Sumbu MALAT1/miR-143/VEGFA Menggerakkan Kerusakan Endotel yang Akibatnya Aneurisma Intrakranial

Abstrak

Peran beberapa RNA non-koding panjang (lncRNA) dalam aneurisma intrakranial (AI) telah diteliti dalam banyak penelitian. Tujuan studi ini adalah untuk menjelaskan mekanisme sumbu sinyal lncRNA transkrip adenokarsinoma paru-metastasis 1 (MALAT1)/microRNA-143 (miR-143)/faktor pertumbuhan endotel vaskular-A (VEGFA) dalam cedera endotel vaskular yang menginduksi AI. Ekspresi MALAT1, miR-143, dan VEGFA dalam jaringan AI dan jaringan arteri normal terdeteksi. Matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) dalam jaringan, faktor von Willebrand (vWF) dalam serum dan jaringan, dan endotelin-1 (ET-1) dalam serum terdeteksi. Tikus AI yang dimodelkan diinjeksi dengan MALAT1 yang di-silence atau di-overekspresi untuk mendeteksi cedera endotel vaskular. Sel endotel vaskular dari pasien AI diekstraksi dan ditransfeksi dengan MALAT1 yang di-silence atau di-overekspresi untuk memverifikasi dampak MALAT1 terhadap keberadaan sel dan apoptosis. Koneksi antara MALAT1, miR-143, dan VEGFA diverifikasi melalui prediksi online, uji aktivitas luciferase, dan uji RNA-pull down. Overekspresi MALAT1 dan VEGFA serta ekspresi buruk miR-143 ditemukan dalam jaringan AI. Downregulasi MALAT1 menghambat tekanan darah, ekspresi ET-1, vWF, dan MMP-9, serta indeks apoptosis sel endotel vaskular tikus dengan AI. MALAT1 yang di-downregulasi menghambat apoptosis dan mempromosikan keberadaan sel endotel vaskular dalam AI. MALAT1 terikat pada miR-143 dan miR-143 menargetkan VEGFA. Studi ini menunjukkan bahwa MALAT1 meningkatkan ekspresi VEGFA melalui ikatan kompetitif pada miR-143, sehingga meningkatkan apoptosis dan menurunkan keberadaan sel endotel vaskular dalam AI.

Pendahuluan

Aneurisma intrakranial (AI), juga dikenal sebagai aneurisma serebral, disebabkan oleh peningkatan tekanan intrakranial yang diinduksi oleh pembesaran abnormal lokal rongga arteri serebral atau dinding arteri [1]. AI adalah penyakit parah dengan mortalitas dan morbitas tinggi, dan tingkat prevalensinya sekitar 1–3% di populasi umum [2]. Ciri klinis utama AI adalah vaskulisme serebral, pendarahan serebral spontan, dan palsi saraf okulomotor [3]. Hingga saat ini, faktor risiko umum yang mengakibatkan terjadinya dan perkembangan AI meliputi gangguan hemodinamik, gen, penuaan, infeksi, dan faktor kongenital [4]. Perawatan klinis utama, terutama kliping bedah dan/atau coiling endovaskular, berfungsi untuk mencegah pecahnya aneurisma [5]. Namun, mekanisme detail yang mendasari AI masih belum terungkap, yang mencerminkan kebutuhan mendesak akan metode yang lebih efektif dalam pengelolaan AI.

RNA non-koding panjang (lncRNA) lebih panjang dari 200 nukleotida yang termasuk dalam spesies RNA non-koding [6]. Dilaporkan bahwa ekspresi lncRNA growth arrest-associated lncRNA 1 dalam AI downregulated ancung adenocarcinoma transcript 1 (MALAT1) adalah lncRNA yang sangat kaya dan banyak diekspresi dengan panjang sekitar 8000 nt [7]. MALAT1 telah didokumentasikan untuk memodulasi disfungsi otot halus dalam aneurisma aorta torakal [8]. Juga, sebuah studi telah menyajikan ekspresi abnormal lncRNA dan messenger RNA (mRNA) dalam AI, dan jaringan koekspresi lncRNA-mRNA memberikan petunjuk untuk menemukan patogenesis AI [9]. MALAT1 telah disarankan untuk meningkatkan ekspresi osterix dan memodulasi differensi osteogenik melalui target ekspresi miRNA-143 (miR-143) dalam sel mesenkimal tulang sumsum manusia [10]. Sebuah studi juga telah menyajikan peran klaster miR-143/145 dalam membalik regulasi faktor 5 krüppel-like dalam sel otot halus dan kontraktilitas serta proliferasinya dalam AI [11]. Menurut Feng et al., downregulasi miR-143/145 dan tingkat matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) yang lebih tinggi dalam sirkulasi mungkin terkait dengan pembentukan dan pecahnya AI [12]. Analisis telah mengungkapkan bahwa miRNA yang tidak terkontrol paling banyak (miR-143 dan miR-145) adalah target umum dari gen yang merupakan jalur sinyal, seperti faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF), dan gen lain yang mengatur pergerakan atau adheksi seluler [13]. Sebuah studi telah mengungkapkan pentingnya prediktif variasi faktor pertumbuhan endotel vaskular-A (VEGFA) dalam AI [14]. Oleh karena itu, kami mencoba mengevaluasi mekanisme sumbu sinyal MALAT1/miR-143/VEGFA dalam AI yang diinduksi oleh cedera endotel vaskular.

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika

Studi ini disetujui oleh Komite Review Institusional Rumah Sakit Pertama USTC, Divisi Ilmu Kehidupan dan Kedokteran, Universitas Ilmu dan Teknologi China dan mengikuti prinsip Deklarasi Helsinki. Peserta memberikan persetujuan tertulis dalam studi ini. Semua eksperimen hewan selaras dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol diizinkan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan Rumah Sakit Pertama USTC, Divisi Ilmu Kehidupan dan Kedokteran, Universitas Ilmu dan Teknologi China.

Subjek Studi

Dua puluh pasien AI (grup AI) yang telah didiagnosis melalui pemeriksaan citra dan telah menerima kliping neurobedah di Rumah Sakit Pertama USTC, Divisi Ilmu Kehidupan dan Kedokteran, Universitas Ilmu dan Teknologi China dipilih untuk eksperimen kami. Terdapat 11 laki-laki dan 9 perempuan yang berusia 43,27 ± 6,25 tahun. Jaringan AI diambil. Secara bersamaan, jaringan vaskular kortikal temporal dari kutub temporal diambil dari 20 pasien (grup kontrol) dengan epilepsi lob temporal yang disklerosis amigdala dan hipokampus. Jaringan yang diambil diperiksa sebagai jaringan arteri normal oleh histopatologi setelah operasi, dan terdapat 13 laki-laki dan 7 perempuan berusia 44,18 ± 5,91 tahun. Tidak ada perbedaan signifikan yang dikenali dalam gender dan usia antara grup AI dan grup kontrol (keduanya P > 0,05). Sampel darah vena (2 tabung) diperoleh dari semua subjek dalam kondisi puasa pada waktu yang sama di pagi hari sebelum operasi.

Pembuatan Model Tikus AI

Enam puluh tikus Sprague-Dawley jantan grade bersih (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China), berat antara 200 dan 250 g, dipelihara selama 7 hari (25 ± 2 °C, kelembaban relatif 65–70%, 12 jam siklus cahaya dan gelap, asupan air dan makanan bebas). Tikus ditetapkan elastase pankreas babi ke arteri karotid eksternal dan sekitar dinding arteri bifurkasi. Arteri karotid eksternal diligasi dengan dua benang bedah di cabang arteri karotid eksternal sekitar 1,5 mm. Arteri karotid eksternal dipotong antara dua garis untuk membentuk aneurisma karotid internal pada segmen buta arteri karotid eksternal. Tikus diberi makan 1% larutan garam selama 1 minggu setelah operasi. Angiografi serebral dilakukan setelah 1 bulan dan pembentukan aneurisma diamati.

Setelah pembuatan model tikus AI, 50 tikus secara acak didistribusikan ke dalam grup kosong (n = 10, tikus yang dimodel dirawat dengan injeksi stereotaktik 100 μL larutan penyalang fosfat (PBS) sekali sehari), grup kontrol negatif (NC) rambut pendek (sh) (n = 10, tikus yang dimodel dirawat dengan injeksi stereotaktik 100 μL sh-MALAT1 NC sekali sehari), grup sh-MALAT1 (n = 10, tikus yang dimodel dirawat dengan injeksi stereotaktik 100 μL plasmid sh-MALAT1 sekali sehari), grup kontrol negatif (NC) overexpressed (Oe) (n = 10, tikus yang dimodel dirawat dengan injeksi stereotaktik 100 μL plasmid Oe-MALAT1 NC sekali sehari), dan grup Oe-MALAT1 (n = 10, tikus yang dimodel dirawat dengan injeksi stereotaktik 100 μL plasmid Oe-MALAT1 sekali sehari) [15]. Plasmid di atas disusun oleh Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, China).

Uji Tekanan Darah Tikus

Tekanan darah arteri ekor tikus diukur pada minggu ke-1, ke-4, dan ke-12 setelah operasi. Sebelum mengukur tekanan darah, tikus ditempatkan dalam perangkat pemanas suhu konstan untuk sementara waktu untuk mencegah gangguan suhu eksternal. Kedua, tikus diam selama beberapa menit dalam kurung tikus khusus untuk mencegah gangguan aktivitas. Jika tekanan darah bervariasi secara besar, pengukuran dilakukan dua atau tiga kali pada waktu yang berbeda untuk mendapatkan nilai rata-rata.

Pengambilan Jaringan Aneurisma

Setelah 3 bulan, tikus dianestesikan dengan 1% natrium pentobarbital (40 mg/kg) melalui injeksi intraperitoneal untuk mendapatkan sampel darah dari vena. Tikus di eutanasi, dada dibuka, ventrikel kiri diintubasi ke aorta, dan vena cava dipotong untuk melepaskan darah. Secara bersamaan, 30 mL larutan garam normal yang mengandung natrium heparin digunakan untuk perfusi jantung cepat untuk membersihkan darah, dan kemudian 10 mL paraformaldehyd 10%/0,1 M PBS (pH 7,4) diinjeksi ke otak. Setelah perfusi dan fiksasi, otak tikus dibuka. Sirkulasi arteri di dasar tengkorak diamati dengan hati-hati, jaringan aneurisma dipisahkan, dan perubahan aneurisma diamati di bawah mikroskop.

Imunoabsorpsi Enzim (ELISA)

Indeks terkait serum diuji dengan kit ELISA. Sampel darah yang dikumpulkan ditempatkan dalam termostat 37 °C selama 1 jam dan difugasi pada 3000 r/min selama 10 menit. Deteksi ekspresi endotelin-1 (ET-1) dan faktor von Willebrand (vWF) dilakukan sesuai petunjuk kit (semua kit dibeli dari NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China).

Warna Hematoxylin-Eosin (HE)

Sampel difiksasi dengan formalina 10% selama lebih dari 24 jam dan disimpan dalam blok parafin. Blok parafin dewax dengan xylene selama 20 menit, dihidrasi dengan serangkaian alkohol menurun (100%, 95%, 80%, 75%) selama 1 menit, dan dicoret dengan hematoxylin selama 10 menit. Kemudian, jaringan dibersihkan dengan air tisu, diferensiasi dengan etanol asam klorida selama 30 detik, dan direndam dalam air hangat pada 50 °C selama 5 menit. Dicret dengan larutan eosin, jaringan dibersihkan dengan air tisu, dihidrasi dengan alkohol 70% dan 90%, dibersihkan dengan xylene, dan ditutup dengan gumi netral. Morfologi jaringan diamati di bawah mikroskop daya tinggi.

Pengamatan Mikroskop Transmisi Elektron

Jaringan cadangan difiksasi dengan dialdehida glutarik 2,5% dan asam osmitik 1%, dihidrasi lalu diembed dengan resin Epon812. Irisan semi-tipis dicoret dengan toluene biru, dirapikan, dan dibuat menjadi irisan ultra-tipis. Irisan dicret dengan asetat uranil dan sitrat timbal dan diamati oleh mikroskop transmisi elektron JME-2000EX (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, China).

Warna Tandem Deoxynukleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL)

Warna TUNEL dilakukan untuk mengamati apoptosis sel endotel dalam tikus AI berdasarkan kit TUNEL (Roche, Basel, Swiss). Irisan aneurisma tikus yang disiapkan dicuci dua kali dengan xylene (5 menit/kali) dan dihidrasi dengan serangkaian alkohol menurun (100%, 95%, 80%, 75%) selama 3 kali (5 menit/kali). Jaringan diperlakukan dengan larutan protease K 20 μg/mL tanpa DNase selama 15–30 menit, ditetapkan 50 μL larutan reaksi TUNEL selama 60 menit, dan dikembangkan dengan 50 μL diaminobenzidin (DAB) pada 25 °C selama 10 menit. Kemudian, irisan dicret dengan hematoxylin, dihidrasi dengan alkohol gradien, dibersihkan dengan xylene, dan ditutup dengan gumi netral. Irisan diamati di bawah mikroskop optik dan indeks apoptosis dihitung.

Isolasi dan Identifikasi Sel Endotel Vaskular Aneurisma

Isolasi sel endotel dilakukan sesuai dengan metode yang dilakukan oleh Boscolo et al. [16]. Jaringan AI dipotong menjadi fragmen 3 mm². Jaringan diinkubasi dengan kolagenase B 0,1%/dispase 0,1% (Roche) selama 25 menit pada 37 °C. Kemudian, jaringan yang terlepas pralus dihaluskan selama 2 menit dengan pipet 2 mL dan difilter dengan saringan 100 μm (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, Amerika Serikat). Selanjutnya, suspensi sel difugasi lalu di-resuspend dalam medium MV2 (termasuk faktor pertumbuhan dan serum fetal sapi 20%) (PromoCell, Heidelberg, Jerman). Sel ditanam pada 1 × 10⁴ sel/mL dalam kolam kultur yang dilapisi fibronectin 1 μg/cm². Mengikuti metode yang dijelaskan oleh Jackson et al. [17], sel dengan konsistensi 80–100% dipisahkan dengan titik (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, Inggris) yang dilapisi Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, Inggris). Sel endotel yang menempel pada titik dilapisi lectin dikumpulkan dengan konsentrat partikel magnetik dan sel yang tidak dikonjugasi dicuci dengan medium dasar. Sel positif UEA di-resuspend dalam medium kultur dan ditanam dalam kolam kultur dilapisi fibronectin untuk meningkatkan rasa menempel dan laju pertumbuhan sel.

Sel ditanam dalam MV2 pada kamar slide dilapisi fibronectin. ketika konsistensi sel mencapai 80–100%, sel ditetapkan dalam aseton pada 4 °C dan diperlakukan dengan Triton X-100 1% selama 5 menit dan kemudian serum albumina sapi (BSA) 0,5% selama 15 menit. Sel ditetapkan dengan antibody primer terhadap vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, Amerika Serikat) dan diinkubasi selama 2 jam (NC dilakukan tanpa antibody primer), ditetapkan dengan imunoglobulin G conjectured peroksidase hidrosa (1:150, Abcam) dan diinkubasi selama 30 menit. Kemudian sel dikembangkan dengan 50 μL DAB pada 25 °C selama 5 menit, dicret dengan hematoxylin, diferensiasi dengan asam klorida 0,1%, dihidrasi dengan alkohol, diikuti dengan pembersihan xylene, dan penutupan gumi netral. Setelah kering, difoto di bawah mikroskop terbalik.

Pengelompokan Sel dan Transfeksi

Sel endotel vaskular aneurisma dalam fase logaritmik dikelompokkan menjadi 5 grup: grup kosong (sel endotel vaskular aneurisma tanpa perawatan apa pun), grup sh-NC (sel endotel vaskular aneurisma ditransfeksi dengan plasmid sh-MALAT1 NC), grup sh-MALAT1 (sel endotel vaskular aneurisma ditransfeksi dengan plasmid sh-MALAT1), grup Oe-NC (sel endotel vaskular aneurisma ditransfeksi dengan plasmid Oe-MALAT1 NC), dan grup Oe-MALAT1 (sel endotel vaskular aneurisma ditransfeksi dengan plasmid Oe-MALAT1). Plasmid di atas disintesis oleh Genechem. Transfeksi sel dilakukan sesuai dengan petunjuk reagen lipofectamine™ 2000 (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, California, Amerika Serikat).

Uji 3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2, 5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT)

Sel endotel vaskular setiap grup ditanam pada plate 96-lubang dengan kepadatan 3 × 10⁴ sel/mL dan dikultur pada 37 °C, 5% CO₂ selama 48 jam. Setiap grup disiapkan dengan 5 lubang paralel, dan setiap lubang ditambahkan 20 μL larutan MTT segar (5 mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, Amerika Serikat). Setelah reaksi 4 jam, sel dicampur dengan 200 μL dimetil sulfoksida. Setelah larut sepenuhnya, nilai optik densitas sel dalam setiap grup diukur oleh pembaca plate (BioRad, Hercules, California, Amerika Serikat) pada 490 nm.

Situsometri Alir

Distribusi siklus sel diuji dengan warna iodida propidium (PI). Sel endotel vaskular dilepas, difugasi, di-resuspend dengan etanol 75% yang telah didinginkan, dan ditetapkan selama malam hari pada −20 °C. Sel difugasi untuk membuang sobrenatan. Sel ditambahkan dalam 450 μL PBS, ditambahkan 100 μL Rnase A, dan dicret dengan 400 μL PI pada 4 °C selama 30 menit menghindari cahaya. Situsometer alir (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, Amerika Serikat) digunakan untuk menguji distribusi siklus sel.

Apoptosis sel diuji dengan warna ganda Annexin V/PI. Sel endotel yang dilepas dikumpulkan dan dicuci dengan PBS 3 kali. Sel di-resuspend dengan 100 μL larutan binding 1× yang telah didinginkan dan dicampur dengan 5 μL Annexin dan 5 μL PI, masing-masing. Apoptosis sel diuji oleh situsometer alir. Dengan AnnexinV sebagai sumbu lintas dan PI sebagai sumbu panjang, kuadran kiri atas mewakili sel yang cedera mekanik (AnnexinV⁻/PI⁺), kuadran kanan atas untuk sel apoptosis akhir atau sel nekrosis (AnnexinV⁺/PI⁺), kuadran kiri bawah untuk sel normal negatif (AnnexinV⁻/PI⁻), dan kuadran kanan bawah untuk sel apoptosis awal (AnnexinV⁺/PI⁻). Total sel apoptosis (AnnexinV⁺/PI⁻ dan AnnexinV⁺/PI⁺) dihitung dan dinyatakan sebagai persentase.

Reaksi Rantai Polimerase Kuantitatif Transkripsi Balik (RT-qPCR)

Total RNA dalam jaringan dan sel diekstraksi oleh Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China), dan konsentrasi serta keurnian RNA ditentukan. Proses transkripsi balik RNA ke DNA komplementer dilakukan sesuai dengan petunjuk kit transkripsi balik (K1621, Fermentas, Maryland, NY, Amerika Serikat). Uraian primer MALAT1, miR-143, dan VEGFA (Tabel 1) dirancang dan disusun oleh Genechem. Untuk mengevaluasi ekspresi lncRNA, miRNA, atau mRNA, RT-qPCR dilakukan menggunakan SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokyo, Jepang) dengan sistem PCR Real-Time Roche (Roche). U6 ditetapkan sebagai parameter internal miR-143, sementara MALAT1 dan VEGFA, dengan gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai parameter internal. Tingkat transkripsi relatif gen target dihitung dengan metode 2^−△△Ct.

Analisis Western Blot

Total protein dari jaringan dan sel diekstraksi. Konsentrasi protein ditentukan dengan petunjuk kit asam bisonikotinat (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Protein dipisahkan oleh elektroforesis dengan gel poliakrilamida 10% (Boster Biological Technology). Membran ditransfer ke membran fluorida polyvinylidenid dan kemudian ditutup dengan BSA 5% selama 1 jam. Membran diinkubasi dengan antibody primer terhadap Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000), dan matrix metalloproteinase (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, Inggris), Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000), dan Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, Amerika Serikat), dan GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvania, Amerika Serikat) dan dengan antibody sekunder (1:500, Jackson Immuno Research) yang dilabeli dengan peroksida hidrosa. Membran diperoleh oleh sistem citra pemindahan inframerah dua warna Odyssey, dan nilai abu-abu pita diukur oleh perangkat lunak analisis citra Quantity One.

Uji Gen Laporan Luciferase Ganda

Situs ikatan MALAT1 dan miR-143 diprediksi dan diuraikan oleh situs bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Hubungan ikatan antara MALAT1 dan miR-143 diverifikasi lebih lanjut oleh uji gen pelapor luciferase. Fragmen gen wilayah 3′translasian tidak terjemahkan (3′UTR) MALAT1 sintetik diperkenalkan ke dalam vektor pelapor luciferase pmiR-Report (Thermo Fisher Scientific) untuk menghasilkan MALAT1 tipe liar (MALAT1-WT) oleh situs endonuklease Bamh1 dan Ecor1. Situs mutasi komplementer dari urutan dirancang pada MALAT1-WT, dan fragmen target disisipkan ke dalam vektor pelapor luciferase pmiR-Report untuk menghasilkan MALAT1 tipe mutant (MALAT1-MUT) oleh ligase DNA T4 setelah pencerna endonuklease pembatas. MALAT1-WT dan MALAT1-MUT yang benar diurutkan ditransfeksi bersama dengan mimic NC dan miR-143 mimic ke dalam sel endotel vaskular. Sel dipanen dan dilisis 48 jam setelah transfeksi, dan aktivitas luciferase diuji oleh kit deteksi luciferase (BioVision, San Francisco, CA, Amerika Serikat) dengan luminometer (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, Amerika Serikat).

Hubungan target miR-143 dan VEGFA dan situs ikatan miR-143 dan VEGFA 3′UTR diprediksi melalui situs bioinformatika (https://www.targetscan.org/vert_72/). Urutan wilayah promotor 3′UTR VEGFA yang mengandung situs ikatan miR-143 disusun dan dikloning ke dalam vektor pelapor luciferase pmiR-Report untuk menghasilkan VEGFA-WT. Berdasarkan pelapor ini, situs ikatan VEGFA-WT dan miR-143 dimutasi untuk membentuk VEGFA-MUT. Pelapor VEGFA-WT atau VEGFA-MUT dicampur dengan mimic NC atau miR-143 mimic lalu ditransfeksi bersama ke dalam sel endotel vaskular selama 48 jam. Setelah itu, sel dilisis dan aktivitas luciferase diuji oleh kit deteksi luciferase.

Uji RNA-Pull Down

Untuk memverifikasi hubungan ikatan antara miR-143 dan MALAT1, uji RNA-pull down dilakukan. Tiga urutan miRNA terlabel biotin Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT, dan Bio-miR-NC dirancang dan dipercayakan kepada Perusahaan GenePharma (Shanghai, China). Oligonukleotida terbiotin ini ditransfeksi ke sel selama 48 jam. Kemudian, sel dipanen dan diinkubasi dengan lisat sel spesifik (Ambion, Austin, Texas, Amerika Serikat) selama 10 menit. Setelah itu, lisat diinkubasi dengan titik streptavidin M-280 yang telah dilapisi RNase-bebas dan tRNA yeast (semua dari Sigma) pada 4 °C selama 3 jam, lalu dibersihkan dua kali dengan larutan lisis dingin, tiga kali dengan larutan garam rendah, dan sekali dengan larutan garam tinggi. Sonde antagonis miR-143 ditetapkan sebagai NC. Total RNA diekstraksi dengan Trizol dan tingkat enrichment MALAT1 diuji menggunakan RT-qPCR.

Analisis Statistik

Semua data diuraikan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, Amerika Serikat). Data pengukuran direpresentasikan oleh rata-rata ± standar deviasi. Perbandingan antara dua grup dilakukan oleh uji t sampel independen, sedangkan perbandingan antara beberapa grup dievaluasi oleh analisis variansi satu arah (ANOVA), dan perbandingan pasangan dilakukan oleh uji perbandingan berganda Tukey. Hubungan antara ekspresi MALAT1 dan fitur klinis-patologis AI ditentukan oleh uji chi-square. Nilai P kurang dari 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.

Hasil

MALAT1 dan VEGFA Overekspresi dan miR-143 Downregulasi dalam Jaringan AI

Ekspresi ET-1 dan vWF dalam serum grup AI dan grup kontrol terdeteksi oleh ELISA, dan hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi ET-1 dan vWF meningkat dalam grup AI dibandingkan grup kontrol (keduanya P < 0,05) (Gambar 1a, b).

Sumbu MALAT1/miR-143/VEGFA Menggerakkan Kerusakan Endotel yang Akibatnya Aneurisma Intrakranial

Perubahan patologis jaringan AI diamati melalui warna HE. Tidak ada kerusakan yang jelas pada endoderm, sel endotel, dan sel otot halus terlihat dalam jaringan arteri normal, dan sel tersusun rapi dengan struktur lengkap. Jaringan AI menunjukkan sel endotel yang rusak, sel otot halus yang degenerasi, dinding arteri yang menipis, serat elastis yang pecah, dan sel peradaran yang infiltras (Gambar 1c).

Perubahan ultrastuktur jaringan AI dan jaringan arteri normal diamati oleh mikroskop transmisi elektron. Ditemukan bahwa sel endotel lengkap dan struktur adventitia utuh; tidak ada lapis elastis internal yang patah atau sel otot halus apoptosis terlihat dalam jaringan arteri normal. Dalam jaringan AI, ditunjukkan degenerasi parah dinding pembuluh darah, terutama manifests sebagai hilangnya sebagian besar sel endotel, lapis elastis internal yang sangat patah, sel otot halus yang sangat rusak dan degradasi, dan gangguan membran luar pembuluh darah (Gambar 1d).

RT-qPCR dilakukan untuk menentukan ekspresi mRNA MALAT1, miR-143, dan VEGFA, sementara analisis western blot untuk ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF dalam jaringan AI dan jaringan arteri normal. Ditemukan bahwa dibandingkan dengan jaringan arteri normal, tingkat ekspresi MALAT1, VEGFA, MMP-9, dan vWF meningkat dan ekspresi miR-143 menurun dalam jaringan AI (semua P < 0,05) (Gambar 1e, f).

Grado Hunt-Hess, Tingkat Kerusakan Endotel, dan Riwayat Merokok Berkorelasi dengan Ekspresi MALAT1 dalam Jaringan AI

Berdasarkan ekspresi median MALAT1, pasien dikelompokkan menjadi dua grup: grup ekspresi rendah dan grup ekspresi tinggi. Hubungan antara ekspresi MALAT1 dan fitur klinis-patologis pasien dengan AI dianalisis. Hasilnya menunjukkan bahwa grado Hunt-Hess, tingkat kerusakan endotel, dan riwayat merokok terkait dengan ekspresi MALAT1 (semua P < 0,05), sementara usia, gender, dan mode bedah tidak terkait dengan ekspresi MALAT1 (semua P > 0,05) (Tabel 2).

Downregulasi MALAT1 Menghambat Tekanan Darah, Ekspresi ET-1, vWF, dan MMP-9, serta Indeks Apoptosis Sel Endotel Vaskular Tikus dengan AI

Seperti yang ditampilkan dalam Tabel 3, knockdown MALAT1 menurunkan, sementara pemulihan MALAT1 meningkatkan tekanan darah pada minggu ke-4 dan ke-12.

ELISA mengungkapkan bahwa downregulasi MALAT1 mengurangi, sementara up-regulasi MALAT1 meningkatkan ekspresi ET-1 dan vWF dalam serum tikus dengan AI (Gambar 2a, b).

Perubahan patologis jaringan AI dalam setiap grup disurvei dengan warna HE. Grup kosong, grup sh-NC, dan grup Oe-NC menunjukkan membran dalam yang rusak, sel endotel yang terlupas, sel otot halus yang degenerasi, sel dan lapis yang berkurang, dan dinding arteri yang tipis. Dalam grup sh-MALAT1, endoderm, sel endotel, lapis sel otot halus, dan lapis membran luar arteri intrakranial sedikit rusak tetapi tersusun rapi. Grup Oe-MALAT1 menunjukkan hilangnya lapis intima, sel endotel yang terlupas, serat elastis yang patah, dan sel peradaran yang infiltras (Gambar 2c).

Jaringan AI tikus dalam setiap grup diamati oleh mikroskop transmisi elektron. Ditampilkan bahwa sel endotel denaturasi, lapis subendotel terurai, lapis elastis internal hilang, dan sel otot halus berkurang ditampilkan dalam grup kosong, grup sh-NC, dan grup Oe-NC. Grup sh-MALAT1 menunjukkan sel endotel datar, inti oval, dan serat kolagen yang meningkat tetapi tanpa lapis elastis. Grup Oe-MALAT1 ditandai oleh hilangnya sel endotel dan lapis elastis yang terpisah dari lapis otot, yang terurai ke dalam lumen (Gambar 2d).

Indeks apoptosis sel endotel vaskular dalam tikus AI diuji oleh warna TUNEL. Menyilencekan MALAT1 mengurangi indeks apoptosis sel endotel vaskular, sementara overexpressed MALAT1 menunjukkan efek sebaliknya (Gambar 2e, f).

Deteksi RT-qPCR ekspresi mRNA MALAT1, miR-143, dan VEGFA, dan analisis western blot ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF dalam jaringan AI menunjukkan bahwa eliminasi MALAT1 menekan ekspresi MALAT1, VEGFA, MMP-9, dan vWF, dan meningkatkan ekspresi miR-143. Sebaliknya, elevasi MALAT1 memberlakukan pengaruh sebaliknya pada ekspresi gen ini (Gambar 2g, h).

Ekspresi Rendah MALAT1 Meningkatkan Keberadaan dan Menahan Apoptosis Sel Endotel Vaskular dalam AI

Warna imunohistokimia digunakan untuk mendeteksi ekspresi penanda spesifik endotel vWF. Ditunjukkan bahwa sitoplasma sel endotel vaskular AI ditutupi oleh partikel coklat halus, yang positif, sementara sitoplasma dalam grup NC-nya tidak memiliki partikel coklat. Hasilnya mengonfirmasi bahwa sel yang dikultur adalah sel endotel (Gambar 3a, b).

Uji MTT, situsometri alir, bersama analisis western blot digunakan untuk menguji keberadaan dan apoptosis sel endotel vaskular. Ditampilkan bahwa pengurangan MALAT1 mempromosikan keberadaan sel endotel vaskular (meningkatkan ekspresi Cyclin D1 dan Ki-67) dan menekan apoptosis (mengurangi sel fase G0/G1 dan meningkatkan sel fase S dan G2/M, mengurangi Bax dan meningkatkan Bcl-2 ekspresi). Namun, up-regulasi MALAT1 berfungsi dengan cara yang sebaliknya terhadap pengurangan MALAT1 pada keberadaan dan apoptosis sel (Gambar 3c–g).

miR-143 Terikat pada MALAT1 dan VEGFA adalah Gen Target miR-143

Ekspresi MALAT1, miR-143, dan VEGFA dalam sel endotel vaskular setiap grup diverifikasi melalui RT-qPCR dan analisis western blot. Hasilnya menunjukkan bahwa knockdown MALAT1 menekan ekspresi MALAT1 dan VEGFA dan meningkatkan ekspresi miR-143. Sebaliknya, up-regulasi MALAT1 menyebabkan peningkatan ekspresi MALAT1 dan VEGFA dan penurunan ekspresi miR-143 (Gambar 4a, b).

Wilayah ikatan spesifik antara MALAT1 dan miR-143 ditetapkan oleh perangkat lunak analisis online (Gambar 4c). Hasil uji gen pelapor luciferase ganda menunjukkan bahwa aktivitas luciferase terganggu dalam grup MALAT1-WT + miR-143 mimic dibandingkan grup MALAT1-WT + mimic-NC (P < 0,05). Namun, tidak ada perbedaan yang mencolok dalam aktivitas luciferase dalam grup MALAT1-MUT + miR-143 mimic relatif pada grup MALAT1-MUT + mimic-NC (P > 0,05), menunjukkan bahwa miR-143 secara spesifik terikat pada MALAT1 (Gambar 4d). Hasil uji RNA-pull down melaporkan bahwa tingkat enrichment MALAT1 dalam grup Bio-miR-143-WT meningkat dibandingkan grup Bio-miR-NC (P < 0,05), tetapi tidak ada perbedaan yang mencolok dalam tingkat enrichment MALAT1 dalam grup Bio-miR-143-MUT (P > 0,05) (Gambar 4e).

Perangkat lunak bioinformatika menetapkan hubungan target antara miR-143 dan VEGFA (Gambar 4f). Hasil aktivitas luciferase menunjukkan bahwa aktivitas luciferase relatif tertekan setelah VEGFA-WT dan miR-143 mimic ditransfeksi bersama ke dalam sel endotel vaskular (P < 0,05). Namun, aktivitas luciferase relatif sel endotel vaskular tidak terpengaruh oleh transfeksi bersama VEGFA-MUT dan miR-143-mimic (P > 0,05) (Gambar 4g). Ditunjukkan bahwa VEGFA adalah gen target langsung miR-143.

Diskusi

AI adalah penyakit intrakranial serah, yang terutama mengakibatkan pendarahan subaraknoid [18]. Sebuah studi sebelumnya telah menunjukkan terlibatnya jaringan RNA endogen kompetitif terkait lncRNA dalam AI [19]. Juga, sebuah studi terbaru telah memberikan bukti bahwa polimorfisme fungsional dalam wilayah promotor gen miR-143/145 terkait dengan risiko AI [20]. Dalam studi yang dilakukan oleh Xu et al., ditunjukkan bahwa overexpressed faktor angiogenik, seperti VEGFA, mungkin terkait dengan pembentukan dan pecahnya AI [21]. Untuk menjelaskan mekanisme molekular MALAT1 dalam AI, serangkaian uji telah dilakukan dan hasilnya menunjukkan bahwa AI yang diinduksi oleh cedera endotel vaskular diatur oleh sumbu sinyal MALAT1/miR-143/VEGFA.

Pertama, studi kami telah memberikan bukti yang besar bahwa MALAT1 dan VEGFA diupregulasi dan miR-143 downregulated dalam jaringan AI. Sebuah studi terbaru telah menyajikan bahwa MALAT1 adalah salah satu lncRNA yang paling diupregulasi dalam proses ishemia serebral [22]. Sebuah studi lainnya telah menyajikan bahwa MALAT1 diupregulasi dalam sel kanker ovarium dan berniat untuk terlibat dalam proses apoptosis, migrasi, dan proliferasi sel kanker ovarium [23]. Sebuah studi mengenai profil ekspresi AI tidak pecah dan pecah telah menunjukkan bahwa ekspresi faktor angiogenik seperti VEGFA diupregulasi dalam aneurisma pecah [21]. Selain itu, sebuah studi klinis telah menyajikan bahwa klaster miR-143/145 pasien AI downregulated dibandingkan subjek sehat [11]. Selain itu, sebelumnya dibahas bahwa miR-143/145 terlibat dalam berbagai proses biologis yang terkait dengan pembentukan aneurisma dan downregulated dalam pasien AI [20]. Temuan-temuan ini lebih atau kurang bersinar dengan hasil eksplorasi sebelumnya.

Keadaan dari temuan di atas, studi ini juga telah menjelajahi peran fungsional MALAT1 dalam AI melalui uji gain-of-function dan loss-of-function. Dapat diringkas bahwa downregulasi MALAT1 mengurangi tekanan darah, kadar serum ET-1, dan ekspresi vWF serta MMP-9 dalam jaringan AI. Sebelumnya telah disarankan bahwa downregulasi MALAT1 mencegah upregulasi produk transkripsi ET-1 yang diinduksi glukosa [24]. Juga, dilaporkan bahwa ekspresi MALAT1 yang ektopis adalah indiktor pembentukan vWF [25]. Sebuah studi lainnya telah memverifikasi bahwa depletasi MALAT1 dalam makrofag berasal dari sumsum tulang menghambat ekspresi MMP-9 [26].

Juga, eksperimen sel telah dilakukan untuk konfirmasi lebih lanjut fungsi MALAT1 dalam AI. Hasilnya telah menunjukkan bahwa knockdown MALAT1 mempromosikan keberadaan sel endotel vaskular dan menekan apoptosis dalam AI. Secara serupa, telah didokumentasikan bahwa gangguan MALAT1 meningkatkan arsitektur dinding aorta dan melambat pertumbuhan aneurisma [8]. Melengkapkan temuan studi kami, ada penelitian yang menyoroti bahwa ekspresi buruk MALAT1 menginduksi apoptosis dan menahan proliferasi sel leukemia mieloid akut [27]. Sebuah studi lainnya juga telah menunjukkan efek inhibitor knockdown MALAT1 pada proliferasi sel kartilase osteoartritis manusia [28]. Selain itu, penelitian sebelumnya secara umum mengonfirmasi bahwa downregulasi MALAT1 dapat menginduksi apoptosis dan melemahkan proliferasi sel glioma [29]. Selain itu, ekspresi rendah MALAT1 yang diinduksi oleh interferensi RNA mempromosikan apoptosis dan menekan proliferasi sel multiple myeloma [30]. Secara kolektif, studi-studi ini telah menjelaskan mekanisme molekular MALAT1 dalam AI hingga beberapa titik.

Selain itu, studi ini telah membuktikan bahwa miR-143 terikat pada MALAT1 dan VEGFA adalah gen target miR-143. Secara serupa, sebuah makalah berpendapat bahwa MALAT1 secara langsung terikat pada miR-143 dan menekan ekspresinya [10]. Zhu et al. telah menemukan bahwa MALAT1 melaksanakan perannya melalui interaksi dengan miR-143 dalam sel kanker rahim kerang [31]. Dikonfirmasi lebih lanjut bahwa MALAT1 secara tidak langsung memodulasi VEGFA melalui miR-200b-3p [32]. Selain itu, sebuah studi lain telah menyarankan bahwa miR-143-3p memediasi efek ZFPM2 pada sejumlah target protein dalam darah, termasuk VEGFA [33]. Namun, interaksi antara MALAT1, miR-143, dan VEGFA dalam AI belum dibahas dan memerlukan studi lebih lanjut.

Kesimpulan

Dari hasil ini, jelas bahwa knockdown MALAT1 menekan apoptosis dan mempromosikan keberadaan sel endotel vaskular dalam AI dengan memodulasi sumbu miR-143/VEGFA. Jaringan koekspresi menunjukkan hubungan antara MALAT1 dan miR-143 dengan terlibatnya VEGFA. Temuan dalam studi ini sebagian membuka patogenesis awal dan perkembangan AI, dan target yang diteliti mungkin menjadi titik masuk yang sangat potensial untuk mengungkap patologi AI dari perspektif lain. Terbatas, studi berskala besar lebih lanjut diperlukan untuk secara menyeluruh menggambarkan mekanisme sumbu MALAT1/miR-143/VEGFA dalam AI.

Mengontrol Ukuran Nanopartikel Emas melalui Polaritas Pelarut dalam Sintesis Reduksi Kimia Detektor Fotovoltaik Inframerah Suhu Kamar Tingkat Tinggi Menggunakan Heterojunti p-GeTe/n-Si

bahan nano