Silika Nanopartikel untuk Pengiriman Protein Intraseluler:Pendekatan Sintesis Baru Menggunakan Green Fluorescent Protein

Hasil dan Diskusi

Penelitian ini bertujuan memfungsikan nanopartikel silika dengan GFP di bawah kondisi yang sesuai yang mempertahankan karakteristik biokimia dan fungsionalitas protein. Dalam pekerjaan sebelumnya, kami mensintesis di dekat IR dye-doped monodisperse fluorescent silika nanopartikel dalam kisaran ukuran antara 15 dan 80 nm, menggunakan hidrolisis terkontrol -arginin dari tetraethoxysilane (TEOS) dalam sistem sikloheksana/air bifasik [26]. Di sini, kami telah mengadopsi prosedur sintesis ini untuk menanamkan GFP, sebagai protein model, ke dalam matriks silika. Dalam Skema 1, prosedur untuk sintesis partikel digambarkan secara skematis. Struktur yang didoping GFP dan yang tidak didoping (inti/kulit) masing-masing disorot dalam warna hijau dan abu-abu. Pada langkah pertama, partikel inti silika yang didoping GFP (C_F ) didapatkan. Langkah pertumbuhan kembali berikutnya (C_F S₁ dan C_F S₁ S₂ ) memungkinkan sintesis ukuran partikel yang lebih besar. Selama langkah pertumbuhan kembali pertama, cangkang dimodifikasi dengan (C_F S_1F ) atau tanpa (C_F S_1U ) penggabungan protein. Demikian pula, pada langkah pertumbuhan kembali kedua, baik berlabel (C_F S_1F S_2F , C_F S_1U S_2F ) atau tidak berlabel (C_F S_1F S_2U , C_F S_1U S_2U ) cangkang ditambahkan. Variasi ini memungkinkan kontrol yang sangat baik atas jumlah protein yang disematkan dan pengaturannya yang disesuaikan ke dalam cangkang yang ditentukan atau inti partikel. Selanjutnya, nanopartikel silika murni tanpa GFP tertanam (C_U , C_U S_1U , dan C_U S_1U S_2U ) disintesis untuk menyelidiki pengaruh potensial dari penyisipan protein pada sifat partikel. Selain itu, untuk semua langkah ini, GFP dilarutkan dalam dua sistem buffer yang berbeda (ʟ-arginin dan NaHCO₃ ) dari berbagai nilai pH, untuk mengetahui pengaruh pelarut protein terhadap sintesis partikel, morfologi, intensitas fluoresensi, panjang gelombang emisi dan potensial .

Tinjauan tentang partikel yang disintesis dan struktur partikelnya. Warna hijau menunjukkan penyematan GFP ke dalam inti atau cangkang, masing-masing. Warna abu-abu mewakili cangkang tanpa GFP (C_F = inti neon, C_U = inti tidak berlabel, S_F = cangkang berpendar, S_U = kulit tidak berlabel, S₁ = lapisan cangkang pertama, S₂ = lapisan cangkang kedua)

Karakterisasi Nanopartikel

Penentuan Atribut Partikel Fisik

Untuk menggambarkan ukuran partikel dan morfologi setelah penggabungan GFP dan untuk menentukan pengaruh dari dua sistem buffer yang berbeda pada properti ini, gambar TEM direkam (Gbr. 1). Gambar TEM lebih lanjut dari GFP(NaHCO₃ ) dimodifikasi, GFP(ʟ-arginine) dimodifikasi, dan nanopartikel tidak berlabel disajikan dalam SI (File tambahan 1:Gambar S1, File tambahan 2:Gambar S2, File tambahan 3:Gambar S3, File tambahan 4:Gambar S4). Mengikuti prosedur sintesis dengan dua langkah pertumbuhan kembali, diperoleh tiga ukuran partikel yang berbeda. Partikel inti memiliki ukuran sekitar 15 nm, partikel setelah langkah pertumbuhan kembali pertama sekitar 22 nm dan partikel setelah langkah kedua sekitar 32 nm. Singkatnya, semua nanopartikel kira-kira bulat dan menunjukkan distribusi ukuran yang sempit (p < 10%). Tiga generasi nanopartikel GFP(ʟ-arginine) yang diwarnai sepenuhnya (C_F , C_F S_1F , dan C_F S_1F S_2F ) dan GFP(NaHCO₃ ) (C_F ) nanopartikel inti dipilih sebagai model.

Gambar TEM dari tiga generasi nanopartikel termodifikasi GFP-ʟ-arginin dan partikel inti GFP(NaHCO₃ ) nanopartikel yang dimodifikasi. Dalam a , c dan d , tiga generasi GFP(ʟ-arginine) ditampilkan:C_F partikel inti (a , d_TEM = 15,5 ± 1,1 nm); C_F S_1F nanopartikel setelah langkah pertumbuhan kembali pertama (inti + cangkang 1) (c , d_TEM = 23.5 ± 2.0 nm) dan C_F S_1F S_2F setelah langkah pertumbuhan kembali kedua (inti + cangkang 1 + cangkang 2) (d , d_TEM = 35,3 ± 2,0 nm). Dalam b , GFP(NaHCO₃ )-berlabel inti nanopartikel (d_TEM = 15.2 ± 1.2 nm) ditampilkan

Membandingkan ukuran nanopartikel yang didoping GFP dan tidak berlabel (Tabel 1), perlu dicatat bahwa jumlah langkah pertumbuhan kembali yang sama menghasilkan ukuran partikel rata-rata yang sama, terlepas dari keberadaan protein atau larutan buffer yang digunakan. Partikel yang tidak berlabel juga memiliki ukuran yang sama (C_U :d_TEM = 13.4 ± 0.4 nm, d_DLS = 10 ± 3 nm; C_U S_1U :d_TEM = 20.9 ± 1.3 nm, d_DLS = 20 ± 6 nm; C_U S_1U S_2U :d_TEM = 33.2 ± 1.0 nm, d_DLS = 38 ± 10 nm).

Sebagai kesimpulan, ditunjukkan bahwa penggabungan protein ke dalam matriks silika dan larutan buffer, di mana protein disediakan, tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap ukuran partikel dan morfologi yang dihasilkan.

Sejauh pengetahuan kami, tidak ada nanopartikel silika tertanam GFP yang dijelaskan dalam literatur, menunjukkan ukuran kecil yang serupa serta distribusi ukuran yang sama sempitnya (< 10%) [20, 27]. Nanopartikel kecil tersebut memiliki potensi aplikasi yang menjanjikan di bidang pengiriman protein intraseluler serta dalam diagnosis dan terapi kanker [28].

ζ-Potensial

Potensi dari semua nanopartikel ditentukan melalui perhitungan menggunakan mobilitas elektroforesisnya. Semua jenis nanopartikel yang didoping menunjukkan potensi negatif dengan nilai absolut mulai dari 28 hingga 36 mV (Gbr. 2). Sebagai perbandingan, -potensial partikel tidak berlabel menunjukkan nilai yang sangat mirip dengan 35,5 ± 2,0 mV untuk partikel inti, 34.0 ± 3,7 mV setelah langkah pertumbuhan kembali pertama dan 34.5 ± 1,2 mV setelah langkah pertumbuhan kembali kedua. Nilai potensial (< − 28 mV) yang sangat negatif ini menunjukkan stabilitas nanopartikel yang tinggi terhadap aglomerasi karena tolakan elektrostatik. Dibandingkan dengan potensi dari nanopartikel yang tidak berlabel, data menunjukkan bahwa baik ukuran partikel yang dihasilkan maupun penggabungan GFP ke dalam matriks partikel baik inti partikel atau cangkang tidak memiliki pengaruh yang signifikan terhadap muatan partikel.

-potensial [mV] dari nanopartikel berlabel. Nanopartikel dibuat mulai dari GFP yang dilarutkan dalam 7,2 mM -arginin atau 10 mM NaHCO₃ . Bilah kesalahan menunjukkan simpangan baku yang diturunkan dari tiga pengukuran

Studi Spektroskopi

Spektroskopi Fluoresensi

Semua nanopartikel silika yang didoping GFP menunjukkan emisi maksimum yang sama (λ _em = 508 nm), yang juga sebanding dengan emisi maksimum GFP gratis (SI, File tambahan 5:Gambar S5). Untuk membandingkan intensitas fluoresensi dari berbagai nanopartikel berlabel, konsentrasi nanopartikel dinormalisasi (perhitungan dalam SI 5.). Seperti yang diharapkan, penambahan bertahap dari cangkang berlabel menyebabkan peningkatan fluoresensi nanopartikel (Gbr. 3).

Intensitas fluoresensi yang dinormalisasi dari emisi maksimum pada 508 nm, untuk masing-masing dari berbagai sistem partikel. Selanjutnya, intensitas fluoresensi teoretis (titik abu-abu ) partikel dalam kaitannya dengan peningkatan volume partikel ditunjukkan

Nanopartikel dengan inti berlabel saja, tetapi dengan cangkang yang tidak didoping, menunjukkan fluoresensi terendah. Nanopartikel dengan satu cangkang tambahan berlabel menunjukkan fluoresensi menengah, dan nanopartikel dengan dua cangkang berlabel menunjukkan fluoresensi terkuat (Gbr. 3). Hebatnya, penambahan kulit luar yang tidak didoping tampaknya sedikit mengurangi fluoresensi nanopartikel dibandingkan dengan nanopartikel yang memiliki lapisan luar yang didoping. Efek ini mungkin ditimbulkan oleh efek pelindung dari cangkang silika yang tidak berlabel. Singkatnya, penambahan cangkang yang didoping GFP ke partikel inti menyebabkan peningkatan intensitas fluoresensi nanopartikel yang dihasilkan yang tampaknya berkorelasi dengan perubahan volume yang menyertai pertumbuhan nanopartikel.

Penyematan GFP yang awalnya dilarutkan dalam -arginin setelah pemurnian menghasilkan intensitas fluoresensi 1,3 kali lipat lebih tinggi dari nanopartikel yang dihasilkan dibandingkan dengan nanopartikel yang diperoleh melalui proses penanaman analog mulai dari GFP yang dilarutkan dalam NaHCO₃ . Demikian pula, GFP yang diencerkan dalam -arginin menunjukkan intensitas fluoresensi yang lebih tinggi dibandingkan dengan GFP yang diencerkan dalam NaHCO₃ (File tambahan 5:Gambar S5). Efeknya mungkin dijelaskan oleh nilai pH yang berbeda dari buffer (pH_ʟ-arginin = 10.3, pH\( _{{\mathrm{NaHCO}}_3} \) = 9.2).

Untuk alasan ini, fluoresensi GFP murni diukur secara sistematis sebagai fungsi dari nilai pH (SI, File tambahan 6:Gambar S6). Data menunjukkan peningkatan fluoresensi berbentuk hiperbolik dengan peningkatan pH pada kisaran pH 5,5 - 10.5. Hasilnya konsisten dengan laporan lain tentang fluoresensi GFP yang bergantung pada pH. Untuk GFP tipe liar, telah dilaporkan bahwa fluoresensi tidak berubah dalam kisaran pH 6 - 10 tetapi menurun pada pH yang lebih rendah dan meningkat pada nilai pH> 10 [29]. Selain itu, sensitivitas pH GFP dapat dimodifikasi dengan pengenalan mutasi titik [30]. GFP yang digunakan dalam penelitian ini memiliki mutasi tiga titik dibandingkan dengan Aequorea protein tipe liar, yaitu S2A, F64L, S65T. Dari jumlah tersebut, substitusi serin pada posisi 65 melawan treonin telah terbukti meningkatkan intensitas fluoresensi protein, ketika tereksitasi pada 480 nm, karena asam amino ini terlibat dalam pembentukan kromofor. Selain itu, varian S65T/F64L menunjukkan fluoresensi yang bergantung pada pH [30]. Nanopartikel yang didoping GFP (C_F ) menunjukkan fluoresensi bergantung pH yang sebanding (Gbr. 3), yang menunjukkan bahwa mekanisme ketergantungan pH tidak terpengaruh oleh proses penyisipan.

Hasil Kuantum Fluoresensi

Untuk lebih mengkarakterisasi sifat-sifat nanopartikel fluoresen, hasil kuantumnya ditentukan. Ini dicapai dengan memplot intensitas fluoresensi terintegrasi versus absorbansi pada 488 nm (Gbr. 4). Selanjutnya, hasil kuantum dihitung menggunakan Persamaan. 2. Menggunakan rhodamin 6G sebagai referensi, hasil kuantum nanopartikel yang didoping GFP C_F S_1F dan GFP murni ditentukan menjadi φ\( _{{\mathrm{C}}_{\mathrm{F}}{\mathrm{S}}_{1\mathrm{F}}} \) = 0.62 dan _{GFP murni} =0,38, masing-masing. Hasilnya dikonfirmasi dengan menggunakan Atto488 sebagai referensi kedua (SI, File tambahan 7:Gambar S7). Hasil kuantum yang lebih tinggi dari nanopartikel yang didoping GFP dibandingkan dengan GFP murni tampaknya disebabkan oleh enkapsulasi GFP ke dalam matriks silika dan dapat dikaitkan dengan imobilisasi spasial protein atau lingkungan kimia yang diubah yang disediakan oleh matriks silika. .

Plot intensitas fluoresensi terintegrasi dari partikel yang didoping GFP dan GFP murni versus absorbansi pada 488 nm. Rhodamin 6G digunakan sebagai referensi. Korelasi linier dilengkapi dengan garis lurus . Persamaan linier yang sesuai adalah sebagai berikut:y _{GFP murni} = 1.00554 × 10 ¹⁰ × x , R ² = 0.97712; y\( _{C_F{S}_{1F}} \) = 6.12332 × 10 ⁹ × x , R ² = 0.99331; y _rhodamin6G = 4.1772 × 10 ⁹ × x , R ² = 0.99678

Stabilitas Partikel

Kebocoran Protein

Eksperimen pelindian dilakukan untuk membuktikan stabilitas pengikatan nanopartikel yang didoping GFP. Setelah ultrafiltrasi melalui membran dengan MWCO yang memungkinkan melewatkan GFP (MW~27 kDa) tetapi mempertahankan nanopartikel, tidak ada fluoresensi yang dapat dideteksi dalam filtrat, yang menunjukkan sambungan permanen GFP ke matriks silika.

Ultrasentrifugasi Analitis

Untuk mendukung hasil yang diperoleh dan untuk menentukan jenis ikatan GFP pada matriks partikel, dilakukan ultrasentrifugasi analitik. Untuk tujuan ini, diberi label C_F S_1F S_2F partikel dan C_U . yang tidak berlabel S_1U S_2U particles mixed with GFP were measured at the same particle and GFP concentrations. The results (Additional file 8:Figure S8 in the SI) indicate that most of the GFP molecules are embedded into the silica matrix during the synthesis.

Thermal Stability

To determine their thermal stability, the fluorescence signals of C_F in comparison to pure GFP were measured after incubation at room temperature and 60 °C respectively (Fig. 5). After 24 h at room temperature, no decrease in the fluorescence of both samples was detectable, indicating no influence on the protein stability. However, after 24 h at elevated temperature of 60 °C, only 20% of the initial fluorescence intensity of C_F could be observed, whereas no fluorescence signal of pure GFP reverted. This strongly indicates a higher thermal stability of GFP-embedded silica compared to pure GFP. Since an elevated temperature leads to a significant increase in the thermal motions of the protein molecule, which can disrupt its structure, it is hypothesised that the surrounding silica matrix protected the GFP against external influences by spatial constraints.

Influence of temperature (r.t., 60 °C) on the fluorescence of GFP-doped particles (C_F , ʟ-arginine) and pure GFP. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm versus time [h] is shown

Photostability

Furthermore, the photostability of the samples was tested. For measurements, the nanoparticle stock suspension (C_F , ʟ-arginine) was diluted tenfold. Pure GFP was diluted in ʟ-arginine according to the calculated concentration of GFP in the nanoparticle suspension. After exposure of the samples to light of a green LED array over a period of time up to 20 min, the fluorescence intensity was measured (Fig. 6). Within 20 min, the fluorescence intensity of the nanoparticle suspension decreased only slightly. After 20 min, 89% of the initial fluorescence (100%) of the nanoparticles was preserved. In comparison, the pure GFP seemed to be more affected by light exposure. After 20 min, only 81% of the initial fluorescence of pure GFP remained. This result indicated, that GFP, when embedded into silica nanoparticles, was better protected from photochemical alterations induced by the LED light than the pure protein.

Photostability of GFP-doped nanoparticles (C_F ) and pure GFP in ʟ-arginine. The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was measured after exposure to LED light for the given times. Data are mean values. Error bars indicate the standard deviation

Stability Against Protein Degradation

As a further characterisation step, the degradation of GFP in the presence of proteinase K was tested. Therefore, three different systems were used (pure GFP, unlabelled C_U S_1U S_2U mixed with GFP and labelled C_F S_1F S_2F ). For all systems, equal amounts of GFP and particles were used. After 90 min of incubation, the fluorescence intensity of pure GFP and unlabelled particles with added GFP decreased to 5 - 7% of the initial fluorescence intensity, whereas the one of the labelled particles decreased to 52% (Fig. 7). This result indicates that the GFP is protected by the silica matrix and is degraded slower than free GFP in presence of proteolytic enzymes.

Stability against protein degradation of pure GFP (grey ), unlabelled particles mixed with GFP (C_U S_1U S_2U , blue ), and GFP-doped silica nanoparticles (C_F S_1F S_2F , green ). The normalised fluorescence intensity [%] of the emission maximum at 508 nm was plotted against the incubation time [min] with proteinase K

To conclude, the encapsulation of GFP into silica matrix appeared to bring about significant advantages:The stability of the protein was increased not only against elevated temperatures and light-induced photobleaching but also against the degradation through enzymes. Therefore, the silica matrix seems to protect the embedded GFP as compared to the free GFP.

Cellular Uptake Experiments

In order to determine, if the GFP-doped nanoparticles are able to deliver their cargo into cells, uptake experiments were performed (Fig. 8). A549 cells were exposed to GFP-doped nanoparticles and for comparison to the pure protein. In order to optimise the GFP load of the particles for imaging, a higher amount of GFP as compared to the nanoparticles described before was embedded into the particles. More specifically, a 20-fold amount of GFP in ʟ-arginine was used to label the second shell of the C_F S_1F S_2F particles. These nanoparticles were diluted to a final concentration of 37 μg SiO₂ per millilitre in cell culture medium and incubated for 24 h with the cells. The amount of GFP in both samples (nanoparticles and pure GFP) was 5 μg mL ⁻¹ .

Confocal microscopy images of A549 cells after 24 h exposure to GFP dissolved in ʟ-arginine (A1 –A3 ) and GFP-doped nanoparticles C_F S_1F S_2F (B1 –B3 ), and control cells (C ). Top (1):merge-images; middle (2):Cell membrane (WGA):red; bottom (3):GFP, green . Arrows indicate internalised nanoparticles. Contrast and brightness were enhanced by using the ImageJ software

In order to visualise the cells, the cell membrane was labelled, using tetramethylrhodamine-coupled WGA (wheat germ agglutinin). Confocal imaging was used to localise the GFP-doped nanoparticles and the pure GFP in the cells. After exposure of cells to GFP, no signal related to GFP was observed inside the cell bodies (Fig. 8a). Compared to the control cells, no difference in signal intensity of both channels could be observed (Fig. 8c).

In contrast, after exposure of the cells to the GFP-loaded nanoparticles, bright fluorescence signals were detected in the perinuclear region, indicating internalisation of the loaded nanoparticles through endocytosis. The GFP-loaded nanoparticles appeared to be excluded from the nuclear compartment. A second fraction of agglomerated nanoparticles was detected on top of the cell membrane (Fig. 8b).

In conclusion, the GFP-doped nanoparticles are internalised by the cells and are able to transport their cargo into the cells. After exposure of the cells to GFP, fluorescence signals were not detected inside the cell body. This finding is in line with the results of Pesce et al. [31], who did not observe cell-associated fluorescence after incubation of A549 cells with GFP for 24 h. The lack of cell-associated GFP signals might be due to the fact that GFP is not internalised by the cells. Alternatively, GFP fluorescence might be quenched by the low pH value present in endocytic vesicles or lysosomes or degraded by proteolytic enzymes. Therefore, the fluorescence signals of the nanoparticles might indicate a protective effect of the silica nanoparticle matrix against lysosomal degradation.