguna. Scaffold nanofibrous yang dihasilkan dianalisis menggunakan berbagai karakterisasi fisiokimia. Kami berhipotesis bahwa scaffold nanofibrous CS-Fb kombinasi baru akan menghadirkan kandidat yang layak untuk pembalut luka bioaktif dan biomimetik yang dapat memberikan PDGF dan dapat efektif dalam mempengaruhi migrasi fibroblas yang diperlukan untuk penyembuhan luka.
Asam asetat (glasial, 99,85%), CS (berat molekul rendah, deasetilasi 75–85%), PEO (MW 300.000 g/mol), Fb (tipe IS, protein 65–85%), 1,1,1, 3,3,3-hexafluoroisopropanol (HFIP), dan albumin serum sapi (BSA, -96%) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Dimetil sulfoksida (DMSO) dibeli dari Merck Millipore (Billerica, MA, USA). Fibroblas kulit manusia (PCS-201-012) dan reagen kultur sel dibeli dari Koleksi Kultur Tipe Amerika (Manassas, VA, USA). Faktor pertumbuhan yang diturunkan dari trombosit manusia rekombinan bebas pembawa-BB (rhPDGF-BB) dibeli dari PeproTech (Rocky Hill, NJ, USA). Semua reagen memiliki tingkat reagen dan digunakan tanpa pemurnian atau modifikasi lebih lanjut.
Larutan stok kitosan-PEO dibuat dengan melarutkan CS dan PEO dalam asam asetat 1% dengan BSA (0,5% v /v ) dan DMSO (10% v /v ) untuk mendapatkan total kandungan polimer 5,5 berat dengan rasio massa 2:1 CS terhadap PEO. Polietilen oksida ditambahkan untuk meningkatkan kemampuan elektrospin CS seperti yang dijelaskan sebelumnya [16]. Larutan stok Fibrinogen (110 mg/mL) dibuat dengan melarutkan Fb dalam satu bagian 10× Eagle’s minimum essential media (EMEM) dan sembilan bagian HFIP. Larutan stok CS-PEO dan Fb diaduk pada suhu kamar hingga larut sempurna. Untuk perancah yang dimuat, PDGF dicampur ke dalam setiap larutan polimer segera sebelum elektrospinning. Scaffold nanofibrous komposit CS-PEO/Fb Electrospun dibuat menggunakan sistem electrospinning multi-nozzle (Gbr. 1). Solusi dimuat satu per satu dan dipompa secara mekanis ke dalam sistem menggunakan jarum suntik sekali pakai, terhubung ke pemintal 18-gauge dan pompa jarum suntik NE-1000 (New Era Pump Systems, Farmingdale, NY), pada laju aliran 0,7 dan 1,0 mL j −1 untuk CS-PEO dan Fb, masing-masing. Kolektor mandrel, berputar pada 25 RPM, terletak di antara ujung pemintal pada jarak 22 cm untuk CS-PEO dan 12,5 cm untuk Fb. Selama proses fabrikasi, tegangan DC 28 dan 22 kV diterapkan ke ujung pemintal untuk larutan polimer CS-PEO dan Fb. Perancah nanofiber fabrikasi dikumpulkan pada kaca penutup kaca 18 cm untuk pengujian biologis atau langsung dipotong dari mandrel untuk analisis permeabilitas dan kekuatan tarik. Semua percobaan electrospinning dilakukan pada suhu kamar dan kelembaban relatif 35-45% selama 3 jam. Sampel yang mengandung PDGF disimpan pada suhu -20 °C dalam desikator, sedangkan perancah yang tidak dimuat disimpan dalam desikator pada suhu kamar setelah fabrikasi.
Skema electrospinner dual-spinneret
Scaffold nanofibrous electrospun dilapisi sputter dengan emas dan diamati menggunakan mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FESEM) (Zeiss Sigma VP-40, Jerman). Dua puluh mikrograf diambil per perancah, dan tiga perancah pintal individual dianalisis per formulasi. Rata-rata diameter nanofiber dihitung dengan mengukur lima titik acak per mikrograf menggunakan ImageJ (NIH, Bethesda, MD). Jumlah total 100 pengukuran dilakukan per formulasi perancah.
Time-of-flight ion mass spectrometry (ToF-SIMS) digunakan untuk menganalisis kimia permukaan dan kontribusi komponen polimer dalam scaffold. ToF-SIMS adalah metodologi analitik permukaan yang sensitif dan mendalam yang menilai komposisi kimia lapisan nanometer atas suatu material dengan membombardir dengan Bi3 berenergi tinggi 2+ cluster di bawah vakum ultra-tinggi [25, 26]. Fragmen ion sekunder yang dikeluarkan dari permukaan material kemudian dianalisis berdasarkan rasio massa atom terhadap muatan (m/z) dan digunakan untuk menyimpulkan komposisi kimia permukaan secara keseluruhan.
Analisis ToF-SIMS dilakukan oleh Evans Analytics Group (EAG, Sunnyvale, CA) menggunakan ToF-SIMS IV (Ion-ToF GmBH, Jerman) dengan pistol ion logam cair bismut (30 kV). Instrumen dioperasikan dalam mode microprobe ion di mana tiga spektrum ion positif dan negatif diperoleh dari setiap sampel. Ion positif dan negatif yang dipilih dipetakan pada area raster 50 × 50-μm dengan resolusi gambar 2048 × 2048-piksel untuk menyediakan pemetaan komponen polimer perancah. Intensitas yang dinormalisasi, yang didefinisikan sebagai jumlah setiap ion sekunder dibagi dengan jumlah total ion yang tercatat dikalikan 10.000, dilaporkan untuk setiap fragmen. Rata-rata dari tiga lokasi berbeda pada permukaan enam sampel yang dibuat secara independen dianalisis (n = 6). Distribusi polimer CS-PEO dan Fb yang dianalisis oleh ToF-SIM mewakili keseluruhan perancah.
Sudut kontak air perancah CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb ditentukan sesuai dengan Standar Amerika untuk Metode Pengujian (ASTM) D7334-08. Perancah nanofibrous dipintal dengan listrik ke kaca penutup. Tetesan tunggal air suling (2 L) diaplikasikan ke permukaan perancah dan sudut kontak diukur dalam waktu 30 detik menggunakan Krüss DSA10 MK2 Drop Shape Analyzer (Krüss, Hamburg, Jerman). Pengukuran diulang tiga kali di lokasi yang berbeda untuk setiap sampel, dan sudut kontak rata-rata dihitung. Enam perancah electrospun independen dianalisis (n = 6).
Sifat mekanik perancah electrospun diukur pada suhu kamar menggunakan Instron® E3000 ElectroPuls (Instron, Canton, MA) yang dilengkapi dengan sel beban 250-N pada laju regangan 1 mm min −1 . Ketebalan sampel diukur pada enam posisi acak dengan Mikroskop Pemindaian Laser 3D Keyence VK-200 (Keyence, Itasca, IL). Ketebalan perancah yang digunakan untuk pengujian tarik adalah 93,8 ± 7,4 μm. Sebelum pengujian, perancah dipotong menjadi spesimen persegi panjang 40 × 25-mm. Data yang diperoleh dilaporkan dan diplot sebagai kurva tegangan-regangan, di mana tegangan tarik didefinisikan sebagai rasio gaya terhadap luas penampang spesimen dan di mana regangan didefinisikan sebagai perubahan panjang terhadap panjang aslinya. Modulus Young, tegangan tarik, dan perhitungan regangan saat putus diperoleh dari kurva tegangan-regangan dari rata-rata sepuluh sampel per formulasi.
Laju perpindahan uap air perancah CS-PEO/Fb diukur sesuai dengan metode pengering ASTM E96/E96M. Sebanyak enam spesimen electrospun independen disiapkan per formulasi dan ditempatkan pada pembukaan bejana uji yang mengandung pengering silika gel yang dapat digunakan kembali pada suhu kamar dan kelembaban rata-rata relatif 58,2 ± 5,2%. Laju transmisi uap air (WVTR) dihitung dari berat wadah uji yang diukur pada titik waktu yang berbeda selama 48 jam:
$$ \mathrm{WVTR}=\frac{G}{t\times A} $$ (1)dimana G mewakili perubahan berat wadah uji, t adalah waktu yang telah berlalu, dan A adalah luas penampang perancah.
Sitotoksisitas tidak langsung dari perancah dievaluasi berdasarkan pendekatan yang diadaptasi dari metode uji standar ISO10993-5 [27, 28]. Fibroblas kulit manusia dikultur pada suhu 37 °C dan 5% CO2 dalam media fibroblas bebas serum dan disegarkan setiap 3 hari. Setelah sel mencapai pertemuan, mereka ditripsinisasi dan diunggulkan ke dalam pelat 12-sumur (10.000 sel/mL). Hari berikutnya, media diisi ulang dan perancah nanofibrous diperkenalkan. Proliferasi sel dipantau selama 120 jam menggunakan uji proliferasi sel 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-(2,4-disulfofenil)-2H-tetrazolium sodium (WST-1).
Fibroblas kulit manusia ditripsinisasi dan diunggulkan ke perancah CS-PEO, Fb, dan CS-PEO/Fb. Setelah 24 jam inkubasi pada 37°C dan 5% CO2 , sel dicuci dan diwarnai dengan kit viabilitas sel LIVE/DEAD™ (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) sesuai dengan spesifikasi pabrik. Selain itu, adhesi dan perlekatan fibroblas manusia ke perancah dievaluasi dengan pewarnaan dengan Phalloidin-Atto 565 (Sigma Aldrich dan 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI; ThermoFisher Scientific) sesuai dengan spesifikasi pabrikan. Gambar diamati dan diambil menggunakan mikroskop confocal terbalik (Nikon C1, C1EZ, Melville, NY, USA).
Degradasi scaffold nanofibrous CS-PEO/Fb dilakukan dalam media basal fibroblast (FBM, ATCC) pada suhu 37 °C dan 5% CO2 . Scaffolds direndam dalam FBM dan diinkubasi selama 1, 6, 24, atau 48 jam. Berat kering awal setiap perancah dicatat; pada setiap titik waktu, perancah dicuci, dikeringkan-beku, dan ditimbang kembali. Degradasi perancah dihitung dari rumus berikut:
$$ \mathrm{Degradasi}\%=\left({W}_0-{W}_{\mathrm{t}}\right)/{W}_0\times 100 $$ (2)dimana A 0 adalah berat awal perancah, dan W t adalah berat perancah pada titik waktu masing-masing.
Eluat, dikumpulkan dari titik waktu tertentu selama percobaan degradasi in vitro, diuji menggunakan Kit ELISA spesifik rhPDGF-BB (Sistem R&D, Minneapolis, MN). Nilai absorbansi yang terdeteksi dibandingkan dengan standar, seperti yang ditentukan oleh instruksi pabrik untuk penentuan konsentrasi PDGF. Jumlah PDGF yang terdeteksi dinormalisasi dengan berat (mg) perancah terkait yang digunakan.
Migrasi fibroblas kulit manusia dievaluasi menggunakan kit uji migrasi sel ORIS™ (Platypus Technologies, Madison, WI) untuk menilai bioaktivitas PDGF. Secara singkat, fibroblas yang diobati dengan mitomycin C (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ditripsinisasi dan diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur yang berisi sumbat yang disediakan oleh pabrikan dan diinkubasi pada suhu 37 ° C dan 5% CO2 semalam. Hari berikutnya, sumbat dihilangkan sehingga membuat zona migrasi tempat 100 L eluat yang dikumpulkan pada berbagai titik waktu ditambahkan dan diinkubasi selama 24 jam tambahan. 50 ng mL yang baru disiapkan −1 PDGF dan media fibroblas basal digunakan sebagai kontrol positif dan negatif, masing-masing. Migrasi fibroblas dinyatakan sebagai perubahan lipatan, dibandingkan dengan migrasi yang ditimbulkan oleh 50 ng mL −1 pengobatan PDGF. Studi dilakukan dalam rangkap tiga dalam tiga eksperimen independen untuk tiga konsentrasi pemuatan (2, 4, dan 8 μg/mL).
Data berkelanjutan dinyatakan sebagai sarana ± standar deviasi. Perbedaan rata-rata antar kelompok dianalisis menggunakan analisis varians satu arah (ANOVA). Uji perbandingan berganda Tukey digunakan untuk menentukan rata-rata di antara kelompok rata-rata yang berbeda secara statistik. Signifikansi statistik ditetapkan pada α =0,05. Semua data dianalisis menggunakan GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).
Kombinasi berbagai polimer telah terbukti secara signifikan meningkatkan sifat komposit yang dihasilkan [29, 30]. Sistem polimer kombinasi secara efektif memungkinkan modulasi kekuatan perancah, fleksibilitas, biodegradasi, dan kinetika pelepasan obat, yang merupakan parameter penting untuk aplikasi pembalut luka. Namun, pembuatan komposit unik dapat dibatasi oleh interaksi kimia intrinsik antara polimer penyusunnya. Misalnya, endapan polimer diamati terbentuk ketika mencampur Fb bermuatan negatif dan CS bermuatan positif; pengamatan ini didokumentasikan dengan baik untuk molekul dengan interaksi elektrostatik yang kuat di bawah berbagai kondisi pelarut [31,32,33]. Akibatnya, fabrikasi scaffold komposit polimer CS-Fb memerlukan penggunaan teknik elektrospinning ekstrusi ganda, seperti yang dijelaskan sebelumnya [34].
Diameter serat rata-rata untuk scaffold CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb masing-masing adalah 269,9 ± 68,4, 202,3 ± 113.2, dan 351,1 ± 101,7 nm (Gbr. 2). Menariknya, perancah komposit CS-PEO / Fb menunjukkan serat nano yang lebih tipis daripada perancah CS-PEO atau Fb. Penurunan ukuran diameter serat bisa disebabkan oleh gaya elektrostatik tambahan yang dihasilkan oleh jet polimer bermuatan secara bersamaan [35,36,37]. Tolakan pancaran polimer menjauh satu sama lain yang disebabkan oleh gaya-gaya ini dapat meningkatkan jarak antar-pemintal dan waktu pengendapan. Perpanjangan waktu deposisi yang dihasilkan berkorelasi dengan peningkatan ketidakstabilan lentur yang diketahui menyebabkan pemanjangan serat dan pembentukan serat yang lebih tipis.
Mikrograf FESEM representatif dari perancah electrospun. a CS-PEO, diameter rata-rata 269,9 ± 68,4 nm. b CS-PEO/Fb, diameter rata-rata 202,3 ± 113,2 nm. c Fb, diameter rata-rata 351.1 ± 101.7 nm (n = 100)
Spektrum ToF-SIMS dari perancah CS, Fb, dan PEO ditunjukkan pada Gambar. 3. Biasanya, spesies sidik jari kimia yang unik dapat digunakan untuk membedakan komponen polimer individu. Karena kesamaan kimia antara CS dan Fb, bagaimanapun, ada sejumlah spesies yang mengandung nitrogen (C3 H6 TIDAK + , CH4 N + , CN − , dan CNO − ) hadir di kedua spektrum, sehingga sulit untuk membedakan polimer satu sama lain. Namun, ketika Fb dimasukkan ke dalam scaffold, jumlah total CN − dan CNO − spesies meningkat sedangkan fragmen lainnya tetap tidak berubah atau menurun. Oleh karena itu, memeriksa perubahan di CN − dan CNO − intensitas fragmen diperbolehkan untuk deteksi tidak langsung Fb. Demikian pula, peningkatan C2 H5 O + (45 m/z) ion digunakan untuk mengidentifikasi fragmen etilen oksida PEO dalam perancah komposit.
Perwakilan a positif dan b spektrum ion negatif ToF-SIMS untuk CS murni (atas), Fb (tengah), dan PEO (bawah). Fragmen ion yang dilingkari digunakan sebagai sidik jari unik untuk mengidentifikasi senyawa
Untuk menjelaskan keberadaan dan distribusi komponen Fb dalam perancah komposit, CNO − dan CN − ion dipetakan pada raster 50 × 50-μm dari perancah murni dan komposit untuk mendapatkan peta panas (Gbr. 4a, b). Teknik pemetaan yang sama dilakukan pada C2 H5 O + untuk menentukan distribusi PEO (Gbr. 4c). Peningkatan intensitas peta panas berkorelasi dengan kandungan polimer Fb atau PEO yang lebih tinggi. Kami mengamati bahwa intensitas CNO − , CN − , dan C2 H5 O + didistribusikan secara merata di seluruh area raster 50 × 50-μm dari perancah komposit. Karena ketebalan perancah (93,8 ± 7,4 μm) dan deposisi serat lapis demi lapis, komposisi permukaan diharapkan mewakili keseluruhan perancah. Oleh karena itu, data ToF-SIM menunjukkan bahwa ketika scaffold nanofibrous CS-PEO/Fb dibuat menggunakan electrospinning dual-spinneret, komponen individual disimpan secara seragam di seluruh scaffold komposit.
Pemetaan ToF-SIMS a CNO − , b CN − , dan c C2 H5 O + fragmen ion pada berbagai perancah di atas area raster 50 × 50-μm
Sudut kontak air dari perancah berserat CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb elektrospun ditentukan masing-masing sebesar 44,2° ± 5,1°, 61,4° ± 7,6°, dan 115,7° ± 16,2° (Gbr. 5). Berdasarkan sudut kontak air, scaffold CS-PEO dan CS-PEO/Fb bersifat hidrofilik (> 90°), sedangkan scaffold Fb bersifat hidrofobik (< 90°). Sudut kontak air dari perancah komposit CS-PEO/Fb menunjukkan karakteristik permukaan yang berada di antara komponen-komponennya, yang menunjukkan bahwa CS-PEO dan Fb diendapkan secara homogen selama fabrikasi. Karakteristik permukaan permukaan polimer memainkan peran penting dalam pengendapan protein dan faktor adhesi. Secara khusus, faktor adhesi bakteri penting diketahui terjadi lebih mudah pada permukaan hidrofobik, yang mendorong kolonisasi bakteri [38]. Dengan demikian, sifat hidrofilik CS-PEO/Fb mungkin bermanfaat dalam mencegah perlekatan bakteri.
Perilaku air deionisasi pada permukaan substrat kaca, perancah CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb
Pengujian tarik uniaksial dilakukan pada scaffold nanofibrous dengan ketebalan rata-rata 93,8 ± 7,4 μm. Ringkasan hasil ditunjukkan pada Tabel 1 dan kurva tegangan-regangan yang sesuai ditunjukkan pada Gambar 6. Umumnya, sifat mekanik bahan komposit berkorelasi dengan konstituen terlemahnya. Hasil menunjukkan bahwa perancah Fb saja tidak akan memiliki sifat mekanik yang ideal untuk aplikasi pembalut luka. Ini menekankan pentingnya menggabungkan CS-PEO untuk mendapatkan produk yang lebih stabil secara mekanis.
Kurva tegangan-regangan perancah CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb. Data mewakili sepuluh perancah yang diproduksi secara independen
WVTR memainkan peran penting dalam menjaga kelembaban ideal dari lingkungan luka, yang berdampak positif pada granulasi seluler dan epitelisasi [39, 40]. Nilai WVTR yang lebih tinggi berkorelasi dengan dehidrasi luka yang cepat karena penguapan dan eksudasi, yang dapat menurunkan suhu tubuh dan meningkatkan metabolisme. Sebaliknya, nilai WVTR yang sangat rendah berkorelasi dengan akumulasi eksudat, penghambatan penyembuhan, dan peningkatan risiko infeksi. Lamke dkk. melaporkan WVTR untuk kulit normal sebagai 204 ± 12 g m −2 hari −1 dan antara 279 dan 5138 g m −2 hari −1 untuk kulit yang terluka, tergantung pada kondisi luka [41, 42]. Untuk epitelisasi luka dan peningkatan penyembuhan, WVTR ideal 2028,3 ± 237,8 g m −2 hari −1 telah dilaporkan [43]. WVTR scaffold CS-PEO dan Fb adalah 693.2 ± 95.7 dan 686.1 ± 44.17 g m −2 hari −1 , masing-masing. Meskipun lebih dekat ke WVTR ideal daripada perancah murni, perancah CS-PEO/Fb (806,5 ± 56,1 g m −2 hari −1 ) masih berada di bawah WVTR ideal (Gbr. 7). Manipulasi parameter fisik perancah dapat meningkatkan WVTR untuk meniru tingkat ideal yang dilaporkan dengan lebih baik.
Laju transfer uap air dari perancah CS-PEO, CS-PEO/Fb, dan Fb electrospun. Bilah kesalahan mewakili simpangan baku (n = 6, *p < 0,05 bila dibandingkan dengan perancah CS-PEO/Fb)
Scaffolds Chitosan-PEO/Fb tidak menunjukkan efek proliferasi yang signifikan pada fibroblas manusia selama 48 jam awal (Gbr. 8); namun, paparan berkepanjangan pada 72 jam menghasilkan penurunan proliferasi yang signifikan secara statistik dibandingkan dengan kontrol tanpa perancah. Hasilnya menunjukkan bahwa ada penghambatan proliferasi seluler yang ditunjukkan oleh scaffold, yang mungkin kumulatif dari waktu ke waktu.
Perbandingan proliferasi fibroblas dermal manusia saat terkena perancah elektrospun Fb dan CS-PEO/Fb (n = 9, *p < 0,05 perbandingan dibuat untuk “tidak ada kontrol perancah” pada setiap titik waktu)
Penurunan kapasitas proliferasi mungkin karena derajat asetilasi (DA) yang terkait dengan CS, yang telah terbukti memiliki interaksi seluler yang kuat melalui muatan positifnya [44]. Younes dkk. mendemonstrasikan sel karsinoma kandung kemih yang diobati dengan CS (> 50% DA) secara signifikan mengurangi viabilitas setelah 24 jam, menunjukkan bahwa sitotoksisitas CS berhubungan langsung dengan DA-nya yang dapat berdampak pada proliferasi [45]. Efek ini juga dapat diisolasi pada kondisi percobaan in vitro; penelitian sebelumnya telah menunjukkan CS menjadi non-toksik in vivo, karena produk biodegradasinya dapat dibersihkan melalui jalur metabolisme [46]. HFIP sisa dari proses electrospinning juga dapat berkontribusi pada sitotoksisitas yang diamati. Namun, sitotoksisitas yang sama tidak diamati dalam perancah Fb murni elektrospun, yang juga disiapkan dalam HFIP. HFIP kemungkinan dihilangkan dari perancah electrospun selama proses fabrikasi karena volatilitasnya yang tinggi. Penurunan viabilitas sel yang dapat diamati akan terlihat jika sisa HFIP yang tergabung ke dalam sistem serat dilepaskan selama paparan waktu terhadap fibroblas dermal manusia.
Gambar 9a–c menunjukkan distribusi dan viabilitas fibroblas dermal yang diunggulkan pada permukaan kaca berlapis fibronektin, perancah CS-PEO/Fb tanpa muatan, dan perancah CS-PEO/Fb dengan muatan PDGF (4 μg/mL). Setelah 24 jam dalam kultur, sel mati minimal diamati dibandingkan dengan sel hidup. Tidak ada perbedaan mencolok antara perancah yang dimuat dan dibongkar dengan PDGF.
Confocal micrographs of fibroblasts seeded on a , d fibronectin-coated glass; b , e unloaded CS-PEO/Fb scaffold; dan c , f PDGF-loaded (4 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. a–c Cells were stained with LIVE/DEAD™:live cells (green), dead cells (red). d–f Cells were stained with DAPI (blue) and phalloidin (red)
Fibrinogen serves as an important mediator of cellular attachment and growth during wound healing. Phalloidin stains cellular actin filaments allowing for visualization of fibroblast attachment. Figure 9c, d shows the actin filament morphology of the fibroblasts on the surface of fibronectin-coated glass, unloaded CS-PEO/Fb scaffolds, and PDGF-loaded CS-PEO/Fb scaffolds. Overall, normal fibroblast morphology was observed, with the exception of some rounder cells being present on the scaffold samples. The changes in morphology may be attributed to the presence of CS, as shown in previous studies [47]. Alternatively, the differences could be due to the small porosity of the scaffold and dimensionality of the fiber surface in comparison to the flat surface of the control.
Scaffold degradation was evaluated by obtaining the dry weight of the scaffold after incubation in FBM for up to 48 h (Fig. 10). The scaffolds degraded at a linear rate after an initial burst release of material within the first hour. Weight loss in the initial hour was likely due to the solubility of PEO in aqueous solutions [16], and the subsequent weight loss was likely due to Fb and CS release. This highlights a unique biphasic degradation profile that could be beneficial for the delivery of bioactive molecules. Concurrently, CS-PEO/Fb scaffolds were shown to maintain their substructure for a minimum of 48 h (Fig. 10:insert), and the addition of 8 μg/mL of PDGF did not alter the scaffold degradation properties.
Degradation of electrospun unloaded CS-PEO/Fb scaffolds and PDGF-loaded (8 μg/mL) CS-PEO/Fb scaffolds. Insert:FESEM micrograph of CS-PEO/Fb scaffold after 48 h of incubation (n = 6)
Cumulative releases of PDGF after 48 h of incubation were 1.8 ± 0.7, 4.4 ± 1.8, and 11.4 ± 4.8 ng of PDGF/mg of scaffold for initially incorporated concentrations of 2, 4, and 8 μg/mL of PDGF, respectively. The results demonstrated that PDGF was released from the scaffolds in a dose-dependent manner (Fig. 11).
PDGF is released from CS-PEO/Fb scaffolds for up to 48 h in a dose-dependent manner (n = 10, *p < 0.05 when compared to 2 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point, # p < 0.05 when compared to 4 μg/mL of PDGF dosage at each specific time point)
During the in vitro degradation, CS-PEO/Fb scaffolds exhibited a unique biphasic release profile, with 21.6 ± 0.1% of the total eluted PDGF being detected in the first hour followed by linear release kinetics. This observation was thought to be a result of the combined polymers and highlighted the functional importance of Fb as a reservoir for the sustained release of biologically critical molecules. Growth factors (e.g., PDGF/VEGF, FGF, and TGF-β families) have been shown to bind the Fb heparin domain with high affinity and have been reported to retain their bioactivity for over 7 days [48,49,50].
Fold differences in fibroblast migration in response to the released PDGF eluates collected from the scaffolds at various time points are shown in Fig. 12. Previously published reports have demonstrated that fibroblast attachment and migration rates are affected by PDGF in a dose-dependent manner [51, 52]. For example, Gamal et al. showed when at least 50 ng/mL PDGF was delivered locally, adherent fibroblast migration was increased [52]. In addition, Thommen et al. reported that the distance of migration was significantly increased when exposed to PDGF concentrations greater than 10 ng/mL [53]. Therefore, the biological activity of the scaffold-eluted PDGF was measured by its ability to induce migration and was normalized to a single 50 ng/mL PDGF dose.
Human dermal fibroblast migration after 24 h exposure to scaffold eluates acquired at 1, 6, 24, and 48 h in FBM (n = 8, *p < 0.05 when compared to unloaded CS-PEO/Fb scaffold at each specific time point)
Eluates collected from electrospun scaffolds, which were loaded with 4 or 8 μg PDGF/mL polymer solutions, demonstrated similar levels of fibroblast migration when compared to a single 50 ng/mL treatment. The data suggest that PDGF delivered by electrospun nanofibers can be equally effective in promoting fibroblast migration as a single application of PDGF. Additionally, the migration elicited by the scaffold-released PDGF was sustained for 48 h. Sustained delivery of PDGF eliminates the need for daily applications, which is an advantage over commercially available treatments such as Regranex®.
Fibroblast migration reached a maximum when cells were treated with the 24-h eluates from each of the PGDF-loaded scaffolds. Notably, when fibroblasts were treated with the 6-h eluates from the 4 and 8 μg PDGF/mL electrospun scaffolds, the same level of maximum migration was achieved. This suggests that the rate of migration increased in response to increased PDGF loading. Additionally, 4 and 8 μg/mL PDGF-loaded scaffolds might be able to elicit fibroblast migration potentials beyond the detection limits of the current assay, which can only assess the endpoint of migration, but not the migration rate. Finally, results demonstrated that eluates from unloaded CS-PEO/Fb scaffolds were also capable of eliciting a linear increase in migration over the same elution time points, albeit less effectively than the PDGF-loaded scaffolds. This result is most likely mediated by the ability of fibrinogen to enhance fibroblast migration [54, 55]. In general, PDGF-loaded composite scaffolds significantly improved in vitro migration, compared to the individual components of the scaffold.
The versatility of electrospinning allows for the combination of advantageous properties of various polymers and proven bioactive molecules. We utilized this technique to fabricate unique CS-PEO/Fb scaffolds with the ability to release biologically active PDGF over 48 h. This study evaluated the chemical and physical properties of the nanofibrous scaffolds including (1) morphology, (2) physical and mechanical properties, (3) in vitro scaffold degradation, and (4) the ability to release functional PDGF in a dose- and time-dependent manner. Electrospun CS-PEO/Fb scaffolds demonstrated nanoscale morphological properties that are conducive to wound dressing applications, as well as an adequate WVTR, mechanical stability, and a unique biphasic PDGF delivery profile. Furthermore, PDGF maintained its biological function throughout the electrospinning process, and when combined with the natural, chemotactic properties of Fb elicited dermal fibroblast migration that is functionally equivalent to a single 50 ng/mL dose of PDGF. Overall, these results highlight the potential of CS-PEO/Fb scaffolds as a viable wound dressing capable of delivering bioactive PDGF to enhance fibroblast recruitment and wound healing.
Chitosan
Degree of acetylation
Dimethyl sulfoxide
Matriks ekstraseluler
Eagle’s minimum essential media
Fibrinogen
Fibroblast blast media
Field emission scanning electron microscope
Fibroblast growth factor
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol
Faktor pertumbuhan yang diturunkan dari trombosit
Polietilen oksida
Poly(lactide-co-glycolide)
Transforming growth factor beta
Spektrometri massa ion sekunder waktu terbang
Faktor pertumbuhan endotel pembuluh darah
Water vapor transfer rate
bahan nano
Artikel sebelumnya menjelaskan cara kerja blockchain, mengapa itu aman, dan memperkenalkan penggunaan blockchain untuk logistik, seperti rantai pasokan dan pelacakan aset. Dalam artikel ini, kami akan terus memberikan contoh dan aplikasi potensial untuk blockchain dalam otomasi industri. Blockchai
KONVEYOR DIRANCANG UNTUK BAHAN APA PUN YANG ANDA LAMPIRKAN PADA MEREKA. Apakah Anda akan mendorong casting merah menyala ke sabuk karet? Tidak. Bagaimana dengan pasir panas yang mengalir ke celemek atau konveyor sabuk logam? Hanya jika Anda suka menyapu. Hanya satu teknologi yang memenuhi tuntutan
Teknologi terus bergerak dan berubah – tidak pernah diam untuk waktu yang lama. Meskipun demikian, perangkat lunak dan teknologi robot juga terus berubah. Satu perusahaan robotika telah menghadirkan platform perangkat lunak baru yang akan sangat membantu dalam aplikasi di masa mendatang. Menurut se
Dunia pencetakan 3D sangat hadir di bidang kedokteran , meskipun banyak orang tidak memiliki pengetahuan tentang itu. Bisa dibilang tahun 2011 adalah tahun booming 3D printing di sektor ini berkat kasus Kaiba Gionfriddo. Gadis Kaiba lahir dengan penyakit yang melemahkan trakea sedemikian rupa hingga
