Meneliti Peran Ukuran Tetesan Emulsi dan Surfaktan dalam Proses Fabrikasi Berbasis Ketidakstabilan Antarmuka Nanocrystals Micellar

Hasil dan Diskusi

Kami dan yang lainnya baru-baru ini memperkenalkan metode ketidakstabilan antarmuka untuk merangkum nanocrystals untuk membentuk nanopartikel komposit untuk aplikasi biologis. Namun, kami sering menemukan hasil yang tidak dapat direproduksi dan terkadang bertentangan pada intensitas fluoresensi QD (QD digunakan sebagai model nanocrystals di sini). Masalah ini perlu ditangani untuk diterjemahkan ke industri dan klinik. Banyak faktor (misalnya, pelarut, polimer, suhu, ukuran "mikro-reaktor") yang terlibat selama proses fabrikasi dapat menyebabkan hilangnya fluoresensi dan hasil yang tidak dapat direproduksi. Kami telah menyelidiki berbagai faktor yang terlibat dan telah menemukan bahwa ukuran "mikro-reaktor" (tetesan emulsi) merupakan faktor kunci dalam hal ini, dengan penggunaan surfaktan PVA menjadi faktor yang terkait erat. Di bawah ini, kami terutama menjelaskan hasil pada efek ukuran tetesan emulsi serta PVA surfaktan.

Kami membandingkan efek dari dua metode emulsifikasi yang berbeda dengan kekuatan mekanik yang sangat berbeda, yaitu, pengocokan manual (mengocok campuran dengan kuat secara manual) dan sonikasi mandi (mensonikasi campuran dalam sonikator mandi). Kami menemukan bahwa kedua metode ini pada akhirnya dapat menghasilkan dispersi yang transparan dan homogen setelah penguapan pelarut organik, yang menunjukkan keberhasilan pembentukan misel yang dienkapsulasi nanokristal (Gbr. 1b, c, bawah). Karena tampilan visual yang transparan dan homogen biasanya digunakan sebagai indikator sederhana dan nyaman untuk keberhasilan pembentukan misel dalam proses fabrikasi berbasis ketidakstabilan antarmuka, dampak potensial dari metode emulsifikasi yang berbeda pada produk misel sebelumnya diabaikan. Kami menggunakan mikroskop cahaya untuk memeriksa ukuran tetesan emulsi yang dihasilkan oleh dua metode emulsifikasi yang berbeda ini, masing-masing, dan menemukan bahwa metode pengocokan manual menghasilkan tetesan ~25 μm (berdiameter), sedangkan metode sonikasi mandi menghasilkan ~3 μm ( diameter) yang (Gbr. 1b, c, atas). Kira-kira ukuran 500 tetesan diukur untuk setiap sampel menggunakan gambar mikroskop cahaya untuk mendapatkan ukuran rata-rata dan distribusi ukuran. Analisis statistik (t . Siswa uji) menunjukkan bahwa perbedaan antara ukuran rata-rata tetesan yang dibentuk oleh pengocokan manual (~25 μm) dan dengan sonikasi (~3 m) signifikan secara statistik (P < 0,001). Yang penting, kami juga melakukan eksperimen kontrol untuk mengonfirmasi bahwa dua metode emulsifikasi yang berbeda ini secara konsisten menghasilkan ukuran tetesan emulsi dalam dua rentang ukuran berbeda yang disebutkan di atas, masing-masing:pengocokan manual dengan beberapa durasi waktu yang berbeda (0,5, 1, 2, dan 3 menit) semuanya menghasilkan dalam ~25 μm tetesan emulsi (dengan distribusi ukuran serupa) dan sonikasi rendaman dengan beberapa durasi waktu berbeda (0,5, 1, dan 2 mnt) semuanya menghasilkan ~3 m tetesan emulsi (dengan distribusi ukuran serupa, File tambahan 1:Gambar S1) .

Pengamatan visual dari tetesan emulsi dan misel terenkapsulasi QD yang dihasilkan setelah penguapan pelarut organik. a Tidak ada PVA yang digunakan. Sedikit atau tidak ada tetesan emulsi yang terbentuk (gambar atas ); sedikit atau tidak ada misel yang dienkapsulasi QD yang terbentuk pada penghilangan pelarut organik (gambar bawah , sisipan menunjukkan gambar fluoresen yang sesuai menggunakan lampu UV genggam untuk menggairahkan merah fluoresensi QD). b Pengocokan manual digunakan untuk membentuk tetesan emulsi. ~25 m tetesan emulsi terbentuk (gambar atas , sisipan menunjukkan hasil pengukuran ukuran droplet dari analisis citra 500 droplet). Selain itu, variasi ukuran karena waktu pengocokan yang berbeda ditemukan minimal (Gbr. S1). Setelah penghilangan pelarut organik, dispersi transparan dan homogen terbentuk, menunjukkan keberhasilan pembentukan misel yang dienkapsulasi nanokristal (gambar bawah , sisipan menunjukkan gambar fluoresen yang sesuai menggunakan lampu UV genggam untuk menggairahkan merah fluoresensi QD). c Sonikasi mandi digunakan untuk membentuk tetesan emulsi. ~3 m tetesan emulsi terbentuk (gambar atas , sisipan menunjukkan hasil pengukuran ukuran droplet dari analisis citra 500 droplet). Selain itu, variasi ukuran karena waktu pengocokan yang berbeda menjadi minimal (Gbr. S1). Setelah penghilangan pelarut organik, dispersi transparan dan homogen terbentuk, menunjukkan keberhasilan pembentukan misel yang dienkapsulasi nanokristal (gambar bawah , sisipan menunjukkan gambar fluoresen yang sesuai menggunakan lampu UV genggam untuk menggairahkan merah fluoresensi QD). Untuk menganalisis ukuran tetesan emulsi dari sampel tertentu, pertama, gambar mikroskop cahaya dari tetesan emulsi diambil, dan selanjutnya, diameter ~500 tetesan diukur dengan perangkat lunak gratis ImageJ untuk mendapatkan ukuran rata-rata dan distribusi ukuran tetesan emulsi sampel

Selanjutnya, kami juga melakukan perlakuan emulsifikasi tanpa adanya surfaktan PVA dan menemukan bahwa hampir tidak ada tetesan emulsi yang berhasil terbentuk, dilihat dari hasil mikroskop cahaya (Gbr. 1a, atas), dan hampir tidak ada misel yang berhasil terbentuk, dilihat dari pengamatan pemisahan fase yang hampir sempurna (presipitasi QD) pada produk akhir, yaitu kegagalan untuk membentuk produk misel (Gbr. 1a, bawah). Hasil Gambar 1a menunjukkan bahwa surfaktan PVA diperlukan dalam proses ketidakstabilan antarmuka untuk keberhasilan pembentukan tetesan emulsi (sebagai "reaktor mikro") dan misel (sebagai produk akhir). Ini tidak sepele karena menunjukkan bahwa, meskipun PS-PEG juga bersifat amfifilik, keberadaan PS-PEG saja (tanpa kehadiran PVA) dalam sistem tidak dapat memberikan tetesan emulsi yang diperlukan untuk proses ketidakstabilan antarmuka.

Meskipun dispersi produk tampak transparan dan homogen setelah terbentuk (hasil karakterisasi TEM dan DLS menunjukkan misel enkapsulasi QD berbentuk bola dan monodispersi, File tambahan 2:Gambar S2), perbedaan ukuran tetesan emulsi yang diberikan oleh dua di atas berbeda metode emulsifikasi, yaitu, pengocokan manual dan sonikasi, ditemukan menyebabkan perbedaan besar dalam produk nanocrystals misel. Kami mengukur dan mengikuti perubahan intensitas fluoresen dari misel QD (misel yang dienkapsulasi QD) yang masing-masing dibentuk oleh pengocokan dan sonikasi manual, selama periode waktu 40 hari pada 4 °C. Kami menemukan bahwa, untuk misel, QD yang dibentuk oleh pengocokan manual (selama 1 menit, terbentuk dari ~25 m tetesan emulsi), meskipun intensitas fluoresen (diukur dengan spektroskopi fluoresen) dipertahankan selama proses pembentukan misel, dari waktu ke waktu (~10 hari) intensitas fluoresensi QD misel menurun secara bertahap menjadi hanya sekitar 50% dari tingkat intensitas fluoresen asli, dan tetap stabil setelahnya (Gbr. 2a). Sebaliknya, QD misel yang dibentuk oleh sonikasi (selama 30 detik, terbentuk dari ~3 m tetesan emulsi) sebagian besar mempertahankan intensitas fluoresen (diukur dengan spektroskopi fluoresen) selama seluruh periode waktu (Gbr. 2a). Selanjutnya, kami menggunakan mata telanjang untuk mengamati bagian bawah dispersi QD misel yang dibentuk oleh pengocokan manual dan sonikasi, masing-masing, setelah sampel dibiarkan selama 10 hari pada 4 °C. Di bagian bawah misel, dispersi QD yang dibentuk dengan pengocokan manual (selama 1 menit) setelah 10 hari penyimpanan, endapan yang terlihat diamati dengan mata telanjang (Gbr. 2a, inset). Sebaliknya, di bagian bawah dispersi QD misel yang dibentuk dengan sonikasi (selama 30 detik) setelah 10 hari penyimpanan, tidak ada endapan yang terlihat dengan mata telanjang (Gbr. 2a, inset). Hasil ini menunjukkan bahwa, meskipun kedua metode emulsifikasi dapat mengarah pada keberhasilan pembentukan misel terenkapsulasi QD dengan efisiensi enkapsulasi yang serupa, sebagian besar misel terenkapsulasi QD dibentuk oleh tetesan emulsi yang lebih besar (~25 m, dihasilkan oleh pengocokan manual selama 1 menit ) secara koloid tidak stabil dan dari waktu ke waktu mengakibatkan pengendapan dan dengan demikian kehilangan fluoresensi dari dispersi, sementara semua misel yang dienkapsulasi QD yang dibentuk oleh tetesan emulsi yang lebih kecil (~3 m, dihasilkan oleh sonikasi mandi selama 30 detik) stabil secara koloid dan dengan demikian dipertahankan fluoresensi untuk jangka waktu yang lama (studi TEM dispersi setelah penyimpanan 10 hari juga menunjukkan morfologi nanocrystals misel yang terpelihara dengan baik, seperti yang ditunjukkan pada file tambahan 3:Gambar S3). Selain itu, kami menemukan bahwa, ketika waktu sonikasi ditingkatkan dari 30 detik menjadi 1 dan 2 menit untuk membentuk tetesan emulsi, intensitas fluoresen berkurang secara drastis, meskipun misel yang dienkapsulasi QD stabil secara koloid untuk jangka waktu yang lama untuk suhu yang berbeda. durasi waktu perawatan sonikasi dilihat dari intensitas fluoresen yang stabil sepanjang waktu penyimpanan (Gbr. 2b). Hilangnya fluoresensi yang ditunjukkan pada Gambar. 2b kemungkinan disebabkan oleh pembentukan cacat permukaan pada QD oleh perlakuan mekanis yang kuat dan berkepanjangan. Dalam percobaan kontrol, intensitas fluoresen QD hidrofobik yang dilarutkan dalam kloroform juga ditemukan menurun secara bertahap di bawah perlakuan sonikasi dengan peningkatan waktu sonikasi (File tambahan 4:Gambar S4), yang mendukung penyebab hilangnya fluoresensi yang diusulkan ini. Bersama-sama, Gambar 2a, b mengungkapkan dua mekanisme utama hilangnya fluoresensi dalam sistem misel yang dienkapsulasi QD yang dibuat oleh proses ketidakstabilan antarmuka, yaitu misel terenkapsulasi QD yang tidak stabil secara koloid dan cacat permukaan QD yang dihasilkan oleh perlakuan mekanis.

Stabilitas fluoresensi misel yang dienkapsulasi QD dibuat oleh proses ketidakstabilan antarmuka. a Perubahan intensitas fluoresensi (diukur dengan spektroskopi fluoresen) dari waktu ke waktu untuk misel yang dienkapsulasi QD, dengan tetesan emulsi yang dibentuk oleh pengocokan manual (selama 1 menit, yaitu ~25 m tetesan) atau sonikasi (selama 30 detik, yaitu ~3 m tetesan), masing-masing. sisipan adalah gambar dispersi misel yang dienkapsulasi QD setelah 10 hari penyimpanan pada 4 °C dengan tetesan emulsi yang dibentuk dengan pengocokan manual (selama 1 menit, yaitu ~25 m tetesan) atau sonikasi (selama 30 detik, yaitu ~3 m tetesan), masing-masing. Panel a menunjukkan bahwa salah satu penyebab hilangnya fluoresensi misel terenkapsulasi QD adalah adanya misel terenkapsulasi QD yang tidak stabil secara koloid. b Perubahan intensitas fluoresensi (diukur dengan spektroskopi fluoresen) dari waktu ke waktu untuk misel yang dienkapsulasi QD dengan tetesan emulsi yang dibentuk oleh sonikasi (yaitu, tetesan ~3 m) selama tiga durasi waktu perlakuan sonikasi yang berbeda. Panel b menunjukkan bahwa salah satu penyebab hilangnya fluoresensi misel yang dienkapsulasi QD adalah cacat permukaan QD yang dihasilkan oleh perlakuan mekanis yang kuat dan berkepanjangan

Di antara dua mekanisme kehilangan fluoresensi ini, meskipun diketahui dengan baik bahwa kehilangan fluoresensi QD dapat disebabkan oleh kerusakan pada permukaan QD, hasil bahwa bagian dari misel yang tidak stabil secara koloid mengejutkan kami. Dengan demikian, kami melakukan studi lebih lanjut tentang mekanisme khusus ini. Kami pertama kali mengajukan pertanyaan apakah QD yang diendapkan di atas memang dienkapsulasi dalam misel (atau struktur perakitan mirip misel). Kami menemukan bahwa hanya mengocok dispersi dengan endapan ini dapat menyebabkan kembalinya intensitas fluoresen dari dispersi ke tingkat aslinya (Gbr. 3a, kiri); sebaliknya, studi kontrol menggunakan perlakuan yang sama untuk QD hidrofobik yang diendapkan dalam air tidak menunjukkan peningkatan intensitas fluoresen (Gbr. 3a, kanan). Selain itu, gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari bagian bawah sampel produk yang dibentuk dengan pengocokan manual setelah 10 hari penyimpanan menunjukkan sejumlah besar QD yang berkerumun dalam struktur bulat dan non-bola besar (Gbr. 3b, kiri); sebaliknya, di bagian bawah sampel produk yang dibentuk dengan sonikasi setelah 10 hari penyimpanan, gambar TEM yang sesuai hanya menunjukkan sejumlah kecil QD yang dikelompokkan dalam struktur bola (Gbr. 3b, tengah). Dengan demikian, hasil ini menunjukkan bahwa QD yang diendapkan memang dienkapsulasi dalam misel atau struktur rakitan seperti misel, yaitu, QD ini bukan QD hidrofobik telanjang. Kami kemudian mengajukan pertanyaan apa sifat kimia dari misel yang tidak stabil secara koloid ini (atau struktur rakitan mirip misel). Karena misel PS-PEG harus stabil secara koloid, kami berhipotesis bahwa misel yang tidak stabil (atau struktur rakitan mirip misel) dibentuk oleh surfaktan PVA. Hipotesis ini didukung oleh dua baris bukti eksperimental berikut. Pertama, kami menemukan bahwa menggunakan PVA tanpa PS-PEG dalam proses ketidakstabilan antarmuka memang dapat menghasilkan misel yang merangkum QD (Gbr. 3b, kanan). Kedua, kami melakukan percobaan dialisis pada QD misel PS-PEG dan QD misel PVA, masing-masing, untuk perbandingan. Setelah perawatan dialisis (dengan cutoff berat molekul tas dialisis menjadi 200 kD, yang lebih besar dari berat molekul PVA dan PS-PEG) terhadap air murni, QD misel PS-PEG tetap stabil secara koloid, dilihat dari fakta bahwa fluoresensi QD tetap homogen dalam dispersi (Gbr. 3c, kiri). Sebaliknya, dispersi QD misel PVA menghasilkan agregat fluoresen yang terlihat jelas setelah perawatan dialisis yang hampir identik seperti di atas (Gbr. 3c, kanan). As the dialysis experiment could be considered as mimicking the dilution treatment that micelle-based nanomaterials would encounter once introduced to an in vivo environment, our dialysis experimental results indicate that the QD-encapsulated PVA micelles would become colloidally unstable in vivo. Therefore, the results shown in Fig. 3c suggest that the fluorescence loss from using large emulsion droplets (~25 μm, produced by manual shaking) is caused by colloidally unstable PVA micelles (or other micelle-like assembly structures) encapsulating QDs.

Examining the colloidally unstable part of the micellar QDs. a Kiri , the disappearance of fluorescence of the colloidally unstable part of the micellar QDs from the dispersion after 10-day storage could be resumed after the dispersion was shaken. Benar , the fluorescence of hydrophobic QDs was not detected in water because they could not be dispersed in water. b Kiri and middle are the TEM images of the bottom portions of the micellar QD dispersions formed from manual shaking for 1 min (i.e., ~25 μm emulsion droplets) and sonication for 30 s (~3 μm emulsion droplets), respectively, after 10-day storage. Benar , TEM image of PVA micellar QDs. c Dialysis (against water) treatment on PS-PEG micellar QDs (left ) and PVA micellar QDs (right ), masing-masing. A hand-held UV lamp was used to excite the red QD fluorescence

Further, we conducted two additional experiments to confirm the roles of emulsion droplet size and the surfactant PVA. In the first experiment, we used a water-miscible organic solvent tetrahydrofuran (THF) instead of the water immiscible organic solvent chloroform. In this case, the “emulsion droplet” size could be considered as zero, and the surfactant PVA was not used because it was not needed to facilitate the mixing of oil phase with water phase. It was found that the fabrication process produced QD-encapsulated micelles with stable fluorescence (Fig. 4a), which is consistent with the result that small emulsion droplets lead to colloidally stable QD-encapsulated micelles and stable fluorescence. In addition, it was observed that the micelles formed by this process (with THF, without PVA) had large size distribution and some of the formed micelles even had non-spherical shapes (Fig. 4b). This indicates that “zero droplet size” could lead to poorly controlled micelle size and shape (although the formed micelles are colloidally stable). Thus, the results of the “zero emulsion droplet size” experiment (with the water-miscible THF as the organic solvent), on the one hand, are consistent with the finding that smaller emulsion droplets lead to colloidally stable micellar nanocrystals (judging by the stable fluorescence given by “zero-sized emulsion droplets”), and on the other hand, indicate the advantage of having an emulsion droplet (with non-zero droplet size) compared with no emulsion droplet at all (“zero-droplet size”, which gives poor micelle morphology). In the second experiment, we used electrospray, which is known to give ultrafine and uniform droplets with the typical droplet size range being a few hundred nanometers to a few micrometers (smaller than what the sonication treatment generates), as the method to produce emulsion droplets (PVA was used in this case) [35,36,37,38,39]. It was found that this method led to micellar QDs with stable fluorescence and well-controlled micelle size and shape (Fig. 4c, d). It should be mentioned that electrospray typically can only produce droplet sizes smaller than what the sonication treatment gives (i.e., a few hundred nanometers to a few micrometers). Thus, to study the effect of larger emulsion droplet size, in this work, we used another mechanical treatment method, i.e., manual shaking, to give larger droplets (~25 μm). The actual size of electrospray-generated droplets is difficult to be obtained by direct imaging (for example, the size of electrospray-generated oil-in-water emulsion droplets would change greatly upon entering the large volume of water phase in the collection container due to aggregation and fusion, and the typical sub-micrometer size of electrospray-generated droplets is approaching the diffraction limit of optical microscopy), but could be theoretically calculated or experimentally measured by methods that characterize aerodynamic mobility as done previously in the literature.

Using additional methods to form small emulsion droplets to confirm the importance of droplet size. a , b Using water-miscible THF as the oil phase solvent (without using PVA) led to micellar QDs with stable fluorescence (a ) and irregular micelle shapes (b ). c , d Using electrospray (with PVA) to form droplets led to micellar QDs with stable fluorescence (c ) and regular micelle shape (d )

Figure 5 presents a schematic to summarize our results and insights on the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystals-encapsulated micelles (with QDs as the model for nanocrystals). Each oil-in-water emulsion droplet serves as a “micro-reactor” for the interfacial instability-mediated self-assembly “reaction.” When no PVA (surfactant) is used, emulsion droplet does not form, and thus, no micelle is formed. When the emulsion droplet is large in size (~25 μm), only a part of the QDs (approximately 50%, based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, Fig. 2a) in the droplet get encapsulated in PS-PEG (an amphiphilic block copolymer) micelles, which are colloidally stable, while the other part of the QDs get encapsulated in PVA (also an amphiphilic polymer, but not a block copolymer) micelles, which are colloidally unstable. When the emulsion droplet is small in size (~3 μm or smaller), nearly all QDs (based on the remaining fluorescence intensity in the dispersion after 10-day storage, combined with comparison of fluorescent intensity with hydrophobic QDs undergoing similar mechanical treatment, Fig. 2a, Fig. 4a, c, and Additional file 4:Fig. S4) in the droplet get encapsulated in stable PS-PEG micelles. Thus, the roles of emulsion droplets and the surfactant PVA in the interfacial instability-based fabrication process of nanocrystal-encapsulated micelles are intricate and intertwined, particularly in the context of biological applications:the surfactant PVA is required for successful formation of emulsion droplets and micelle products, and yet it is also responsible for formation of the colloidally unstable part of nanocrystal-encapsulated micelles, which would be detrimental in a number of biological applications; and the key to avoid the colloidally unstable nanocrystal-encapsulated PVA micelles is to use emulsion droplets small in size (~3 μm or smaller).

Roles of emulsion droplet size and surfactant in the interfacial instability-based fabrication of micellar nanocrystals

In addition, it should be mentioned that, for a well-dispersed oil-in-water emulsion to form, a surfactant is often required to lower the surface tension between the oil phase and water phase, and PVA was selected here as the surfactant because it was applied in nearly all the previous works on using the interfacial instability method to fabricate micelles [25, 26, 33,34,35]. We cannot rule out the possibility that other surfactants could give different results. Examining the effects of different types of surfactant would be part of the future studies.

Finally, we performed proof-of-concept biological experiments using live cells to demonstrate that our micellar nanocrystal products (with the emulsion droplets formed from sonication treatment for 30 s) are (1) fairly biocompatible, (2) can be functionalized with biological molecules, (3) can be introduced into live cells, and (4) if conjugated with biological targeting molecules, can bind with specific biological targets (Fig. 6). Cytotoxicity studies by MTT assay showed that the QD-encapsulated PS-PEG micelles had fairly low cytotoxicity in three different cell lines compared with the negative control (cultured cells in the absence of nanomaterials added, i.e., concentration being zero) (Fig. 6a). To bio-functionalize QD-encapsulated PS-PEG micelles, in the micelle fabrication process the PS-PEG molecules were replaced with PS-PEG-COOH molecules, the latter of which could then be conjugated with a wide spectrum of biomolecules (e.g., peptides, nucleic acids, and antibodies) via well-established bioconjugation methods. To show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be introduced into live cells, the micelles were conjugated with Tat peptide, which is derived from HIV virus and is known to be able to introduce a variety of nanomaterials into live cells with high efficiency and low toxicity [40,41,42]. The thus-formed Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs were then incubated with HeLa cells, and live cell confocal imaging was conducted to study the cellular transport of the fluorescent nanomaterials. The live cell confocal imaging system used here permits spinning-disk confocal imaging of live cells cultured on the microscope stage, ensuring that the natural transport process is followed with minimal disturbance. HeLa cells were selected here because this cell line was used in the first tracking study of the cellular transport of Tat peptide-conjugated QDs by Ruan et al. [42]. It was found that, 6 h after the first contact of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs with the cells, many of the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs had been internalized by the cells, judging by the composite confocal images to show the positions of QDs, cell nucleus and cell periphery, and the cellular uptake level was much higher than that without the assistance of Tat peptide (Fig. 6b). Imaging of the change of QD distribution at different time points of cellular transport for the Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs indicated that, after entering the cells, they were gradually accumulated at a perinuclear region (Additional file 5:Fig. S5). Additional file 6:video 1 shows a three-dimensional reconstructured image of the distribution of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs in the cell at the time point of 24 h, which further confirms cellular internalization and perinuclear accumulation. The behavior of the cellular transport of Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs is consistent with that of Tat peptide-conjugated QDs previously reported in the literature [42]. Further, to show that QD-encapsulated PS-PEG micelles can be modified (bio-functionalized) to bind with specific biological targets via ligand-receptor binding, the micelles were conjugated with RGD peptide, which is known to specifically recognize integrins on cell surface [43]. Fluorescent microscopy imaging results indicated that RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs could bind with α _v β₃ -integrin over-expressed cells (U87MG cell line, a human glioblastoma cell line, Fig. 6c, right), judging by the significant QD fluorescence on or in the cells. In contrast, the two control experiments, one of which used RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to incubate with MCF cells (without α _v β₃ -integrin over-expression, Fig. 6c, left) and the other of which used PS-PEG-COOH micellar QDs (without RGD peptide conjugation) to incubate with U87MG cells (Fig. 6c, middle), showed little to no QD fluorescence on or in the cells. Thus, these results demonstrated the ability of RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs to specifically bind with α _v β₃ -integrin molecules.

Interactions of PS-PEG micellar QDs (prepared by using sonication 30 s in the interfacial instability method) with biological cells. a PS-PEG micellar QDs were fairly biocompatible judging from the MTT cytotoxicity assay results. The concentrations were based on the amounts of QDs used. b Tat peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can be internalized by live cells. c RGD peptide-conjugated PS-PEG micellar QDs can specifically recognize and bind with the α _v β₃ -integrin molecules over-expressed on U87MG cells (right image ). In comparison, in the absence of α _v β₃ -integrin over-expression (MCF-7 cells, left image ) or Tat peptide (PS-PEG-COOH micellar QDs, middle image ), no significant binding (QD fluorescence) was observed. The red fluorescence was from QDs. The cell nucleus was stained by the blue fluorescent dye Hoechst 33342. Cell periphery is shown by white line (from the corresponding bright field microscopy images)