Aptasensor Fluoresens Grafit Oksida Tinggi Sensitivitas untuk Deteksi Cepat Sel Leukemia CCRF-CEM
Abstrak
Sebuah aptasensor fluoresens yang praktis, hemat biaya, dan tinggi sensitivitas untuk deteksi leukemia telah dikembangkan berdasarkan kompleks grafit oksida-aptamer (GO-apt). Grafit oksida (GO) dapat menyerap aptamer Sgc8 yang dilabeli karboxifluorescein (FAM-apt) melalui tumpukan π-π dan mematikan fluoresens melalui transfer energi resonansi fluoresens (FRET). Ketika tidak ada sel target Sgc8 CCRF-CEM, fluoresens hampir semua dimatikan. Sebaliknya, ketika sel CCRF-CEM ditambahkan, fluoresens yang dimatikan dapat pulih secara cepat dan signifikan. Oleh karena itu, berdasarkan perubahan sinyal fluoresens, kami dapat mendeteksi jumlah sel CCRF-CEM dalam rentang luas dari 1 × 102 hingga 1 × 107 sel/mL dengan batas deteksi (LOD) 10 sel/mL. Oleh karena itu, strategi aptasensor fluoresens berbasis grafit oksida ini mungkin menjanjikan untuk deteksi kanker.
Latar Belakang
Leukemia adalah penyakit hematologik maligan agresif dan umum, yang mengancam kelangsungan hidup dan kesehatan manusia, terutama pada anak-anak dan remaja [1, 2]. Penyakit ini tidak hanya mempengaruhi sel hematopoetik normal tubuh tetapi juga sumsum tulang, serta sistem kekebalan tubuh [3,4,5]. Oleh karena itu, diagnosis dini leukemia untuk pengobatan dan peningkatan kualitas hidup pasien sangat penting. Saat ini, metode yang umum digunakan untuk mendeteksi leukemia adalah mengambil sel darah perifer dan sumsum tulang, kemudian berbagai jenis analisis [6], termasuk morfologi sel, sitokimia [7,8,9], fenotipe imun [10, 11], imunohistokimia [12, 13], dan sitometri aliran berbasis aptamer [14, 15], telah dilakukan. Metode-metode ini dapat mendeteksi sel leukemia, namun masih memiliki banyak kekurangan seperti biaya tinggi, sensitivitas rendah, dan rumit. Oleh karena itu, sangat mendesak untuk menemukan metode hemat biaya, tinggi sensitivitas, dan sederhana untuk mendeteksi leukemia.
Aptamer, yang merupakan ssDNA atau RNA pendek satu rantai, ditayangkan melalui penyaringan in vitro sistematika evolusi ligand dengan pengayaan eksponensial (SELEX) [16, 17]. Berdasarkan struktur tersier yang khusus, aptamer memiliki afinitas pengikatan yang kuat dan spesifisitas tinggi terhadap target, termasuk molekul organik kecil, protein, dan bahkan sel [18,19,20]. Selain itu, aptamer juga memiliki karakteristik mudah disintesis dan dimodifikasi sehingga banyak digunakan sebagai sond deteksi kanker [21]. Deteksi kanker berbasis nanomaterial yang difungsionalkan aptamer juga merupakan topik hangat dalam beberapa tahun terakhir [22, 23], seperti titik kuantum dan nanopartikel silika [24].
Grafit oksida (GO), sebagai nanomaterial karbon datar dua dimensi yang baru, telah menerima perhatian besar karena sifat uniknya termasuk keterlarutan air yang baik [25], luas permukaan spesifik yang besar, dan kemampuan mematikan fluoresens yang luar biasa [26, 27]. Berdasarkan sifat-sifat ini, GO dianggap sebagai penerima energi yang baik dalam transfer energi resonansi fluoresens (FRET), yang membuat GO memiliki prospek aplikasi yang luas dalam aptasensor fluoresens [28]. Selain itu, GO dapat berikatan dengan aptamer melalui interaksi tumpukan π-π, tetapi tidak dengan DNA ganda atau kompleks aptamer-target [19, 29, 30]. Oleh karena itu, sensor aptamer berbasis grafit dapat meningkatkan stabilitas aptamer dibandingkan sond aptamer bebas [31].
Saat ini, banyak penelitian melaporkan bahwa strategi aptasensor fluoresens berbasis grafit oksida untuk mendeteksi target dapat dilakukan [21, 32]. Namun, jarang studi yang dilakukan menggunakan aptasensor berbasis GO untuk sel leukemia, sejauh ini. Di sini, kami merancang strategi baru untuk deteksi sinyal 'nyala' sel leukemia berdasarkan GO dan aptamer Sgc8 yang dilabeli karboxifluorescein (FAM-apt). GO dan aptamer digunakan sebagai pematikan fluoresens dan agen target, masing-masing. Ketika tidak ada sel leukemia, GO dapat berinteraksi dengan FAM-apt dan mematikan hampir semua fluoresens, dan sinyal deteksi mati. Namun, ketika sel target ada, aptamer secara aktif menargetkan sel dan jatuh dari GO, resulting in pemulihan fluoresens dalam sistem deteksi, dan sinyal deteksi menyala. Oleh karena itu, konsentrasi sel target dapat diukur sesuai dengan perubahan intensitas fluoresens.
Metode
Reagen
FFAM-apt dengan urutan 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3′ disintesis oleh Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). Dalam pekerjaan ini, buffer Tris-HCl yang mengatur sendiri digunakan, termasuk 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl2, dan 100 mM NaCl. Aptamer yang digunakan dalam eksperimen ini dilarutkan dengan buffer Tris-HCl. Bubuk grafit oksida dibeli dari Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Semua larutan disiapkan dengan air ultrapurno 18 MΩ yang difilter dari sistem pemurnian Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
Sel
Sel baris CCRF-CEM (baris sel limfoblast leukemia akut manusia), Ramos (baris sel limfoma Burkitt manusia), 293T (baris sel ginjal embrio manusia), dan H22 (baris sel kanker hepa tikus) dibeli dari Bank Sel Akademi Ilmu Pengetahuan China (Shanghai, China). Semua baris sel dikultur pada 5 persen karbon dioksida dan 37 °C, dan medium 1640 mengandung 10 persen serum sapi janin (FBS; HyClone) dan 100 U/mL penicillin-streptomycin (Gibco, Grand Island, NY, USA).
Alat
Semua spektrum fluoresens dan intensitas fluoresens diukur dan dicatat oleh spektrofotometer fluoresens F-7000 (Perusahaan Hitachi, Tokyo, Jepang). Cuvette kuarsa 700 µL digunakan untuk menampung larutan sampel. Karena panjang gelombang puncak karakteristik karboxifluorescein (FAM), intensitas luminesensi dipantau dengan mengeksitasi sampel pada 490 nm dan mengukur emisi pada 518 nm.
Semua citra mikroskopi daya atom (AFM) diambil oleh mikroskop SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Jepang).
Potensi zeta GO, FAM-apt, dan kompleks grafit oksida-aptamer (GO-apt) ditentukan oleh analyzer ukuran nanopartikel, potensi zeta, dan bobot molekul absolut (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Inggris).
Spektrum serap UV-cahaya terlihat GO, FAM-apt, dan GO-apt direkam pada NanoDrop 2000 (Thermo, AS).
Persiapan Aptasensor Fluoresens GO-apt
Bubuk grafit oksida dilarutkan dan dicairkan dalam air Milli-Q yang difilter kemudian dicairkan secara ultrasonik untuk mendapatkan larutan hitam homogen dengan konsentrasi 1 mg/mL. Mencerahkan larutan stok dengan buffer Tris-HCl 20 mM, kami mendapatkan konsentrasi 20 nM FAM-apt. Dan setelah itu, 1 µL FAM-apt (10 µM) dan 10 µL larutan GO (1 mg/mL) yang disiapkan dicampur kemudian dicairkan dengan buffer Tris-HCl hingga 500 µL.
Citram Sel
Sel CCRF-CEM dan Ramos dikultur selama 12 jam dalam plate enam lubang (5 × 105 sel per lubang). Sel dicuci dua kali dengan PBS dingin dan diintos dengan larutan GO-apt pada 4 °C dalam gelap selama 30 menit. Kemudian, sel dicuci tiga kali dan diperbaiki selama 20 menit dengan 4 persen polioksimetilena. Sel dicuci lagi dengan PBS dan diwarnai dengan 4′,6-diamidino-2-fenilindol hidroklorida (DAPI; Life Co., AS) selama 5 menit dalam gelap. Akhirnya, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan diperiksa oleh mikroskop fluoresens (Nikon DS-Ri1; Jepang).
Deteksi Sel CCRF-CEM
Sel CCRF-CEM dikumpulkan oleh sentrifugasi dan disuspendi dalam 1 mL PBS. Konsentrasi sel CCRF-CEM yang berbeda (0 hingga 1,0 × 107/mL) diintos dengan aptasensor fluoresens GO-apt pada 4 °C dalam gelap selama 30 menit. Setelah intos, sel CCRF-CEM terdeteksi oleh spektroskopi fluoresens dalam rentang panjang gelombang 560–500 nm. Batas deteksi (LOD) diperkirakan berdasarkan perhitungan 3σ / S, di mana σ adalah deviasi standar untuk larutan GO-apt (n = 10) dan S adalah kemiringan persamaan linier [33].
Uji Spesifikitas
Untuk menyelidiki spesifikitas aptasensor fluoresens berbasis GO, kami menguji sistem dengan beberapa sel yang berbeda, termasuk sel Ramos, sel H22, dan sel 293T. Setiap sistem reaksi 100 µL mencakup 1 × 106 sel.
Analisis Statistik
Setiap eksperimen diulang tiga kali. Data diproses oleh perangkat lunak SigmaPlot 12.5, dan analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Ambang signifikansi dalam semua analisis adalah P < 0,0001.
Hasil dan Diskusi
Prinsip Aptasensor Fluoresens GO-apt untuk Deteksi Sel CCRF-CEM
Dalam studi ini, GO dan FAM-apt digunakan untuk merancang aptasensor fluoresens untuk mendeteksi sel CCRF-CEM. Prinsip sensor fluoresens untuk deteksi sel CCRF-CEM ditunjukkan dalam Gambar 1. Ketika tidak ada sel CCRF-CEM, aptamer yang dimodifikasi FAM terserap pada permukaan GO melalui tumpukan π-π. Karena GO dan fluorofor terlalu dekat untuk transfer energi, sebagai pematikan, GO mematikan fluoresens FAM. Ketika ada sel CCRF-CEM, gaya ikatan lemah GO-aptamer memungkinkan aptamer untuk jatuh dari permukaan GO dan berikatan dengan sel, menyebabkan pemulihan fluoresens. Oleh karena itu, jumlah sel CCRF-CEM dapat terdeteksi sesuai dengan pemulihan intensitas fluoresens FAM.
Ilustrasi skematis aptasensor fluoresens GO-apt untuk deteksi sel CCRF-CEM
Pematikan dan Pemulihan Fluoresens
Proses berkelanjutan pematikan fluoresens GO dan pemulihan fluoresens kehadiran sel CCRF-CEM dapat diamati oleh spektrofotometer fluoresens. Seluruh proses sensing berdasarkan aptamer fluoresens GO ditunjukkan dalam Gambar 2a. Spektrum fluoresens FAM-apt dalam buffer Tris-HCl 25 nM menunjukkan intensitas fluoresens yang kuat berkat kehadiran FAM (Gambar 2a, kurva a). Namun, setelah penambahan GO, intensitas fluoresens berkurang secara signifikan (Gambar 2a, kurva b), menunjukkan bahwa GO mampu mematikan fluoresens secara efisien ketika GO dan aptamer berada di dekat satu sama lain dan terserap bersama. Anehnya, ketika 5 × 106 sel CCRF-CEM ditambahkan, fluoresens yang dimatikan dapat pulih seiring waktu (Gambar 2a, kurva c). Meskipun, intensitas fluoresens FAM-apt tanpa konjugasi GO tidak berubah secara jelas ketika sel CCRF-CEM ditambahkan (Gambar 2a, kurva d). CCRF-CEM adalah sel non-fluoresens (Gambar 2a, kurva e); oleh karena itu, pemulihan fluoresens terutama disebabkan oleh pemisahan aptamer dari permukaan grafit dan paparan grup fluoresens. Eksperimen pematikan dan pemulihan fluoresens ini secara jelas menggambarkan bahwa kompleks aptamer sel CCRF-CEM (CEM-apt) dapat menjaga FAM-apt dari pematikan oleh GO, dan CEM memiliki afinitas pengikatan yang lebih kuat terhadap aptamernya daripada GO. Berkat perbedaan struktur antara aptamer satu rantai dan kompleks CEM-aptamer, aptamer pada permukaan GO dapat berinteraksi dengan CEM dan kemudian berubah menjadi kompleks CEM-aptamer. Fenomena ini juga secara jelas menunjukkan bahwa pengikatan kompleks CEM-aptamer terhadap aptamer lebih lemah daripada GO, sehingga memungkinkan aptamer untuk jatuh dari permukaan GO. Karena FAM-apt terletak jauh dari permukaan GO dan efisiensi transfer energi berkurang, fluoresens dipulihkan. Analisis statistik spektrum emisi fluoresens aptamer Sgc8 yang dilabeli FAM dan sel CCRF-CEM dilakukan dalam kondisi yang berbeda (Gambar 2b).
Kebijakan deteksi Go-apt sel CEM. a Spektrum emisi fluoresens FAM-apt dan sel CCRF-CEM dalam kondisi yang berbeda: (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, dan (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 µg/mL); CCRF-CEM (1 × 106 sel). Eksitasi 490 nm. b Analisis statistik spektrum emisi fluoresens FAM-apt dan sel CCRF-CEM dalam kondisi yang berbeda. NS tidak signifikan. ****P < 0,0001
Karakterisasi Aptasensor Fluoresens GO-apt
Untuk memverifikasi desain, GO seragam dan terdesentralisasi diperoleh. Dari Gambar 3a, kami mengetahui bahwa lembar GO dengan ketebalan 1,17 nm memiliki penampilan dua dimensi khas melalui AFM. Namun, GO-apt dengan ketebalan 1,94 nm menunjukkan bahwa FAM-apt telah berhasil terserap pada permukaan GO. Potensi zeta FAM-apt dan GO adalah − 11,35 dan − 23,90 mV, masing-masing, tetapi ketika GO berinteraksi non-kovalen dengan FAM-apt, nilai mutlak potensi zeta meningkat (Gambar 3b). Hasil-hasil ini menunjukkan bahwa aptasensor telah berhasil dikonstruksi. Dari Gambar 3c, kami mengetahui bahwa GO menunjukkan serapan kuat pada 234 nm yang dikaitkan dengan transisi π-π* ikatan C=C aromatik. FAM-apt ditandai dengan band serapan urutan DNA (260 nm) dan FAM (503 nm), sedangkan penambahan GO ke dalam larutan FAM-apt menyebabkan perpindahan ke merah dan serapan FAM pada 503 nm meningkat. Alasannya mungkin adalah FAM-apt terserap pada permukaan GO, yang menunjukkan interaksi elektronik antara dua sistem π GO dan pewarna dalam keadaan dasar. Oleh karena itu, hasil menunjukkan bahwa GO-apt telah berhasil dikonstruksi.
Karakterisasi GO-apt. a Citra AFM GO dan CEM-apt. b Potensi zeta permukaan FAM-apt, GO, dan CEM-apt. Bar kesalahan menunjukkan ± SD (n = 3). c Spektrum serap UV-cahaya terlihat (a) GO, (b) FAM-apt, dan (c) GO-apt
Mikroskopi Fluoresens Sel
Untuk memvisualisasikan secara langsung spesifikitas penurunan FAM-apt yang berikatan pada tingkat seluler, kami mengintos sel CCRF-CEM dan Ramos dengan Go-apt kemudian menganalisisnya menggunakan mikroskopi fluoresens. Konsisten dengan eksperimen spektrum fluoresens, FAM-apt dapat jatuh dari Go-apt dan kemudian berikatan dengan sel CCRF-CEM untuk pewarnaan fluoresens, tetapi tidak dengan sel Ramos (Gambar 4).
Citra mikroskopi fluoresens sel CCRF-CEM dan Ramos setelah dicampur dengan GO-apt. Inti diwarnai dengan DAPI. Skala bar menunjukkan 25 µm
Optimisasi Kondisi Eksperimen untuk Deteksi Sel CCRF-CEM
Untuk mendapatkan performa yang baik dari aptasensor fluoresens, waktu pematikan dan pemulihan fluoresens dioptimalkan. Perilaku kinetik FAM-apt dan GO, serta FAM-apt dalam larutan GO homogen dengan sel CCRF-CEM, diselidiki dengan memantau intensitas fluoresens sebagai fungsi waktu pematikan dan pemulihan (Gambar 5a, b). Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 5a, pematikan fluoresens FAM-apt sebagai fungsi waktu intos dalam kehadiran GO dapat diamati. FAM-apt dengan cepat terserap pada permukaan GO dan, setelah itu, mengalami transfer energi, dan pada saat yang sama, intensitas fluoresens berkurang secara signifikan dan cenderung lambat setelah 2 menit. Sebaliknya, CEM-apt terbentuk dan rilis dari permukaan GO lebih lambat. Intensitas fluoresens mencapai platfom ketika waktu intos lebih dari 30 menit (Gambar 5b). Eksperimen yang bergantung pada waktu ini menunjukkan bahwa GO, sebagai pematikan yang baik, dengan cepat mematikan fluoresens FAM-apt dan secara bertahap memulihkan fluoresens dalam kehadiran CEM.
Optimisasi kondisi eksperimen. a Pematikan fluoresens FAM-apt (20 nM) dalam buffer Tris-HCl oleh GO sebagai fungsi waktu. b Pemulihan fluoresens FAM-apt dalam larutan GO oleh sel CCRF-CEM (1 × 106) sebagai fungsi waktu. c Efek konsentrasi GO terhadap intensitas fluoresens FAM-apt tanpa (kurva a) dan dengan (kurva b) 1 × 106 sel CCRF-CEM. d Rasio intensitas fluoresens (F/F0) FAM-apt oleh 1 × 106 sel CCRF-CEM sebagai fungsi konsentrasi GO. Eksitasi 490 nm
Untuk membuat aptasensor fluoresens lebih sensitif terhadap deteksi sel CCRF-CEM, sistem reaksi yang digunakan untuk mengoptimalkan konsentrasi GO menjadi tidak terelakkan. Gambar 5c, yang secara jelas menggambarkan strategi kami, menunjukkan efek konsentrasi GO yang berbeda terhadap intensitas fluoresens FAM-apt tanpa (Gambar 5c, kurva a) dan dengan (Gambar 5c, kurva b) sel CCRF-CEM. Seperti yang kami lihat dari Gambar 5c, setelah penambahan GO, sinyal latar belakang fluoresens berkurang secara signifikan. Gambar 5d menunjukkan fluoresens yang dipulihkan FAM-apt oleh 1 × 106 sel CEM sebagai fungsi konsentrasi GO. Dari Gambar 5d, kami dapat menemukan bahwa ketika konsentrasi GO adalah 20 µg/mL, rasio F/F0 (di mana F0 dan F adalah intensitas fluoresens FAM pada 518 nm tanpa dan dengan kehadiran sel CCRF-CEM, masing-masing) mendapatkan nilai tertinggi, yaitu 13,0354. Oleh karena itu, 20 µg/mL dianggap sebagai konsentrasi GO optimal.
Deteksi Sel CCRF-CEM dengan Aptasensor Fluoresens GO-apt
Untuk mendapatkan hasil eksperimen yang baik, kondisi eksperimen optimal digunakan untuk mendeteksi sel CCRF-CEM. Gambar 6a menunjukkan bahwa dengan meningkatnya jumlah sel CCRF-CEM dari 0 hingga 1 × 107, intensitas fluoresens juga meningkat sesuai. Selain itu, F/F0 menunjukkan ketergantungan linier yang jelas terhadap jumlah sel CCRF-CEM dalam rentang 1 × 102–1 × 107 (Gambar 6b). Persamaan regresi linier adalah Y(F/F0) = 3.2608 × log C − 5.1892 (di mana C adalah jumlah sel CCRF-CEM) dengan koefisien regresi R2 = 0,9922. Batas deteksi dianggap kurang dari sepuluh sel. Oleh karena itu, sensing aptamer fluoresens berbasis GO memiliki rentang deteksi yang luas sehingga dapat digunakan sebagai biosensor ideal untuk mendeteksi sel CCRF-CEM. Dibandingkan dengan metode lain, metode ini memiliki sensitivitas yang lebih tinggi (Tabel 1) [34,35,36,37,38,39].
Deteksi Go-apt sel CEM. a Spektrum emisi fluoresens aptasensor fluoresens GO-apt dalam kehadiran konsentrasi sel CCRF-CEM yang berbeda. b Hubungan linier antara rasio intensitas fluoresens (F/F0) dan konsentrasi sel CCRF-CEM
Spesifikitas Aptasensor Fluoresens GO-apt
Untuk menyelidiki spesifikitas aptasensor fluoresens GO, beberapa sel yang berbeda digunakan untuk menguji sistem, seperti sel Ramos, sel H22, dan sel 293T. Setiap sistem reaksi 100 µL mencakup 1 × 106 sel. Gambar 7 menunjukkan bahwa CCRF-CEM mendapatkan intensitas fluoresens yang lebih tinggi daripada grup kontrol lainnya. Hasil juga secara jelas menunjukkan bahwa aptasensor fluoresens yang dirancang memiliki spesifikitas yang tinggi.
Spesifikitas aptasensor fluoresens untuk CEM. Rasio intensitas fluoresens (F/F0) aptasensor fluoresens GO-apt dalam kehadiran sel CEM, sel Ramos, sel H22, dan sel 293T, masing-masing (1 × 106), di mana F0 dan F adalah intensitas fluoresens tanpa dan dengan sel deteksi pada 518 nm. Eksitasi 490 nm
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan aptasensor fluoresens yang praktis, hemat biaya, dan tinggi sensitivitas untuk deteksi sel CCRF-CEM. Strategi ini secara cerdas menggunakan interaksi ikatan non-kovalen melalui tumpukan π-π antara grafit dan DNA satu rantai serta performa unggul pematikan fluoresens grafit. Dibandingkan dengan aptamer, pengikatan kompleks CEM-aptamer terhadap GO lebih lemah, sehingga fluoresens yang dimatikan oleh grafit dapat secara bertahap dipulihkan. Dalam kondisi optimal, batas deteksi dianggap kurang dari 100 sel. Oleh karena it
<<<<===>>>
i, berdasarkan performa unggulnya, aptasensor fluoresens memiliki prospek yang luas dalam deteksi sel tumor.
