Deteksi Cepat di Lokasi Rongalite dalam Makanan Menggunakan Ujian Strip Aliran Lateral Berbasis Aptamer Sandwich
Abstrak
Kami menyajikan ujian strip aliran lateral (LFSA) yang cepat dan mudah digunakan yang menggunakan dua aptamer yang sangat spesifik—A09 dan B09—yang difungsionalkan dengan nanopartikel emas (AuNPs) untuk mendeteksi rongalite, bahan berbahaya yang terkadang digunakan sebagai aditif makanan. Aptamer A09 yang dilabeli biotin diimobilkan pada membran nitroselulosa yang dilapisi streptavidin sebagai sond tangkap, sementara aptamer B09 yang dikonjugasi AuNPs berfungsi sebagai sond sinyal. Ujian ini memberikan garis merah yang jelas di zona uji untuk konsentrasi rongalite yang rendah hingga 1 µg mL−1, yang dapat diamati oleh mata telanjang dalam waktu 15 menit, menjadikannya ideal untuk pemantauan di lokasi produk pertanian dan pangan.
Latar Belakang
Rongalite (natrium hidroksimetilsulfinat) banyak digunakan dalam pewarnaan industri dan kimia polimer sebagai agen perekat. Namun, penambahan yang tidak sengaja atau sengaja ke dalam produk makanan telah menyebabkan khawatir serius tentang kesehatan, termasuk pemerikalan formaldehida dan efek samping yang dilaporkan di China [5]. Oleh karena itu, metode deteksi yang dapat diandalkan dan cepat sangat penting untuk melindungi keamanan pangan dan kesehatan masyarakat.
Aptamer—molekul DNA atau RNA rentetan tunggal—menawarkan keuntungan yang berbeda dibandingkan antibodi: mereka disintesis kimiawi dengan konsistensi batch yang tinggi, menunjukkan imunogenisitas rendah, dan dapat dengan mudah dimodifikasi untuk berbagai platform sensa [6]. Meskipun ujian aptamer elektrokimia dan terpadu enzim ada untuk rongalite, mereka sering memerlukan instrumen yang kompleks dan waktu analisis yang lama [10]. Sebaliknya, ujian strip aliran lateral (LFSAs) menyediakan solusi satu langkah, portabel, dan berbiaya rendah yang cocok untuk pengujian di lokasi.
Sampai saat ini, hanya sejumlah kecil ujian strip kromatografi berbasis aptamer yang menargetkan rongalite [13]. Mempertimbangkan penatalaksanaan regulasi yang semakin ketat dan prevalensi aditif ilegal, kami mengembangkan LFSA format sandwich yang memanfaatkan spesifisitas dua aptamer dan kejelasan optik AuNPs, memungkinkan deteksi cepat di lokasi rongalite dalam berbagai matriks makanan.
Metode
Bahan dan Reagen
Rongalite diperoleh dari Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Klorida emas(III) trihidrat (HAuCl4) dan sitrat natrium dibeli dari Sigma-Aldrich (USA). Reagen pendukung (NaCl, BSA, sukrosa, PEG20000, Tween-20) diperoleh dari Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Membran nitroselulosa (NC) (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) disuplai oleh Pall Corporation dan Millipore Corporation melalui Jiening Biotech Company. Sampel makanan—termasuk kue beras (ersi), mie, tahu, dan tahu glucono-delta-lakton—dikumpulkan dari pasar lokal.
Persiapan Aptamer melalui SELEX
Protokol evolusi sistematik dari ligan dengan pengayaan eksponensial (SELEX) diikuti untuk mengisolasi aptamer dengan affinitas tinggi terhadap rongalite. Library ssDNA 82-mer awal (5′‑GACATATTCAGTCTGACAGCG‑N40‑GATGGACGAATATCGTCTAGC‑3′) diinkubasi dengan rongalite, urutan yang tidak terikat dicuci, dan aptamer yang terikat diperkaya oleh PCR. Setelah 12 siklus pengayaan—termasuk seleksi kontras terhadap senyawa yang terkait secara struktural—penclonan klonal menghasilkan dua aptamer affinitas tinggi: A09 dan B09. Urutan mereka tercantum di bawah ini dan disintesis oleh Tsingke Biological Technology.
Aptamer primer A09 (dilabeli biotin): 5′‑Biotin‑GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
Nanopartikel emas (~40 nm diameter) disintesis melalui reduksi sitrat HAuCl4 mengikuti protokol standar [18]. Ukuran dan monodispersitas dikonfirmasi oleh spektroskopi UV/Vis (λmax ≈ 530 nm) dan mikroskop transmisi elektron (TEM) (Fig. 2). Aptamer sekunder B09 dikonjugasi dengan AuNPs dengan menginkubasi 1 mL larutan AuNP dengan 4 µL dari 100 µM B09, diikuti dengan pengendapan yang diinduksi garam, sentrifugasi, dan resuspended dalam 1 mL PBS (pH 7.4) yang berisi 5 % BSA, 5 % sukrosa, 1 % PEG20000, dan 0,05 % Tween-20.
Desain Strip Aliran Lateral
Rangkaian LFSA (Fig. 3) melibatkan pad sampel, pad konjugasi emas, membran NC (Pall 90), dan pad serap pada kartu pendukung. Pad sampel dirawat sebelumnya dengan PBS + 3 % BSA + 0,05 % Tween-20 dan dikeringkan pada 37 °C selama 2 jam. Pad konjugasi emas menerima B09-AuNPs. Garis uji pada membran NC dibuat dengan mencoret 1 µL biotin-A09 (10 µM) yang dicampur dengan 10 µL streptavidin (1 mg mL−1) selama 1 jam pada 4 °C, sementara garis kontrol terdiri dari streptavidin saja. Setelah dikeringkan, strip dipotong menjadi bagian 40 mm dan disimpan selama semalaman pada 37 °C.
Ujian Spesifikitas
Strip uji ditantang dengan 80 µL dari 10 µg mL−1 rongalite, formalin, atau air deion. Munculnya garis uji merah yang berbeda mengonfirmasi spesifikitas, sementara garis kontrol tetap terlihat di semua kondisi.
Ujian Bergantung pada Dosis
Konsentrasi rongalite (0, 0,8, 1, 5, 10 µg mL−1) disiapkan dalam PBS dan 80 µL diterapkan pada pad sampel. Garis merah yang terlihat dalam waktu 15 menit menentukan batas deteksi, yang diamati pada 1 µg mL−1.
Ujian Sampel Makanan
Lima sampel makanan yang diduga mengandung rongalite diekstrak (1 g + 10 mL air). Setelah difilter, 80 µL dari setiap ekstrak diuji pada LFSA. Hasil divalidasi silang dengan kromatografi cairan efisiensi tinggi (HPLC).
Hasil dan Pembahasan
Afinitas dan Spesifikitas Aptamer
Regresi non-linear dari kurva penyurupan (Fig. 4a) menghasilkan konstanta dissosiasi sebesar 61,1 ± 16,4 nM untuk A09 dan 39,8 ± 12,7 nM untuk B09, mengonfirmasi ikatan yang kuat dan spesifik terhadap rongalite (Fig. 4b).
a Kurva ikatan untuk A09 dan B09 (penentuan Kd). b Interaksi affinitas tinggi antara aptamer dan rongalite.
Kinerja Ujian
LFSA sandwich menghasilkan garis uji merah saat AuNP-B09 terikat rongalite dan ditangkap oleh A09 yang diimobilkan. Garis kontrol, yang dibentuk oleh ikatan streptavidin dengan AuNP-B09 berlebih, mengonfirmasi integritas ujian (Fig. 5). Pengujian spesifikitas terhadap formalin dan air deion tidak menghasilkan positif palsu, dan batas deteksi ditetapkan pada 1 µg mL−1—yang jauh di bawah level yang dilaporkan dalam sampel makanan yang tercemar [5].
Spesifikitas (a) dan sensitivitas (b) dari LFSA. a 80 µL dari 10 µg mL−1 rongalite; b Larutan standar (0–10 µg mL−1) yang diuji.
Analisis sampel makanan mengonfirmasi kehadiran rongalite dalam beberapa produk, yang dikorefasikan oleh HPLC (Tabel 1). Keandalan ujian dikaitkan dengan buffer yang dioptimalkan (PBS pH 7.4 + 5 % BSA + 5 % sukrosa + 1 % PEG20000 + 0,05 % Tween-20) dan pilihan membran NC Pall 90, yang menyediakan aliran optimal dan ikatan non-spesifik minimal.
Dibandingkan dengan metode kromatografi (GC, HPLC), LFSA menawarkan sensitivitas yang sebanding sambil menghilangkan kebutuhan akan instrumen yang canggih dan waktu pemrosesan yang lama. Biaya rendahnya, operasi satu langkah, dan bacaan visual menjadikannya ideal untuk pemeriksaan keamanan pangan di lokasi dan kepatuhan regulasi.
Kesimpulan
Kami telah mengembangkan LFSA sandwich yang dapat diandalkan dan hemat biaya yang mendeteksi rongalite dalam matriks makanan dengan batas 1 µg mL−1. Ujian ini memanfaatkan spesifisitas aptamer ganda dan kejelasan optik AuNPs, memungkinkan penyaringan segera di lokasi. Platform ini dapat memainkan peran penting dalam mengurangi kontaminasi rongalite yang dibawa makanan dan melindungi kesehatan masyarakat.
Singkatan
AuNPs:
Nanopartikel emas
HPLC:
Kromatografi cairan efisiensi tinggi
LFIA:
Imunoassay aliran lateral
LFSA:
Ujian strip aliran lateral
NC membrane:
Membran nitroselulosa
POCT:
Pengujian di lokasi
SELEX:
Evolusi sistematik dari ligan dengan pengayaan eksponensial
