Deteksi Cepat Rongalite melalui Uji Sandwich Lateral Flow Strip Menggunakan Sepasang Aptamers

Metode

Bahan dan Reagen

Rongalit disediakan oleh Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl₄ (trisodium citrate dehydrate) dibeli dari Sigma Aldrich (USA). NaCl, BSA, sukrosa, formalin, PEG20000, dan Tween20 berasal dari Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

Membran NC (yaitu, pall 90, pall 170, dan Millipore 135) berasal dari Pall Corporation dan Millipore Corporation, secara terpisah, dan dibeli dari Jiening Biotech Company.

Sampel makanan, ersi (kue beras berbentuk persegi yang dipotong tipis di Cina), mi, tahu, dan glucono-δ-lactone-tofu, dibeli dari pasar terdekat.

Preparasi Aptamer melalui Evolusi Sistematis Ligan dengan Pengayaan Eksponensial (SELEX)

Proses SELEX terdiri dari langkah-langkah berikut (Gbr. 1):(i) inkubasi target dengan perpustakaan DNA acak, (ii) isolasi DNA yang terikat pada target, (iii) amplifikasi DNA dengan reaksi berantai polimerase (PCR) , (iv) persiapan DNA untai tunggal untuk perpustakaan putaran berikutnya, (v) pengulangan langkah i–iv selama 5–15 siklus yang melibatkan penyaringan penghitung interval dengan zat non-target untuk menghilangkan ssDNA nonspesifik, dan (vi) kloning dan pengurutan akhir dari perpustakaan yang diperkaya [16].

Proses pemilihan aptamer tipikal (SELEX)

Aptamer disaring mengikuti langkah-langkah yang dijelaskan sebelumnya. Secara singkat, perpustakaan aptamer ssDNA awal yang terdiri dari 82-mer nukleotida dengan urutan acak panjang berbasis 40 pusat dari masing-masing aptamer disintesis (Tsingke Biological Technology). Urutan acak dari kumpulan aptamer ssDNA adalah 5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′, di mana N berarti nukleotida acak dari A, G, C, atau T.

Dalam penelitian ini, primer 1 (5′-GACATATTCAGTCTGACAGC-3′) dan primer 2 (5′-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3′) digunakan untuk amplifikasi library.

Untuk menyaring aptamers yang secara khusus mengikat rongalite, perpustakaan ssDNA acak yang disintesis ditambahkan ke piring dengan rongalite. Selanjutnya, ssDNA yang tidak terikat dihilangkan dengan mencuci; ssDNA terikat dipulihkan dan diamplifikasi oleh PCR. Afinitas pengikatan aptamer secara bertahap meningkat saat putaran seleksi meningkat.

Kekhususan dan K _d nilai aptamers individu ditentukan mirip dengan metode Tang [17].

Urutan aptamer yang digunakan dalam karya ini adalah sebagai berikut:

• Aptamer utama A09,

  5′-Biotin-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC

• Aptamer sekunder B09,

  5′-Biotin-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Urutan aptamer ini (A09 dan B09) disintesis dan dibeli dari Tsingke Biological Technology.

Produksi AuNP

AuNPs disintesis melalui reduksi sitrat HAuCl₄ protokol [18]. Produksi AuNPs monodispersi dengan ukuran yang memadai dikonfirmasi oleh spektrofotometri UV/Vis (Thermo Scientific™ Evolution 60S). Berbentuk bulat (diameter sekitar 40 nm) dan AuNP berwarna merah tua disintesis. Ukuran AuNP yang tidak dimodifikasi ini diperkirakan dengan menggunakan hukum Beer–Lambert pada 530 ± 2 nm dan mikroskop elektron transmisi (Gbr. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

Aptamer B09 sekunder terkonjugasi dengan AuNPs disiapkan dengan mengikuti protokol yang dilaporkan [18]. Secara singkat, 1 mL AuNPs yang telah disiapkan diinkubasi dengan 4 μL larutan aptamer B09 sekunder (100 μM), dan campuran disimpan dalam laci pada suhu kamar setidaknya selama 16 jam. Satu mol NaCl kemudian ditambahkan tetes demi tetes ke dalam vial sambil digoyang-goyangkan dengan lembut hingga mencapai konsentrasi akhir 0,1 M dalam campuran. Botol disimpan di laci setidaknya 1 hari sebelum digunakan. Aptamers tiolasi tak terkonjugasi dihilangkan dengan sentrifugasi pada 12.000g selama 20 menit pada 4 °C. Tabung dikeluarkan dari centrifuge dan cairan supernatan bening diperoleh, dengan nanopartikel berada di bagian bawah tabung. Campuran disentrifugasi selama 5 menit tambahan dalam kasus supernatan warna merah. Supernatan dipipet dengan hati-hati dan nanopartikel akhirnya didispersikan dalam 1 mL buffer PBS (phosphate-buffered saline) 0,01 M (pH = 7.4) yang mengandung 5% BSA, 5% sukrosa, 1% PEG20000, dan 0,05% Tween20.

Desain Jalur Aliran Lateral

LFSA dirancang seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3. Secara singkat, strip berisi beberapa bantalan yang tumpang tindih pada sampel kartu pendukung (GF-08, 20 × 300 mm), konjugat emas, membran nitroselulosa (NC) (Pall 90, 60 × 300 mm), dan bantalan penyerapan (H-5076, 20 × 300 mm). Panjang tumpang tindih adalah 2 mm. Bantalan sampel direndam dalam buffer PBS 0,01 M (pH =-7,4) yang mengandung 3% BSA dan 0,05% Tween20 dan selanjutnya dikeringkan pada suhu 37 °C selama 2 jam. Pad konjugat emas diperlakukan dengan buffer PBS 0,01 M (pH = 7.4) yang mengandung 5% BSA, 5% sukrosa, 1% PEG20000, dan 0,05% Tween20. AuNP fungsional kemudian disemprotkan dengan penyemprot (XYZ3010-1429) pada bantalan konjugat emas yang dirawat. Satu mikroliter biotin-A09 aptamer (10 M) diinkubasi dengan 10 μL streptavidin (1 mg/mL) selama 1 jam pada 4 °C. streptavidin terkonjugasi aptamer kemudian dilapisi dengan dispenser (XYZ3010-1429) pada membran NC untuk membentuk garis uji, sedangkan streptavidin (1 mg/mL) dilapisi dengan instrumen untuk membentuk garis kontrol. Setelah itu, membran NC yang telah diberi perlakuan dikeringkan pada suhu 37 °C selama 2 jam untuk imobilisasi. Terakhir, strip tersebut dirakit dan LFSA dipotong menjadi strip dengan lebar 40 mm dan disimpan pada suhu 37 °C semalaman hingga digunakan.

Gambar TEM AuNPs (40 nm)

Konfigurasi strip uji aliran lateral tipikal (format sandwich)

Uji Spesifisitas

Delapan puluh mikroliter larutan rongalit (10 μg/mL) ditambahkan ke bantalan sampel dari strip yang dirakit. Langkah ini diulang untuk target counter lainnya termasuk formalin dan air deionisasi untuk uji spesifisitas. Air deionisasi digunakan sebagai kontrol. Garis merah akan muncul di area bergaris yang diharapkan. Setiap kontrol diulang dua kali.

Uji Tergantung Dosis

Serupa dengan uji spesifik, larutan rongalit dengan berbagai konsentrasi (0,8, 1, 5, dan 10 g/mL) disiapkan. Delapan puluh mikroliter larutan rongalite ditambahkan ke bantalan sampel dari strip yang dirakit. Pengamatan warna merah dalam waktu 15 menit pada garis uji dianggap sebagai kriteria untuk menentukan batas deteksi.

Uji Sampel Makanan

Untuk mengevaluasi kepraktisan dan keakuratan LFSA baru ini, lima sampel makanan yang kemungkinan mengandung rongalit tambahan dikumpulkan dari pasar di sekitar institut. Satu gram sampel diekstraksi dengan 10 mL air. Kemudian, 80 L masing-masing larutan ekstrak sampel diaplikasikan pada lajur aliran lateral berbasis aptamer untuk mendeteksi rongalit. Hasil ini dikonfirmasi oleh kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC).

Hasil dan Diskusi

Konstanta Spesifisitas dan Disosiasi (K _d ) dari Aptamers Terpilih

Konsentrasi yang berbeda dari aptamers A09 dan B09 diinkubasi dengan jumlah rongalite yang tetap. Kurva saturasi memplot absorbansi terukur pada 450 nm terhadap konsentrasi input aptamer yang sesuai ditunjukkan pada Gambar 4a. Analisis regresi non-linier digunakan untuk K _d perhitungan nilai. K _d nilai A09 adalah 61.12 ± 16.36 nM dan B09 adalah 39.81 ± 12.73 nM. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4b, afinitas pengikatan antara A09/B09 dan rongalite tinggi.

a Pengukuran K _d nilai A09 dan B09. GraphPad Prism digunakan untuk melakukan analisis penyesuaian penyembuhan nonlinier untuk K _d perhitungan. b Afinitas pengikatan spesifik antara A09/B09 dan rongalite

Spesifikasi dan Sensitivitas

Aptamer A09 berlabel biotin (capturing aptamer) terikat pada streptavidin yang awalnya dilapisi pada membran. Jalur ini dipilih sebagai jalur uji. Sementara itu, streptavidin disejajarkan pada zona kontrol.

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, setelah aptamer sekunder AuNP (sebagai probe pensinyalan) terikat pada rongalit, aptamer primer yang berjajar pada zona uji terikat ke situs lain dari senyawa ini. Garis merah yang dihasilkan oleh AuNP akan muncul di zona uji jika analisis positif. Berkenaan dengan eksperimen kontrol, streptavidin pada zona kontrol menangkap sisa aptamer B09 berlabel AuNP yang dimodifikasi dengan biotin, sehingga memberikan sinyal kontrol setiap saat.

Kekhususan (a ) dan sensitivitas (b ) dari LFSA untuk rongalite. a 80 μL larutan rongalite (10 μg/mL) ditambahkan ke bantalan sampel dari strip yang dirakit. Langkah ini diulangi untuk target kontra lainnya termasuk formalin untuk uji spesifisitas. Air deionisasi digunakan sebagai kontrol. b Larutan standar rongalit dengan berbagai konsentrasi (0, 0,8, 1, 5, dan 10 g/mL) disiapkan. 80 μL larutan standar dipipet ke pad sampel, dan pengamatan warna merah dalam waktu 15 menit pada garis uji dianggap sebagai kriteria untuk menentukan batas deteksi

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, hasilnya menunjukkan rongalit mudah dideteksi dengan mata telanjang pada konsentrasi serendah 1 μg/mL.

Sampel makanan ini dianalisis melalui LFSA yang dikembangkan di sini, dan hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1.

Menariknya, garis kontrol tidak dipertahankan setelah setiap LFSA. Konsentrasi rongalit atau ion garam yang tinggi dapat menghasilkan sinyal yang samar pada zona kontrol. Oleh karena itu, komposisi buffer penangguhan ulang secara kritis mempengaruhi kinerja uji strip. Berdasarkan hasil yang diperoleh, buffer PBS 0,01 M (pH = 7.4) yang mengandung 5% BSA, 5% sukrosa, 1% PEG20000, dan 0,05% Tween20 dipilih sebagai buffer penangguhan ulang.

Komposisi berbagai bantalan memiliki efek dramatis pada kinerja uji strip. Di antara berbagai alternatif, membran NC ditemukan sebagai pendukung padat yang paling cocok untuk adsorpsi dan hibridisasi asam nukleat. NC telah banyak digunakan sebagai bantalan sinyal di jalur aliran lateral karena menyediakan laju aliran yang cukup [19]. Jenis ukuran membran NC yang berbeda dengan laju aliran masing-masing dapat cocok untuk pengujian ini. Dalam pekerjaan ini, tiga membran NC yang umum digunakan (yaitu, pall 90, pall 170, dan Millipore 135) yang dibeli dari Jiening Biotech Company diuji. Pall 90 dipilih di sini sebagai membran NC yang paling cocok untuk LFSA.

Sejumlah besar teknologi telah dikembangkan untuk pendeteksian rongalite. Namun, hanya sedikit yang telah diterapkan secara luas dalam deteksi di tempat, terutama karena terkait dengan biaya tinggi dan protokol kompleks, seperti GC dan HPLC, yang tidak praktis untuk operator harian. LFSA, pendekatan satu langkah, telah menjadi platform yang sempurna karena formatnya yang ramah pengguna, biaya produksi yang rendah, dan kenyamanan. Meskipun sensitivitasnya lebih buruk daripada strip kromatografi, LFSA akan menjadi metode yang menjanjikan di bidang pengujian di tempat perawatan.

LFSA masih memiliki sensitivitas yang lebih rendah daripada strip kromatografi. Selain itu, teknologi LFSA yang menggunakan aptamers menunjukkan beberapa keunggulan yang melekat pada immunoassay aliran lateral (LFIA, metode berbasis antibodi) dan ini terlepas dari kemajuan terbaru di bidang ini. Meskipun pengujian serupa dapat juga dirancang menggunakan antibodi, sensor aptamer menawarkan stabilitas dan keuntungan berbiaya rendah. Selain itu, aptamer lebih fleksibel untuk mengembangkan format yang berbeda karena terdiri dari asam nukleat yang memiliki hibridisasi intra dan antar molekul, replikasi enzimatik, dan karakteristik penentuan urutan yang mudah. Berdasarkan sifat positif ini, banyak sensor aptamer telah dikembangkan untuk pengujian multipleks.

Selain itu, LFSA dapat menggunakan label yang berbeda termasuk titik kuantum yang dikembangkan baru-baru ini [20] dan fosfor yang mengonversi [21]. Namun, di antara semua label yang dilaporkan, AuNP adalah yang paling banyak digunakan untuk LFSA. Properti yang paling luar biasa dari label Au terletak pada kemampuannya untuk mewarnai membran NC yang memungkinkan pengamatan langsung dengan mata telanjang. Karakteristik ini membedakan LFSA dari metode laboratorium mahal saat ini yang menjadikan teknologi ini alat analitik yang nyaman.

Point-of-care testing (POCT) telah diusulkan sebagai alat yang ideal untuk mengurangi biaya pengujian ini. Platform biosensor LFSA, pengujian yang paling dikenal, saat ini digunakan untuk POCT [22]. Platform biosensor LFIA terutama mencakup format sandwich dan kompetitif (atau penghambatan). Secara umum, uji format sandwich dirancang jika molekul target memiliki setidaknya dua epitop. Sebuah aptamer ganda yang diikat ke rongalite di dua situs pengikatan yang berbeda dikembangkan di sini yang berisi probe penangkap dan pensinyalan yang dirakit dalam format tipe sandwich.

Kesimpulan

LFSA yang mudah dan murah dengan format sandwich berhasil dikembangkan untuk deteksi cepat rongalite di lokasi. Pengujian melibatkan beberapa aptamers yang terkonjugasi dengan AuNPs. Setelah mengoptimalkan beberapa parameter utama, pengujian yang dikembangkan memberikan sensitivitas tinggi dengan nilai batas deteksi serendah 1 μg/mL. Teknologi ini dapat dengan mudah digunakan untuk mempelajari kontaminasi sampel makanan dengan rongalit. Pengujian ini menyediakan platform deteksi rongalite di tempat yang andal dan dapat berkontribusi untuk memecahkan masalah keamanan pangan.

Singkatan

AuNP:

Nanopartikel emas

HPLC:

Kromatografi cair kinerja tinggi

LFIA:

Immunoassay aliran lateral

LFSA:

Uji lajur aliran lateral

Membran NC:

Membran nitroselulosa

POCT:

Pengujian di tempat perawatan

SELEX:

Evolusi sistematis ligan dengan pengayaan eksponensial

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

Resonansi Plasmon pada Fotoabsorbsi Nanokristal ZnO Koloid dengan Doping Tinggi Bi2Se3 Sensitized TiO2 Nanotube Films untuk Proteksi Katodik Fotogenerasi Baja Tahan Karat 304 Di Bawah Cahaya Tampak