Nanopartikel Tembaga Oksa-Hidroksida Doped Ligand: Strategi Antimikroba Efektif

Abstrak

Resistensi bakteri terhadap terapi antimikroba adalah masalah klinis yang semakin meningkat. Hal ini sama seperti untuk aplikasi topikal seperti juga untuk terapi sistemik. Secara topikal, ion tembaga dapat menjadi antimikroba yang efektif dan murah yang bertindak melalui banyak jalur sehingga membatasi peluang bakteri untuk resistensi. Namun, kimia tembaga tidak memudahkan formulasi yang akan dengan mudah melepaskan ion tembaga pada pH yang kompatibel biologis. Di sini, kami telah mengembangkan nanopartikel hidroksida oksa-tembaga adipat tartrat (CHAT) sebagai bahan yang murah, aman, dan mudah disintesis yang seharusnya memungkinkan rilis ion tembaga antimikroba dalam lingkungan luka yang terinfeksi.

Pertama, kami menyintesis CHAT dan menunjukkan bahwa ini memiliki ukuran partikel terakui 2–5 nm dan potensial zeta rata-rata −40 mV. Berikutnya, saat dicairkan ke dalam media bakteri, CHAT menunjukkan efek yang serupa dengan klorida tembaga terhadap Escherichia coli dan Staphylococcus aureus, dengan aktivitas bergantung pada dosis yang sebagian besar terjadi pada 12,5–50 mg/L tembaga. Memang, pada tingkat ini, CHAT dengan cepat melarutkan diri dan, seperti yang dikonfirmasi oleh biosensor tembaga bakteri, menunjukkan pemuatan intracellular yang identik dengan ion tembaga yang berasal dari klorida tembaga. Namun, saat diformulasikan pada 250 mg/L dalam matriks yang diterapkan secara topikal, yaitu hidroksietil selulosa, manfaat CHAT dibandingkan klorida tembaga terlihat. Pertama menghasilkan rilis tembaga yang cepat dan berkelanjutan dalam rentang bakterisidal, sedangkan klorida tembaga, yang membentuk endapan tidak larut pada konsentrasi dan pH tersebut, mencapai rilis maksimum 10 ± 7 mg/L tembaga pada 24 jam.

Kami menyediakan formulasi praktis untuk terapi antimikroba berbasis tembaga topikal. Studi lebih lanjut, terutama in vivo, layak dipertimbangkan.

Latar Belakang

Infeksi mikroba berkontribusi pada jutaan kematian secara global [1]. Seringkala, ketidakefisian perawatan antimikroba disebabkan oleh resistensi mikroba terhadap antibiotika konvensional [2,3,4,5]. Oleh karena itu, antimikroba baru sangat dicari. Tembaga lama diakui karena efek antimikrobanya dan mungkin memiliki potensi untuk keberlanjutan klinis yang lebih besar dari antibiotika standar karena tampaknya bertindak melalui banyak mekanisme terhadap bakteri, termasuk interaksi dengan protein dan DNA bakteri, produksi spesies reaktif oksigen (ROS), dan gangguan integritas membran [6, 7]. Untuk alasan yang sama, disarankan bahwa potensi resistensi antimikroba dari strain bakteri patogen terhadap tembaga dan logam lain adalah terbatas [7,8,9]. Selain itu, tembaga relatif murah dan bertoksisitas rendah bagi manusia karena esensialitasnya pada tingkat jejak telah memastikan evolusi kontrol homeostatik yang ketat [10,11,12]. Oleh karena itu, ada penggunaan umum logam ini untuk tindakan pencegahan infeksi, sebagian besar untuk menghindari pembentukan biofilme bakteri pada permukaan di area berisiko tinggi seperti rumah sakit dan asuhan lanjut [13, 14]. Sebaliknya, tembaga belum menemukan penggunaan terapeutik yang signifikan dalam formulasi antimikroba topikal, tidak seperti perak yang banyak digunakan [15].

Bakteri rentan terhadap pemuatan tembaga dalam lingkungan intracellular mereka, dan efektivitas sumber tembaga terkait dengan kemampuannya untuk melepaskan ion tembaga [16, 17]. Dalam hal ini, tantangan signifikan untuk antimikroba berbasis tembaga adalah pencapaian formulasi yang konsentrasi yang memungkinkan rilis berkelanjutan dari tembaga antimikroba pada konsentrasi efektif ke dalam fluida seperti eksudat luka. Ini karena tembaga adalah ion logam hidrolitik dan seiring dengan peningkatan konsentrasinya pada pH formulasi topikal umum (yaitu dekat netral), kecenderungannya untuk menginduksi hidrolisis dan membentuk oksa-hidroksida tidak larut juga meningkat [18]. Pada pH fisiologis, oksa-hidroksida ini bukan substrat yang baik untuk rilis ion tembaga yang larut, atau oleh karena itu, potensialmente efektif [16, 19, 20].

Baru-baru ini, dengan tujuan menemukan suplemen besi yang tersedia secara biologis, masalah rilis efektif ion ferritik dari sumber oksa-hidroksida yang konsentrasi di bawah kondisi fisiologis diselesaikan melalui modifikasi struktural partikel primer. Dalam karya tersebut, besi diendapkan dalam kehadiran ligan kristal-doping GRAS, yaitu asam adipat dan asam tartrat, untuk sengaja menstabilkan struktur akhir oksa-hidroksida ferritik. Strategi ini memiliki keuntungan (a) mencegah aglomerasi irreversibel partikel oksa-hidroksida ferritik dan (b) meningkatkan secara besar-besaran labilitasnya (kemudahan kelerengaan) di bawah kondisi fisiologis yang sesuai. Bahan ini telah disebut “besi [oksa-]hidroksida adipat tartrat” atau IHAT [21, 22]. Dengan analogi, kami mempertimbangkan di sini apakah tembaga [oksa-]hidroksida adipat tartrat (CHAT) dapat disintesis dan diformulasikan pada konsentrasi tinggi tetapi masih melepaskan ion tembaga pada tingkat antimikroba yang efektif. Khususnya, tujuan dari karya ini adalah untuk mengembangkan proses sintesis yang murah dan dapat diskalakan yang menghasilkan nanopartikel oksa-hidroksida tembaga yang, tidak seperti materi yang telah dilaporkan sebelumnya, seharusnya dengan mudah melepaskan konsentrasi biocida ion tembaga dalam lingkungan luka yang disimulasikan.

Oleh karena itu, dalam studi ini, kami menyintesis CHAT dan mengkarakterisasi kemampuannya untuk menyampaikan tembaga yang tersedia secara biologis, dan oleh karena itu, untuk mendemonstrasikan aktivitas antimikroba. Kami telah berkonsentrasi pada strain Escherichia coli sebagai spesies “indikator” untuk bakteri Gram-negatif [19, 23] tetapi telah secara tambahan menunjukkan bukti-prinsip efek terhadap Staphylococcus aureus, sebagai bakteri Gram-positif yang sering memperoleh resistensi multiobat. Oleh karena itu, studi ini bertujuan untuk menilai nilai pengembangan CHAT lebih lanjut untuk aplikasi klinis dalam terapi antimikroba topikal.

Metode

Keadaan sebaliknya, semua eksperimen dilakukan menggunakan air ultra-tinggi murni (UHP) (purifikasi osmosis terbalik; 18,2 ΩM/cm), pada suhu kamar (20 ± 2 °C), dan semua reagen dibeli dari Sigma Aldrich.

Formulasi Tembaga dan Nanopartikel CHAT

Stok klorida tembaga (40 mM tembaga) disiapkan dengan melarutkan CuCl₂·2H₂O dalam air. Stok nanopartikel oksida tembaga (CuO NPs; Sigma 544868) disiapkan dari serbuk komersial yang bebas dari impuritas, memiliki ukuran partikel primer 34 nm (rentang 10–50 nm), dan sebelumnya telah diuji sebagai agen antimikroba [24,25,26]. Stok ini disiapkan pada 1,3 g/L tembaga dengan mendisperse serbuk dalam air dengan pengadukan yang energik. Suspensi koloidal nanopartikel CHAT disintesis menggunakan metode co-precipitation [27]. Secara singkat, klorida tembaga, asam tartrat, dan asam adipat dilarutkan dalam air untuk mencapai rasio molar tembaga/asam tartrat/asam adipat dalam suspensi akhir 2:1:1 dan konsentrasi tembaga 2,5 g/L. pH awal campuran selalu di bawah 2,5, dan tembaga sepenuhnya terlarutkan. pH kemudian secara perlahan ditingkatkan dengan penambahan titik-titik larutan konsentrat NaOH (5 M) dengan pengadukan konstan hingga pH 8,2 ± 0,2.

Konten Tembaga dan Distribusi Fasa Suspensi Koloidal CHAT

Konten tembaga dalam suspensi koloidal ditentukan oleh spektrometri emisi optik plasma terkait induktif (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Semua sampel dicairkan hingga konsentrasi di bawah 100 mg/L dalam HNO₃ 5% (v/v) paling sedikit 24 jam sebelum analisis untuk memastikan kelerengan penuh tembaga. Standar kalibrasi (0,1 hingga 100 mg/L tembaga) disesuaikan matriks dalam HNO₃ 5%, dan kuantifikasi tembaga dilakukan pada 324,754 nm. Fraksi konten tembaga menjadi persentase tembaga yang aglomerasi, nanopartikel, dan larut tercapai melalui filtrais dan ultra-filtrais stok CHAT. Suspensi difilter (potong 200 nm), dan retentat dianggap sebagai fraksi aglomerasi. Untuk mengisolasi tembaga larut dan membedakannya dari tembaga nanopartikel, suspensi koloidal di-ultrafilter melalui filter 3-KDa (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16.000×g, 5 menit) karena ini sesuai dengan potong di bawah 1 nm (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). Konten tembaga dari semua fraksi (total, filtrat 200 nm, ultra-filtrat 3 KDa) ditentukan oleh ICP-OES, dan fraksi diekspresikan sebagai persentase terhadap konten tembaga total sebagai berikut:

$$ {\displaystyle \begin{array}{l}\%\mathrm{Tembaga}\ \mathrm{Larut}\ \left(<1\mathrm{nm}\right)\%\kern0.5em =\frac{\kern0.5em {Cu}_{3\mathrm{KDa}}}{Cu_{\mathrm{Total}}}\times 100\\ {}\%\mathrm{Tembaga}\ \mathrm{Aglomerasi}=\frac{\ {Cu}_{\mathrm{Total}}-{Cu}_{<200\mathrm{nm}}\kern0.5em }{Cu_{\mathrm{Total}}}\kern0.5em \times 100\\ {}\%\mathrm{Tembaga}\ \mathrm{Nanopartikel}\kern0.5em =100-\%\mathrm{Tembaga}\ \mathrm{Aglomerasi}-\%\mathrm{Tembaga}\ \mathrm{Larut}\end{array}} $$

Penentuan Konten Tembaga dan Rasio Tembaga terhadap Ligan dalam Nanopartikel CHAT Kering

Nanopartikel CHAT diaglomerasi dan diendapkan untuk memungkinkan pemulihan dan penghapusan komponen yang tidak terikat. Untuk mengaktifkan ini, etanol ditambahkan ke dalam suspensi koloidal CHAT (2,5 g/L tembaga) pada rasio 2:1 etanol/suspensi (v/v), dan aglomerasi CHAT yang dihasilkan dipulihkan melalui sentrifugasi (4500×g × 15 menit dalam Mistral 6000). Fase larutan, yang berisi spesies ligan yang tidak terikat, dibuang. Penentuan konten tembaga dalam fase padat CHAT dilakukan sebagai berikut. Bubuk dihasilkan dengan mengeringkan oven pelet yang diendapkan etanol hingga bobot konstan pada 45 °C. Ini kemudian digiling dan 35,2 ± 0,3 mg (n = 2) dicerna dalam 11 ± 1 g HNO₃ 70%, dengan bobot yang akurat dicatat. Setelah sepenuhnya dicerna, larutan ini dicairkan 20-kali dalam air dan konsentrasi tembaga ditentukan oleh ICP-OES. Rasio ligan terhadap tembaga ditentukan secara langsung dari aglomerasi CHAT kering yang diendapkan etanol. Aglomerasi pertama kali dicerna ulang dalam air ke volume aslinya untuk memfasilitasi pelarutan dengan jumlah HCl yang lebih rendah—persyaratan untuk analisis kromatografi cairan efisiensi tinggi (HPLC). Aliquots dicerna dalam HNO₃ 5% untuk analisis tembaga ICP-OES (seperti yang dijelaskan di atas) atau dalam HCl 80 mM untuk analisis ligan (asam tartrat dan asam adipat) HPLC. Analisis ligan dilakukan dalam sistem kromatografi fase terbalik standar (kolom C18 dalam Waters Alliance 2690/5 yang dilengkapi dengan detektor PDA 2998; detail lebih lanjut diberikan dalam Additional file 1).

Karakterisasi Fisikokimia Suspensi CHAT

Distribusi ukuran partikel hidrodinamis ditentukan oleh pencaran cahaya dinamis (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Aliquots suspensi koloidal CHAT (2,5 g/L tembaga) ditransfer ke dalam cuvette disposable 1-mL, dan pengukuran (n = 3) dilakukan pada 25 ± 2 °C. Pengaturan yang tepat ditunjukkan dalam Additional file 2. Potensial zeta suspensi CHAT ditentukan oleh mikro-elektroforesis Doppler laser (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) menggunakan sel kapiler lipatan disposable (DTS1070) dan mengasumsikan konstanta dielektrik 78,5 dan viskositas 0,89 cP. Karakterisasi mikroskopi elektron transmisi (TEM) dilakukan dengan menitikkan tetesan suspensi CHAT pada grid karbon berlubang dan mengeringkan pada 50 °C selama semalam. Grid kemudian dicitrakan pada TEM (FEI-Philips CM100) pada 120 kV dalam mode bright-field.

Aktivitas Antimikroba Formulasi Tembaga

Ases dilakukan dalam media MOPS logam berat (HMM), media yang dikenal kompatibel dengan ion logam (Additional file 3), yang disemen dengan glukosa 0,4% dan hidrolisat asam kasein 0,1%, dan pH disesuaikan ke 7,2 ± 0,2 [28]. Sebelum penambahan senyawa tembaga, Escherichia coli (NCTC11100) dan Staphylococcus aureus RN4220 [29] ditumbuhkan selama semalam pada 30 °C dengan pengocokan konstan dalam incubator Infors HT Minitron pada 80 rpm. Selanjutnya, suspensi bakteri dicairkan hingga densitas optik 0,05–0,1 (ca. 10⁶ sel/mL) pada 595 nm untuk E. coli (Multiskan RC 351 Labsystem) atau 600 nm untuk S. aureus (pembaca plate Multiskan, ThermoFisher Scientific). Selanjutnya, stok klorida tembaga dan suspensi koloidal CHAT dicairkan dalam HMM dan ditambahkan ke dalam suspensi bakteri untuk mendapatkan konsentrasi tembaga akhir antara 0,4 dan 100 mg/L. Inkubasi kemudian berlangsung selama 6 hingga 9 jam, dan pertumbuhan bakteri ditentukan dengan memantau densitas optik sebagai ukuran biomasa bakteri.

Kelerengan tembaga seiring waktu dalam media pertumbuhan bakteri ditentukan dengan mencairkan stok klorida tembaga dan suspensi koloidal CHAT dalam HMM ke 12,5, 25, dan 50 mg/L tembaga dan menentukan fraksi tembaga larut pada 0, 2, 4, dan 8 jam melalui ultrafiltrais (3 KDa) dan analisis ICP-OES, seperti yang dijelaskan di atas.

Ketersediaan Biologis Intracelluler Formulasi Tembaga

Bakteri sensing tembaga bioluminesensial rekombinan, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), yang merespons jumlah tembaga yang tersedia secara biologis sub-toksik dengan meningkatkan bioluminesensinya digunakan untuk mengukur ketersediaan biologis tembaga senyawa tembaga [30]. Suspensi bakteri disiapkan seperti yang dijelaskan untuk ases aktivitas antimikroba dan diinkubasi dengan serangkaian pengenceran klorida tembaga dan CHAT (0 hingga 50 mg/L tembaga) pada plate mikrowell 96-lubang selama 4 jam. Bioluminesens diukur dengan Orion II Plate Luminometer (Berthold Detection Systems), dan induksi bioluminesens dihitung sebagai berikut:

$$ Bioluminescence\ induction,\ Fold\ Change=\frac{ Bioluminescence\ in\ Cu\ exposure}{Bioluminescence\ without\ Cu} $$

Stres Intracelluler yang Diinduksi oleh Formulasi Tembaga

Kemampuan senyawa tembaga untuk menginduksi anion superoxide intracellular dan patau rantai tunggal DNA dievaluasi dengan bakteri bioluminesensial rekombinan, E. coli K12::soxRSsodAlux dan E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), masing-masing [17]. Kultur bakteri disiapkan seperti yang dijelaskan untuk ases antimikroba, dan bakteri diekspose terhadap serangkaian pengenceran klorida tembaga dan CHAT (0 hingga 50 mg/L tembaga) pada plate mikrowell putih 96-lubang selama 4 jam. Performa biosensor dikontrol dengan mengekspos bakteri pada kimia indutor anion superoxide menadion (0,04–30 μg/L), atau pada peroksida hidrogen (0,1–150 mg/L), sebagai kontrol positif untuk E. coli K12::soxRSsodAlux atau E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), masing-masing. Lagi, bakteri diinkubasi pada plate mikrowell putih 96-lubang dan bioluminesens diukur dengan Orion II Plate Luminometer dan induksi bioluminesens dihitung seperti dalam Eq. 5.

Penyisipan Formulasi Tembaga dalam Gel Hidroksietil Selulosa

Stok klorida tembaga, CHAT, dan nanopartikel oksida tembaga komersial, tidak dimodifikasi (CuO NPs) dicairkan dalam air UHP ke 250 mg/L tembaga. Suspensi CHAT dan CuO NPs yang dihasilkan pada pH hampir netral dan dapat disisipkan secara langsung dalam gel, tetapi larutan klorida tembaga masih asam setelah dicairkan dan oleh karena itu disesuaikan ke pH 7,0 ± 0,2. Hidroksietilselulosa (HEC) kemudian dilarutkan secara langsung (2% w/v) ke dalam stok yang dicairkan yang berbeda menggunakan roller mixer (Denley Spiramix 5) hingga gel homogen terbentuk. Sepuluh gram dari setiap gel dipindahkan ke dalam tabung Falcon dan dibiarkan menyonyam selama semalam. Selanjutnya, 10 mL buffer natrium bikarbonat 50 mM segar (dilarutkan dari bubuk NaHCO₃ dan disesuaikan ke pH 7,0 ± 0,2) dipindahkan ke dalam setiap tabung dengan hati-hati untuk meminimalkan gangguan pada antarmuka gel-cair (luas permukaan spesifik 7,1 cm²). Aliquots kemudian dikoleksi dan dianalisis oleh ICP-OES untuk menentukan rilis tembaga seiring waktu.

Hasil

Seperti yang dijelaskan dalam bagian “Metode”, CHAT disintesis dengan cara yang serupa dengan analog besinya, IHAT [21, 22], dengan doping oksa-hidroksida tembaga (2,5 g/L tembaga) dengan asam tartrat dan asam adipat. Ini menghasilkan suspensi koloidal stabil di mana semua tembaga melewati filter 200 nm tetapi sangat sedikit (5%) melewati filter 3-KDa. Ini menunjukkan bahwa sebagian besar tembaga adalah nanopartikel (95%; Gambar 1a) dengan sedikit tembaga “bebas” dan tidak ada aglomerasi besar yang terdeteksi—seperti analog IHAT [21, 22]. Saat diendapkan dalam etanol, untuk menghilangkan spesies ligan yang tidak terikat, dan kemudian dikeringkan, CHAT mengandung 31 ± 1% tembaga (w/w) menurut analisis ICP-OES. Rasio molar tembaga terhadap ligan, yang ditentukan oleh HPLC, adalah 2:1 untuk tembaga terhadap tartrat dan 2:0,3 untuk tembaga terhadap adipat. Partikel CHAT tampak hampir monodisperse dengan diameter 2–3 nm melalui citra TEM (Gambar 1b). Temuan ini konsisten dengan data ukuran hidrodinamis CHAT ditambah dengan kulit hidrasi karena diameter median menurut volume dalam air UHP adalah 3,4 nm (Gambar 1c) dan distribusi ukuran sempit (2,4–5,6 nm untuk 80% volume) ketika dievaluasi dengan pencaran cahaya dinamis. Potensial zeta rata-rata adalah −39 mV (Gambar 1d), konsisten dengan nanopartikel yang membentuk dispersi akuat stabil [27], dan, memang, suspensi stok CHAT ditunjukkan stabil selama beberapa tahun (Additional file 4).

Selanjutnya, kami mempertimbangkan aktivitas antimikroba CHAT saat suspensi stok dicairkan dalam media pertumbuhan bakteri ke konsentrasi yang terkait dengan aktivitas antimikroba garam tembaga. Untuk CHAT dan klorida tembaga, kurva inhibisi pertumbuhan sangat serupa untuk E. coli dan S. aureus dengan sebagian besar aktivitas terjadi pada konsentrasi tembaga total antara rentang 12,5 dan 50 mg/L (Gambar 2). Inhibisi pertumbuhan E. coli yang lengkap diamati setelah inkubasi dengan 18,8 (CuCl₂) dan 25 (CHAT) mg/L tembaga, sedangkan untuk S. aureus, inhibisi pertumbuhan yang lengkap diperoleh pada 75 (CuCl₂) dan 100 (CHAT) mg/L tembaga (Gambar 2; Persentase inhibisi pertumbuhan vs konsentrasi tembaga disediakan dalam Additional file 5).

Memang, pada konsentrasi antimikroba ini, setidaknya 94% CHAT dengan cepat melarutkan diri (dalam 15 menit), lagi seperti yang dihitung oleh ultrafiltrais dan analisis ICP-OES (Gambar 3a). Kami therefore menyangka bahwa efektivitas antimikroba CHAT terkait dengan labilitas kimia ini, dengan pelarutan cepat nanopartikel yang memungkinkan akuisisi intracellular ion tembaga oleh bakteri. Untuk menguji ini, kami menantang sensor tembaga E. coli, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), di mana bioluminesens meningkat sebagai respons terhadap konsentrasi ion tembaga intracellular sub-toksik [30], dengan 0 hingga 50 mg/L tembaga sebagai CHAT atau klorida tembaga. Peningkatan konsentrasi dalam media budaya dari kedua sumber tembaga menyebabkan peningkatan bioluminesens dalam strain sensor tembaga E. coli (Gambar 3b), konsisten dengan kenaikan tembaga intracellular. Lereng kurva respons-dosis identik hingga 6,25 mg/L untuk kedua sumber tembaga mengonfirmasi bahwa tembaga yang tersedia secara biologis dari CHAT dapat dibandingkan dengan sumber yang sepenuhnya terlarut. Selanjutnya, pada konsentrasi hingga 50 mg/L tembaga, luminesensi tidak meningkat karena toksisitas kedua senyawa tembaga (Gambar 3b).

Secara paralel dengan mempelajari tembaga intracellular dalam E. coli yang diekspose terhadap larutan yang disiapkan dengan CHAT atau klorida tembaga, kami juga menguji kemampuan larutan ini untuk memicu anion superoxide intracellular atau menyebabkan kerusakan DNA bakteri dalam biosensor E. coli yang berbeda. Dalam kedua kasusnya, tidak ada efek yang signifikan teramati, meskipun sensor merespons kontrol positif yang relevan, yaitu peroksida hidrogen dan menadion, masing-masing (Gambar 3c, d). Digabungkan, respons ekivalen dari ketiga biosensor bakteri terhadap larutan yang disiapkan dari berbagai bentuk kimia tembaga sangat mendukung gagasan bahwa, dalam kedua kasus, bakteri sedang diekspose terhadap tembaga larut yang sama, meskipun satu formulasi awalnya adalah nanopartikel.

Terakhir, seperti yang disebut di atas, keuntungan CHAT dibandingkan garam tembaga larut hanya akan terlihat jika formulasi konsentrasi memungkinkan CHAT untuk mempertahankan labilitasnya tidak seperti yang terakhir. Menggunakan hidroksietil selulosa (HEC), basis air umum untuk formulasi topikal [31,32,33], kami menyisipkan 250 mg/L tembaga sebagai klorida tembaga, CHAT, atau sebagai nanopartikel oksida tembaga komersial (CuO NPs). Ketika 10 mL buffer NaHCO₃ 50 mM, sebagai eksudat luka yang disederhanakan, ditambahkan ke 10 g dari setiap gel yang mengandung tembaga HEC (yaitu 2,5 mg tembaga), ada rilis tembaga yang berkelanjutan dari persiapan yang mengandung CHAT, hingga lebih dari 60 mg/L pada 24 jam (Gambar 4). Selain itu, rilis cukup cepat dengan konsentrasi aktif antimikroba yang tercapai pada 2–4 jam. Sebaliknya, klorida tembaga yang disesuaikan pH-nya netral adalah substrat yang buruk untuk rilis tembaga, seperti yang diantisipasi oleh kecenderungannya untuk hidrolisis dan membentuk aglomerasi oksa-hidroksida tembaga, sehingga pada 24 jam, hanya 10 ± 7 mg/L tembaga yang tercapai dalam larutan (Gambar 4). Nanopartikel oksida tembaga komersial tidak menghasilkan rilis tembaga yang dapat teramati sama sekali (Gambar 4).

Diskusi

Kami menunjukkan di sini bahwa nanomaterial berbasis tembaga, yaitu CHAT, dapat diformulasikan pada konsentrasi tinggi, tidak seperti nanopartikel berbasis tembaga yang telah dijelaskan sebelumnya [34, 35], sambil mempertahankan propertinya sebagai sumber tembaga yang tersedia secara biologis dan labil dengan efikasi antimikroba. Seperti yang disebut di atas, sintesis CHAT terinspirasi dari banyak tahun kerja sebelumnya pada analog besinya, IHAT [21, 22]. Ini, pada gilirannya, terinspirasi dari solusi alam untuk rotasi mineral cepat in vivo, untuk daur ulang yang efisien dari ion logam esensial, di mana molekul organik digunakan untuk menstabilkan struktur kristal partikel mineral primer [21, 22]. Dalam versi sintetis, ligan GRAS diintegrasikan ke dalam oksa-hidroksida logam saat terbentuk dalam larutan dari polimer silang [21, 22]. Melalui destabilisasi struktural, ini memastikan labilitas fase mineral akhir dan juga menghasilkan nanopartikel yang sangat negatif—seperti yang ditunjukkan oleh pengukuran potensial zeta—yang menolak aglomerasi dan agregasi, sehingga menghasilkan suspensi nanopartikel yang stabil selama tahun. Di sini, dan seperti yang sebelumnya ditunjukkan untuk IHAT, tartrat adalah ligan dominan dalam mencapai perubahan fisikokimia ini pada struktur oksa-hidroksida tembaga karena incorporasinya sekitar 3 kali lipat lebih besar daripada adipat—yang terakhir berperan lebih sebagai buffer selama sintesis [21, 22].

Dalam absence modifikasi, oksa-hidroksida logam yang baru diendapkan akan aglomerasi dan agregasi dan akan mulai menua, di mana mereka kondensasi dan secara bertahap meningkat kristalinnya. Transisi ukuran dan fasa mineral ini mengurangi kemampuan struktur untuk berpartisipasi dalam reaksi balik, yaitu, untuk meledak kembali. Oleh karena tidak mengejutkan bahwa ketika oksa-hidroksida tembaga baru terbentuk, dari netralisasi pH larutan klorida tembaga, setidaknya beberapa tembaga larut dilepaskan dalam ases rilis gel kami (Gambar 4), sedangkan untuk nanopartikel oksida tembaga komersial, yang aglomerasi dan terdiri dari fase mineral yang lebih padat (yaitu oksida tembaga), tembaga yang tidak teramati dilepaskan. Kekurangan pelarutan dari nanopartikel 30 nm komersial—yang, terlepas dari status agregasinya, akan menyajikan luas permukaan besar untuk pelarutan—menunjukkan bahwa fasa mineral adalah pengemudi kunci dalam rilis ion tembaga dan bahwa, seperti yang disebut di atas, modifikasi partikel primer mineral, yang dicapai di sini melalui doping ligan, benar-benar diperlukan untuk membawa perubahan yang signifikan dalam karakteristik pelarutan. Selain itu, sintesis CHAT dilakukan pada suhu kamar, karena suhu sintesis tinggi mendukung fase yang kurang amorf yang akibatnya dapat mengurangi laju pelarutan. Juga, sintesis pada suhu kamar memiliki manfaat mengurangi biaya energi saat memproduksi dalam skala besar.

Meskipun mungkin ada cara lain untuk formulasi konsentrasi tembaga yang tinggi dan stabil yang memungkinkan rilis berkelanjutan dan pelarutan cepat ion ketika diperlukan, kami tidak dapat membayangkan sintesis lain yang sederhana ini dan biaya barang (untuk reagen) yang rendah. Ini adalah faktor penting karena isu infeksi topikal dan resistensi bakteri sama sekali tidak terbatas pada negara berkembang. Negara berkembang semakin dilanda oleh masalah resistensi bakteri dan oleh karena itu solusi antimikroba yang terjangkau dan efektif sangat dibutuhkan [36, 37]. Meskipun tidak cukup studi untuk mencapai solusi konkret, ada bukti bahwa resistensi terhadap ion logam toksik lebih sulit dicapai oleh bakteri daripada resistensi terhadap antibiotika konvensional [7]. Teori didasarkan pada ide bahwa tembaga dan perak mungkin tidak memiliki jalur aktivitas antimikroba yang diskret, melainkan dapat mempengaruhi banyak target termasuk berbagai sistem enzim dan oleh karena itu dapat menstabilkan struktur sel bakteri secara keseluruhan [17, 19, 38]. Memang, telah ditunjukkan bahwa bakteri tetap rentan terhadap tembaga dan ion logam tertentu meskipun paparan selama berabad-abad [6, 7, 39]. Menariknya, ada bukti terbaru bahwa antimikroba berbasis logam bahkan dapat mengembalikan sensitivitas bakteri terhadap antibiotika konvensional meskipun resistensi sebelumnya [40, 41].

Kesimpulan

Di sini, kami telah menunjukkan bahwa masalah ion tembaga yang tersedia secara biologis, pada pH fisiologis dan konsentrasi tinggi, dapat diatasi dengan doping nanomineral tembaga dengan asam organik, dalam strategi yang serupa dengan yang sebelumnya digunakan untuk analog besi [21, 22]. Nanopartikel berbasis tembaga ini (disebut CHAT) dengan cepat melarutkan diri dalam media bakteri, menunjukkan penyerapan intracellular tembaga dan aktivitas antibakteri yang setara dengan garam tembaga larut. Kritis, namun, dan tidak seperti garam tembaga sederhana, CHAT dapat dikonsentrasi dalam formulasi pH netral dan mempertahankan labilitasnya dalam hal rilis ion tembaga. Memang, CHAT melepaskan ion tembaga dalam rentang bakterisidal dan dapat menjadi dasar untuk agen antimikroba topikal baru, baik sendirian atau meningkatkan efektivitas antibiotika yang menahan. Seiring dengan meningkatnya resistensi antibiotika, antimikroba topikal baru diperlukan dan CHAT murah, mudah disintesis, dan menggunakan komponen yang umumnya diakui aman (GRAS). Studi in vivo layak dipertimbangkan.

Singkatan

CHAT:

Nanopartikel tembaga [oksa-]hidroksida adipat tartrat

CuO NPs:

Nanopartikel oksida tembaga

DLS:

Pencaran Cahaya Dinamis

Escherichia coli:

E. coli

GRAS:

Umum Diakui Aman

HEC:

Hidroksietilselulosa

HMM:

Media MOPS Logam Berat

HPLC:

Kromatografi Cair Efisiensi Tinggi

ICP-OES:

Spektrometri Emisi Optik Plasma Terkait Induktif

IHAT:

Nanopartikel besi [oksa-]hidroksida adipat tartrat

MOPS:

3-(N-morfolino) propansulfat asam

Staphylococcus aureus:

S. aureus

UHP:

Ultra-Tinggi Murni