Peragaan Biosensor Berbasis Grafena yang Fleksibel untuk Deteksi Sel Kanker Ovarium yang Sensitif dan Cepat
Abstrak
Sangat penting untuk mengembangkan metode deteksi dini dan prediksi yang efisien untuk kanker ovarium melalui pendekatan yang mudah dan murah. Untuk mengatasi masalah seperti itu, di sini, kami mengembangkan metode deteksi sel tumor bersirkulasi (CTC) baru untuk mendeteksi kanker ovarium secara sensitif dengan menggunakan biosensor berbasis graphene fleksibel pada substrat polietilen tereftalat (PET). Hasilnya menunjukkan bahwa biosensor fleksibel berbasis graphene menunjukkan deteksi sensitif dan cepat untuk sel kanker ovarium:ia memberikan respons berbeda yang jelas untuk media kultur sel dan larutan kanker, sel kanker berbeda dan larutan sel kanker dengan konsentrasi berbeda; itu menunjukkan sensitivitas tinggi untuk mendeteksi beberapa puluh sel kanker ovarium per ml; selain itu, biosensor graphene yang fleksibel sangat cocok untuk deteksi sel kanker ovarium secara cepat dan sensitif dalam waktu 5 detik. Karya ini memberikan strategi fabrikasi biosensor graphene berbiaya rendah dan mudah untuk mendeteksi / mengidentifikasi sel kanker ovarium CTC secara sensitif dan cepat.
Abstrak Grafis
Pengantar
Kanker ovarium adalah kanker ginekologi kedua yang paling umum dan memiliki kematian tertinggi di antara kanker ginekologi [1, 2]. Sejauh ini, pasien kanker ovarium umumnya didiagnosis sangat terlambat karena gejala kanker ovarium yang tidak spesifik dan metode skrining dini yang kurang efektif. Pencitraan yang dikombinasikan dengan antigen karbohidrat CA125 dapat digunakan dalam deteksi, mendiagnosis kekambuhan setelah pembedahan atau kemoterapi. CA125 bukanlah penanda tunggal yang akurat untuk kanker ovarium karena dipengaruhi oleh banyak faktor dan memiliki nilai prediksi positif palsu yang tinggi. Sensitivitas peningkatan CA125 (> 35 U/mL) yang kami gunakan dalam diagnosis kekambuhan kanker ovarium kurang dari 70% [3]. Pemeriksaan ultrasonografi dan pemeriksaan radiologis juga tidak memiliki sensitivitas dan spesifisitas yang memadai dalam deteksi dini dan diagnosis kekambuhan. Tingkat kelangsungan hidup 5 tahun kanker ovarium pada stadium I dan II adalah 90% dan 70% secara terpisah [4]. Meskipun kemajuan dalam perawatan bedah dan terapi adjuvant, tingkat kelangsungan hidup 5 tahun kanker ovarium pada stadium lanjut kurang dari 30% [4]. Deteksi dini kanker ovarium terkait dengan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun yang lebih tinggi, dan diagnosis awal kekambuhan juga penting. Beberapa pendekatan baru seperti autoantibodi TP53, tes metilasi DNA, algoritma microRNA, analisis sitologi seperti Pap telah dilaporkan meningkatkan sensitivitas deteksi dini kanker ovarium [5]. Namun, sangat mendesak tetapi masih menantang untuk mengembangkan metode deteksi baru dengan sensitivitas yang lebih tinggi untuk semua stadium kanker ovarium.
Baru-baru ini peneliti menemukan bahwa tumor stadium awal dapat meluruh ke dalam sel kanker ke dalam aliran darah dan menyebabkan metastasis [6]. Sel masuk ke aliran darah perifer melalui intravasasi dari tumor primer, rekurensi, atau metastasis yang disebut sel tumor sirkulasi yang dapat digunakan sebagai biomarker diagnostik atau prognostik untuk tumor padat. CTC jarang ditemukan dalam darah tepi, dan metode deteksi memerlukan sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi. Dalam beberapa tahun terakhir, pemisahan imunomagnetik, pemisahan mikofluida, metode berbasis filter, dan PCR bertarget ligan dilaporkan dalam mendeteksi CTC [8,9,10,11]. Sampai saat ini, sistem pencarian sel dari Janssen Diagnostics adalah satu-satunya metode deteksi CTC yang disetujui oleh Food and Drug Administration (FDA) AS, yang dapat digunakan untuk memantau pasien dengan kanker payudara, kolorektal, dan prostat metastatik [12,13,14]. Deteksi CTC pada kanker ovarium memberikan metode diagnostik noninvasif dan memiliki keuntungan bila sulit untuk biopsi. Namun, tingkat deteksi CTC pada stadium awal kanker ovarium masih rendah. Metode baru untuk mendeteksi CTC dengan sensitivitas yang lebih tinggi masih diperlukan. Jika kita dapat dengan mudah mendeteksi CTC pada pasien kanker ovarium, ini dapat berguna baik dalam deteksi dini tumor, pemantauan kekambuhan, dan efek pengobatan.
Graphene, semikonduktor dua dimensi diisolasi oleh Andre Geim dan Kostia Novoselov pada tahun 2004 [15]. Baru-baru ini, bahan 2D seperti graphene telah banyak diterapkan dalam penginderaan dan bio-sensing, konversi dan penyimpanan energi, katalisis, komposit dan pelapis, elektronik dan bidang biomedis [15]. Sensor graphene adalah kandidat yang menjanjikan untuk mendeteksi biomarker kanker karena strukturnya yang unik dan kinerja listrik yang sangat baik, yang telah dikembangkan untuk mendeteksi antigen karsinoembrionik, antigen spesifik prostat, antigen karbohidrat 19–9 dan 15–3 [16,17,18,19] ]. Dibandingkan dengan biosensor berbasis graphene konvensional yang dibuat pada SiO2 kaku2 /Si substrat dengan fotolitografi konvensional, penguapan elektroda, pengangkatan dan proses paket sensor menggunakan fasilitas berharga, penting untuk mengembangkan pendekatan yang murah dan mudah untuk membuat biosensor berbasis graphene fleksibel dengan sensitivitas tinggi dan kecepatan deteksi yang cepat.
Untuk mengatasi masalah seperti itu, di sini, kami mengembangkan pendekatan baru dan mudah untuk membuat biosensor fleksibel berbasis graphene pada substrat PET. Dua elektroda dibuat langsung pada graphene/PET dengan menggunakan pasta perak, dan cell pool dibuat langsung dengan menggunakan gel silikon; biosensor fleksibel ini dapat dibuat dengan tangan di laboratorium mana pun tanpa memerlukan proses fotolitografi dan fasilitas yang berharga. Anehnya, biosensor fleksibel berbasis graphene kami menunjukkan sangat sensitif dan dapat dengan cepat mendeteksi sel kanker ovarium. Sejauh yang kami ketahui, belum ada laporan tentang biosensor fleksibel berbasis graphene untuk mendeteksi sel kanker ovarium.
Bahan dan Metode
Pertumbuhan dan Transfer Film Grafena
Dalam karya ini, film graphene ditumbuhkan pada permukaan Cu foil (Alfa Aesar, No. 13382) dengan deposisi uap kimia (CVD) [20]. Pertama, oksida permukaan Cu foil dihilangkan dengan larutan asam klorida 20% selama 5 menit; kemudian, foil Cu dibersihkan dengan air de-ionisasi selama beberapa kali dan kemudian, dikeringkan dengan aliran nitrogen. Cu foil yang telah dibersihkan diletakkan di atas kuarsa boat dan dimasukkan ke dalam tabung kuarsa tungku CVD. Ruang tungku dipompa ke 1 × 10
–2
Pa. Temperatur tungku dinaikkan hingga 1000 °C selama 20 menit dengan 50 sccm 99,999% H2 , dan kemudian, 50 sccm dari 99,999% metana dimasukkan ke dalam tabung untuk pertumbuhan film graphene area besar selama 20 menit. Terakhir, tungku CVD didinginkan pada suhu kamar dengan CH4 /H2 aliran gas.
Grafena / Cu foil area besar dipotong menjadi banyak bagian yang diinginkan. Kemudian, PMMA dilapisi spin pada permukaan foil graphene/Cu, membentuk struktur seperti sandwich PMMA/graphene/Cu. Selanjutnya, foil Cu di bawahnya digores dengan 1 M FeCl3 larutan. PMMA/graphene dibersihkan dalam air DI selama 30 menit dan kemudian dipindahkan ke substrat PET. Akhirnya, PMMA dihilangkan dengan aseton, dan sampel graphene/PET diperoleh.
Fabrikasi Biosensor Berbasis Grafena
Prosedur fabrikasi biosensor berbasis graphene dijelaskan sebagai berikut. Pertama, sekitar 1 cm × 2 cm film graphene pada Cu foil dipindahkan ke substrat PET 1 cm × 2 cm dengan metode transfer basah berbantuan PMMA. Kemudian, dua elektroda dibuat di sekitar pusat film graphene/PET dengan menggunakan pasta perak. Terakhir, untuk menguji respons listrik larutan sel kanker, kumpulan sel dengan panjang dan lebar beberapa milimeter, dan tinggi sekitar 1 mm dibuat dengan gel silikon di tepi elektroda. Setelah gel silikon dari kumpulan sel benar-benar mengeras, seseorang dapat menggunakan penganalisis semikonduktor Agilent 4155B untuk memeriksa apakah biosensor graphene dapat bekerja secara normal.
Kultur Sel Kanker Ovarium SKOV3
Seri sel kanker ovarium SKOV3 (disediakan oleh laboratorium umum dari Second Affiliated Hospital of West China) dikultur dalam media lengkap RPMI-1640 (Transgen, Prancis) yang mengandung 10% serum anak sapi (MRC, USA) di bawah kondisi 5% CO 2 dan 37 °C.
Persiapan Larutan Sel dan Pengukuran Listrik
Sel-sel kanker diencerkan dengan konsentrasi tertentu dengan media kultur sel. Ambil larutan sel 50μL dengan pipet ke dalam alur untuk pengukuran. Sinyal listrik direkam oleh penganalisis semikonduktor Agilent 4155B.
Hasil dan Diskusi
Foto 10 × 10 cm
2
film graphene yang ditumbuhkan CVD area luas pada Cu foil ditunjukkan pada Gambar. 1 a. Dari Gambar 1a, orang dapat mengamati bahwa dibandingkan dengan foil Cu kosong dengan warna metalik cerah, warna graphene/Cu sedikit lebih gelap. Spektrum Raman yang sesuai dari graphene/Cu ditunjukkan pada Gambar 1b. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1b, puncak Raman pada 1580 cm
−1
dan 2680 cm
−1
sesuai dengan puncak G dan 2D film graphene. Untuk memeriksa lebih lanjut kualitas film graphene, kami telah mengukur spektrum Raman film graphene monolayer yang ditransfer ke SiO2 /Si substrat, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1c. Seseorang dapat mengamati bahwa rasio antara IG dan Aku2D lebih rendah dari 0,5, yang menegaskan bahwa ketebalan graphene adalah monolayer; kita juga dapat mengamati bahwa puncak D sangat rendah dan hampir tidak dapat diamati, yang menunjukkan bahwa kualitas film graphene sangat tinggi dan cacatnya sangat sedikit.
a Foto Cu foil telanjang (panel kiri) dan graphene yang ditanam pada Cu foil (panel kanan), b Spektrum Raman dari graphene/Cu, dan c Spektrum Raman dari graphene/SiO2 /Si
Foto-foto biosensor graphene fleksibel pada substrat PET ditunjukkan pada Gambar 2. Solusi sel kanker dapat ditambahkan ke dalam cell pool, dan sinyal listrik biosensor graphene dapat diperoleh dari dua elektroda pasta perak. Respon listrik untuk media kultur sel, dan larutan CTC diukur.
Foto biosensor graphene/PET
Ketergantungan waktu dari respons arus untuk cairan tersebut dicatat pada tegangan tetap 0,01 V sebelum dan sesudah memasukkannya ke dalam kumpulan sel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3, orang dapat mengamati bahwa sebelum mencelupkan cairan tersebut, arus tetap konstan; ketika cairan tersebut dimasukkan ke dalam kolam sel, arus dengan cepat berkurang dan kemudian perlahan-lahan menjaga keseimbangan baru. Tanggapan didefinisikan sebagai η = (Aku0Aku )/Saya0 *100%, di mana Saya0 adalah arus sesaat sebelum mencelupkan cairan, dan I adalah nilai maksimal (atau minimal) setelah mencelupkan cairan pada suatu waktu. Orang dapat melihat bahwa setelah seseorang memasukkan cairan seperti itu, resistensi grafem meningkat. Respon listrik untuk media kultur sel telanjang, dan larutan CTC sebelum dan sesudah larutan pencelupan 200 detik berturut-turut adalah 2,96%, dan 37,04%. Jelas, dibandingkan dengan media kultur sel telanjang, respons listrik untuk larutan CTC bahkan dengan 30 sel/ml sangat signifikan, yang menunjukkan bahwa biosensor berbasis graphene fleksibel sangat sensitif untuk deteksi sel kanker.
a Respons listrik untuk media kultur sel telanjang, dan b solusi kanker dengan 30 sel
Ketergantungan waktu sinyal listrik untuk media kultur sel telanjang dan larutan CTC dengan 30 sel kanker/ml dianalisis lebih lanjut dari Gambar. 3. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, orang dapat mengamati bahwa dibandingkan dengan media kultur sel kosong, tegangan listrik respon untuk solusi CTC (bahkan 30 sel/ml) sangat sensitif dan cepat. Setelah larutan sel dicelupkan, hanya perlu 2.1, 2.0, 4.5, 7.5, 10.5, 28.5 untuk mencapai respon 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, sedangkan respon kultur sel yang sesuai sedang hanya meningkat dari 0,15 menjadi 1,3%. Artinya, biosensor graphene fleksibel sangat cocok untuk deteksi cepat dan sensitif dalam 5 dtk.
Ketergantungan waktu respons listrik untuk media kultur sel dan larutan CTC
Kami menyelidiki lebih lanjut respons listrik untuk dua jenis sel kanker CTC (sel SUDHL8 dan sel OCILYS) dengan konsentrasi 10.000 (10 K)/ml yang sama. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, ketergantungan waktu arus untuk dua sel kanker yang berbeda dengan tren yang sedikit berbeda dan perbedaan besar dalam respons listrik. Artinya, biosensor graphene menjanjikan untuk digunakan untuk mengidentifikasi sel kanker yang berbeda.
Ketergantungan waktu respon listrik untuk sel kanker yang berbeda:a SUDHL8, dan b OCILYS
Ketergantungan waktu arus listrik dan respons untuk larutan sel kanker SUDHL 8 dengan berbagai konsentrasi sel 10.000 (10 K)/ml dan 100 K/ml juga telah diselidiki. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, seseorang dapat mengamati bahwa larutan dengan larutan konsentrasi sel kanker yang lebih rendah menunjukkan arus yang lebih tinggi, yang menunjukkan bahwa sel kanker cenderung menjadi penyekat dan lebih banyak sel yang tidak bermanfaat untuk konduktif. Ketergantungan waktu respons untuk dua larutan konsentrasi menunjukkan tren perubahan yang serupa dan respons untuk larutan konsentrasi rendah sedikit lebih tinggi daripada larutan konsentrasi tinggi. Hasil ini menunjukkan bahwa biosensor dapat digunakan untuk mengidentifikasi larutan kanker dengan konsentrasi yang berbeda.
Ketergantungan waktu arus listrik (a ) dan tanggapan (b ) untuk sel kanker SUDHL8 dengan konsentrasi 10 K dan 100 K sel/ml yang berbeda
Seperti disebutkan di atas, hasil menunjukkan bahwa biosensor berbasis graphene yang murah dan fleksibel menunjukkan respons yang berbeda untuk media kultur sel dan larutan kanker, sel kanker yang berbeda dan larutan sel kanker dengan konsentrasi yang berbeda, yang menunjukkan bahwa biosensor berbasis graphene fleksibel tersebut menjanjikan untuk menjadi digunakan untuk mendeteksi dan mengidentifikasi sel kanker ovarium CTC.
Kesimpulan
Untuk mengembangkan metode deteksi dini yang efisien khususnya untuk kanker ovarium, kami mengembangkan biosensor fleksibel berbasis graphene yang sangat sederhana pada substrat PET. Biosensor fleksibel ini terdiri dari kumpulan sel dan dua elektroda dan membandingkan sinyal listrik sebelum dan sesudah menambahkan larutan sel, yang menunjukkan sensitivitas tinggi dan kecepatan deteksi yang cepat. Ini menunjukkan respon yang berbeda untuk media kultur sel dan larutan kanker, sel kanker yang berbeda dan larutan sel kanker dengan konsentrasi yang berbeda. Pekerjaan kami menunjukkan bahwa biosensor berbasis graphene fleksibel menjanjikan untuk digunakan untuk mendeteksi/mengidentifikasi sel kanker ovarium CTC secara sensitif dan cepat.
Ketersediaan Data dan Materi
Penulis dapat mengonfirmasi bahwa semua data yang relevan disertakan dalam artikel dan file informasi tambahannya.
