RNA Non-coding Panjang MALAT1/microRNA-143/VEGFA Sumbu Sinyal Memodulasi Vascular Endothelial Injury-Induced Intracranial Aneurysm

Bahan dan Metode

Pernyataan Etika

Studi ini didukung oleh Institutional Review Board of First Affiliated Hospital of USTC, Division of Life Sciences and Medicine, University of Science and Technology of China dan mengikuti prinsip Deklarasi Helsinki. Peserta memberikan persetujuan tertulis dalam penelitian ini. Semua percobaan hewan sejalan dengan Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol tersebut diizinkan oleh Komite Etika Eksperimen Hewan dari Rumah Sakit Afiliasi Pertama USTC, Divisi Ilmu Hayati dan Kedokteran, Universitas Sains dan Teknologi China.

Mata Pelajaran

Dua puluh pasien IA (kelompok IA) yang telah didiagnosis dengan pemeriksaan pencitraan dan telah menerima kliping bedah saraf di Rumah Sakit Afiliasi Pertama USTC, Divisi Ilmu Hayati dan Kedokteran, Universitas Sains dan Teknologi China dipilih untuk eksperimen kami. Ada 11 laki-laki dan 9 perempuan yang berusia 43,27 ± 6,25 tahun. Jaringan IA diambil sampelnya. Sementara itu, jaringan vaskular arteri kortikal temporal dari kutub temporal direseksi dari 20 pasien (kelompok kontrol) dengan epilepsi lobus temporal yang disebabkan oleh sklerosis amigdala dan hipokampus. Jaringan yang direseksi diperiksa sebagai jaringan arteri normal oleh histopatologi setelah operasi, dan ada 13 laki-laki dan 7 perempuan berusia 44,18 ± 5,91 tahun. Tidak ada perbedaan signifikan yang diakui dalam jenis kelamin dan usia antara kelompok IA dan kelompok kontrol (keduanya P> 0,05). Sampel darah vena (2 tabung) diperoleh dari semua subjek dalam kondisi puasa pada waktu yang sama pada pagi hari sebelum operasi.

Pembentukan Model Tikus IA

Enam puluh tikus jantan Sprague-Dawley kelas bersih (Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd., Hunan, China), dengan berat antara 200 dan 250 g, dibesarkan selama 7 hari (25 ± 2 °C, kelembaban relatif 65–70 %, 12 h siklus terang dan gelap, asupan air dan makanan gratis). Tikus dijatuhkan dengan elastase pankreas babi ke arteri karotis eksternal dan di sekitar dinding arteri bifurkasi. Arteri karotis eksterna diikat dengan dua garis bedah pada cabang arteri karotis eksterna sekitar 1,5 mm. Arteri karotis eksterna dipotong antara dua garis untuk membentuk aneurisma karotis interna di segmen buta arteri karotis eksterna. Tikus diberi makan dengan 1% saline selama 1 minggu setelah operasi. Angiografi serebral dilakukan setelah 1 bulan dan pembentukan aneurisma diamati.

Setelah pembentukan model tikus IA, 50 tikus secara acak didistribusikan ke dalam kelompok kosong (n =10, tikus model diperlakukan dengan injeksi stereotaktik 100 μL phosphate buffered saline (PBS) sekali sehari), kelompok short hairpin RNA (sh)-negative control (NC) (n =10, tikus model diperlakukan dengan injeksi stereotaktik 100 μL sh-MALAT1 NC sekali sehari), kelompok sh-MALAT1 (n =10, tikus model diperlakukan dengan injeksi stereotaktik plasmid sh-MALAT1 100 μL sekali sehari), kelompok ekspresi berlebih (Oe)-NC (n =10, tikus model diperlakukan dengan injeksi stereotaktik plasmid NC 100 μL Oe-MALAT1 sekali sehari), dan kelompok Oe-MALAT1 (n =10, tikus model diperlakukan dengan injeksi stereotaktik 100 L Oe-MALAT1 plasmid sekali sehari) [15]. Plasmid di atas disusun oleh Shanghai Genechem Co., Ltd. (Shanghai, China).

Tes Tekanan Darah Tikus

Tekanan darah arteri ekor tikus diukur pada minggu ke-1, ke-4, dan ke-12 setelah operasi. Sebelum dilakukan pengukuran tekanan darah, tikus ditempatkan pada alat pemanas suhu konstan sejenak untuk mencegah gangguan suhu eksternal. Kedua, tikus didiamkan selama beberapa menit di kandang khusus tikus untuk mencegah gangguan aktivitas. Jika tekanan darah sangat bervariasi, maka ditentukan dua atau tiga kali dalam waktu yang berbeda untuk mendapatkan nilai rata-rata.

Akuisisi Jaringan Aneurisma

Setelah 3 bulan, tikus dibius dengan 1% natrium pentobarbital (40 mg/kg) dengan injeksi intraperitoneal untuk mendapatkan sampel darah dari vena. Tikus di-eutanasia, dan dada dibuka, ventrikel kiri diintubasi ke dalam aorta, dan cava dipotong untuk mengeluarkan darah. Sementara itu, 30 mL salin normal yang mengandung natrium heparin digunakan untuk perfusi jantung yang cepat untuk menyiram darah, dan kemudian 10 mL 10% poliformaldehida/0.1 M PBS (pH 7.4) disuntikkan ke otak. Setelah perfusi dan fiksasi, otak tikus dibuka. Sirkulasi arteri di dasar tengkorak diamati dengan cermat, jaringan aneurisma dipisahkan, dan perubahan aneurisma diamati di bawah mikroskop.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Indeks terkait serum diuji dengan kit ELISA. Sampel darah yang dikumpulkan ditempatkan dalam termostat 37 °C selama 1 jam dan disentrifugasi pada 3000 r/menit selama 10 menit. Deteksi ekspresi endothelin-1 (ET-1) dan faktor von Willebrand (vWF) dilakukan sesuai dengan instruksi kit (semua kit dibeli dari NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Jiangsu, China).

Pewarnaan Hematoxylin-Eosin (HE)

Sampel difiksasi dengan formalin 10% selama lebih dari 24 jam dan diawetkan dalam blok parafin. Blok parafin didewax dengan xilena selama 20 menit, didehidrasi dengan seri alkohol menurun gradien (100%, 95%, 80%, 75%) selama l menit, dan diwarnai dengan hematoksilin selama 10 menit. Kemudian, jaringan dibilas dengan akuades, dibedakan dengan etanol asam klorida selama 30 s, dan direndam dalam air hangat pada suhu 50 C selama 5 min. Dicelup dengan larutan eosin, jaringan dibilas dengan air suling, didehidrasi dengan alkohol 70% dan 90%, dibersihkan dengan xilena, dan ditutup dengan gom netral. Morfologi jaringan diamati di bawah mikroskop berdaya tinggi.

Pengamatan Mikroskop Elektron Transmisi

Jaringan cadangan difiksasi dengan 2,5% glutaric dialdehyde dan 1% asam osmitat, didehidrasi dan kemudian ditanam dengan resin Epon812. Bagian semi-tipis diwarnai dengan toluena biru, dipangkas, dan dibuat menjadi bagian ultra-tipis. Bagian dicelup dengan uranil asetat dan timbal sitrat dan diamati dengan mikroskop elektron transmisi JME-2000EX (Hitachi High-Technologies Co., Ltd., Shanghai, China).

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-Mediated Deoxyuridine Triphosphate-Biotin Nick End-Labeling (TUNEL) Pewarnaan

Pewarnaan TUNEL tersirat untuk mengamati apoptosis sel endotel pada tikus IA berdasarkan kit TUNEL (Roche, Basel, Swiss). Bagian aneurisma tikus yang telah disiapkan dicuci dua kali dengan xilena (5 min/waktu) dan didehidrasi dengan alkohol seri menurun (100%, 95%, 80%, 75%) selama 3 kali (5 min/waktu). Jaringan diperlakukan dengan larutan protease K 20 μg/mL tanpa DNase selama 15–30 min, dijatuhkan dengan larutan reaksi TUNEL 50 μL selama 60 min, dan dikembangkan dengan 50 μL diaminobenzidine (DAB) pada 25 °C selama 10 min. Kemudian, bagian-bagian tersebut diwarnai dengan hematoxylin, didehidrasi dengan alkohol gradien, dibersihkan dengan xilena, dan ditutup dengan gom netral. Bagian diamati di bawah mikroskop optik dan indeks apoptosis dihitung.

Isolasi dan Identifikasi Sel Endotel Pembuluh Darah Aneurisma

Isolasi sel endotel dilakukan sesuai dengan metode yang dilakukan oleh Boscolo et al. [16]. Jaringan IA dipotong menjadi 3 mm ² fragmen. Jaringan diinkubasi dengan 0.1% collagenase B/0.1% dispase (Roche) selama 25 min pada 37 °C. Kemudian, jaringan yang telah dipisahkan ditriturasi selama 2 menit dengan pipet 2 mL dan disaring dengan saringan 100 m (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA). Selanjutnya, suspensi sel disentrifugasi dan kemudian disuspensikan kembali dalam media MV2 (termasuk faktor pertumbuhan dan 20% serum janin sapi) (PromoCell, Heidelberg, Jerman). Sel-sel diunggulkan pada 1 × 10 ⁴ sel/mL dalam labu kultur yang dilapisi dengan 1 μg/cm ² fibronektin. Mengikuti metode yang dijelaskan oleh Jackson et al. [17], sel-sel pertemuan 80-100% dipisahkan dengan manik-manik (Dynabeads M-450 Tosylactived, Oxoid, Hampshire, UK) dilapisi oleh Ulex europaeus Agglutinin I (UEA) (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, UK) . Sel-sel endotel yang melekat pada manik-manik berlapis lektin dikumpulkan dengan konsentrator partikel magnetik dan sel-sel yang tidak terkonjugasi dicuci dengan media basal. Sel-sel positif UEA disuspensikan kembali dalam media kultur dan diunggulkan dalam labu kultur berlapis fibronektin untuk meningkatkan adhesi dan laju pertumbuhan sel.

Sel ditumbuhkan dalam MV2 pada slide ruang berlapis fibronektin. Ketika pertemuan sel mencapai 80-100%, sel-sel diikat dalam aseton pada 4 °C dan diperlakukan dengan 1% Triton X-100 selama 5  menit dan kemudian 0,5% bovine serum albumin (BSA) selama 15 menit. Sel-sel ditetesi dengan antibodi primer terhadap vWF (1:300, Abcam, Cambridge, MA, USA) dan diinkubasi selama 2 jam (NC dilakukan tanpa adanya antibodi primer), ditetesi dengan lobak peroksidase-conjectured immunoglobulin G (1:150, Abcam) dan diinkubasi selama 30 menit. Kemudian sel-sel dikembangkan dengan 50 μL DAB pada 25 °C selama 5  menit, diwarnai dengan hematoxylin, dibedakan dengan asam klorida 0,1%, didehidrasi dengan alkohol, diikuti dengan pembersihan xilena, dan penyegelan gusi netral. Setelah kering, sel difoto di bawah mikroskop terbalik.

Pengelompokan dan Transfeksi Sel

Sel-sel endotel vaskular aneurisma pada fase logaritma dibagi menjadi 5 kelompok:kelompok kosong (sel endotel vaskular aneurisma tanpa pengobatan apa pun), kelompok sh-NC (sel endotel vaskular aneurisma yang ditransfeksi dengan plasmid sh-MALAT1 NC), kelompok sh-MALAT1 ( sel endotel vaskular aneurisma yang ditransfeksi dengan plasmid sh-MALAT1, kelompok Oe-NC (sel endotel vaskular aneurisma yang ditransfeksi dengan plasmid Oe-MALAT1 NC), dan kelompok Oe-MALAT1 (sel endotel vaskular aneurisma yang ditransfeksi dengan plasmid Oe-MALAT1). Plasmid di atas disintesis oleh Genechem. Transfeksi sel dilakukan sesuai dengan instruksi lipofectamine ^TM 2000 reagen (11668-027, Invitrogen, Carlsbad, California, AS).

3-(4, 5-Dimethylthiazol-2-Yl)-2, Uji 5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT)

Sel-sel endotel vaskular dari masing-masing kelompok diunggulkan pada pelat 96-sumur dengan kepadatan 3 × 10 ⁴ sel/mL dan dikultur pada 37 °C, 5% CO₂ selama 48  jam. Setiap kelompok diatur dengan 5 sumur paralel, dan setiap sumur ditambahkan dengan 20 μL larutan MTT segar (5 mg/mL, Sigma, St. Louis, MO, USA). Setelah reaksi 4 jam, sel dicampur dengan 200 μL dimetil sulfoksida. Setelah pembubaran penuh, nilai kerapatan optik sel di setiap kelompok diukur dengan pembaca lempeng mikro (BioRad, Hercules, California, AS) pada 490 nm.

Flow Cytometry

Distribusi siklus sel diuji dengan pewarnaan propidium iodida (PI). Sel-sel endotel pembuluh darah dipisahkan, disentrifugasi, disuspensikan kembali dengan etanol 75% yang telah didinginkan sebelumnya, dan diikat semalaman pada suhu 20 °C. Sel disentrifugasi untuk membuang supernatannya. Sel ditambahkan dalam 450 μL PBS, ditambahkan dengan 100 μL Rnase A, dan diwarnai dengan 400 μL PI pada 4 °C selama 30  menit untuk menghindari cahaya. Sebuah flow cytometer (FACSCalibur, Becton, Dickinson and Company, NJ, USA) digunakan untuk menguji distribusi siklus sel.

Apoptosis sel diuji dengan pewarnaan ganda Annexin V/PI. Sel endotel yang terlepas dikumpulkan dan dicuci dengan PBS sebanyak 3 kali. Sel disuspensi ulang dengan buffer pengikat 1 × 100 μL yang telah didinginkan sebelumnya dan dicampur dengan 5 μL Annexin dan 5 μL PI, masing-masing. Apoptosis sel diuji dengan flow cytometer. Dengan AnnexinV sebagai sumbu transversal dan PI sebagai sumbu longitudinal, kuadran kiri atas mewakili sel-sel cedera mekanis (AnnexinV ⁻ /PI ⁺ ), kuadran kanan atas untuk sel apoptosis akhir atau sel nekrotik (AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ), kuadran kiri bawah untuk sel normal negatif (AnnexinV ⁻ /PI ⁻ ), dan kuadran kanan bawah untuk sel-sel apoptosis awal (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ ). Total sel apoptosis (AnnexinV ⁺ /PI ⁻ dan AnnexinV ⁺ /PI ⁺ ) dihitung dan dinyatakan sebagai persentase.

Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)

Total RNA dalam jaringan dan sel diabstraksikan oleh Trizol (Takara Biotechnology Ltd., Dalian, China), dan konsentrasi serta kemurnian RNA ditentukan. Proses transkripsi balik RNA menjadi DNA komplementer dilakukan sesuai dengan instruksi kit transkripsi balik (K1621, Fermentas, Maryland, NY, USA). Urutan primer MALAT1, miR-143, dan VEGFA (Tabel 1) dirancang dan disusun oleh Genechem. Untuk mengevaluasi ekspresi lncRNA, miRNA, atau mRNA, dilakukan RT-qPCR menggunakan SYBR GreenPCR Master Mix (Takara, Tokyo, Jepang) dengan sistem Roche Real-Time PCR (Roche). U6 ditetapkan sebagai parameter internal miR-143, sedangkan MALAT1 dan VEGFA, dengan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH) sebagai parameter internal. Tingkat transkripsi relatif gen target dihitung dengan 2 ^−△△Ct metode.

Analisis Western Blot

Total protein dari jaringan dan sel diabstraksikan. Konsentrasi protein ditentukan dengan instruksi dari kit asam bicinchoninic (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, China). Protein dipisahkan dengan elektroforesis dengan gel poliakrilamida 10% (Boster Biological Technology). Membran dipindahkan ke membran polivinilidena fluorida dan kemudian disegel dengan 5% BSA selama 1  jam. Membran diinkubasi dengan antibodi primer terhadap Ki-67 (1:1000), VEGFA (1:1000), vWF (1:1000), dan matrix metalloproteinase (MMP)-9 (1:1000, Abcam, Cambridge, UK) , Cyclin D1 (1:1000), Bax (1:1000), dan Bcl-2 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California, USA), dan GAPDH (1:2000, Jackson Immuno Research, Grove, Pennsylvania, USA) dan dengan antibodi sekunder (1:500, Jackson Immuno Research) yang diberi label dengan lobak peroksida. Membran diperoleh dengan sistem pencitraan pemindaian fluoresensi inframerah dua warna Odyssey, dan nilai pita abu-abu diukur dengan perangkat lunak analisis gambar Quantity One.

Pengujian Gen Pelapor Luciferase Ganda

Situs pengikatan MALAT1 dan miR-143 diperkirakan dan diuraikan oleh situs web bioinformatika (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/). Hubungan yang mengikat antara MALAT1 dan miR-143 selanjutnya diverifikasi oleh uji gen reporter luciferase. Fragmen gen MALAT1 3′daerah yang tidak diterjemahkan (3′UTR) sintetis diperkenalkan ke vektor reporter luciferase pmiR-Report (Thermo Fisher Scientific) untuk menghasilkan tipe liar MALAT1 (MALAT1-WT) oleh situs endonuklease Bamh1 dan Ecor1. Situs mutasi urutan komplementer dari urutan dirancang pada MALAT1-WT, dan fragmen target dimasukkan ke dalam vektor reporter luciferase pmiR-Report untuk menghasilkan tipe mutan MALAT1 (MALAT1-MUT) oleh T4 DNA ligase setelah pencernaan restriksi endonuklease. MALAT1-WT dan MALAT1-MUT yang diurutkan dengan benar ditransfusikan bersama dengan meniru NC dan miR-143 meniru ke dalam sel endotel vaskular. Sel dipanen dan dilisiskan 48 jam setelah transfeksi, dan aktivitas luciferase diuji dengan kit deteksi luciferase (BioVision, San Francisco, CA, USA) dengan luminometer (Glomax20/20, Promega, Madison, Wisconsin, USA).

Hubungan target miR-143 dan VEGFA dan situs pengikatan miR-143 dan VEGFA 3′UTR diperkirakan melalui situs web bioinformatika (http://www.targetscan.org/vert_72/). Urutan wilayah promotor VEGFA 3′UTR yang mengandung situs pengikatan miR-143 digabungkan dan diklon ke vektor reporter luciferase pmiR-Report untuk menghasilkan VEGFA-WT. Atas dasar reporter ini, situs pengikatan VEGFA-WT dan miR-143 dimutasi untuk membentuk VEGFA-MUT. Reporter VEGFA-WT atau VEGFA-MUT dicampur dengan mimik NC atau miR-143 dan kemudian ditransfusikan bersama ke dalam sel endotel vaskular selama 48 jam. Setelah itu, sel dilisis dan aktivitas luciferase diuji dengan kit deteksi luciferase.

Pengujian RNA-Pull Down

Untuk memverifikasi hubungan pengikatan antara miR-143 dan MALAT1, uji RNA-pull down diimplementasikan. Tiga sekuens miRNA berlabel biotin Bio-miR-143-WT, Bio-miR-143-MUT, dan Bio-miR-NC dirancang dan dipercayakan kepada Perusahaan GenePharma (Shanghai, Cina). Oligonukleotida terbiotinilasi ini ditransfusikan ke dalam sel selama 48 jam. Kemudian, sel dipanen dan diinkubasi dengan lisat sel tertentu (Ambion, Austin, Texas, USA) selama 10 menit. Setelah itu, lisat ditetaskan dengan manik-manik streptavidin M-280 yang telah dilapisi sebelumnya dengan RNase-free dan ragi tRNA (semua dari Sigma) pada 4 °C selama 3 jam, kemudian dibersihkan dua kali dengan larutan lisis dingin, tiga kali dengan suhu rendah buffer garam, dan sekali dengan larutan buffer tinggi garam. Sebuah probe miR-143 antagonis didirikan sebagai NC. Total RNA diabstraksikan dengan Trizol dan kemudian tingkat pengayaan MALAT1 diuji menggunakan RT-qPCR.

Analisis Statistik

Semua data diuraikan oleh perangkat lunak SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Data pengukuran diwakili oleh mean ± standar deviasi. Perbandingan antara dua kelompok dilakukan oleh sampel independen t sementara perbandingan di antara beberapa kelompok dinilai dengan analisis varians satu arah (ANOVA), dan perbandingan berpasangan dilaksanakan dengan uji perbandingan ganda Tukey. Hubungan antara ekspresi MALAT1 dan gambaran klinikopatologis IA ditentukan dengan uji chi-kuadrat. P nilai kurang dari 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan secara statistik.

Hasil

MALAT1 dan VEGFA Diekspresikan Berlebihan dan miR-143 Di-downregulasi di Jaringan IA

Ekspresi ET-1 dan vWF dalam serum pada kelompok IA dan kelompok kontrol dideteksi oleh ELISA, dan hasilnya menunjukkan bahwa ekspresi ET-1 dan vWF meningkat pada kelompok IA versus kelompok kontrol (keduanya P <0,05) (Gbr. 1a, b).

MALAT1 dan VEGFA diekspresikan secara berlebihan, dan miR-143 diturunkan regulasinya di jaringan IA. a Ekspresi ET-1 dalam serum pasien IA dan pasien epilepsi lobus temporal dengan ELISA. b Ekspresi vWF dalam serum pasien IA dan pasien epilepsi lobus temporal dengan ELISA. c Pengamatan patologis jaringan IA dan jaringan arteri normal dengan pewarnaan HE. d Pengamatan morfologi jaringan IA dan jaringan arteri normal dengan mikroskop elektron transmisi. e MALAT1, miR-143, dan ekspresi mRNA VEGFA dalam jaringan IA dan jaringan arteri normal oleh RT-qPCR. f Ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF dalam jaringan IA dan jaringan arteri normal dengan analisis western blot. Sel endotel (EC), lamina elastis internal (IEL), sel otot polos (SMC). Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi; perbandingan antar kelompok dilakukan oleh sampel independen t tes

Perubahan patologis jaringan IA diamati melalui pewarnaan HE. Tidak tampak kerusakan yang nyata pada endoderm, sel endotel, dan sel otot polos yang terlihat pada jaringan arteri normal, dan sel-sel tersebut tersusun rapi dan memiliki struktur yang lengkap. Jaringan IA menunjukkan sel endotel yang rusak, sel otot polos yang mengalami degenerasi, dinding arteri yang menipis, serat elastik yang pecah, dan sel inflamasi yang terinfiltrasi (Gbr. 1c).

Perubahan ultrastruktur IA dan jaringan arteri normal diamati dengan mikroskop elektron transmisi. Ditemukan bahwa sel-sel endotel lengkap dan struktur adventitia utuh; tidak ada membran elastis internal yang rusak atau sel otot polos apoptosis yang terlihat pada jaringan arteri normal. Pada jaringan IA ditandai dengan degenerasi parah dinding pembuluh darah, terutama bermanifestasi sebagai hilangnya sebagian besar sel endotel, lapisan elastis internal yang rusak parah, sel otot polos yang rusak parah dan terdegradasi, dan gangguan pada membran luar pembuluh darah. (Gbr. 1d).

RT-qPCR dilakukan untuk menentukan ekspresi mRNA MALAT1, miR-143, dan VEGFA, sedangkan analisis western blot untuk ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF pada jaringan IA dan jaringan arteri normal. Hal ini menunjukkan bahwa berbeda dengan jaringan arteri normal, tingkat ekspresi MALAT1, VEGFA, MMP-9, dan vWF meningkat dan ekspresi miR-143 terdegradasi dalam jaringan IA (semua P <0,05) (Gbr. 1e, f).

Tingkat Hunt-Hess, Derajat Kerusakan Endotel, dan Riwayat Merokok Berkorelasi dengan Ekspresi MALAT1 di Jaringan IA

Mengingat median ekspresi MALAT1, pasien dikelompokkan menjadi dua kelompok:kelompok ekspresi rendah dan kelompok ekspresi tinggi. Hubungan antara ekspresi MALAT1 dan gambaran klinikopatologis pasien dengan IA dianalisis. Hasilnya menunjukkan bahwa tingkat Hunt-Hess, tingkat kerusakan endotel, dan riwayat merokok dikaitkan dengan ekspresi MALAT1 (semua P <0,05), sedangkan usia, jenis kelamin, dan mode bedah tidak terkait dengan ekspresi MALAT1 (semua P> 0,05) (Tabel 2).

Downregulated MALAT1 Menekan Tekanan Darah, Ekspresi ET-1, vWF, dan MMP-9, Serta Indeks Apoptosis Sel Endotel Vaskular Tikus dengan IA

Seperti yang ditampilkan pada Tabel 3, knockdown MALAT1 mengalami degradasi, sedangkan restorasi MALAT1 meningkatkan tekanan darah pada minggu ke-4 dan ke-12.

ELISA mengungkapkan bahwa downregulasi MALAT1 berkurang, sementara upregulasi MALAT1 meningkatkan ekspresi ET-1 dan vWF dalam serum tikus dengan IA (Gbr. 2a, b).

MALAT1 yang diregulasi ke bawah menekan tekanan darah, ekspresi ET-1, vWF, dan MMP-9, serta indeks apoptosis sel endotel vaskular tikus dengan IA. a Ekspresi ET-1 dalam serum tikus dengan ELISA. b Ekspresi vWF dalam serum tikus dengan ELISA. c Perubahan patologis jaringan IA pada tikus diamati dengan pewarnaan HE. d Ultrastruktur jaringan IA pada tikus diamati dengan mikroskop elektron transmisi. e Apoptosis sel endotel vaskular dengan pewarnaan TUNEL. f Indeks apoptosis sel endotel vaskular tikus. g MALAT1, miR-143, dan ekspresi mRNA VEGFA dalam jaringan IA tikus dengan RT-qPCR. h Ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF dalam jaringan IA tikus dengan analisis western blot. * P <0,05 vs. grup sh-NC, # P <0,05 vs. kelompok Oe-NC. Data pengukuran digambarkan sebagai mean ± standar deviasi, dan perbandingan antara beberapa kelompok dinilai dengan analisis varians satu arah diikuti dengan uji perbandingan ganda Tukey

Perubahan patologis jaringan IA pada masing-masing kelompok disurvei dengan pewarnaan HE. Kelompok kosong, kelompok sh-NC, dan kelompok Oe-NC dimanifestasikan dengan membran dalam yang rusak, sel endotel terkelupas, sel otot polos yang merosot, sel dan lapisan yang berkurang, dan dinding arteri yang menipis. Pada kelompok sh-MALAT1, lapisan endodermis, sel endotel, lapisan sel otot polos, dan lapisan membran luar arteri intrakranial sedikit rusak tetapi tersusun rapi. Kelompok Oe-MALAT1 menunjukkan lapisan intima yang menghilang, sel endotel yang terkelupas, serat elastik yang rusak, dan sel inflamasi yang terinfiltrasi (Gbr. 2c).

Jaringan IA tikus pada masing-masing kelompok diamati dengan mikroskop elektron transmisi. Ditampilkan bahwa sel endotel yang terdenaturasi, lapisan subendotel yang hancur, lapisan elastis internal yang menghilang, dan sel otot polos yang berkurang disajikan pada kelompok kosong, kelompok sh-NC, dan kelompok Oe-NC. Kelompok sh-MALAT1 menunjukkan sel endotel datar, nukleus oval, dan peningkatan serat kolagen tetapi tanpa lapisan elastis. Kelompok Oe-MALAT1 ditampilkan oleh sel-sel endotel yang menghilang dan lapisan elastis yang terpisah dari lapisan otot, yang hancur ke dalam lumen (Gbr. 2d).

Indeks apoptosis sel endotel vaskular pada tikus IA diuji dengan pewarnaan TUNEL. Membungkam MALAT1 mengurangi indeks apoptosis sel endotel vaskular, sementara MALAT1 yang diekspresikan secara berlebihan menunjukkan efek sebaliknya (Gbr. 2e, f).

Deteksi RT-qPCR ekspresi MALAT1, miR-143, dan VEGFA mRNA, dan analisis western blot ekspresi protein VEGFA, MMP-9, dan vWF dalam jaringan IA menunjukkan bahwa eliminasi MALAT1 menekan ekspresi MALAT1, VEGFA, MMP-9, dan vWF , dan ekspresi miR-143 yang meningkat. Sebaliknya, elevasi MALAT1 memberikan pengaruh yang berlawanan pada ekspresi gen ini (Gbr. 2g, h).

Ekspresi MALAT1 Rendah Meningkatkan Viabilitas dan Menahan Apoptosis Sel Endotel Vaskular di IA

Pewarnaan imunohistokimia digunakan untuk mendeteksi ekspresi penanda spesifik endotel vWF. Dimanifestasikan bahwa sitoplasma sel endotel vaskular IA ditutupi dengan partikel halus berwarna coklat yang positif, sedangkan sitoplasma pada kelompok NC-nya tidak memiliki partikel berwarna coklat. Hasilnya menegaskan bahwa sel yang dikultur adalah sel endotel (Gbr. 3a, b).

Low expression of MALAT1 advances viability and restrains apoptosis of vascular endothelial cells in IA. a vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells were covered with fine yellow particles. b vWF immunohistochemical staining in IA vascular endothelial cells:IA vascular endothelial cells showed no brown particles in the NC group. c Vascular endothelial cell viability in each group by MTT assay. d Protein expression of CyclinD1 and Ki-67 in each group by western blot analysis. e Cell cycle changes in each group by PI staining. f Cell apoptosis rate in each group by Annexin V/PI double staining. g Bax and Bcl-2 protein expression in each group by western blot analysis. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

MTT assay, flow cytometry, together with western blot analysis were utilized to test vascular endothelial cell viability and apoptosis. It was displayed that MALAT1 diminution promoted vascular endothelial cell viability (heightened Cyclin D1 and Ki-67 expression) and depressed apoptosis (decreased G0/G1 phase cells and increased S and G2/M phase cells, reduced Bax and elevated Bcl-2 expression). However, MALAT1 upregulation functioned in an opposite way to that of MALAT1 diminution on cell viability and apoptosis (Fig. 3c–g).

MiR-143 Is Bound to MALAT1 and VEGFA Is a Target Gene of miR-143

MALA1, miR-143, and VEGFA expression in vascular endothelial cells of each group were verified through RT-qPCR and western blot analysis. The results presented that MALA1 knockdown depressed MALA1 and VEGFA expression and enhanced miR-143 expression. On the contrary, MALA1 upregulation led to the increment in MALAT1 and VEGFA expression and the reduction in miR-143 expression (Fig. 4a, b).

MiR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. a MALAT1, miR-143, and VEGFA mRNA expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. b VEGFA protein expression in vascular endothelial cells of aneurysm in each group. c The binding sites of MALAT1 and miR-143 predicted by the bioinformatics website. d The regulatory relation of MALLA1 and miR-143 validated by dual luciferase reporter gene assay. e The binding relationship between MALAT1 and miR-143 verified by RNA-pull down assay. f The binding sites of miR-143 and VEGFA predicted by the bioinformatics website. g The regulatory relation of miR-143 and VEGFA validated by dual luciferase reporter gene assay. * P <0.05 vs. the sh-NC group, # P <0.05 vs. the Oe-NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, comparisons between two groups were assessed by independent sample t test, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way analysis of variance followed with Tukey’s multiple comparisons test

The specific binding region between MALAT1 and miR-143 was divined by online analysis software (Fig. 4c). The results of dual luciferase reporter gene assay revealed that the luciferase activity was impaired in the MALAT1-WT + miR-143 mimic group versus the MALAT1-WT + mimic-NC group (P <0.05). However, there was no distinct difference in luciferase activity in the MALAT1-MUT + miR-143 mimic group relative to that in the MALAT1-MUT + mimic-NC group (P> 0.05), indicating that miR-143 was specifically bound to MALAT1 (Fig. 4d). The results of RNA-pull down assay reported that the enrichment level of MALAT1 in the Bio-miR-143-WT group was heightened compared to the Bio-miR-NC group (P <0.05), but there was no distinct difference in MALAT1 enrichment level in the Bio-miR-143-MUT group (P> 0.05) (Fig. 4e).

Bioinformatics software divined a targeted relationship between miR-143 and VEGFA (Fig. 4f). The results of luciferase activity showed that the relative luciferase activity repressed after VEGFA-WT and miR-143 mimic co-transfected into vascular endothelial cells (P <0.05). However, the relative luciferase activity of vascular endothelial cells was not affected by co-transfection of VEGFA-MUT and miR-143-mimic (P> 0.05) (Fig. 4g). It was indicated that VEGFA was a direct target gene of miR-143.

Diskusi

IA is a serious intracranial disease, which mainly leads to subarachnoid hemorrhage [18]. A previous study has demonstrated the involvements of lncRNA-related competitive endogenous RNA networks in IA [19]. Also, a recent study has provided a proof that functional polymorphism in miR-143/145 gene promoter region is connected with the risk of IA [20]. In a study conducted by Xu et al. , it is shown that overexpression of angiogenic factors, such as VEGFA, may be related to IA formation and rupture [21]. In order to explain the molecular mechanism of MALAT1 in IA, a series of assays have been conducted and the results revealed that IA induced by vascular endothelial injury was regulated by MALAT1/miR-143/VEGFA signal axis.

Firstly, our study has provided substantial evidence that MALAT1 and VEGFA are upregulated and miR-143 is downregulated in IA tissues. A recent study has presented that MALAT1 is one of the most upregulated lncRNAs in the process of cerebral ischemia [22]. Another study has presented that MALAT1 is upregulated in ovarian cancer cells and intends to participate in the processes of ovarian cancer cell apoptosis, migration, and proliferation [23]. A study concerning to the expression profile of unruptured and ruptured IA has demonstrated that the expression of angiogenic factors such as VEGFA is upregulated in ruptured aneurysm [21]. Moreover, a clinical study has presented that the miR-143/145 cluster of IA patients is downregulated compared to healthy subjects [11]. In addition, it is previously discussed that miR-143/145 takes part in various biological processes associated with aneurysm formation and is downregulated in patients with IA [20]. All these findings are more or less echoed with the previous exploration outcomes.

Except for the abovementioned findings, this study has also explored the functional role of MALAT1 in IA through gain-off-function and loss-of-function assays. It could be summarized that downregulation of MALAT1 reduced blood pressure, serum levels of ET-1, and vWF and MMP-9 expression in IA tissues. It has been suggested previously that downregulation of MALAT1 restrains the upregulation of the glucose-induced ET-1 transcription product [24]. Also, it is reported that ectopic MALAT1 expression is the inducer of vWF generation [25]. Another study has verified that the depletion of MALAT1 in bone marrow-derived macrophages inhibits the expression of MMP-9 [26].

Also, cell experiments have been conducted for further confirmation of the functions of MALAT1 in IA. The results have suggested that MALAT1 knockdown promoted vascular endothelial cell viability and depressed apoptosis in IA. Similarly, it has been documented that disturbance of MALAT1 improves aortic mural architecture and retards aneurysm growth [8]. Supplementary to our study finding, there is research highlighting that poor expression of MALAT1 induces apoptosis and restrains proliferation of acute myeloid leukemia cells [27]. Another study has also demonstrated the inhibitory effects of MALAT1 knockdown on proliferation of human osteoarthritis cartilage cells [28]. Besides that, a prior research generally confirms that downregulation of MALAT1 can induce apoptosis and attenuate the proliferation of glioma cells [29]. Moreover, low expression of MALAT1 induced by RNA interference promotes apoptosis and suppresses proliferation of multiple myeloma cells [30]. Collectively, these studies have explained the molecular mechanism of MALAT1 in IA to some extent.

In addition, this study has evidenced that miR-143 is bound to MALAT1 and VEGFA is a target gene of miR-143. Similarly, a paper contends that MALAT1 binds directly to miR-143 and suppresses its expression [10]. Zhu dkk. have found that MALAT1 exerts its roles via interacting with miR-143 in cervical carcinoma cells [31]. It is further confirmed that MALAT1 indirectly modulate VEGFA via miR-200b-3p [32]. Moreover, another study has suggested that miR-143-3p mediates ZFPM2 effect on a number of protein targets in blood, including VEGFA [33]. Nevertheless, the interactions among MALAT1, miR-143, and VEGFA in IA have not been discussed and need further study.

Conclusion

From these results, it is clear that MALAT1 knockdown depresses apoptosis and promotes viability of vascular endothelial cells in IA by modulating miR-143/VEGFA axis. The co-expression network suggests the connection between MALAT1 and miR-143 with the involvement of VEGFA. The findings in this study partially disclose the pathogenesis of IA initiation and progression, and the studied targets may be a notably potential entry point to reveal pathology of IA from another perspective. Limitedly, further large-scale studies are required to comprehensively illustrate the mechanisms of MALAT1/miR-143/VEGFA axis in IA.

Sintesis Berbagai Ukuran Nanopartikel Emas dengan Metode Reduksi Kimia dengan Polaritas Pelarut Berbeda Detektor fotovoltaik inframerah berdasarkan heterojungsi p-GeTe/n-Si