Piperlongumine-Eluting Gastrointestinal Stent Menggunakan Reactive Oxygen Species-Sensitive Nanofiber Mats untuk Penghambatan Sel Cholangiocarcinoma

Bahan dan Metode

Materi

PL dibeli dari LKT Labs. Co., (Minnesota, AS). Poli(L-laktida) (PLA, PLA-0005, M.W. = 5000 g/mol dari data pabrikan) dibeli dari Wako Pure Chem. Co.Ltd. (Osaka, Jepang). Metoksi poli(etilena likol)-suksinimidilglutarat (MePEG-NHS, M.W. = 5000 g/mol) dibeli dari Sunbio Co. Ltd. (Seoul, Korea). Stent tertutup membran silikon untuk saluran empedu diperoleh dari M.I. Teknologi. (Pyeongtaek, Korea). Poli(ε-kaprolakton) (PCL, jumlah rata-rata MW = 80.000 g/mol), N-hidroksisuksinimida (NHS), N-(3-dimetilaminopropil)-N′-etilkarbodiimida hidroklorida (EDAC), tetrahidrofuran (THF), kloroform , dimetil sulfoksida (DMSO), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), dan selenocystamine dihydrochloride dibeli dari Sigma-Aldrich Chemical Co., (St. Louis, MO , AS). Membran dialisis atau alat dialisis (M.W. cutoff size (MWCO) 1000 g/mol dan 8000 g/mol) dibeli dari Spectrum/Por Lab., Inc. (CA, USA). Semua pelarut organik dan bahan kimia lainnya digunakan sebagai kelas ekstra murni. Persediaan kultur sel seperti media RPMI1640 dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Life Tech. Inc. (Grand Island, NY, AS). Semua reagen dan pelarut organik yang digunakan adalah kelas HPLC.

Sintesis Kopolimer Blok LEse

Konjugat MePEG-selenocystamine

MePEG-NHS (500 mg) dilarutkan dalam 20 mL DMSO. Lebih dari lima ekuivalen selenocystamine dilarutkan secara terpisah dalam 15 mL air deionisasi dan dicampur dengan 5 mL DMSO. Setelah itu, larutan selenocystamine diteteskan secara perlahan ke dalam larutan MePEG-NHS kemudian diaduk secara magnetis selama 24 h. Setelah ini, reaktan dimasukkan ke dalam tabung dialisis (MWCO 1000 g/mol) dan kemudian didialisis dengan banyak air selama 2 hari. Larutan dialisis diliofilisasi selama 2 hari. Padatan terliofilisasi digunakan untuk mensintesis kopolimer blok.

Blokir sintesis kopolimer

PLA (500 mg) dilarutkan dalam 20 mL DMSO dengan jumlah EDAC dan NHS yang setara. Larutan ini diaduk secara magnetis selama 12 h. Untuk larutan ini, mPEG-selenocystamine solid (530 mg) ditambahkan dan diaduk lebih lanjut selama 2 hari. Setelah ini, reaktan dimasukkan ke dalam tabung dialisis (MWCO:8000 g/mol) dan kemudian didialisis dengan banyak air selama 2 hari. Larutan dialisis diliofilisasi selama 2 hari. Produk yang diliofilisasi diendapkan dalam metanol untuk menghilangkan mPEG-selenocystamine yang tidak bereaksi sekali lagi. Hasil akhir lebih tinggi dari 94%. Hasil = [(berat padatan terliofilisasi)/(berat PLA + berat mPEG-selenocystamine)] × 100.

Karakterisasi Polimer

Untuk memantau sintesis polimer, ¹ Spektroskopi resonansi magnetik nuklir-H (NMR) digunakan. Polimer dilarutkan dalam bentuk DMSO-d dan diukur dengan ¹ Spektroskopi H-NMR (Spektrometer FT-NMR Superkonduktor 500 MHz, UnityInova 500, Varian Inc. Agilent Tech., CA, USA).

Berat molekul polimer diukur dengan kromatografi permeasi gel (GPC, Waters GPC system, MA 01757, USA):Pompa pelarut HPLC Waters 1515, detektor indeks bias Waters 2414, dan tiga kolom Resolusi Tinggi Waters Styragel (HR4, HR2, HR1 ). Polimer dilarutkan dalam THF ekstra murni yang mengandung 0,1 N LiBr sebagai eluen (laju alir 1,0 mL/menit). Polistirena digunakan untuk membuat kurva kalibrasi.

Mat Nanofiber yang Diisi PL dan Dilapisi pada Stent GI

Mat nanofiber bermuatan PL

Vorinostat (100 mg) dilarutkan dalam 10 mL larutan aseton. Untuk larutan ini, LEse (100~400 mg) dan PCL (600~900 mg) kemudian ditambahkan dan diaduk secara magnetis selama 2 h. Solusi ini digunakan untuk membuat tikar nanofiber dan melapisi stent yang dilapisi membran silikon menggunakan mesin electrospinning (EBS ES-Biocoater; Nano NC, Seoul, Korea Selatan). Mesin electrospinning terdiri dari catu daya tegangan tinggi, pompa jarum suntik, sistem robot XY, dan kolektor drum-roll. Larutan polimer/obat dalam spuit (NanoNC, 24G) disemprotkan ke stent logam yang dilapisi membran silikon (diameter 1 cm, panjang 10 cm, kecepatan putar 500 rpm, laju semprot 100 μL/menit, tegangan 15 kV) yang ditempatkan ke kolektor bergulir. Membran nanofiber bermuatan PL dilapisi ke stent. Untuk menghilangkan pelarut yang tersisa, stent berlapis nanofiber bermuatan PL dikeringkan dalam oven pengering vakum selama 24  jam. Stent berlapis nanofiber bermuatan PL disimpan pada suhu 4 °C hingga penelitian berikutnya.

Tikar nanofiber bermuatan PL dipisahkan dengan hati-hati dari stent untuk pelepasan obat dan penelitian pada hewan. Membran nanofiber kosong disiapkan tanpa adanya PL dengan prosedur serupa.

Isi obat diukur sebagai berikut:5 mg tikar nanofiber yang digabungkan dengan PL dilarutkan dalam DMSO selama 2 h. Spektrofotometer UV (UV-1601, Shimadzu Co. Ltd. Osaka, Jepang) digunakan untuk mengukur konsentrasi obat pada 325 nm. Tikar nanofiber kosong juga dilarutkan dalam DMSO dan digunakan untuk pengujian blanko.

Studi pelepasan obat dilakukan dengan saline buffer fosfat (PBS, 0,01 M, pH-7,4) in vitro. Tikar nanofiber dipotong menjadi disk, dan 10 mg disk direndam ke dalam 40 mL PBS (0,01 M, pH 7.4) dalam tabung kerucut 50 mL. Ini ditempatkan ke dalam inkubator gemetar pada 100 rpm (37 °C). Seluruh media diambil untuk mengukur konsentrasi PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber pada interval waktu tertentu. Konsentrasi PL dalam media diukur dengan spektrofotometer UV (325 nm). Tikar nanofiber kosong juga digunakan untuk digunakan sebagai tes kosong. Dalam studi pelepasan, hidrogen peroksida ditambahkan ke media pelepasan untuk menyelidiki efek ROS pada laju pelepasan obat.

Morfologi

Morfologi tikar nanofiber diamati dengan mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (S-4800; Hitachi, Tokyo, Jepang) pada 25 kV.

Budaya Sel

Garis sel CCA manusia seperti SNU478, SNU245, dan SNU 1196 garis sel CCA diperoleh dari Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Garis sel CCA manusia HuCC-T1 diperoleh dari Health Science Research Resources Bank (Osaka, Jepang). Semua sel dikultur dalam RPMI1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS yang tidak diaktifkan panas dan 1% penisilin/streptomisin pada 37 °C dalam 5% CO₂ inkubator.

Studi Aktivitas Antikanker

Berbagai sel CCA (1 × 10 ⁴ ) diunggulkan di pelat 96-sumur digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antikanker dari PL itu sendiri, tikar nanofiber yang digabungkan dengan PL, atau PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber. Sel dipertahankan semalaman dalam 5% CO₂ inkubator pada suhu 37 °C. Untuk perlakuan PL, PL yang dilarutkan dalam DMSO (10 mg PL/mL DMSO) diencerkan dengan media RPMI1640. Konsentrasi akhir DMSO lebih rendah dari 0,5%. Untuk perawatan PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber, tikar nanofiber yang digabungkan dengan PL direndam dalam 40 mL PBS dalam tabung kerucut 50 mL. Pada hari ke 5 dan hari ke 15, konsentrasi PL diukur dengan spektrofotometer UV seperti dijelaskan di atas dan digunakan untuk merawat sel. Nanofiber kosong juga disesuaikan dengan eksperimen rilis untuk perbandingan. Sel terpapar PL itu sendiri atau PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber selama 2 hari. Kelangsungan hidup sel CCA dievaluasi dengan uji proliferasi MTT. Tiga puluh mikroliter larutan MTT (5 mg/mL PBS, pH 7.4) ditambahkan ke sumur, dan kemudian sel diinkubasi selama 4 h dalam 5% CO₂ inkubator pada suhu 37 °C. Media dibuang dan ditambahkan 100 μl DMSO. Viabilitas sel dianalisis dengan pembaca lempeng mikro pada 570 nm (pembaca lempeng mikro Tak Terbatas M200 Pro, Tecan, Mannedorf, Swiss). Viabilitas sel dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi dari delapan sumur.

Pengukuran ROS

Generasi ROS dalam sel CCA diuji dengan metode DCFH-DA. Sel CCA (1 × 10 ⁴ sel) diunggulkan dalam pelat 96-sumur diperlakukan dengan berbagai konsentrasi PL itu sendiri atau PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber dalam media RPMI bebas fenol merah dengan DCFH-DA (konsentrasi akhir 20 μM). Enam jam atau 12 h kemudian, sel dicuci dengan PBS dua kali dan diganti dengan 100 μL media RPMI bebas fenol merah segar. Isi ROS dalam sel dianalisis dengan perubahan intensitas fluoresensi menggunakan pembaca pelat mikro Pro Infinite M200 (panjang gelombang eksitasi 485 nm, panjang gelombang emisi 535 nm).

Western Blotting

Western blotting sel CCA dilakukan seperti yang dijelaskan sebelumnya [31]. Sel terpapar PL itu sendiri atau PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber selama 24 jam. Setelah itu, sel dipanen dengan tripsinisasi, dicuci dengan PBS dingin, dan dikumpulkan dengan sentrifugasi. Pelet dilisiskan dalam buffer lisis yang mengandung 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% asam deoksikolat, 0,1% natrium dodesil sulfat (SDS) dengan fenilmetilsulfonil fluorida, dan koktail protease inhibitor (Roche Diagnostics, Basel, Swiss ). Larutan ini disentrifugasi selama 30 menit pada 4 °C (14.000×g ); lisat sel (supernatan) kemudian digunakan untuk mengukur konsentrasi protein menggunakan kit BCA Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, USA). Protein (50 μg) dimasukkan ke dalam elektroforesis gel SDS-poliakrilamida (SDS-PAGE), dipindahkan ke membran polivinil difluorida (PVDF), diblokir dengan susu skim 5% di TBS-T, diperiksa dengan antibodi primer yang sesuai, dan kemudian diobati dengan antibodi terkonjugasi HRP sekunder selama 1 jam. Imunoblot dideteksi dengan chemiluminescence dan kemudian diukur dengan analisis digital menggunakan program perangkat lunak ImageJ.

Studi In Vivo Menggunakan Model Tumor Xenograft

Tikus yang mengandung HuCC-T1 (tikus telanjang BALB / c, berusia 5 minggu, jantan, berat 18-23 g; Orient, Seongnam, Korea Selatan) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas antitumor in vivo dari stent nanofiber yang digabungkan dengan PL. 1 × 10 ⁶ Sel HuCC-T1 dalam 100 μL PBS diberikan secara subkutan (s.c.) ke punggung tikus telanjang. Disk nanofiber yang digabungkan dengan PL dan nanofiber kosong ditanamkan di bawah tumor padat ketika tumor padat menjadi sekitar 4 ~ 5 mm diameter. Dosis PL adalah 10 mg PL/kg. Sebagai perbandingan, PL dilarutkan dalam larutan campuran Cremophor EL®/ethanol (0,5% v /v Cremophor EL® dan 0,5% v /v etanol dalam PBS (pH 7.4, 0.01 M)). Kelompok kontrol disuntik secara subkutan dengan PBS di samping jaringan tumor. Untuk nanofiber yang tergabung dengan PL dan grup nanofiber kosong, disk nanofiber disiapkan sebagai berikut; wafer nanofiber dengan berat yang sama dipotong menjadi cakram bundar dan kemudian bagian belakang kulit tikus dipotong dengan hati-hati (panjang 0,5 cm). Setelah ini, wafer nanofiber ditanamkan dengan hati-hati di bawah jaringan tumor padat. Untuk membuat kondisi yang sama, tikus dengan perlakuan kontrol dan injeksi PL juga telah mengeksisi kulit di samping tumor (panjang 0,5 cm). Setiap kelompok terdiri dari lima ekor mencit. Volume tumor diukur dengan interval 5 hari, dan hari pertama implantasi nanofiber ditetapkan sebagai hari 0. Volume tumor dihitung dengan persamaan berikut:V = (a × [b < ² )/2. a :diameter terbesar; b :diameter terkecil.

Semua penelitian pada hewan dilakukan dengan hati-hati di bawah pedoman Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Nasional Pusan ​​(PNUIACUC). Protokol hewan yang digunakan dalam penelitian ini telah ditinjau secara ketat oleh PNUIACUC tentang prosedur etis dan perawatan ilmiah mereka, dan telah disetujui (Nomor Persetujuan:PNU-2017-1608).

Imunohistokimia

Jaringan tumor diisolasi 30 hari kemudian. Kemudian, jaringan tumor difiksasi dalam formaldehida 4%, parafin tertanam, dan diiris untuk pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E). Pewarnaan imunohistokimia dilakukan dengan protein terkait apoptosis seperti antibodi caspase-3 dan caspase-9. Antibodi digunakan pada pengenceran 1:100 atau 1:200, lalu pewarnaan dilakukan menggunakan kit Envision (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) sesuai dengan protokol pabrikan.

Analisis Statistik

Analisis statistik data dari sel yang dirawat dan yang tidak diberi perlakuan dilakukan menggunakan t . Siswa tes. p nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Hasil

Karakterisasi Polimer

Untuk membuat stent GI yang mengelusi PL, kopolimer blok LEse disintesis seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. MePEG-NHS direaksikan dengan selenocystamine, dan kemudian gugus terminal amina dikonjugasikan dengan gugus akhir karboksil PLA. Selenocystamine yang tidak bereaksi dari konjugat MePEG-selenocystamine dihilangkan dengan prosedur dialisis. Selanjutnya, konjugat MePEG-selenocystamine yang tidak bereaksi dari kopolimer blok yang disintesis juga dihilangkan dengan prosedur dialisis dan pengendapan dalam metanol. Puncak spesifik selenocystamine dikonfirmasi masing-masing pada 1,7 ppm dan 2,9 ppm, sedangkan puncak spesifik MePEG juga dikonfirmasi pada 3,5~3,7 ppm. Ketika PLA terkonjugasi, gugus metil PLA dikonfirmasi pada 1,4 ppm. Homopolimer PCL dan campuran kopolimer blok LEse dicampur untuk membuat tikar nanofiber. MW dan komposisi kopolimer blok LEse dan homopolimer PCL diukur dengan ¹ Spektroskopi H-NMR dan GPC. Hasil estimasi MW ditunjukkan pada Tabel 1. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, MW kopolimer blok LEse diestimasi berdasarkan MW PEG menggunakan ¹ Spektroskopi H-NMR sebagai 9760 g/mol. Pengukuran GPC menunjukkan bahwa kopolimer blok LEse masing-masing memiliki 8210 g/mol Mn, 9530 g/mol Mw, dan 1,16.

Skema sintesis kopolimer blok LEse

Karakterisasi Piperlongumine-Incorporated Nanofiber Coated GI Stent

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2 dan Tabel 2, berbagai rasio kopolimer blok PCL dan LEse digunakan untuk membuat nanofiber dan untuk melapisi ke stent GI. Homopolimer PCL menghasilkan tikar nanofiber halus dan tipis dengan bentuk agregat yang diminimalkan. Ketika kopolimer blok LEse ditambahkan, beberapa bentuk agregat seperti butiran dan partikel diamati seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2. Pada rasio LEse yang lebih tinggi (75/25 dan 60/40), tikar nanofiber menunjukkan bentuk serat yang lebih tebal dan tidak beraturan. struktur. Ketika terdiri dari lebih dari 50% rasio LEse dalam isinya, polimer secara signifikan dikumpulkan dan tikar menunjukkan ketidakteraturan yang parah (data tidak ditampilkan). Struktur nanofibrous hampir tidak diperoleh dari kopolimer blok LEse saja. Oleh karena itu, struktur nanofibrous dapat dicapai dengan pencampuran dengan homopolimer PCL. Kandungan obat dalam matras nanofiber yang dilengkapi PL hampir mirip dengan nilai teoritis seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Hasil ini menunjukkan bahwa matras nanofiber yang digabungkan dengan PL berhasil dibuat dari homopolimer PCL dan campuran kopolimer blok LEse dan kemudian dilapisi ke stent GI.

a Stent GI berlapis nanofiber yang dilengkapi PL. b Foto FE-SEM dari nanofiber yang digabungkan dengan PL

Gbr. 3 menunjukkan kinetika pelepasan obat dari matras nanofiber. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, PL terus menerus dilepaskan dari tikar nanofiber selama 25 hari. Pelepasan ledakan PL dari matras nanofiber diamati hingga 4 hari, dan kemudian PL terus menerus dilepaskan dari matras nanofiber hingga hari ke 25. Kandungan kopolimer blok LEse yang lebih tinggi dalam matras nanofiber menghasilkan pelepasan PL yang lebih cepat dari matras nanofiber. Karena kopolimer blok LEse kurang hidrofobik daripada homopolimer PCL, lapisan nanofiber PCL/LEse dengan kandungan kopolimer blok LEse yang lebih tinggi harus membengkak lebih dari homopolimer PCL. Kemudian, tikar nanofiber dengan kandungan kopolimer blok LEse yang lebih tinggi menghasilkan pelepasan obat yang lebih cepat. Selanjutnya, laju pelepasan PL dapat dipercepat dengan adanya ROS karena ikatan diselenide dalam kopolimer blok LEse dapat dihancurkan oleh ROS seperti H₂ O₂ , dan kemudian faktor-faktor ini menginduksi disintegrasi matras nanofiber yang responsif redoks (Gbr. 3c~e). Tikar nanofiber homopolimer PCL tidak responsif secara signifikan terhadap penambahan H₂ O₂ , yaitu, PCL tidak terlalu terpengaruh oleh H₂ O₂ tambahan; di sisi lain, ketika kopolimer blok LEse dicampur, pelepasan PL dari tikar nanofiber dipercepat secara signifikan sebagai H₂ O₂ telah ditambahkan . Terutama, rasio kopolimer blok LEse yang lebih tinggi dalam tikar nanofiber menginduksi kinetika pelepasan obat yang lebih cepat seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3c, d, dan e. Hasil ini menunjukkan bahwa tikar nanofiber yang digabungkan dengan PL memiliki potensi pelepasan obat yang responsif terhadap redoks di lingkungan biologis. Tikar nanofiber yang digabungkan dengan PL yang disiapkan dengan kopolimer blok PCL/LEse (60/40) digunakan setelah kultur sel in vitro dan studi hewan in vivo.

a Pelepasan PL dari nanofibers memiliki berbagai komposisi. Rasio berat PCL/Lese masing-masing adalah 100/0, 90/10, 75/25, dan 60/40. b Pengaruh hidrogen peroksida pada pelepasan PL dari tikar nanofiber (rasio berat PCL/Lese adalah 100/0). c Pengaruh hidrogen peroksida pada pelepasan PL dari tikar nanofiber (rasio berat PCL/Lese adalah 90/10). d Pengaruh hidrogen peroksida pada pelepasan PL dari matras nanofiber (rasio berat PCL/Lese adalah 75/25). e Pengaruh hidrogen peroksida pada pelepasan PL dari matras nanofiber (rasio berat PCL/Lese adalah 60/40)

Aktivitas Antikanker In Vitro

Sifat antikanker dari stent berlapis nanofiber yang digabungkan dengan PL dinilai dengan berbagai sel CCA. Sebagai perbandingan, PL yang dilepaskan dari matras nanofiber diekstraksi pada hari ke 5 dan hari ke 15 selama percobaan pelepasan dan dibandingkan dengan PL utuh. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, aktivitas antikanker pada PL yang dilepaskan dari hari ke 5 dan hari ke 15 tidak berubah secara signifikan dibandingkan dengan PL itu sendiri pada semua sel HuCC-T1 (Gbr. 4a), sel SNU1196 (Gbr. 4b), sel SNU478 ( Gbr. 4c), dan sel SNU245 (Gbr. 4d). Mereka memiliki potensi penghambatan yang hampir sama dalam viabilitas sel meskipun PL itu sendiri menghasilkan aktivitas antikanker yang lebih tinggi pada konsentrasi yang lebih tinggi dari 10 μg/mL. Tabel 3 menunjukkan IC₅₀ nilai PL itu sendiri dan melepaskan PL dari tikar nanofiber. Seperti halnya PL itu sendiri, PL yang dilepaskan dari hari ke 5 dan hari ke 15 mempertahankan aktivitas antikanker sampai hari ke 15 percobaan pelepasan obat dan menunjukkan IC yang wajar₅₀ nilai di semua lini sel CCA meskipun nilai tersebut meningkat secara bertahap pada PL dari hari ke 5 dan hari ke 15 dibandingkan dengan PL itu sendiri. Rilis PL dari hari ke-4 dan hari ke-15 dengan kehadiran H₂ O₂ juga mempertahankan aktivitas antikanker serta PL itu sendiri. Hasil ini menunjukkan bahwa aktivitas antikanker PL dipertahankan selama proses fabrikasi nanofiber dan periode pelepasan obat di lingkungan biologis. Selanjutnya, PL yang dilepaskan dari tikar nanofiber menghasilkan kapasitas generasi ROS hingga periode pelepasan obat selama 15 hari seperti halnya PL itu sendiri (Gbr. 5). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a dan b, PL sendiri menghasilkan ROS secara signifikan lebih banyak pada tingkat yang lebih tinggi dari 5 μg/mL. Pelepasan PL dari hari ke 5 dan hari ke 15 juga menghasilkan ROS meskipun produksi ROS sedikit menurun dengan pelepasan PL dari hari ke 15, menunjukkan bahwa matras nanofiber yang digabungkan dengan PL mempertahankan sifat antikanker intrinsik dari PL selama periode pelepasan obat.

Pengaruh PL dan pelepasan PL dari tikar nanofiber pada kelangsungan hidup berbagai sel CCA. a HuCC-T1, b SNU1196, c SNU478, dan d Sel kolangiokarsinoma SNU245. 2 × 10 ⁴ sel-sel di pelat 96-sumur terkena PL atau melepaskan PL dari nanofibers selama 2 hari. Untuk perawatan PL yang dilepaskan, disk nanofiber yang digabungkan dengan PL direndam ke dalam PBS dan kemudian eksperimen pelepasan dilakukan selama 5 dan 15 hari dengan atau tanpa 10 mM H₂ O₂ . Media ditukar sampai 3 hari seperti halnya studi pelepasan obat. Setelah itu, media dipanen antara 5 dan 15 hari percobaan pelepasan. Solusi ini digunakan untuk menyelidiki perbandingan aktivitas antikanker dari PL itu sendiri dan melepaskan PL

Pengaruh PL dan pelepasan PL dari tikar nanofiber pada generasi ROS sel HuCC-T1 (a ) dan sel SNU245 (b ). PL itu sendiri dan PL yang dilepaskan diperlakukan seperti yang dijelaskan pada Gambar. 3

Gambar 6 menunjukkan ekspresi protein apoptosis dalam sel CCA HuCC-T1. Pelepasan PL (5 hari) memiliki aktivitas yang sama dalam induksi apoptosis sel HuCC-T1 dibandingkan dengan PL itu sendiri, yaitu ekspresi BAX, caspase-3, 7, dan 9, dan pembelahan PARP secara bertahap meningkat dengan pengobatan merilis PL (5 days) serta PL itu sendiri. Hasil ini juga menunjukkan bahwa PL yang dilepaskan memiliki aktivitas antikanker yang wajar terhadap sel CCA serta PL itu sendiri.

Analisis Western blot dari apoptosis sel HuCC-T1. Sel diperlakukan PL itu sendiri atau melepaskan PL dari nanofibers selama 1hari dan kemudian dilakukan analisis western blot

Aktivitas Antikanker In Vivo Terhadap Model Xenograft Tumor HuCC-T1

Tikus telanjang yang mengandung HuCC-T1 disiapkan untuk menilai aktivitas antikanker in vivo dari stent berlapis nanofiber yang digabungkan dengan PL seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7 dan 8. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7, volume tumor HuCC-T1 secara bertahap meningkat selama 1 bulan. Pertumbuhan volume tumor pada perlakuan nanofiber kosong hampir sama dengan perlakuan kontrol. PL injection properly inhibited tumor growth, compared to control treatment or empty nanofiber treatment. Especially, tumor growth was significantly inhibited by the treatment of PL-incorporated nanofiber, i.e., tumor mass in the treatment of PL-incorporated nanofiber was one third of control treatment. These results indicate that PL-incorporated nanofiber mats have superior potential in inhibition of tumor growth of CCA cells. Furthermore, the expression of caspase-3 and 9 was also increased in tumor tissues as shown in Fig. 8, indicating that released PL from nanofiber mats properly inhibited the growth of the tumor and induced apoptosis of tumor cells. Also, PL-incorporated nanofiber-coated stent has potential to inhibit CCA cells in vitro and in vivo.

The effect of PL solution, empty nanofiber mats or PL-incorporated nanofiber mats on the growth of HuCC-T1 tumor (a ) and the body weight changes (b ). HuCC-T1 (1 × 10 ⁶ cells) cells were implanted to the back of mice. PL dose was adjusted to 10 mg/kg. One hundred microliters of PBS or PL solution was s.c. injected beside the tumor tissue for control treatment and PL solution treatment, respectively. For empty nanofiber and vorinostat nanofiber implantation, wafers of the same weight were cut and then implanted under the tumor tissue. *p < 0,001; **p  < 0.01

Immunohistochemical staining (× 400) of HuCC-T1 tumor tissues. Each tumor tissues were stained with BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP-1

Discussion

Abnormal accumulation of ROS in tumor epithelial cells induces carcinogenesis and affects surrounding cells or tissues which constitute tumor microenvironment [39]. Then, abnormal tumor microenvironment is the key player in proliferation, migration, angiogenesis, and metastasis of cancer cells [39,40,41]. An elevated level of ROS in tumor microenvironment induces oxidative stress and causes DNA damage [39]. Also, ROS is also correlated with cholangiocellular proliferation and oncogenic transformation [42]. Paradoxically, increased accumulation of intracellular ROS over toxic level induces apoptosis of cancer cells and tumor suppression [39,40,41,42]. For example, Thanee et al. reported that sulfasalazine as a cystine-glutamate transporter-target drug increased intracellular ROS level and then induced cell death [43]. They also argued that therapeutic efficacy of anticancer drug can be improved by blocking the mechanism of the cell’s ROS defensive system. Also, many research groups investigated ROS-producing small molecules such as melatonin, luteolin, chloroqine, and PL to suppress CCA growth rate by increasing intracellular ROS [44,45,46,47]. Thongsom et al. reported that PL stimulates ROS accumulation in CCA cells and induces cell death by activation of caspase-3 and PARP [47]. We also observed that PL increases the accumulation of intracellular ROS in various CCA cells as shown in Fig. 5. Increased ROS level induced apoptosis signals such as BAX, caspase-3, 7, and 9, and PARP (Fig. 6). The ROS-producing capability of piperlongumine was slightly decreased on day 5 and 15 as shown in Fig. 5. These results might be due to that piperlongumine is unstable in physiological solution, and then ROS-producing capability might have been slightly decreased. Additionally, physicochemical properties of piperlongumine may be affected during the fabrication process of the nanofiber. However, our results showed that ROS-producing capacity of piperlongumine was still maintained during the 15 days of drug release experiment.

Local treatment can be applied for patients with an advanced stage or unresectable stage of CCA [48]. Among various treatment options, DES is a promising candidate for unresectable CCA patients. However, conventional DES for GI tract has no tumor-targetable drug release function, and cytotoxic agent can be eluted in all areas of polymer membrane on the stent. Chemical, physical, or biological stimuli have been applied to induce altered drug delivery in the local region [49,50,51,52]. For example, Wang et al. used a magnitude of applied tensile strain to control drug release rate on the esophageal stent, i.e., increased drug release in a specific region was observed by propagating patterned crack of multilayered coating on the stent [49]. Thin film or nanoporous devices having stimuli-responsiveness such as pH and ionic strength were also investigated for application in DES [50, 51]. Chen and Huang reported that chitosan/poly(vinyl alcohol) hybrid nanofiber membrane was crosslinked with ally disulfide to endow reductant-responsiveness, and then hybrid nanofiber membrane showed favorable biological/material features [52]. We synthesized LEse deblock copolymer and fabricate redox-responsive nanofiber mats for local application in CCA tumors. PCL/LEse-blended nanofiber mats showed increased drug release behavior with responsiveness against H₂ O₂ , indicating that drug release kinetics can be controlled by ROS level in cancer cells or tumor tissues. Furthermore, ROS-dependent drug release from nanofiber mats can be accelerated in tumor since PL is a ROS-producing agent. PL in the tumor may synergistically increase ROS level and then accelerate drug release from nanofiber mats. After all, ROS-dependent release of PL from nanofiber-coated stent synergistically inhibits CCA cells in vitro and in vivo.

Conclusion

We fabricated ROS-sensitive nanofiber mats-coated GI stent using PCL/LEse block copolymer blend. PL was incorporated in nanofiber mats by electrospinning technique. PL release from nanofiber mats was accelerated by addition of H₂ O₂ , indicating that PL-incorporated nanofiber membranes have ROS-responsiveness. PL released from nanofiber mats at 5 days and 15 days showed appropriate anticancer activity even though its anticancer activity was slightly decreased compared to PL itself. As well as PL itself, PL released from nanofiber mats induced ROS generation and apoptosis of CCA cells. Furthermore, PL-incorporated nanofiber mats properly inhibited the growth of HuCC-T1 tumor in mice. We suggest PL-incorporated nanofiber mats prepared by PCL/LEse block copolymer blend as a promising candidate for local treatment of CCA cells.

Mode-Locked Er-Doped Fiber Laser dengan Menggunakan MoS2/SiO2 Saturable Absorber Penilaian Biodegradasi Poli (Asam Laktat) Diisi dengan Nanopartikel Titania Terfungsional (PLA/TiO2) dalam Kondisi Kompos