Ferumoxytol Mengurangi Aktivitas MDSC untuk Mengatasi Imunosupresi Induksi LPS pada Sepsis

Abstrak

Imunosupresi yang diinduksi sepsis dikenal sebagai salah satu fitur utama yang menyebabkan kegagalan terapi. Sel penekan mieloida (MDSC), yang terutama ditandai dengan properti penekannya, dilaporkan memperluas dalam sepsis. Ferumoxytol (FMT), suplemen besi yang disetujui FDA, telah menunjukkan memiliki properti imuno-modulasi dalam tumor. Namun, tidak jelas apakah FMT mengubah fungsi MDSC untuk mengurangi imunosupresi sepsis akhir. Di sini, kami menunjukkan efek imuno-modulasi FMT pada MDSC untuk memperbaiki imunosupresi yang diinduksi lipopolisakarida (LPS) pada tahap akhir sepsis. Pemisahan sel dengan internalisasi FMT dan deteksi kandungan besi seluler menunjukkan bahwa MDSC dapat menyerap FMT. Dosis rendah FMT tidak memiliki efek pada keberadaan sel MDSC, tetapi FMT menghambat perlebaran MDSC in vitro. Selain itu, FMT secara signifikan menurunkan ekspresi Arg-1, S100A8, S100A9, dan p47phox serta produksi ROS dalam MDSC. FMT mengurangi persentase MDSC granulosit (G-MDSC) dan mempromosikan diferensiasi MDSC menjadi makrofag. Selain itu, FMT mengurangi rekrutmen sel darah putih dan pembengkakan dinding alveolus di paru-paru serta area nekrosis di hati dan beberapa penanda biokimia disfungsi hati. FMT mengurangi persentase G-MDSC dan MDSC monosit (M-MDSC) dalam tikus sepah tikus sepsis induksi LPS. Perhatikan, FMT mengurangi fungsi imunosupresi sel T dari baik G-MDSC maupun M-MDSC. Seperti yang diharapkan, FMT juga secara signifikan mengurangi ekspresi gen Arg-1 dan p47phox dalam sel CD11b⁺Gr-1⁺ sepah yang diisolasi dari tikus yang diberi tantangan LPS. Data ini menunjukkan bahwa FMT mengurangi fungsi imunosupresi MDSC dengan menurunkan Arg-1 dan produksi ROS, yang mengindikasikan bahwa FMT dapat mengurangi imunosupresi jangka panjang pada tahap akhir sepsis.

Pendahuluan

FMT, suplemen besi yang disetujui oleh Food and Drug Administration, telah digunakan untuk mengobati anemia defisiensi besi pada penyakit ginjal kronis (CKD) [1], dan FMT juga banyak digunakan sebagai agen kontras dan pengobat obat [2]. Studi sebelumnya menunjukkan bahwa FMT memiliki properti imuno-modulasi, seperti kemampuannya untuk menginduksikan pergeseran fenotipik makrofag M2 menjadi subjenis makrofag M1 positif CD86⁺, TNF-α [3, 4]. Namun, efek FMT pada sel imun lain belum pernah diperiksa.

MDSC adalah populasi heterogen sel mieloida imatur dengan kapasitas imunosupresi yang kuat [5]. Dalam tikus, MDSC dapat diidentifikasi sebagai sel Gr-1⁺CD11b⁺, sementara MDSC manusia tidak memiliki homolog Gr-1 dan didefinisikan sebagai sel CD14⁻HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ atau CD14⁺HLA-DR⁻CD11b⁺CD33⁺ [6]. MDSC terdiri dari dua grup sel besar, MDSC granulosit atau PMN-MDSC dan M-MDSC, dan kedua populasi memiliki fungsi imunosupresi melalui produksi iNOS, ROS, dan Arg-1. Aktivitas yang meningkat Arg-1 menghabiskan l-arginine, dan kekurangan l-arginine menghambat proliferasi sel T dengan menurunkan ekspresi rantai zeta CD3. iNOS menghasilkan NO, yang menghambat fungsi JAK3 dan STAT6 dalam sel T, serta ekspresi MHC II. ROS menyebabkan modifikasi pasca-translasi reseptor sel T dan dapat menyebabkan ketidakresponsifitas sel T spesifik antigen [7]. M-MDSC berasal dari prekursor monosit dan dapat berbeda menjadi makrofag dan DC di bawah kondisi sitokin yang tepat. Sebagian besar pengetahuan kami tentang MDSC berasal dari studi kanker. Dalam beberapa tahun terakhir, perlebaran MDSC juga telah dijelaskan dalam penyakit inflamasi akut dan kronis termasuk inflamasi, luka bakar, dan penyakit autoimun [8, 9]. Terkini, tingkat tinggi penyerapan nanoparticle fluorescent oleh MDSC pada kerongkong dan tikus sepah dilaporkan dalam studi citra [10]. Namun, tidak jelas apakah FMT mengubah fungsi MDSC yang terlibat dalam perkembangan penyakit inflamasi.

Sepsis, respons inflamasi gasal yang tidak teratur terhadap infeksi berat yang dapat menyebabkan disfungsi organ yang mengancam nyawa, adalah penyebab kematian paling umum di unit perawatan intensif. Sepsis memulai respons pro-inflamasi yang luar biasa yang, jika tidak diobati secara dini, dengan cepat berubah menjadi imunosupresi jangka panjang. Perlebaran MDSC telah dijelaskan dalam tikus sepah dan simpul limfatik dalam model hewan sepsis [8, 11], serta pada pasien sepsis [12,13,14]. Aktivasi sel imunosupresi seperti MDSC sangat penting untuk kontrol yang tepat terhadap hiperresponsivitas sistem imun bawaan, tetapi perlebaran berlebihan mereka dapat menyebabkan hiperimunosupresi, yang merupakan daya dorong utama untuk infeksi sekunder dan kematian pada sepsis akhir. Jumlah MDSC yang meningkat berkorelasi dengan penekanan proliferasi limfosit. Telah dilaporkan bahwa MDSC memperoleh fenotip mereka di sumsum tulang dan kemudian bermigrasi ke organ limfosit sekunder untuk menghambat respons sel T dan menekan proliferasi mereka dalam tikus imunosupresi LPS [8]. Sebagian besar pasien sepsis yang berkepanjangan menunjukkan status imunosupresi, dan sebagian besar kematian sepsis disebabkan oleh imunosupresi sepsis akhir. Menghilangkan MDSC dapat memiliki efek bermanfaat pada sepsis akhir dengan memulihkan respons imun [15]. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa FMT dapat memodulasi fungsi MDSC untuk mengurangi imunosupresi sepsis akhir.

Di sini kami menunjukkan efek imuno-modulasi FMT pada MDSC. Kami menggunakan properti magnetik FMT untuk menunjukkan bahwa MDSC mampu fagositosis FMT in vitro. Selain itu, kami menemukan bahwa FMT meredakan fungsi imunosupresi MDSC melalui downregulasi Arg-1 dan ROS. Selanjutnya, eksperimen in vivo mengonfirmasi bahwa FMT memperbaiki tahap akhir sepsis induksi LPS pada tikus dengan melemahkan kemampuan MDSC untuk menghambat sel T. Data kami mengindikasikan bahwa fungsi imuno-modulasi FMT dapat digunakan untuk mengobati imunosupresi yang terjadi pada sepsis akhir.

Bahan dan Metode

Tikus

Tikus C57BL/6 jantan (8–10 minggu) dibeli dari Pusat Penelitian Hewan Model Universitas Nanjing (Nanjing, China). Tikus dipelihara dalam kondisi bebas patogen spesifik (SPF) pada siklus terang/gelap 24 jam dan diizinkan akses bebas ke makanan dan air. Semua eksperimen dengan tikus disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institucional Universitas Nanjing.

Staining Biru Prussia

Distribusi seluler FMT terdeteksi menggunakan kit staining Biru Prussia Perl (Solarbio, China) sesuai petunjuk produsen. Singkatnya, sel diperbaiki dalam paraformaldehida 4% selama 15 menit, kemudian diinkubasi dengan kalium ferosianida 10% selama 25–30 menit, diikuti dengan pencuci dan staining kebal dengan nuclear fast red selama 10 menit. Sel yang mengandung partikel biru dalam sitoplasma positif staining Biru Prussia.

Generasi MDSC Berbasis Sumsum Tulang

Sel sumsum tulang diperoleh dengan membalas femur dan tibia tikus tipe liar diikuti oleh lysis sel darah merah. Sel sumsum tulang dikultur dalam medium RPMI-1640 lengkap dengan 10% FBS, 1% v/v penicilin dan streptomycin (Gibco, CA), 40 ng/mL faktor stimulasi koloni granulosit-makrofag (GM-CSF) (Miltenyi Biotech, Jerman) dan 40 ng/mL IL-6 (Miltenyi Biotech, Jerman) pada 37 °C dalam inkubator 5% CO₂ selama 4 hari. Sel non-aderen dikumpulkan untuk eksperimen selanjutnya.

Uji Keberadaan Sel

Keberadaan sel dianalisis menggunakan Cell Counting Kit-8 (Dojino, Kumamoto, Jepang) sesuai petunjuk produsen. Singkatnya, MDSC (5 × 10³) dipindahkan ke kultur 96-lubang dan diinkubasi dalam atmosfer 5% CO₂ pada 37 °C sebelum perawatan. Medium kemudian diganti dengan medium segar yang mengandung berbagai konsentrasi FMT (250, 500, 1000, 2000 μg/mL) selama 24 jam. Susupan kemudian dibuang dan medium segar yang mengandung larutan CCK-8 ditambahkan. Setelah diinkubasi pada 37 °C selama 3 jam, absorbansi diukur pada 450 nm menggunakan Gen5 microplate reader (BioTek, USA).

Isolasi RNA Total dan Real-time PCR

RNA total diekstrak dari sel menggunakan reagennya TRIzol (Invitrogen, USA) dan diukur dengan Nanodrop Spectrophotometer (Thermo Scientific, USA) sebelum ditranskripsi balik menggunakan HiScript II 1st strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme Biotech Co., Ltd, China) sesuai petunjuk produsen. Reaksi rantai polimerase kuantitatif real-time (PCR) dilakukan menggunakan SYBR Green PCR Kit (Bio-Rad, Hercules, CA) pada sistem real-time qPCR Applied Biosystems StepOne-Plus (Applied Biosystems, Forster City, CA). Ekspresi gen dinormalisasi ke GAPDH menggunakan metode 2⁻ΔΔCt. Sekuens primer terdaftar dalam File Tambahan 1: Tabel S1.

Citometri Aliran

Jaringan disiapkan sebagai suspensi sel tunggal dengan kolagenase jenis D (1 mg/mL) dan DNase I (0,1 mg/mL) dalam Hanks’ Balanced Salt Solution (HBSS) pada 37 °C selama 30 menit, dan kemudian sel darah merah tikus sepah dilisis. Suspensi sel difilter melalui saringan sel 70-μm, dan limfosit dikumpulkan melalui sentrifugasi pada 300 g selama 5 menit pada 4 °C. Setelah dicuci, sel segera disiapkan untuk pengurutan sel teraktivasi fluorescens. Sel tunggal diinkubasi dengan FcR blocking reagent (Miltenyi Biotech, Jerman) selama 10 menit, diikuti dengan staining dengan konjugat antibodi berikut selama 20 menit: FITC-labeled anti-CD11b, anti-CD11c, anti-CD4 dan anti-CD8; PE-labeled anti-Ly6G; APC-labeled anti-Ly6C, anti-CD3, anti-F4/80 dan anti-MHC II (BioLegend, CA). Setelah dicuci, sel terdeteksi dengan FACS Calibur (BD, CA) dan data dianalisis menggunakan FlowJo 7.6 (Tree Star, Inc., USA)

Staining H&E

Jaringan hati dan paru diperbaiki dalam formaldehida fosfat 4%. Jaringan yang diperbaiki diembed dalam paraffin, dan irisan tebal 5-μm diwarnai dengan hematoxylin dan eosin untuk mikroskopi cahaya.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

Tingkat serum TNFα, MCP-1, dan IL-1β ditentukan menggunakan kit ELISA spesifik (Dakewe, China) sesuai petunjuk produsen. Setiap sampel dijalankan duplikat.

Deteksi ROS

ROS seluler diukur menggunakan kit 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) (Beyotime, China) sesuai petunjuk produsen. Singkatnya, sel dicuci dua kali dengan PBS dan diinkubasi dengan 5 μM DCFH-DA pada 37 °C dalam kegelapan selama 30 menit, kemudian dicuci dengan medium RPMI-1640 dan disuspendasi dalam PBS. Sel dianalisis untuk fluorescens hijau seluler menggunakan citometer aliran (BD, CA).

Uji Proliferasi Sel T

Sel T CD3⁺ total diperkaya dari tikus sepah tikus tipe liar menggunakan CD3ε MicroBead kit (Miltenyi Biotech, Jerman) dan diinkubasi dengan CFSE stain (Invitrogen, USA). Untuk proliferasi sel T yang diinduksi anti-CD3/CD28, sel T diaktifkan dengan anti-CD3 antibodi (1 μg/mL) dan anti-CD28 antibodi (1 μg/mL). G-MDSC (Gr-1^highLy-6G⁺) dan M-MDSC (Gr-1^dimLy-6G⁻) yang diisolasi dari tikus sepah tikus yang diobati FMT atau kendaraan menggunakan Myeloid-Derived Suppressor Cell Isolation kit (Miltenyi Biotech, Jerman) sesuai petunjuk produsen. MDSC dikultur bersama pada rasio 1:1 dengan sel T CD3⁺ yang dilabeli CFSE dalam kultur 96-lubang datar selama 3 hari. CFSE terbagi sama rata di antara sel anak dengan setiap pembagian; oleh karena itu, proliferasi ditentukan oleh citometri aliran. Keurniaan sel setelah pengurutan > 90%.

Statistik dan Analisis Data

Semua statistik dihitung menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, CA) dan disajikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antara dua grup dianalisis dengan uji Mann–Whitney U atau uji t Student dua arah yang tidak berpasangan. One-way ANOVA digunakan untuk perbandingan beberapa grup. Semua eksperimen diulang paling tidak tiga kali. Perbedaan dengan nilai p < 0,05 dianggap secara statistik signifikan.

Hasil

Sebagian Besar MDSC Menyerap FMT

Untuk memverifikasi apakah sel dengan internalisasi FMT dipisahkan oleh MACS MicroBeads, kami menggunakan staining Biru Prussia untuk mendeteksi kandungan besi seluler dalam makrofag yang diobati FMT (1000 ng/mL) selama 24 jam. Sel dibagi menjadi tiga grup: sebelum pemisahan magnetik, sel positif FMT yang dipilih magnetik (FMT+), dan yang tidak diisolasi magnetik (FMT-). Staining Biru Prussia menunjukkan bahwa mayoritas sel yang dipilih magnetik positif Biru Prussia (Gambar 1a). Untuk membandingkan kemampuan fagositosis FMT antara MDSC, makrofag, dan DC, kami mengisolasi limfosit tikus sepah dari tikus C57BL/6 naif yang diobati FMT selama 6 jam, 12 jam, 24 jam, dan 48 jam. Limfosit tikus sepah dibagi menjadi dua subset: sebelum pemisahan magnetik dan sel positif FMT. Analisis citometri aliran menunjukkan bahwa hampir 60% MDSC dan lebih dari 60% makrofag mengakumulasi FMT setelah 12–48 jam (Gambar 1b, c). Hanya sekitar 40% DC positif FMT pada 24 jam. Data ini menunjukkan bahwa seperti makrofag, MDSC dapat menyerap FMT dan mengindikasikan bahwa FMT dapat mempengaruhi fungsi MDSC.

FMT Menghambat Perlebaran MDSC In Vitro

Telah dilaporkan bahwa FMT menginduksikan pergeseran fenotipik makrofag M2 menjadi subjenis makrofag M1 positif CD86⁺, TNF-α [3]. Karena terdapat sejumlah besar MDSC yang dapat menyerap FMT, kami berhipotesis bahwa FMT dapat mengubah fungsi MDSC. Pertama, efek sitotoksik FMT pada konsentrasi 250, 500, 1000, dan 2000 μg/mL terhadap MDSC dievaluasi dengan uji keberadaan sel CCK8. Hasil menunjukkan bahwa FMT tidak memiliki efek pada keberadaan sel pada dosis rendah dan hanya menunjukkan sitotoksik sedang pada dosis maksimum 2000 μg/mL (Gambar 2a). Kami kemudian menguji apakah FMT pada berbagai konsentrasi akan mempengaruhi generasi MDSC. Sel sumsum tulang yang diisolasi dari tikus C57BL/6 naif diobati dengan medium atau berbagai konsentrasi FMT (250, 500, 1000, dan 2000 μg/mL) selama 4 hari, diikuti oleh karakterisasi dengan citometri aliran pada hari 4. GM-CSF dan IL-6 ditambahkan pada hari 0. Hasil dari tiga eksperimen independen menunjukkan bahwa FMT pada 1000 dan 2000 μg/mL secara signifikan menurunkan perlebaran MDSC (Gambar 2b, c).

FMT Mengurangi Kemampuan Imunosupresi MDSC

MDSC menggunakan beberapa mekanisme untuk menghambat proliferasi dan fungsi efektor sel T, dengan yang paling terperinci adalah produksi ROS dan Arg-1. Ekspresi komponen p47phox dari kompleks nicotinamide adenine dinucleotide phosphate–oxidase (NOX) bertanggung jawab atas produksi ROS dalam MDSC [5]. Telah dilaporkan bahwa S100A8/A9 disintesis dan disekresi oleh MDSC dalam loop inflamasi autokrin dan ini penting dalam penekanan fungsi sel dendritik dalam model tikus [16]. Untuk menentukan apakah FMT dapat mengubah fungsi MDSC, kami memperoleh BM-derived MDSC seperti yang dijelaskan sebelumnya dan menggunakan RT-PCR untuk mengukur ekspresi mRNA dalam MDSC yang diobati FMT dibandingkan kontrol yang tidak diobati. Hasil menunjukkan bahwa MDSC yang diobati FMT secara signifikan menurunkan ekspresi Arg-1, S100A8, S100A9, dan p47phox dibandingkan MDSC yang tidak diobati (Gambar 3a–h). Selanjutnya, kami mengevaluasi tingkat ROS dalam MDSC kontrol dan MDSC yang diobati FMT. Hasil menunjukkan bahwa MDSC yang diobati FMT menunjukkan tingkat ROS yang jauh lebih rendah dibandingkan sel kontrol (Gambar 3i, j). Kami kemudian membandingkan perubahan subpopulasi MDSC dalam grup yang diobati FMT dan yang tidak diobati. Hasil menunjukkan bahwa FMT menurunkan persentase G-MDSC, dengan peningkatan kecil M-MDSC juga diamati (Gambar 3k, l).

FMT Memromosikan Diferensiasi MDSC menjadi Makrofag

Untuk menentukan apakah FMT merangsang diferensiasi akhir MDSC menjadi makrofag, kami merawat sel dengan 1000 μg/mL FMT pada hari 0 dan melakukan citometri aliran untuk penanda makrofag CD11b dan F4/80 pada hari 1, 3, dan 5. Hasil menunjukkan bahwa 1 hari setelah penambahan 1000 μg/mL FMT proporsi makrofag meningkat secara signifikan lebih dari 2 kali lipat dibandingkan sel yang tidak diobati. Demikian pula, 3 hari dan 5 hari setelah perawatan dengan FMT, proporsi makrofag juga meningkat secara signifikan (Gambar 4a, b).

FMT Meredakan Gejala pada Tikus Sepsis Induksi LPS

Telah dilaporkan bahwa sepsis terkait dengan kerusakan jaringan dan mengarah pada gagal organ serta disfungsi endotel [17]. Untuk menyelidiki apakah FMT mengurangi gejala sepsis akhir, tingkat kerusakan organ pada tikus eksperimental dievaluasi setelah 10 hari. Pemeriksaan histopatologis paru pada sepsis induksi LPS menunjukkan bahwa FMT mengurangi rekrutmen sel darah putih dan pembengkakan dinding alveolus dibandingkan tikus yang diobati kendaraan. Staining H&E juga mengungkapkan bahwa area nekrosis hati lebih kecil pada tikus yang diobati FMT dibandingkan tikus yang diobati kendaraan (Gambar 5a, b). Selain itu, tingkat serum aspartate transaminase, yang digunakan sebagai penanda biokimia disfungsi hati pada hewan ini, jauh lebih rendah pada hati tikus yang diobati FMT dibandingkan kontrol (Gambar 5c). Namun, FMT tidak mempengaruhi tingkat alanine aminotransferase (Gambar 5d). Selanjutnya, sepsis dianggap terkait dengan hasil buruk seperti produksi sitokin inflamasi yang meningkat; oleh karena itu, kami menilai perubahan tingkat sitokin pro-inflamasi dalam serum. Tingkat TNF-α dalam serum sedikit, namun tidak signifikan, lebih rendah pada tikus yang diobati FMT pada 3 jam setelah suntikan LPS, dan tidak ada perbedaan dalam tingkat MCP-1 atau IL-1β antara tikus yang diobati FMT dan tikus yang diobati kendaraan (Gambar 5e–g).

FMT Mengurangi Jumlah MDSC dalam Tikus Sepah Tikus Sepsis Induksi LPS

Bukti yang semakin bertumpuk mendukung bahwa imunosupresi terkait sepsis meningkatkan kematian [18], dan MDSC dianggap sebagai komponen utama jaringan imunosupresi [8]. Telah dilaporkan bahwa G-MDSC lebih spesifik diperluas pada pasien sepsis dan tampaknya menjadi pemain utama imunosupresi yang diinduksi sepsis [12]. Untuk menentukan apakah FMT memodulasi populasi MDSC pada tikus tipe liar, tikus C57BL/6 diberi FMT melalui vena ekor pada jam 1 dan hari 5. Hasil menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan signifikan dalam persentase MDSC yang terdeteksi dalam tikus sepah atau sumsum tulang antara kontrol dan tikus yang diobati FMT (Gambar 6a, e). Perhatikan, FMT menurunkan perlebaran sel CD11b⁺Gr-1⁺ yang bergantung pada LPS baik dalam sumsum tulang maupun tikus sepah (Gambar 6a, e), yang konsisten dengan studi in vitro. Selain itu, FMT juga menurunkan persentase G-MDSC dan M-MDSC dalam tikus sepah, sementara hanya persentase G-MDSC yang menurun dalam sumsum tulang (Gambar 6c, g). Data ini menunjukkan bahwa FMT mengurangi jumlah MDSC dalam tikus sepah tikus sepsis induksi LPS.

FMT Mengurangi Properti Imunosupresi Sel T MDSC In Vivo

Pengurangan numerik dari beberapa populasi sel imun, termasuk sel T CD4 dan CD8, adalah karakteristik utama dari respons imun adaptif setelah sepsis. Ini terkait dengan risiko kematian yang meningkat, serta hasil buruk lainnya [19, 20]. Telah ditunjukkan bahwa MDSC menekan proliferasi sel T dengan mengganggu ekspresi rantai zeta sel T pada pasien sepsis [21]. Untuk mengevaluasi proporsi limfosit pada tahap akhir sepsis, kami mengukur proporsi sel T CD4 dan CD8 dalam model sepsis tikus. Hasil menunjukkan bahwa FMT menyebabkan peningkatan sel T CD4 dan CD8 dalam tikus sepah tikus induksi LPS (Gambar 7a, b). Tidak ada perbedaan dalam persentase sel T CD4 dan CD8 dalam tikus sepah tikus yang diobati FMT dibandingkan tikus kontrol (Gambar 7a, b). Untuk mengonfirmasi lebih lanjut peran MDSC dalam menekan proliferasi sel T in vivo, G-MDSC dan M-MDSC diisolasi dari tikus sepah tikus yang diobati kendaraan atau FMT yang diberi tantangan LPS oleh MACS dan dikultur bersama dengan sel T CD3 pada rasio 1:1. Hasil kami menunjukkan bahwa perawatan FMT mengurangi fungsi imunosupresi sel T baik G-MDSC maupun M-MDSC (Gambar 7e, f). Selanjutnya, kami juga mengukur tingkat ekspresi Arg-1 dan p47phox dalam MDSC yang diisolasi dari tikus sepah tikus. Seperti yang diharapkan, ekspresi gen Arg-1 dan p47phox secara signifikan berkurang dalam sel CD11b⁺Gr-1⁺ tikus sepah yang diisolasi dari tikus yang diobati FMT yang diberi tantangan LPS dibandingkan tikus yang diberi tantangan LPS (Gambar 7g, h). Data ini menunjukkan bahwa FMT mengurangi fungsi imunosupresi MDSC dengan menurunkan produksi Arg-1 dan ROS, yang mengindikasikan bahwa FMT dapat mengurangi imunosupresi jangka panjang pada sepsis tahap akhir.

Diskusi

Suplemen besi FMT yang disetujui FDA telah banyak digunakan sebagai pengobat obat dan agen kontras dalam pemindaian MRI. Ditemukan bahwa FMT menghambat pertumbuhan kanker dengan menginduksikan respons imun pro-inflamasi dengan polarisasi makrofag M1 [3], yang mengindikasikan bahwa FMT memiliki fungsi imuno-modulasi. Dalam studi ini, kami mengevaluasi efek FMT pada MDSC dengan membandingkan fenotipe dan fungsi MDSC yang diobati FMT dengan MDSC kontrol yang tidak diobati. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa MDSC mampu menyerap nanoparticle magnetik [10], dan data kami lebih lanjut menunjukkan bahwa FMT mengurangi fungsi imunosupresi MDSC dalam tikus sepah melalui downregulasi Arg-1 dan ROS. Data kami juga menunjukkan bahwa FMT memiliki efek langsung pada diferensiasi MDSC, dengan sekitar satu lima dari sel yang berbeda secara merata menjadi makrofag setelah 5 hari dalam eksperimen in vitro. Meskipun kami tidak menyelidiki fenotipe makrofag yang terpapar FMT, kami berhipotesis bahwa mereka adalah subjenis M1 pro-inflamasi. Hasil dengan jelas menunjukkan bahwa FMT meningkatkan diferensiasi dan maturasi MDSC, dan oleh karena itu mengindikasikan bahwa ini mendasari pengurangan populasi MDSC yang kami amati selama sepsis akhir.

Sepsis memulai respons imun kompleks yang bervariasi seiring waktu dan diiringi oleh respons pro-inflamasi dan anti-inflamasi. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa kematian pada tahap awal sepsis disebabkan oleh inflamasi berlebihan. Derive dan rekan-rekan melaporkan bahwa transfer adopsi MDSC hari 10 ke tikus sepsis meredakan produksi sitokin peritoneum dan meningkatkan tingkat kelangsungan hidup [22]. Lebih baru lagi, Namkoog dan rekan-rekan mengamati bahwa pretreatment clarithromycin meningkatkan kelangsungan hidup dalam model tikus syok induksi LPS dengan memperluas populasi sel CD11b⁺Gr-1⁺ [23]. Mereka menggambarkan bahwa MDSC memerankan peran pelindung dalam sepsis, namun harus diperhatikan bahwa mereka terkait dengan tahap awal sepsis. Sebagian besar pasien sepsis menunjukkan tanda imunosupresi yang mendalam dengan cepat, dan kematian pada fase ini biasanya disebabkan oleh infeksi sekunder yang didapat di rumah sakit, seringkali dengan patogen oportunistik [24]. Perlebaran MDSC yang berlebihan dapat memfasilitasi sindrom fisiologis imunosupresi yang berkelanjutan, yang menyebabkan hasil buruk [25]. McClure dan rekan-rekan melaporkan bahwa mereka tidak mengamati efek pelindung dari transfer MDSC setelah tikus masuk ke dalam status imunosupresi akhir [26]. Mereka sebelumnya telah menunjukkan bahwa MDSC secara masal memperluas dalam sumsum tulang, tikus sepah, dan simpul limfatik tikus dengan proses sepsis yang berlangsung dan berkontribusi pada penekanan sel T yang diinduksi sepsis [11]. Selain itu, Uhel melaporkan bahwa M-MDSC dan G-MDSC sangat berkontribusi pada disfungsi sel T pada pasien sepsis [12]. Data kami menunjukkan bahwa FMT secara signifikan menurunkan persentase MDSC dan meredakan fungsi MDSC untuk memulihkan jumlah sel T yang ada pada tikus selama sepsis akhir. Oleh karena itu, saat mempelajari peran MDSC dalam sepsis, sangat penting untuk membedakan dengan jelas tahap awal dan akhir sepsis.

Mohus dan rekan-rekan menyarankan bahwa defisiensi besi terkait dengan risiko yang meningkat terhadap infeksi aliran darah yang menyebabkan sepsis, yang mengindikasikan bahwa mekanisme pertahanan imun mungkin terdepresikan dibandingkan dengan sekwestrasi besi bakteri dalam lingkungan besi rendah [27]. Kontroversi yang ditunjukkan dalam studi suplemen besi melaporkan bahwa terapi besi intravena terkait dengan risiko infeksi yang meningkat [28]. Harus diperhatikan bahwa suplemen besi berbeda secara signifikan dalam properti fisikokimia mereka, yang memberikan properti biologis yang berbeda [29]. Dengan FMT, inti besi dibungkus dalam kulit karbohidrat, yang mengarah pada toksisitas rendah, penyerapan lisosom, dan degradasi [30, 31]. Telah dilaporkan bahwa FMT tidak menyebabkan toksisitas hati pada pasien atau model hewan dan biasanya dibuang dalam waktu 2 bulan [32]. Data kami menunjukkan bahwa FMT tidak meningkatkan produksi sitokin inflamasi pada sepsis awal, yang mengindikasikan bahwa FMT dapat diberikan dalam sepsis.

Kesimpulan

Studi ini mendemonstrasikan properti imuno-modulasi baru dari FMT; namun, studi lebih lanjut diperlukan untuk menguraikan mekanisme penekanan MDSC oleh FMT. Selain itu, kami memberikan pendekatan terapeutik yang menarik untuk pengobatan imunosupresi terkait sepsis dan penargetan MDSC dapat memberikan opsi baru yang menjanjikan untuk memulihkan respons imun selama sepsis.

Ketersediaan Data dan Bahan

Data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi ini tersedia dari penulis yang bersesuaian atas permintaan yang wajar.

Singkatan

ALT:

Alanine aminotransferase

Arg1:

Arginase 1

AST:

Aspartate aminotransferase

FMT:

Ferumoxytol

G-MDSCs/PMN-MDSCs:

Polymorphonuclear MDSCs/granulocytic MDSCs

HE:

Hematoxylin–eosin

IL-1β:

Interleukin-1β

iNOS:

Inducible nitric oxide synthase

LPS:

Lipopolysaccharide

MCP 1:

Monocyte chemotactic protein 1

MDSC:

Myeloid-derived suppressor cell

MHC II:

Major histocompatibility complex

M-MDSCs:

Monocytic MDSCs

PBS:

Phosphate-buffered saline solution

ROS:

Reactive oxygen species

TLR:

Toll-like receptor

TNF-α:

Tumor necrosis factor α