Aptasensor Fluorescent Berbasis Grafena Oksida untuk Deteksi Pengaktifan CCRF-CEM
Abstrak
Aptasensor fluoresen yang nyaman, murah, dan sangat sensitif untuk mendeteksi leukemia telah dikembangkan berdasarkan kompleks graphene oxide-aptamer (GO-apt). Grafena oksida (GO) dapat menyerap aptamer Sgc8 berlabel karboksifluorescein (FAM-apt) oleh π -π menumpuk dan memadamkan fluoresensi melalui transfer energi resonansi fluoresensi (FRET). Dengan tidak adanya sel target Sgc8 CCRF-CEM, fluoresensi hampir semuanya padam. Sebaliknya, ketika sel CCRF-CEM ditambahkan, fluoresensi yang dipadamkan dapat dipulihkan dengan cepat dan signifikan. Oleh karena itu, berdasarkan perubahan sinyal fluoresensi, kami dapat mendeteksi jumlah sel CCRF-CEM dalam rentang yang luas dari 1 × 10
2
hingga 1 × 10
7
sel/mL dengan batas deteksi (LOD) 10 sel/mL. Oleh karena itu, strategi aptasensor fluoresen berbasis grafena oksida ini mungkin menjanjikan untuk mendeteksi kanker.
Latar Belakang
Leukemia adalah penyakit hematologi ganas yang agresif dan umum, yang merupakan ancaman bagi kelangsungan hidup manusia dan kesehatan, terutama untuk anak-anak dan remaja [1, 2]. Ini tidak hanya mempengaruhi sel-sel hematopoietik normal tubuh tetapi juga sumsum tulang, serta sistem kekebalan [3,4,5]. Oleh karena itu, diagnosis dini leukemia untuk pengobatan dan peningkatan kualitas hidup pasien sangat penting. Saat ini, metode yang umum digunakan untuk mendeteksi leukemia adalah pengambilan sel darah tepi dan sumsum tulang, setelah itu berbagai macam analisis [6], termasuk morfologi sel, sitokimia [7,8,9], imunofenotipe [10, 11], imunohistokimia [12, 13], dan flow cytometry berbasis aptamer [14, 15], telah dilakukan. Metode-metode tersebut dapat mendeteksi sel-sel leukemia, namun masih memiliki banyak kekurangan seperti biaya yang mahal, sensitivitas yang rendah, dan rumit. Oleh karena itu, sangat mendesak untuk menemukan metode yang murah, sangat sensitif, dan sederhana untuk mendeteksi leukemia.
Aptamers, yang merupakan DNA untai tunggal pendek (ssDNA) atau RNA, disaring dengan skrining in vitro dari evolusi sistematis ligan dengan pengayaan eksponensial (SELEX) [16, 17]. Berdasarkan struktur tersier khusus, aptamer memiliki afinitas pengikatan yang kuat dan spesifisitas yang tinggi dengan target, termasuk molekul organik kecil, protein, dan bahkan sel [18,19,20]. Selain itu, aptamer juga memiliki karakteristik mudah disintesis dan dimodifikasi sehingga banyak digunakan sebagai probe pendeteksi kanker [21]. Nanomaterial yang difungsikan berdasarkan aptamers untuk mendeteksi kanker juga merupakan hotspot dalam beberapa tahun terakhir [22, 23], seperti titik kuantum dan nanopartikel silika [24].
Graphene oxide (GO), sebagai nanomaterial karbon planar dua dimensi baru, telah menerima perhatian besar karena sifatnya yang unik termasuk kelarutan air yang baik [25], luas permukaan spesifik yang besar, dan kemampuan pendinginan fluoresensi yang sangat baik [26, 27]. Berdasarkan sifat-sifat ini, GO dianggap sebagai reseptor energi yang sangat baik dalam transfer energi resonansi fluoresensi (FRET), yang membuat GO memiliki prospek aplikasi yang luas dalam aptasensor fluoresensi [28]. Selain itu, GO dapat mengikat aptamers dengan π -π interaksi susun, tetapi tidak dengan DNA untai ganda atau kompleks target aptamer [19, 29, 30]. Oleh karena itu, sensor aptamer berbasis graphene dapat meningkatkan stabilitas aptamer dibandingkan dengan probe aptamer gratis [31].
Saat ini, banyak penelitian melaporkan bahwa strategi aptasensor fluoresen berbasis grafena oksida untuk target deteksi adalah layak [21, 32]. Namun demikian, beberapa penelitian telah dilakukan menggunakan aptasensor berbasis GO untuk sel leukemia, sejauh ini. Di sini, kami merancang strategi baru untuk deteksi sinyal 'nyala' sel leukemia berdasarkan GO dan aptamer Sgc8 berlabel karboksifluorescein (FAM-apt). GO dan aptamer masing-masing digunakan sebagai pemadam fluoresensi dan agen target. Dengan tidak adanya sel leukemia, GO dapat berinteraksi dengan FAM-apt dan memadamkan hampir semua fluoresensi, dan sinyal deteksi dimatikan. Namun, ketika sel target hadir, aptamers secara aktif menargetkan sel dan jatuh dari GO, menghasilkan pemulihan fluoresensi dalam sistem deteksi, dan sinyal deteksi dihidupkan. Oleh karena itu, konsentrasi sel target dapat diukur sesuai dengan perubahan intensitas fluoresensi.
Metode
Reagen
FFAM-apt dengan urutan 5′-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTTAGA-3′ disintesis oleh Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Cina). Dalam pekerjaan ini, buffer Tris-HCl yang mengatur sendiri digunakan, termasuk 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM MgCl2 , dan 100 mM NaCl. Aptamer yang digunakan dalam percobaan ini dilarutkan dengan buffer Tris-HCl. Bubuk oksida graphene dibeli dari Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Semua larutan disiapkan dengan air ultra murni 18 MΩ yang dimurnikan dari sistem pemurnian Milli-Q (Millipore, Bedford, MA, USA).
Sel
CCRF-CEM (garis sel limfoblas leukemia akut manusia), Ramos (garis sel limfoma Burkitt manusia), 293T (garis sel ginjal embrionik manusia), dan garis sel H22 (garis sel karsinoma hepatoseluler murine) dibeli dari Cell Bank of the Chinese Akademi Ilmu Pengetahuan (Shanghai, Cina). Semua garis sel dikultur pada 5% karbon dioksida dan 37 °C, dan media 1640 mengandung 10% serum janin sapi (FBS; HyClone) dan 100 U/mL penisilin-streptomisin (Gibco, Grand Island, NY, USA).
Aparat
Semua spektrum fluoresensi dan intensitas fluoresensi diukur dan direkam dengan spektrofotometer fluoresensi F-7000 (Hitachi Company, Tokyo, Jepang). Kuvet kuarsa 700 L digunakan untuk menampung larutan sampel. Karena karakteristik panjang gelombang puncak carboxylfluorescein (FAM), intensitas pendaran dipantau dengan menarik sampel pada 490 nm dan mengukur emisi pada 518 nm.
Semua pencitraan mikroskop gaya atom (AFM) diambil dengan mikroskop SPI3800N (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Jepang).
Potensi zeta dari kompleks GO, FAM-apt, dan graphene oxide-aptamer (GO-apt) ditentukan oleh ukuran partikel nano, potensi zeta, dan penganalisis berat molekul absolut (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).
Spektrum serapan UV-tampak GO, FAM-apt, dan GO-apt direkam pada NanoDrop 2000 (Thermo, USA).
Persiapan Aptasensor Fluorescent GO-apt
Bubuk grafena oksida dilarutkan dan ditaburkan dalam air murni Milli-Q kemudian didispersikan dengan ultrasonik untuk mendapatkan larutan hitam homogen dengan konsentrasi 1 mg/mL. Mengencerkan larutan stok dengan 20 mM buffer Tris-HCl, kami memperoleh konsentrasi 20 nM yang sesuai dengan FAM. Dan setelah itu, 1 μL larutan FAM-apt (10 μM) dan 10 μL GO (1 mg/mL) yang telah disiapkan dicampur dan kemudian diencerkan dengan buffer Tris-HCl hingga 500 μL.
Pencitraan Sel
Sel CCRF-CEM dan Ramos dikultur selama 12 jam dalam pelat enam lubang (5 × 10
5
sel per sumur). Sel dicuci dua kali dengan saline buffer fosfat dingin (PBS) dan diinkubasi dengan larutan GO-apt pada 4 °C dalam gelap selama 30 menit. Kemudian, sel dicuci tiga kali dan difiksasi selama 20 menit dengan polioksimetilen 4%. Sel dicuci lagi dengan PBS dan diwarnai dengan 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI; Life Co., USA) selama 5 menit dalam gelap. Akhirnya, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop fluoresensi (Nikon DS-Ri1; Jepang).
Deteksi Sel CCRF-CEM
Sel CCRF-CEM dikumpulkan dengan sentrifugasi dan disuspensikan dalam 1 mL PBS. Perbedaan konsentrasi sel CCRF-CEM (0 hingga 1,0 × 10
7
/mL) diinkubasi dengan aptasensor fluorescent GO-apt pada 4 °C dalam gelap selama 30 menit. Setelah inkubasi, sel CCRF-CEM dideteksi dengan spektroskopi fluoresensi dalam rentang panjang gelombang 560–500 nm. Batas deteksi (LOD) diperkirakan berdasarkan 3σ / S perhitungan, di mana σ adalah standar deviasi untuk solusi GO-apt (n = 10) dan S adalah kemiringan persamaan linier [33].
Uji Kekhususan
Untuk menyelidiki spesifisitas aptasensor fluoresen berbasis GO, kami menguji sistem dengan beberapa sel berbeda, termasuk sel Ramos, sel H22, dan sel 293T. Setiap sistem reaksi 100-μL mencakup 1 × 10
6
sel.
Analisis Statistik
Setiap percobaan diulang tiga kali. Data diolah dengan software SigmaPlot 12.5, dan analisis statistik dilakukan menggunakan GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Ambang batas signifikansi dalam semua analisis adalah P < 0,0001.
Hasil dan Diskusi
Prinsip Fluorescent Aptasensor GO-apt untuk Deteksi CCRF-CEM
Dalam penelitian ini, GO dan FAM-apt digunakan untuk merancang aptasensor fluoresen untuk mendeteksi sel CCRF-CEM. Prinsip sensor fluoresen untuk mendeteksi sel CCRF-CEM ditunjukkan pada Gambar. 1. Dengan tidak adanya sel CCRF-CEM, aptamer yang dimodifikasi FAM diadsorpsi ke permukaan GO oleh π -π menumpuk. Karena GO dan fluorofor terlalu dekat dengan transfer energi, jadi, sebagai quencher, GO memadamkan fluoresensi FAM. Di hadapan sel CCRF-CEM, kekuatan pengikatan yang lemah dari GO-aptamer memungkinkan aptamer jatuh dari permukaan GO dan mengikat sel, menyebabkan restorasi fluoresensi. Oleh karena itu, jumlah sel CCRF-CEM dapat dideteksi sesuai dengan pemulihan intensitas fluoresensi FAM.
Ilustrasi skema aptasensor fluorescent GO-apt untuk mendeteksi sel CCRF-CEM
Pendinginan dan Pemulihan Fluoresensi
Proses pendinginan fluoresensi GO yang terus menerus ini dan pengembalian fluoresensi di hadapan sel CCRF-CEM dapat diamati dengan spektrofotometer fluoresensi. Seluruh proses penginderaan berdasarkan aptamers GO-fluoresensi ditunjukkan pada Gambar. 2a. Spektrum fluoresensi FAM-apt dalam buffer Tris-HCl 25 nM menghadirkan intensitas fluoresensi yang kuat berkat adanya FAM (Gbr. 2a, kurva a). Namun, setelah penambahan GO, intensitas fluoresensi sangat berkurang (Gbr. 2a, kurva b), menunjukkan bahwa GO mampu memadamkan fluoresensi secara efisien ketika GO dan aptamer berdekatan satu sama lain dan teradsorpsi bersama. Anehnya, ketika 5 × 10
6
Sel CCRF-CEM ditambahkan, fluoresensi yang dipadamkan dapat pulih tepat waktu (Gbr. 2a, kurva c). Namun demikian, intensitas fluoresensi FAM-apt tanpa konjugasi GO tidak memiliki perubahan yang jelas ketika sel CCRF-CEM ditambahkan (Gbr. 2a, kurva d). CCRF-CEM adalah sel non-fluoresen (Gbr. 2a, kurva e); oleh karena itu, pemulihan fluoresensi terutama disebabkan oleh disosiasi aptamer dari permukaan graphene dan mengekspos kelompok fluoresen. Eksperimen pendinginan dan pemulihan fluoresensi ini dengan jelas menggambarkan bahwa kompleks CCRF-CEM-aptamer (CEM-apt) dapat mencegah FAM-apt dipadamkan oleh GO, dan CEM memiliki afinitas pengikatan yang lebih kuat ke aptamernya daripada GO. Berkat perbedaan struktur antara aptamer untai tunggal dan kompleks CEM-aptamer, aptamer pada permukaan GO dapat berinteraksi dengan CEM dan kemudian berubah menjadi kompleks CEM-aptamer. Fenomena ini juga dengan jelas menunjukkan bahwa pengikatan kompleks CEM-aptamer ke aptamer lebih lemah daripada GO, sehingga memungkinkan aptamer jatuh dari permukaan GO. Karena FAM-apt terletak jauh dari permukaan GO dan efisiensi transfer energi berkurang, fluoresensi dipulihkan. Analisis statistik spektrum emisi fluoresensi dari aptamer Sgc8 berlabel FAM dan CCRF-CEM dilakukan pada kondisi yang berbeda (Gbr. 2b).
Kelayakan deteksi Go-apt Sel CEM. a Spektrum emisi fluoresensi sel FAM-apt dan CCRF-CEM pada kondisi yang berbeda:(a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM- apt + CCFF-CEM, dan (e) CCRF-CEM; FAM-sesuai (20 nM); GO (25 μg/mL); CCRF-CEM (1 × 10
6
sel). Eksitasi 490 nm. b Analisis statistik spektrum emisi fluoresensi FAM-apt dan CCRF-CEM pada kondisi yang berbeda. NS tidak signifikan. ****P < 0,0001
Karakterisasi dari GO-apt Fluorescent Aptasensor
Untuk memverifikasi desain, GO yang seragam dan terdesentralisasi diperoleh. Dari Gambar 3a, kita mengetahui bahwa lembar GO dengan ketebalan 1,17 nm memiliki tampilan dua dimensi yang khas oleh AFM. Namun, GO-apt dengan ketebalan 1,94 nm menunjukkan bahwa FAM-apt telah berhasil diserap ke permukaan GO. Potensi zeta dari FAM-apt dan GO masing-masing adalah 11,35 dan 23,90 mV, tetapi ketika GO berinteraksi secara non-konvalen dengan FAM-apt, nilai absolut potensi zeta meningkat (Gbr. 3b). Hasil ini menunjukkan bahwa aptasensor telah berhasil dibangun. Dari Gambar. 3c, kita tahu bahwa GO menampilkan penyerapan yang kuat pada 234 nm yang dikaitkan dengan π -π * transisi ikatan C=C aromatik. FAM-apt dicirikan oleh pita serapan dari sekuens DNA (260 nm) dan FAM (503 nm), sedangkan penambahan GO ke dalam larutan FAM-apt menyebabkan pergeseran merah dan absorbansi FAM pada 503 nm meningkat. Alasan yang mungkin adalah bahwa FAM-apt teradsorpsi pada permukaan GO, menunjukkan interaksi elektronik antara keduanya π sistem GO dan pewarna dalam keadaan dasar. Oleh karena itu, hasilnya menunjukkan bahwa GO-apt telah berhasil dibuat.
Karakterisasi GO-apt. a Gambar AFM dari GO dan CEM-apt. b Potensi zeta permukaan FAM-apt, GO, dan CEM-apt. Bilah kesalahan menunjukkan ± SD (n = 3). c Spektrum serapan UV-tampak dari (a) GO, (b) FAM-apt, dan (c) GO-apt
Mikroskopi Fluoresensi Sel
Untuk memvisualisasikan secara langsung kekhususan pengikatan FAM-apt yang jatuh pada tingkat seluler, kami menginkubasi sel CCRF-CEM dan Ramos dengan Go-apt dan kemudian menganalisisnya menggunakan mikroskop fluoresensi. Konsisten dengan eksperimen spektral fluoresensi, FAM-apt dapat jatuh dari Go-apt dan kemudian mengikat ke sel CCRF-CEM untuk pewarnaan fluoresen, tetapi tidak ke sel Ramos (Gbr. 4).
Mikrograf fluoresensi sel CCRF-CEM dan Ramos setelah dicampur dengan GO-apt. Inti diwarnai dengan DAPI. Bilah skala menunjukkan 25 μm
Optimasi Kondisi Eksperimental untuk Deteksi CCRF-CEM
Untuk mendapatkan kinerja yang sangat baik dari aptasensor fluoresen, waktu pendinginan dan pemulihan fluoresensi dioptimalkan. Perilaku kinetik FAM-apt dan GO, serta FAM-apt dalam larutan GO homogen dengan sel CCRF-CEM, diselidiki dengan memantau intensitas fluoresensi sebagai fungsi waktu pendinginan dan pemulihan (Gbr. 5a, b). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, pendinginan fluoresensi FAM-apt sebagai fungsi waktu inkubasi dengan adanya GO dapat diamati. FAM-apt dengan cepat menyerap ke permukaan GO dan, setelah itu, mengalami transfer energi, dan pada saat yang sama, intensitas fluoresensi berkurang secara signifikan dan cenderung melambat setelah 2 menit. Sebaliknya, CEM-apt terbentuk dan pelepasan dari permukaan GO lebih lambat. Intensitas fluoresensi mencapai platform ketika waktu inkubasi lebih tinggi dari 30 menit (Gbr. 5b). Eksperimen yang bergantung pada waktu ini menunjukkan bahwa GO, sebagai quencher yang sangat baik, dengan cepat memadamkan fluoresensi yang sesuai dengan FAM dan secara bertahap mendapatkan kembali fluoresensi dengan adanya CEM.
Optimalisasi kondisi eksperimental. a Pendinginan fluoresensi FAM-apt (20 nM) dalam buffer Tris-HCl oleh GO sebagai fungsi waktu. b Pemulihan fluoresensi FAM-apt dalam solusi GO oleh CCRF-CEM (1 × 10
6
) sebagai fungsi waktu. c Pengaruh konsentrasi GO pada intensitas fluoresensi FAM-apt dengan tidak adanya (kurva a) dan dengan adanya (kurva b) dari 1 × 10
6
sel CCRF-CEM. d Tingkat intensitas fluoresensi (F /B0 ) dari FAM-sesuai dengan 1 × 10
6
Sel CCRF-CEM sebagai fungsi konsentrasi GO. Eksitasi 490 nm
Untuk membuat aptasensor fluoresen lebih sensitif terhadap deteksi CCRF-CEM, sistem reaksi yang digunakan untuk mengoptimalkan konsentrasi GO menjadi sangat diperlukan. Gambar 5c, yang dengan jelas mengilustrasikan strategi kami, menunjukkan efek konsentrasi GO yang berbeda pada intensitas fluoresensi FAM-apt dengan tidak adanya (Gbr. 5c, kurva a) dan di hadapan (Gbr. 5c, kurva b) CCRF -CEM. Seperti yang telah kita lihat dari Gambar 5c, setelah penambahan GO, latar belakang sinyal fluoresensi berkurang secara signifikan. Gambar 5d menunjukkan fluoresensi yang dipulihkan dari FAM-apt sebesar 1 × 10
6
Sel CEM sebagai fungsi konsentrasi GO. Dari Gambar 5d, kita dapat menemukan bahwa ketika konsentrasi GO adalah 20 μg/mL, rasio F /B0 (di mana F0 dan F adalah intensitas fluoresensi FAM pada 518 nm dengan tidak adanya dan adanya CCRF-CEM, masing-masing) mendapat nilai tertinggi, yaitu 13,0354. Oleh karena itu, 20 μg/mL dianggap sebagai konsentrasi GO yang optimal.
Deteksi CCRF-CEM dengan GO-apt Fluorescent Aptasensor
Untuk mendapatkan hasil eksperimen yang baik, digunakan kondisi eksperimen yang optimal untuk mendeteksi CCRF-CEM. Gambar 6a menunjukkan bahwa dengan meningkatnya jumlah CCRF-CEM dari 0 menjadi 1 × 10
7
, intensitas fluoresensi juga meningkat. Selanjutnya, F /B0 menunjukkan ketergantungan linier yang jelas pada jumlah CCRF-CEM dalam kisaran 1 × 10
2
–1 × 10
7
(Gbr. 6b). Persamaan regresi linier adalah Y (B /B0 ) = 3.2608 × log C 5.1892 (di mana C adalah jumlah CCRF-CEM) dengan koefisien regresi R
2
= 0.9922. Batas deteksi dianggap kurang dari sepuluh sel. Oleh karena itu, fluorescence aptamer sensing berbasis GO memiliki jangkauan deteksi yang luas sehingga dapat digunakan sebagai biosensor yang ideal untuk mendeteksi CCRF-CEM. Dibandingkan dengan metode lain, metode ini memiliki sensitivitas yang lebih tinggi (Tabel 1) [34,35,36,37,38,39].
Deteksi sel CEM yang tepat. a Spektrum emisi fluoresensi dari aptasensor fluoresen yang sesuai dengan GO di hadapan konsentrasi sel CCRF-CEM yang berbeda. b Hubungan linier antara tingkat intensitas fluoresensi (F /B0 ) dan konsentrasi sel CCRF-CEM
Kekhususan dari GO-apt Fluorescent Aptasensor
Untuk menyelidiki spesifisitas adaptor fluoresen GO-apt, beberapa sel berbeda digunakan untuk menguji sistem, seperti sel Ramos, sel H22, dan sel 293T. Setiap sistem reaksi 100-μL mencakup 1 × 10
6
sel. Gambar 7 menunjukkan bahwa CCRF-CEM mendapatkan intensitas fluoresensi yang lebih tinggi daripada kelompok kontrol lainnya. Hasilnya juga dengan jelas menunjukkan bahwa aptasensor fluorescent yang dirancang sangat spesifik.
Spesifisitas aptasensor fluoresen untuk CEM. Tingkat intensitas fluoresensi (F /B0 ) dari aptasensor fluorescent GO-apt dengan adanya sel CEM, sel Ramos, sel H22, dan sel 293T, masing-masing (1 × 10
6
), di mana F0 dan F adalah intensitas fluoresensi tanpa dan dengan sel deteksi pada 518 nm. Eksitasi 490 nm
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan aptasensor fluoresen yang nyaman, murah, dan sangat sensitif untuk mendeteksi sel CCRF-CEM. Strategi ini dengan cerdik menggunakan interaksi ikatan non-kovalen oleh π -π penumpukan antara graphene dan DNA untai tunggal dan kinerja superior dari fluoresensi pendinginan graphene. Dibandingkan dengan aptamer, pengikatan kompleks CEM-aptamer ke GO lemah, sehingga fluoresensi yang dipadamkan oleh graphene dapat dipulihkan secara bertahap. Dalam kondisi yang dioptimalkan, batas deteksi dianggap kurang dari 100 sel. Oleh karena itu, berdasarkan kinerjanya yang sangat baik, aptasensor fluoresen memiliki prospek yang luas dalam pendeteksian sel tumor.
