Imunosupresi yang diinduksi sepsis diakui sebagai salah satu fitur utama yang bertanggung jawab atas kegagalan terapi. Sel penekan turunan myeloid (MDSCs), yang terutama dicirikan oleh sifat supresifnya, telah dilaporkan berkembang pada sepsis. Ferumoxytol (FMT), suplemen zat besi yang disetujui FDA, telah terbukti memiliki sifat modulator imun pada tumor. Namun, tidak jelas apakah FMT mengubah fungsi MDSC untuk mengurangi imunosupresi sepsis akhir. Di sini, kami menunjukkan efek imunomodulator FMT pada MDSC untuk memperbaiki imunosupresi yang diinduksi lipopolisakarida (LPS) pada tahap akhir sepsis. Pemisahan sel dengan FMT yang diinternalisasi dan deteksi kandungan besi intraseluler menunjukkan bahwa MDSC dapat menyerap FMT. FMT dosis rendah tidak berpengaruh pada viabilitas sel MDSC, tetapi FMT menghambat perluasan MDSC secara in vitro. Selain itu, FMT secara signifikan menurunkan regulasi tingkat ekspresi Arg-1, S100A8, S100A9, dan p47phox serta produksi ROS di MDSC. FMT menurunkan persentase MDSC granulositik (G-MDSCs) dan mempromosikan diferensiasi MDSC menjadi makrofag. Selanjutnya, FMT mengurangi perekrutan sel darah putih dan penebalan dinding alveolar di paru-paru dan area nekrosis di hati serta beberapa penanda biokimia disfungsi hati. FMT menurunkan persentase G-MDSC dan MDSC monositik (M-MDSC) dalam limpa tikus septik yang diinduksi LPS. Sebagai catatan, FMT mengurangi fungsi imunosupresif sel T dari G-MDSC dan M-MDSC. Diharapkan, FMT juga secara signifikan mengurangi ekspresi gen Arg-1 dan p47phox pada CD11b limpa + Gr-1 + sel yang diisolasi dari tikus yang ditantang LPS. Data ini menunjukkan bahwa FMT menurunkan fungsi imunosupresif MDSC dengan menurunkan produksi Arg-1 dan ROS, menunjukkan bahwa FMT dapat mengurangi imunosupresi jangka panjang pada tahap akhir sepsis.
FMT, suplemen zat besi yang disetujui oleh Food and Drug Administration, telah digunakan untuk mengobati anemia defisiensi besi pada orang dewasa dengan penyakit ginjal kronis (CKD) [1], dan FMT juga banyak digunakan sebagai agen kontras dan pembawa obat [2] . Studi sebelumnya menunjukkan bahwa FMT memiliki sifat imunomodulator, seperti kemampuannya untuk menginduksi pergeseran fenotip pada makrofag M2 menuju CD86 yang tinggi + , subtipe makrofag M1 TNF-α positif [3, 4]. Namun, efek FMT pada sel kekebalan lainnya belum diteliti.
MDSCs adalah populasi heterogen sel myeloid imatur dengan kapasitas penekan kekebalan yang kuat [5]. Pada tikus, MDSC dapat diidentifikasi sebagai Gr-1 + CD11b + sel, sedangkan MDSC manusia tidak memiliki homolog Gr-1 dan didefinisikan sebagai CD14 − HLA-DR − CD11b + CD33 + atau CD14 + HLA-DR − CD11b + CD33 + sel [6]. MDSCs terdiri dari dua kelompok besar sel, granulocytic atau PMN-MDSCs dan M-MDSCs, dan kedua populasi memiliki fungsi penekan imun melalui produksi iNOS, ROS, dan Arg-1. Peningkatan aktivitas Arg-1 menghabiskan l-arginin, dan kekurangan l-arginin menghambat proliferasi sel T dengan menurunkan ekspresi rantai zeta CD3. INOS menghasilkan NO, yang menghambat fungsi JAK3 dan STAT6 dalam sel T, serta ekspresi MHC II. ROS menginduksi modifikasi pascatranslasi reseptor sel T dan dapat menyebabkan sel T spesifik antigen tidak responsif [7]. M-MDSC muncul dari prekursor monosit dan dapat berdiferensiasi menjadi makrofag dan DC dalam kondisi sitokin yang sesuai. Sebagian besar pengetahuan kita tentang MDSC berasal dari studi kanker. Dalam beberapa tahun terakhir, perluasan MDSCs juga telah dijelaskan pada penyakit inflamasi akut dan kronis termasuk peradangan, luka bakar dan penyakit autoimun [8, 9]. Baru-baru ini, tingkat tinggi serapan nanopartikel fluoresen oleh MDSCs di kerongkongan dan limpa tikus dilaporkan dalam studi pencitraan [10]. Namun, tidak jelas apakah FMT mengubah fungsi MDSC yang terlibat dalam perkembangan penyakit inflamasi.
Sepsis, respon inflamasi pejamu yang tidak teratur terhadap infeksi berat yang dapat menyebabkan disfungsi organ yang mengancam jiwa adalah penyebab kematian paling umum di unit perawatan intensif. Sepsis memulai respons proinflamasi yang luar biasa yang, jika tidak diobati dini, dengan cepat berubah menjadi imunosupresi jangka panjang. Perluasan MDSCs telah dijelaskan dalam limpa dan kelenjar getah bening pada model hewan septik [8, 11], serta pada pasien dengan sepsis [12,13,14]. Aktivasi sel imunosupresif seperti MDSC sangat penting untuk kontrol yang tepat dari hiperresponsif sistem imun bawaan, tetapi ekspansi berlebih mereka dapat menyebabkan hiperimunosupresi, yang merupakan kekuatan pendorong utama untuk infeksi sekunder dan kematian pada sepsis lanjut. Peningkatan jumlah MDSC berkorelasi dengan penekanan proliferasi limfosit. Telah dilaporkan bahwa MDSC memperoleh fenotipenya di sumsum tulang dan kemudian bermigrasi ke organ limfoid sekunder untuk menghambat respons sel T dan menekan proliferasinya pada tikus yang mengalami imunosupresi LPS [8]. Sebagian besar pasien dengan sepsis yang berkepanjangan menunjukkan status imunosupresif, dan sebagian besar kematian sepsis disebabkan oleh imunosupresi sepsis lanjut. Menghilangkan MDSC mungkin memiliki efek menguntungkan pada sepsis lanjut dengan memulihkan respon imun [15]. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa FMT dapat memodulasi fungsi MDSC untuk mengurangi imunosupresi sepsis akhir.
Di sini kami menunjukkan efek imunomodulator FMT pada MDSC. Kami menggunakan sifat magnetik FMT untuk mengungkapkan bahwa MDSC mampu memfagositosis FMT secara in vitro. Selain itu, kami menemukan bahwa FMT melemahkan fungsi imunosupresif MDSC melalui downregulasi Arg-1 dan ROS. Lebih lanjut, percobaan in vivo menegaskan bahwa FMT memperbaiki tahap akhir sepsis yang diinduksi LPS pada tikus dengan melemahkan kemampuan MDSC untuk menghambat sel T. Data kami menunjukkan bahwa fungsi imunomodulator FMT dapat digunakan untuk mengobati imunosupresi yang terjadi pada sepsis lanjut.
Tikus jantan C57BL/6 (berusia 8–10 minggu) dibeli dari Model Animal Research Center Universitas Nanjing (Nanjing, China). Tikus-tikus itu dibesarkan dalam kondisi bebas patogen spesifik (SPF) pada siklus terang/gelap 24 jam dan diizinkan akses gratis ke makanan dan air. Semua eksperimen dengan tikus telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional Universitas Nanjing.
Distribusi FMT intraseluler terdeteksi menggunakan kit pewarnaan biru Prusia Perl (Solarbio, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sel difiksasi dalam paraformaldehida 4% selama 15 menit, dan kemudian diinkubasi dengan 10% kalium ferrosianida selama 25-30 menit, diikuti dengan pencucian dan pewarnaan ulang dengan nuklir cepat merah selama 10 menit. Sel yang mengandung partikel biru dalam sitoplasma positif untuk pewarnaan biru Prusia.
Sel sumsum tulang diperoleh dengan membilas tulang paha dan tibia tikus tipe liar diikuti dengan lisis RBC. Sel-sel sumsum tulang dikultur dalam media RPMI-1640 lengkap dengan 10% FBS, 1% v/v penisilin dan streptomisin (Gibco, CA), 40 ng/mL granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Jerman) dan 40 ng/mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Jerman) pada 37 °C dalam 5% CO2 inkubator selama 4 hari. Sel yang tidak patuh dikumpulkan untuk eksperimen lebih lanjut.
Viabilitas sel dianalisis menggunakan Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Jepang) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, MDSC (5 × 10 3 ) dimasukkan ke dalam pelat kultur 96-sumur dan diinkubasi dalam 5% CO2 atmosfer pada 37 °C sebelum perawatan. Media kemudian diganti dengan media segar yang mengandung berbagai konsentrasi FMT (250, 500, 1000, 2000 μg/mL) selama 24 h. Supernatan kemudian dibuang dan media segar yang mengandung larutan CCK-8 ditambahkan. Setelah diinkubasi pada 37 °C selama 3 jam, absorbansi diukur pada 450 nm menggunakan pembaca pelat mikro Gen5 (BioTek, USA).
Total RNA diekstraksi dari sel menggunakan reagen TRIzol (Invitrogen, USA) dan diukur dengan Nanodrop Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) sebelum ditranskripsi terbalik menggunakan HiScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Reaksi rantai polimerase kuantitatif (PCR) real-time dilakukan menggunakan SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) pada sistem qPCR real-time StepOne-Plus Applied Biosystems (Applied Biosystems, Forster City, CA). Ekspresi gen dinormalisasi ke GAPDH menggunakan 2 −ΔΔCt metode. Urutan primer tercantum dalam file tambahan 1:Tabel S1.
Jaringan disiapkan sebagai suspensi sel tunggal dengan kolagenase tipe D (1 mg/mL) dan DNase I (0,1 mg/mL) dalam Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) pada 37 °C selama 30 menit, dan kemudian sel darah merah dari limpa dilisiskan. Suspensi sel disaring melalui saringan sel 70 m, dan limfosit dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 300 g selama 5 menit pada suhu 4 ° C. Setelah dicuci, sel segera disiapkan untuk penyortiran sel yang diaktifkan fluoresensi. Sel tunggal diinkubasi dengan reagen penghambat FcR (Miltenyi Biotech, Jerman) selama 10 menit, diikuti dengan pewarnaan dengan konjugat antibodi berikut selama 20 menit:anti-CD11b berlabel FITC, anti-CD11c, anti-CD4 dan anti-CD8; anti-Ly6G berlabel PE; Anti-Ly6C berlabel APC, anti-CD3, anti-F4/80 dan anti-MHC II (BioLegend, CA). Setelah dicuci, sel dideteksi dengan FACS Calibur (BD, CA) dan data dianalisis menggunakan FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA)
Jaringan hati dan paru-paru difiksasi dalam formaldehida buffer fosfat 4%. Jaringan tetap tertanam dalam parafin, dan bagian setebal 5 m diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk mikroskop cahaya.
Tingkat serum TNFα, MCP-1, dan IL-1β ditentukan menggunakan kit ELISA spesifik (Dakewe, China) sesuai dengan instruksi pabrik. Setiap sampel dijalankan dalam rangkap dua.
ROS intraseluler diukur menggunakan kit 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) (Beyotime, China ) sesuai dengan instruksi pabrik. Secara singkat, sel-sel dicuci dua kali dengan PBS dan diinkubasi dengan 5 μM DCFH-DA pada 37 °C dalam gelap selama 30 menit, kemudian dicuci dengan media RPMI-1640 dan disuspensikan kembali dalam PBS. Sel dianalisis untuk fluoresensi hijau intraseluler menggunakan flow cytometer (BD, CA).
Jumlah CD3 + Sel T diperkaya dari limpa tikus tipe liar menggunakan kit CD3ε MicroBead (Miltenyi Biotech, Jerman) dan pewarnaan CFSE yang diinkubasi (Invitrogen, USA). Untuk proliferasi sel T yang diinduksi antibodi anti-CD3/CD28, sel T diaktifkan dengan antibodi anti-CD3 (1 μg/mL) dan antibodi anti-CD28 (1 μg/mL). G-MDSC (Gr-1 tinggi Ly-6G + ) dan M-MDSC (Gr-1 redup Ly-6G − ) diisolasi dari limpa tikus yang diobati dengan FMT atau yang dirawat dengan kendaraan menggunakan kit Isolasi Sel Penekan Berasal Myeloid (Miltenyi Biotech, Jerman) sesuai dengan instruksi pabrik. MDSC dikultur bersama pada rasio 1:1 dengan CD3 berlabel CFSE + Sel T di pelat dasar datar 96 sumur selama 3 hari. CFSE dibagi rata di antara sel anak dengan setiap divisi; oleh karena itu, proliferasi ditentukan oleh flow cytometry. Kemurnian sel setelah penyortiran adalah> 90%.
Semua statistik dihitung menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) dan disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi (SD). Perbedaan antara dua kelompok dianalisis oleh Mann–Whitney U menguji atau tidak berpasangan, siswa dua sisi t tes. ANOVA satu arah digunakan untuk perbandingan beberapa kelompok. Semua percobaan diulang setidaknya tiga kali. Perbedaan dengan p nilai <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Untuk memverifikasi apakah sel-sel dengan FMT yang diinternalisasi dipisahkan oleh MACS MicroBeads, kami menggunakan pewarnaan biru Prusia untuk mendeteksi kandungan besi intraseluler dalam makrofag yang diobati dengan FMT (1000 ng/mL) selama 24 h. Sel-sel dibagi menjadi tiga kelompok:sebelum pemisahan magnetik, sel-sel FMT-positif yang dipilih secara magnetis (FMT+), dan sel-sel yang tidak diisolasi secara magnetis (FMT-). Pewarnaan biru Prusia menunjukkan bahwa sebagian besar sel yang dipilih secara magnetis adalah positif biru Prusia (Gbr. 1a). Untuk membandingkan kemampuan memfagositosis FMT antara MDSC, makrofag, dan DC, kami mengisolasi splenosit dari tikus C57BL/6 naif yang diobati dengan FMT selama 6 h, 12h, 24h, dan 48h. Splenosit dibagi menjadi dua himpunan bagian:sebelum pemisahan magnetik dan sel FMT-positif. Analisis flow cytometric mengungkapkan bahwa hampir 60% MDSC dan lebih dari 60% makrofag mengakumulasi FMT setelah 12-48 h (Gbr. 1b, c). Hanya sekitar 40% DC yang FMT-positif pada 24 jam. Data ini menunjukkan bahwa seperti halnya makrofag, MDSC dapat menyerap FMT dan menyarankan bahwa FMT dapat memengaruhi fungsi MDSC.
Kemampuan MDSC, makrofag, dan DC untuk menyerap FMT. a Makrofag diperlakukan dengan FMT (1000 ng/mL) selama 24 jam, kemudian diwarnai dengan biru Prusia untuk memastikan keberadaan seluler dan pengendapan besi di antara tiga kelompok:sebelum pemisahan magnetik, dipilih secara magnetis (FMT+), tidak diisolasi secara magnetis (FMT-) . b Splenosit dari tikus naif C57BL/6 diinkubasi dengan FMT selama 6 jam, 12 jam, 24 jam, dan 48 jam. Analisis FACS persentase MDSC, makrofag, dan DC dalam dua himpunan bagian:sebelum pemisahan magnetik, sel FMT-positif. c Rasio sel FMT-positif ke sel sebelum pemisahan magnetik. Semua data mewakili tiga eksperimen independen untuk setiap kelompok eksperimen dan ditampilkan sebagai rata-rata ± standar deviasi
Telah dilaporkan bahwa FMT menginduksi pergeseran fenotip dalam makrofag M2 menuju CD86 yang tinggi + , subtipe makrofag M1 TNF-α positif [3]. Karena ada sejumlah besar MDSC yang dapat menggunakan FMT, kami berhipotesis bahwa FMT dapat mengubah fungsi MDSC. Pertama, efek sitotoksik FMT pada 250, 500, 1000, dan 2000 g/mL pada MDSC dievaluasi dengan uji viabilitas sel CCK8. Hasil penelitian menunjukkan bahwa FMT tidak berpengaruh pada viabilitas sel pada dosis rendah dan hanya menunjukkan sitotoksisitas sedang pada dosis maksimum 2000 g/mL (Gbr. 2a). Kami kemudian menguji apakah FMT pada konsentrasi yang berbeda akan mempengaruhi generasi MDSC. Sel sumsum tulang yang diisolasi dari tikus naif C57BL/6 diobati dengan FMT dengan konsentrasi sedang atau bervariasi (250, 500, 1000, dan 2000 μg/mL) selama 4 hari, diikuti dengan karakterisasi dengan flow cytometry pada hari ke-4. IL-6 ditambahkan pada hari 0. Hasil dari tiga percobaan independen mengungkapkan bahwa FMT pada 1000 dan 2000 μg/mL secara signifikan menurunkan perluasan MDSC (Gbr. 2b, c).
Kuantifikasi aliran cytometric dari persentase CD11b + Gr-1 + sel setelah pengobatan dengan FMT pada 250, 500, 1000, 2000 μg/mL in vitro. a Viabilitas sel MDSC terdeteksi menggunakan uji CCK8 setelah perawatan dengan berbagai konsentrasi FMT selama 24 jam. b , c Sel sumsum tulang yang diisolasi dari tikus C57BL/6 dikultur selama 4 hari dengan GM-CSF dan IL-6 dengan adanya konsentrasi FMT yang berbeda, dan fenotipe sel dievaluasi dengan flow cytometry. Semua data mewakili tiga eksperimen independen untuk setiap kelompok eksperimen dan ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 sebagaimana ditentukan oleh t . Siswa yang tidak berpasangan uji versus sel yang dirawat dengan kendaraan saja
MDSC menggunakan beberapa mekanisme untuk menghambat proliferasi dan fungsi efektor sel T, dengan yang paling baik digambarkan sebagai produksi ROS dan Arg-1. Ekspresi komponen p47phox dari kompleks nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase (NOX) bertanggung jawab untuk produksi ROS di MDSCs [5]. Dilaporkan bahwa S100A8/A9 disintesis dan disekresikan oleh MDSCs dalam loop inflamasi autokrin dan bahwa ini penting dalam penekanan fungsi sel dendritik pada model tikus [16]. Untuk menentukan apakah FMT dapat mengubah fungsi MDSC, kami memperoleh MDSC yang diturunkan dari BM seperti yang dijelaskan sebelumnya dan menggunakan RT-PCR untuk mengukur ekspresi mRNA dalam MDSC yang diobati dengan FMT versus kontrol yang tidak diobati. Hasilnya mengungkapkan bahwa MDSC yang diobati dengan FMT secara signifikan menurunkan regulasi tingkat ekspresi Arg-1, S100A8, S100A9, dan p47phox dibandingkan dengan MDSC yang tidak diobati (Gbr. 3a-h). Selanjutnya, kami mengevaluasi level ROS dalam kontrol MDSC dan MDSC yang diobati dengan FMT. Hasilnya mengungkapkan bahwa MDSC yang diobati dengan FMT menunjukkan tingkat ROS yang jauh lebih rendah daripada sel kontrol (Gbr. 3i, j). Kami kemudian membandingkan perubahan subpopulasi MDSC pada kelompok yang diobati dengan FMT dan yang tidak diobati. Hasil menunjukkan bahwa FMT menurunkan persentase G-MDSC, dengan sedikit peningkatan M-MDSC juga diamati (Gbr. 3k, l).
FMT mengubah fungsi MDSC secara in vitro. MDSC yang diturunkan dari sumsum tulang diobati dengan kendaraan atau FMT selama 24 jam. a –h Ekspresi gen Arg-1, S100A8, S100A9, dan p47phox dari MDSC yang diobati yang diukur dengan RT-PCR kuantitatif. saya MDSC yang diturunkan dari BM diinkubasi dengan FMT selama 24 jam dan produksi ROS dideteksi oleh FCM. j Data kuantitatif i . k Subpopulasi MDSC dalam kelompok yang diobati dengan FMT dan kelompok kontrol. l Analisis FACS dari persentase G-MDSCs dan M-MDSCs. Semua data mewakili tiga eksperimen independen untuk setiap kelompok eksperimen dan ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi. *p <0,05, **p <0,01, ***p <0,001 sebagaimana ditentukan oleh t . Siswa yang tidak berpasangan uji versus sel yang dirawat dengan kendaraan saja
Untuk menentukan apakah FMT merangsang diferensiasi akhir MDSC menjadi makrofag, kami memperlakukan sel dengan 1000 μg/mL FMT pada hari ke 0 dan melakukan flow cytometry untuk penanda terkait makrofag CD11b dan F4/80 pada hari 1, 3, dan 5. hasil menunjukkan bahwa 1 hari setelah penambahan 1000 μg/mL FMT proporsi makrofag meningkat secara signifikan lebih dari 2 kali lipat dibandingkan dengan sel yang tidak diobati. Demikian pula, 3 hari dan 5 hari setelah pengobatan dengan FMT, proporsi makrofag juga meningkat secara signifikan (Gbr. 4a, b).
Pengaruh FMT pada diferensiasi MDSCs. a , b MDSC yang berasal dari sumsum tulang diobati dengan atau tanpa 1000 μg/mL FMT dan jumlah makrofag dinilai setelah 1 hari, 3 hari, dan 5 hari oleh FACS. Semua data mewakili tiga eksperimen independen untuk setiap kelompok eksperimen dan ditampilkan sebagai mean ± standar deviasi. *p <0,05, versus sel yang diobati dengan kendaraan saja
Telah dilaporkan bahwa sepsis dikaitkan dengan kerusakan jaringan dan menyebabkan kegagalan organ dan disfungsi endotel [17]. Untuk menyelidiki apakah FMT mengurangi gejala sepsis lanjut, tingkat kerusakan organ pada tikus percobaan dievaluasi setelah 10 hari. Pemeriksaan histopatologi paru-paru pada sepsis yang diinduksi LPS menunjukkan bahwa FMT mengurangi perekrutan sel darah putih dan penebalan dinding alveolar dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan kendaraan. Pewarnaan H&E juga mengungkapkan bahwa area nekrosis hati lebih kecil pada tikus yang diobati dengan FMT dibandingkan dengan tikus yang diobati dengan kendaraan (Gbr. 5a, b). Selain itu, kadar serum aspartat transaminase, yang digunakan sebagai penanda biokimia disfungsi hati pada hewan ini, secara signifikan lebih rendah pada hati tikus yang diobati dengan FMT dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 5c). Namun, FMT tidak mempengaruhi tingkat alanine aminotransferase (Gbr. 5d). Lebih lanjut, sepsis dianggap berhubungan dengan hasil yang merugikan seperti peningkatan produksi sitokin inflamasi; oleh karena itu, kami menilai perubahan kadar sitokin proinflamasi dalam serum. Tingkat TNF-α dalam serum sedikit, tetapi tidak signifikan, lebih rendah pada tikus yang diobati dengan FMT pada 3 jam setelah injeksi LPS, dan tidak ada perbedaan kadar MCP-1 atau IL-1 yang diamati antara tikus yang diobati dengan FMT dan kendaraan. -tikus yang dirawat (Gbr. 5e–g).
FMT memperbaiki cedera hati pada tikus septik yang diinduksi LPS a Tikus menerima PBS atau i.p. injeksi 5 mg/kg berat badan bakteri LPS pada hari 0. Setelah 1 h dan 5hari, FMT dengan dosis 10 mg/kg atau 100 μL saline diberikan melalui vena ekor. Tikus dibagi menjadi empat kelompok (n =6):kendali, kendaraan penerima; LPS, hanya menerima LPS; FMT, hanya menerima FMT; dan LPS + FMT, menerima LPS dan FMT. b Jaringan paru-paru dan hati diwarnai dengan hematoxylin dan eosin. c-d Serum transaminase (ALT dan AST) diukur (n =6). Kadar sitokin (TNF-a, IL-1β dan MCP-1) diukur dengan ELISA. e -g Efek sepsis yang diinduksi LPS pada produksi sitokin pada tikus kendaraan atau yang diobati dengan ferumoxytol. Kadar sitokin diukur dengan ELISA dalam serum tikus kendaraan atau tikus yang diberi ferumoxytol setelah i.p. Tantangan LPS (50 mg/kg). **p <0,01 seperti yang ditentukan oleh t . Siswa yang tidak berpasangan tes
Banyak bukti mendukung bahwa imunosupresi terkait sepsis meningkatkan mortalitas [18], dan MDSCs dianggap sebagai komponen utama dari jaringan imunosupresif [8]. Telah dilaporkan bahwa G-MDSCs lebih spesifik diperluas pada pasien sepsis dan tampaknya menjadi aktor utama dari penekanan imun yang diinduksi sepsis [12]. Untuk menentukan apakah FMT memodulasi populasi MDSC pada tikus tipe liar, tikus C57BL/6 diberikan FMT melalui vena ekor pada jam 1 dan hari 5. Hasil penelitian menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan dalam persentase MDSC yang terdeteksi di limpa atau tulang. sumsum antara kontrol dan tikus yang diobati dengan FMT (Gbr. 6a, e). Sebagai catatan, FMT menurunkan ekspansi CD11b yang bergantung pada LPS + Gr-1 + sel di sumsum tulang dan limpa (Gbr. 6a, e), yang konsisten dengan studi in vitro. Selain itu, FMT juga menurunkan persentase G-MDSC dan M-MDSC di limpa, sementara hanya persentase G-MDSC yang menurun di sumsum tulang (Gbr. 6c, g). Data ini menunjukkan bahwa FMT menurunkan jumlah MDSC di limpa tikus septik yang diinduksi LPS.
FMT menurunkan jumlah MDSC pada tikus septik yang diinduksi LPS. Tikus dibagi menjadi empat kelompok (n =6):kendali, kendaraan penerima; LPS, hanya menerima LPS; FMT, hanya menerima FMT; dan LPS + FMT, menerima LPS dan FMT. a CD11b + Gr-1 + populasi sel di sumsum tulang terdeteksi oleh FACS. b Data kuantitatif dari a . c Alur cytometry dot plot ekspresi Ly6C dan Ly6G dalam CD11b yang terjaga keamanannya + sel dari limpa. d Kuantifikasi persentase subset granulositik dan monosit. e CD11b + Gr-1 + populasi sel di limpa terdeteksi oleh FCM. f Data kuantitatif e . g Alur cytometry dot plot ekspresi Ly6C dan Ly6G dalam sel CD11b+ yang terjaga keamanannya dari limpa. h Kuantifikasi persentase subset granulositik dan monosit. *p <0,05 seperti yang ditentukan oleh t . Siswa yang tidak berpasangan tes
Pengurangan numerik dari beberapa populasi sel imun, termasuk sel T CD4 dan CD8, merupakan karakteristik utama dari respon imun adaptif setelah sepsis. Hal ini terkait dengan peningkatan risiko kematian, serta hasil buruk lainnya [19, 20]. Telah ditunjukkan bahwa MDSCs menekan proliferasi sel T dengan merusak ekspresi rantai zeta sel T pada pasien sepsis [21]. Untuk mengevaluasi proporsi limfosit pada sepsis stadium akhir, kami mengukur proporsi sel T CD4 dan CD8 dalam model sepsis murine. Hasil penelitian menunjukkan bahwa FMT menyebabkan peningkatan sel T CD4 dan CD8 di limpa tikus yang diinduksi LPS (Gbr. 7a, b). Tidak ada perbedaan persentase sel T CD4 dan CD8 pada limpa tikus yang diobati dengan FMT dibandingkan dengan tikus kontrol (Gbr. 7a, b). Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut peran MDSC dalam menekan proliferasi sel T in vivo, G-MDSC dan M-MDSC diisolasi dari limpa kendaraan atau tikus yang ditantang LPS yang diobati dengan FMT oleh MACS dan dikultur bersama dengan sel T CD3 pada 1:1 perbandingan. Hasil kami menunjukkan bahwa pengobatan FMT mengurangi fungsi imunosupresif sel T dari G-MDSCs dan M-MDSCs (Gbr. 7e, f). Lebih lanjut, kami juga mengukur tingkat ekspresi Arg-1 dan p47phox dalam MDSC yang diisolasi dari limpa tikus. Seperti yang diharapkan, ekspresi gen Arg-1 dan p47phox berkurang secara signifikan pada CD11b limpa + Gr-1 + sel yang diisolasi dari tikus yang ditantang LPS yang diobati dengan FMT bila dibandingkan dengan tikus yang ditantang LPS (Gbr. 7g, h). Data ini menunjukkan bahwa FMT menurunkan fungsi imunosupresif MDSC dengan menurunkan produksi Arg-1 dan ROS, menunjukkan bahwa FMT dapat mengurangi imunosupresi jangka panjang pada sepsis stadium lanjut.
FMT mengurangi sifat imunosupresif MDSC. a CD3 + CD4 + populasi sel di limpa terdeteksi oleh FACS. b Data kuantitatif dari a . c CD3 + CD8 + populasi sel di limpa terdeteksi oleh FACS. d Data kuantitatif dari a . e Kemampuan G-MDSC dari tikus untuk menekan proliferasi sel T yang diinduksi oleh stimulasi anti-CD3/CD28 diukur dengan FACS (n =3 per kelompok). Sebuah histogram representatif ditampilkan. f Kemampuan M-MDSC dari tikus yang ditantang LPS yang diobati dengan kendaraan atau FMT untuk menekan proliferasi sel T yang diinduksi oleh stimulasi anti-CD3/CD28 diukur dengan FACS (n =3 per kelompok). Sebuah histogram representatif ditampilkan. g , h Ekspresi mRNA Arg-1 dan p47phox dalam MDSC dari kendaraan atau tikus yang ditantang LPS yang diobati dengan FMT
Suplemen zat besi FMT yang disetujui FDA telah banyak digunakan sebagai pembawa obat dan agen kontras dalam pemindaian MRI. Ditemukan bahwa FMT menghambat pertumbuhan kanker dengan menginduksi respon imun proinflamasi dengan polarisasi makrofag M1, menunjukkan bahwa FMT memiliki fungsi modulasi imun. Dalam penelitian ini, kami mengevaluasi efek FMT pada MDSC dengan membandingkan fenotipe dan fungsi MDSC yang diobati dengan FMT dengan kontrol MDSC yang tidak diobati. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa MDSC mampu mengambil nanopartikel magnetik [10], dan data kami lebih lanjut menunjukkan bahwa FMT melemahkan fungsi imunosupresif MDSC di limpa melalui downregulasi Arg-1 dan ROS. Data kami juga menunjukkan bahwa FMT memiliki efek langsung pada diferensiasi MDSC, dengan sekitar seperlima sel berdiferensiasi secara merata menjadi makrofag setelah 5 hari dalam percobaan in vitro. Meskipun kami tidak menyelidiki fenotipe makrofag yang terpapar FMT, kami berhipotesis bahwa mereka adalah subtipe M1 proinflamasi. Hasilnya dengan jelas menunjukkan bahwa FMT meningkatkan diferensiasi dan pematangan MDSC, dan dengan demikian menunjukkan bahwa ini mendasari pengurangan populasi MDSC yang kami amati selama sepsis lanjut.
Sepsis memulai respons imun kompleks yang bervariasi dari waktu ke waktu dan disertai dengan respons proinflamasi dan antiinflamasi. Penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa kematian pada tahap awal sepsis disebabkan oleh peradangan yang berlebihan. Derive dan rekan melaporkan bahwa transfer adopsi hari ke 10 MDSC ke tikus septik melemahkan produksi sitokin peritoneal dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup [22]. Baru-baru ini, Namkoog et al. observed that clarithromycin pretreatment enhanced survival in a mouse model of LPS-induced shock by expanding the CD11b + Gr-1 + cell population [23]. They described that MDSCs play a protective role in sepsis, however, it should be noted that they were concerned about the early stages of sepsis. Most patients with sepsis display rapid signs of profound immunosuppression, and deaths in this phase are typically due to the acquisition of a secondary hospital-acquired infection, often with opportunistic pathogens [24]. Overzealous MDSC proliferation may facilitate a physiological syndrome of persistent immunosuppression, causing poor outcomes [25]. McClure et al. reported that they did not observe any protective effects from MDSC transfer once the mice entered the late immunosuppressive state [26]. They had previously shown that MDSCs massively expand in the bone marrow, spleen, and lymph nodes of mice with ongoing septic processes and contribute to sepsis-induced T cell suppression [11]. Additionally, Uhel reported that M-MDSCs and G-MDSCs strongly contribute to T cell dysfunction in patients with sepsis [12]. Our data demonstrated that FMT significantly decreased the percentage of MDSCs and attenuated the functions of MDSCs to restore the number of T cells present in mice during late sepsis. Therefore, when studying the role of MDSCs in sepsis, it is crucial to clearly distinguish the early and late stages of sepsis.
Mohus et al. suggested that iron deficiency was associated with increased risk of future bloodstream infections that cause sepsis, indicating that the immune defense mechanisms may be depressed compared to bacterial iron sequestration in low iron environments [27]. Controversies shown in iron supplemental studies reported that intravenous iron therapy was associated with an increased risk of infection [28]. It should be noted the iron supplements differ significantly in their physicochemical properties, which give them different biological properties [29]. With FMT, an iron core is wrapped in a carbohydrate shell, which leads to low toxicity, lysosomal uptake and degradation [30, 31]. It has been reported that FMT does not cause liver toxicity in patients or animal models and is typically metabolized within 2 months [32]. Our data showed that FMT does not increase the production of inflammatory cytokines in early sepsis, indicating that FMT can be administered in sepsis.
This study demonstrated a novel immune-modulatory property of FMT; however, further studies are needed to elucidate the mechanism of FMT suppression of MDSCs. Furthermore, we provide an attractive therapeutic approach for the treatment of sepsis-associated immunosuppression and targeting MDSCs may provide a promising new option for restoring the immune response during sepsis.
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Alanin aminotransferase
Arginase 1
Aspartat aminotransferase
Ferumoxytol
Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs
Hematoxylin–eosin
Interleukin-1β
Inducible nitric oxide synthase
Lipopolysaccharide
Monocyte chemotactic protein 1
Myeloid-derived suppressor cell
Major histocompatibility complex
Monocytic MDSCs
Phosphate-buffered saline solution
Spesies oksigen reaktif
Toll-like receptor
Tumor necrosis factor α
bahan nano
Abstrak LiNbO3 (LN) kristal telah banyak digunakan sebagai bahan piroelektrik karena polarisasi listrik spontan, yang dapat diisi ulang dengan mudah dan dapat langsung mengubah energi panas menjadi listrik. Sifat kehilangan dielektrik kristal LN yang tahan panas, berbiaya rendah, dan rendah memungk
Abstrak Ketika resistivitas lapisan konduktif AZO berada dalam persyaratan resistansi MCP, interval kandungan Zn sangat sempit (70-73%) dan sulit dikendalikan. Bertujuan pada karakteristik lapisan konduktif AZO pada pelat saluran mikro, sebuah algoritme dirancang untuk menyesuaikan rasio bahan kond
Sumber:www. kolaboratifrobotarm.com Dalam industri manufaktur, penggunaan sistem otomasi dengan cepat mendapatkan momentum. Ini terutama karena kemudahan yang dibawa otomatisasi tersebut ke hasil kerja dan kinerja umum Anda. Pabrikan yang berbeda di berbagai bidang merangkul penggunaan lengan robot
Garis beban BJT, atau Transistor Persimpangan Bipolar, menyediakan elektron dan lubang elektron sebagai pembawa muatan. Itu memungkinkan arus kecil untuk menyuntikkan di salah satu terminalnya. Kemudian dapat mengontrol arus yang lebih besar yang mengalir di antara dua terminal. Perangkat dengan fit
