Efek Osteoinduktif Potensial Nanopartikel Hidroksiapatit pada Sel Punca Mesenkim oleh Interaksi Sel Endotel
Abstrak
Nano-hidroksiapatit (nano-HA) telah menarik perhatian besar di bidang kedokteran regeneratif. Interaksi sel endotel (EC)-sel punca mesenkim (MSC) diperlukan untuk rekonstruksi tulang, tetapi cara nano-HA berinteraksi dalam proses ini masih belum diketahui. Di sini, kami menyelidiki efek sitotoksisitas dan osteoinduktif dari nanopartikel HA (HANPs) pada MSC menggunakan model kultur bersama tidak langsung yang dimediasi oleh EC dan menyoroti mekanisme yang mendasarinya. Ditemukan bahwa pada dosis subsitotoksik, HANPs meningkatkan viabilitas dan ekspresi gen osteoblas, serta nodul termineralisasi dan produksi alkaline phosphatase MSCs. Fenomena ini bergantung pada HIF-1α yang disekresikan oleh EC, yang memicu kaskade pensinyalan ERK1/2. Selain itu, model matematika garis keturunan sel dua tahap dibuat untuk menganalisis secara kuantitatif dampak HIF-1α pada diferensiasi osteogenik MSC. Ini menunjukkan bahwa HIF-1α memberikan efek stimulasi yang bergantung pada dosis pada tingkat diferensiasi osteogenik MSC hingga 1500 pg/mL, yang sesuai dengan hasil di atas. Data kami menyiratkan bahwa interaksi kooperatif antara HANP, EC, dan MSC kemungkinan besar berfungsi untuk merangsang regenerasi tulang. Lebih lanjut, model garis keturunan sel dua tahap berguna dalam sistem in vitro untuk menilai pengaruh potensial molekul efektor dalam rekayasa jaringan tulang.
Pengantar
Rekonstruksi defek tulang yang disebabkan oleh trauma, malformasi kongenital, atau reseksi bedah merupakan tantangan besar bagi bedah ortopedi [1]. Hidroksiapatit (HA), keramik bioaktif representatif, telah digunakan sebagai pengganti tulang [2]. Namun, sifat mekanik dan osteoinduktif yang tidak diinginkan membatasi aplikasi klinisnya [3]. Dalam beberapa tahun terakhir, nano-HA telah menunjukkan bioaktivitas yang lebih optimal dan kinerja mekanik yang lebih baik karena karakteristik bioniknya yang unik dan telah menarik minat yang signifikan dalam bidang biomedis yang terkait dengan pengobatan regeneratif [4]. Ketika nano-HA ditanamkan ke dalam cacat tulang, banyak sel yang terlibat dalam perbaikan tulang akan terpapar padanya. Dengan demikian, perlu untuk menilai perilaku biologis nano-HA. Beberapa bukti telah secara langsung menunjukkan bahwa nanopartikel HA (HANPs) dapat diserap oleh sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton (hWJ-MSCs) dan sel osteoblas, menghasilkan peningkatan diferensiasi osteogenik [5,6,7]. Dua dkk. sebelumnya melaporkan kemampuan HANPs untuk mempromosikan integrasi tulang rawan yang direkayasa ke dalam tulang rawan de novo [8]; sebaliknya, HANPs menghambat kemampuan angiogenik sel endotel vena umbilikalis manusia (HUVECs) [9]. Dalam hal kesehatan manusia, pemahaman yang lebih komprehensif tentang dampak HANP pada regenerasi tulang diperlukan, dan aplikasi berkelanjutan dari tulang buatan berbasis nano yang direkayasa menambah urgensi penelitian tersebut.
Regenerasi tulang pasti disertai dengan invasi neovessels. ECs adalah lapisan seluler bagian dalam dari sistem vaskular yang berfungsi untuk memberikan darah secara pasif dan juga berperan dalam menginduksi, menentukan, dan membimbing regenerasi organ serta mempertahankan homeostasis dan metabolisme [10, 11]. MSC adalah bagian dari ceruk periendotel dan memiliki kemampuan pembaruan diri dan multi-diferensiasi di bawah induksi lingkungan mikro fisiologis dan biokimia tertentu dalam relung penduduk mereka [12]. Tsai dkk. menemukan bahwa EC dapat mensekresi endotelin-1 untuk mengarahkan MSC menuju diferensiasi garis keturunan osteo dan kondro [13]. Selain itu, Saleh et al. menggunakan analisis data microarray untuk mengidentifikasi protein yang disekresikan HUVEC dan jalur pensinyalan crosstalk terkait yang berinteraksi dengan reseptor terikat membran MSC untuk meningkatkan proliferasi dan diferensiasi osteogenik [14]. Dalam rekayasa jaringan tulang, HANP dapat bersentuhan dengan pembuluh darah baru dan diendositosis oleh EC, yang telah terbukti mengubah fungsi fisiologis sel-sel ini [9, 15]. Ini juga dapat mempengaruhi sel-sel osteoprogenitor di sekitarnya dan mempengaruhi perbaikan tulang dengan mengubah pensinyalan parakrin. Namun, sementara dampak langsung HANP pada MSC telah dieksplorasi, masih ada kekurangan pemahaman yang jelas apakah HANP secara tidak langsung dapat menginduksi diferensiasi osteogenik MSC melalui EC, yang penting untuk pemahaman kita tentang efek HANP dalam hal untuk perbaikan tulang.
Dalam penelitian ini, dalam upaya untuk mendapatkan wawasan lebih lanjut tentang efek biologis HANP pada interaksi antara EC dan MSC, model kultur bersama tidak langsung dibuat menggunakan HUVEC dan hWJ-MSC. Dengan memanfaatkan sistem ini, efek sitotoksisitas dan osteoinduktif HANP pada hWJ-MSC melalui pensinyalan parakrin yang dimediasi HUVEC dinilai. Untuk mengidentifikasi faktor kunci yang mempengaruhi interaksi sel endotel-MSC yang diinduksi HANP, faktor terlarut dalam supernatan dari HUVECs yang telah distimulasi dengan HANP dievaluasi dengan penekanan pada mekanisme terkait pada tingkat gen dan protein. Hasilnya menunjukkan bahwa hypoxia-inducible factor (HIF)-1α memainkan peran penting dalam interaksi ini.
Untuk mengamati dan memprediksi secara kuantitatif dampak HIF-1α pada proses osteogenesis, model matematika yang menggabungkan garis keturunan sel dua tahap dengan HIF-1α didirikan. Di sini, dengan menganalisis data empiris, model garis keturunan sel dua tahap digunakan untuk memprediksi jumlah MSC dan derajat diferensiasi pada titik waktu mana pun, berdasarkan kepadatan penyemaian sel awal yang ditentukan dan konsentrasi HIF-1α, dan ini mungkin pada gilirannya memberikan saran yang sesuai untuk kondisi kultur awal dan waktu inkubasi. Hasil penelitian ini akan membantu menjelaskan interaksi antara pengganti tulang berbasis nano dan sistem biologis, yang dapat berfungsi untuk mempromosikan pengembangan biomaterial inovatif untuk digunakan dalam pengobatan regeneratif.
Bahan dan Metode
Persiapan dan Karakterisasi Partikel
HANP pada 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) dan partikel HA berukuran mikro (m-HAP) dengan kemurnian ≥ 99,0% dibeli dari Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China). Ukuran dan bentuk partikel dilihat menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, USA) dan pemindaian mikroskop elektron (SEM; LEO1530VP, Jerman). Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta partikel HA (HAP) ditentukan melalui Zetasizer Nano ZS90 dan Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, UK).
Persiapan dan Kultur Sel
Semua protokol eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Kedokteran Nanjing. HUVEC dan hWJ-MSC diambil dari tali pusat manusia yang baru, seperti yang dijelaskan sebelumnya, setelah mendapatkan persetujuan tertulis dari para donor [16, 17]. Secara singkat, tali pusat dan vena umbilikalis dibilas dengan phosphate-buffered saline (PBS) yang mengandung 1% penisilin dan streptomisin (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Austria). Kemudian, vena umbilikalis diisi dengan kolagenase I 0,1% (Sigma, St. Louis, MO, USA) dan diinkubasi selama 15 menit pada suhu 37°C. Setelah pengumpulan, HUVEC dikultur dalam media EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, USA).
Selanjutnya, pembuluh darah diangkat, dan jeli Wharton dipotong menjadi 1 mm
2
potongan dan kemudian ditempatkan di 25 cm
2
termos kultur jaringan (Corning Incorporated, Corning, NY, USA). Sel-sel ini diinkubasi dalam L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, USA) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (GIBCO) dan 1% PS.
hWJ-MSC dinilai untuk mengkonfirmasi fenotipe menggunakan antibodi monoklonal terhadap CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51, dan CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). HUVEC dinilai menggunakan faktor von Willebrand (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China). HUVEC antara bagian 3–7 dan hWJ-MSC antara bagian 3-5 digunakan dalam eksperimen ini.
Suspensi partikel pada 1 mg/mL dalam PBS kemudian diencerkan dalam L-DMEM hingga konsentrasi akhir. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, HUVEC diinkubasi dalam konsentrasi HAP yang ditunjukkan selama 18 jam. Media kultur disentrifugasi pada 15.000 rpm pada 4 ° C selama 15 menit, dan supernatan yang dilengkapi dengan 10% FBS digunakan sebagai media terkondisi (CM) untuk hWJ-MSC untuk menyelesaikan percobaan berikut. CM terdiri dari media osteogenik yang dilengkapi dengan cairan induksi osteogenik, yang mengandung 10 mM -gliserofosfat, 50 μg/mL L-asam askorbat-2-fosfat, dan 0,1 μM deksametason (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Selain itu, 2-methoxyestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, USA) digunakan sebagai penghambat HIF-1α spesifik. Pada kelompok 2-MeOE2(+), hWJ-MSC dikultur dengan CM dari HUVECs, yang diberi perlakuan awal dengan 5 μM 2-MeOE2 selama 40 menit sebelum suplementasi HAP. PD98059 digunakan sebagai penghambat MEK spesifik. Pada kelompok PD98059, hWJ-MSC dikultur dengan CM yang mengandung 5 μM PD98059.
Ilustrasi kultur bersama tidak langsung HAP/hWJ-MSC yang dimediasi oleh HUVEC. Singkatan:HAP partikel hidroksiapatit, hWJ-MSCs tali pusat manusia Sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton, HUVECs sel endotel vena umbilikalis manusia
Menentukan Viabilitas dan Jumlah Sel
Viabilitas sel dinilai menggunakan MTS Assay Kit (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). hWJ-MSC dibiarkan menempel selama 24 jam dan kemudian dikultur dengan CM selama 24 dan 72 jam. Absorbansi formazan dievaluasi pada 490 nm menggunakan pembaca pelat mikro (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, USA). Absorbansi juga diubah menjadi nomor sel menggunakan kurva kalibrasi standar pada kondisi yang sama.
Reaksi Berantai Polimerase Waktu Nyata (RT-PCR) kuantitatif
Reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) digunakan untuk mengisolasi total RNA dari sel hWJ-MSC yang diinkubasi dalam CM untuk waktu yang ditentukan. DNA komplementer ditranskripsi dari 1,0 µg RNA menggunakan kit Sintesis cDNA Strand Pertama PrimeScript (TaKaRa, Tokyo, Jepang) dalam thermocycler T3 (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Jerman). Tingkat ekspresi gen yang ditunjukkan dianalisis menggunakan kit FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) (Roche, Basel, Swiss) pada sistem amplifikasi waktu nyata kuantitatif (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ekspresi mRNA relatif dari gen target dinormalisasi ke GAPDH dan kemudian ditentukan menggunakan metode \(2^{{ - \Delta \Delta C_{t} }}\). Urutan primer untuk gen target tercantum pada Tabel 1.
Pewarnaan Alizarin Red S (ARS) dan Analisis Kuantitatif
hWJ-MSC dikultur dalam pelat 12-sumur dengan media osteogenik hingga 14 hari, dan kemudian, mineralisasi matriks ekstraseluler diamati menggunakan pewarnaan ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, Cina) setelah. Secara singkat, sampel difiksasi dengan etil alkohol absolut selama 15 menit dan kemudian diwarnai dalam 1% (b/v) ARS (pH, 4,2) pada suhu kamar selama 5 menit. Sel-sel yang diwarnai dicuci dua kali dengan air suling ganda dan kemudian difoto. Untuk analisis kuantitatif proses mineralisasi, 300 L 10% (b/v) cetylpyridinium chloride monohydrate (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) ditambahkan ke setiap sumur, dan pelat diinkubasi selama 30 menit. Sebanyak 90 μL dari setiap sampel dipindahkan ke pelat 96-sumur, dan absorbansinya kemudian diukur pada 405 nm dalam rangkap tiga.
Pewarnaan Alkaline Phosphatase (ALP) dan Analisis Kuantitatif
Setelah hWJ-MSC dikultur dalam pelat 12-sumur dengan media osteogenik hingga 14 hari, pewarnaan ALP dilakukan menggunakan BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit (Beyotime). Secara singkat, hWJ-MSC difiksasi dalam paraformaldehyde 4%. Kemudian, sampel diwarnai dalam campuran nitro-blue tetrazolium dan 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate selama 4 jam dan difoto. Untuk mengukur sintesis ALP, sel dilisiskan dalam buffer lisis RIPA es (Beyotime) selama 30 menit. Lisis sel disentrifugasi pada 12.000 rpm pada 4 ° C selama 10 menit, dan supernatan menjalani analisis kuantitatif ALP menggunakan kit ALP Assay (Beyotime). Absorbansi diukur dalam rangkap tiga pada 405 nm dan dikonversi ke aktivitas ALP menggunakan kurva standar.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
HUVEC diunggulkan pada 2 × 10
5
sel / sumur. CM dikumpulkan dari HUVEC yang dikultur dengan HAP selama 18 jam (File tambahan 1), dan supernatannya menjadi sasaran analisis ELISA (Gbr. 1). Kit ELISA HIF-1α manusia (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) digunakan sesuai dengan instruksi pabrik.
Imunofluoresensi
HUVEC diunggulkan pada slide di pelat 12-sumur (7,6 × 10
4
sel/sumur). Setelah terpapar CM selama 18 jam, sel difiksasi dalam 4% paraformaldehyde (Biosharp, Beijing, China) dan ditembus dengan 0,1% Triton X-100 (Beyotime) dalam PBS sebelum inkubasi dengan 1% antibodi anti-HIF-1α [EPR16897 ](ab179483, Abcam, UK) semalam di 4 ℃. Selanjutnya, sel diinkubasi dengan 1% CoraLite594—IgG Anti-Kelinci Kambing (H + L) terkonjugasi (Proteintech, USA) dalam gelap selama 1 jam. Kemudian, inti dicelup dengan DAPI (Beyotime, Shanghai, China), yang ditambahkan ke sel dan direaksikan selama 30 detik. Sampel diperiksa menggunakan mikroskop laser confocal (Olympus, Jepang). Intensitas fluoresensi diukur menggunakan perangkat lunak analisis ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, USA).
Analisis Western Blot
hWJ-MSC diinkubasi dalam CM selama 24 jam (extracellular signal-regulated kinase (ERK)1/2, p-ERK1/2) atau dalam media osteogenik selama 7 hari (runt-related transcription factor (RUNX)-2, tipe 1 kolagen/kolagen 1 (COL I)). Kemudian, sel-sel dilisiskan dalam buffer lisis RIPA selama 30 menit. Lisis sel disentrifugasi, dan supernatan disimpan pada suhu 20 °C untuk analisis. Setelah 12% SDS-PAGE, protein dipindahkan ke membran polivinilidena difluorida (PVDF). Antibodi utama yang digunakan adalah anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I, dan GAPDH (1:1.000, antibodi poliklonal kelinci; Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA ). Setelah menghilangkan antibodi yang tidak terikat, membran diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam. Sinyal pada membran dideteksi menggunakan sistem pencitraan gel chemiluminescence (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Swedia). Rasio p-ERK terhadap ERK dan RUNX-2/COL I terhadap GAPDH dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak analisis ImageJ v.1.4 (Bethesda).
Penilaian Apoptosis Sel
hWJ-MSC diunggulkan dengan kepadatan 10
5
sel per sumur di piring 6-sumur. Sel-sel yang patuh diperlakukan dengan konsentrasi HIF-1α yang ditunjukkan untuk waktu yang ditunjukkan. Sel kemudian dikumpulkan dan diberi label dengan FITC-Annexin V dan PI (Fcmacs, Nanjing, China) selama 15 menit dalam gelap. Semua sampel diuji menggunakan sitometer aliran FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, USA). Data dianalisis menggunakan FlowJo v10 (BD Biosciences).
Model Garis Garis Sel Dua Tahap
Mempertimbangkan potensi HAP yang sangat besar, dan kesulitan dalam menganalisis sistem kultur bersama, diperlukan model matematika yang dapat memberikan analisis kuantitatif dan prediksi tepercaya diperlukan untuk memahami peran HIF-1α dalam diferensiasi osteogenik hWJ- MSC.
hWJ-MSC dikultur dengan 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, dan 4000 pg/mL HIF-1α serta cairan induksi osteogenik. Setelah menyesuaikan data pada konsentrasi ini, kami menggunakan konsentrasi HIF-1α (diproduksi oleh HUVECs) dalam kelompok kontrol, m-HAP, np80, dan np20 (240, 300, 325, dan 375 pg/mL, masing-masing) untuk uji persamaan pas menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA). Untuk menyederhanakan model, kami menganggap pola pertumbuhan serupa pada konsentrasi HIF-1α yang berbeda adalah identik. Tingkat diferensiasi rata-rata digunakan agar sesuai dengan persamaan derajat-waktu diferensiasi. Tingkat proliferasi, tingkat apoptosis, dan derajat diferensiasi osteogenik dari hWJ-MSC dalam kelompok yang berbeda terdeteksi pada waktu yang ditentukan.
Model silsilah sel dua tahap yang disederhanakan, yang serupa dengan model silsilah sel multi-tahap [18, 19], dibuat berdasarkan data eksperimen. C0 dan C1 mewakili nomor sel hWJ-MSC dan sel terminal, masing-masing. C0 dan C1 diatur oleh:
Di sini, p , dipengaruhi oleh HIF-1α dan waktu, mewakili probabilitas replikasi hWJ-MSC. Sejalan dengan itu, d = 1 − p adalah tingkat diferensiasi yang dapat diperoleh dengan mencocokkan data estimasi dan eksperimen jumlah sel. Parameter v0 mengkuantifikasi seberapa cepat sel membelah pada setiap tahap garis keturunan (khususnya, v = ln2/c , di mana c adalah durasi siklus sel). Laju apoptosis sel terminal dilambangkan dengan A . Untuk kesederhanaan, kami mengabaikan bahwa tingkat apoptosis akan sedikit berbeda dari waktu ke waktu, dan oleh karena itu, A = 4,5% adalah konstanta. K menunjukkan kapasitas lingkungan karena sel tidak dapat mengalami proliferasi tanpa batas [20]. HIF-1α meningkatkan tingkat diferensiasi hWJ-MSC, yang mengarah ke tingkat diferensiasi yang dimodelkan oleh:
$$\begin{aligned} d &=\frac{{d_{0} }}{{1 + (r*H)^{m} }} \\ p &=1 - d \\ \end{aligned} $$
Di sini, H mewakili konsentrasi HIF-1α; d0 menunjukkan tingkat diferensiasi pada 0 pg/mL HIF-1α; r mewakili intensitas regulasi (di sini, mewakili intensitas regulasi HIF-1α pada MSC); dan m sesuai dengan koefisien Hill [21], menggambarkan hubungan antara tingkat diferensiasi MSC dan konsentrasi HIF-1α.
Analisis Statistik
Semua data yang memenuhi persyaratan normalitas dan homoskedastisitas dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD) dari tiga atau lebih eksperimen independen. Perangkat lunak SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, USA) digunakan untuk melakukan analisis statistik melalui ANOVA satu arah atau ANONA dua arah. A P nilai <0,05 dianggap signifikan secara statistik. Analisis statistik disajikan menggunakan GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Hasil
Karakterisasi HAP
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, HAP disiapkan dengan ukuran dan bentuk tertentu. Diameter np20 dengan bentuk hampir bulat rata-rata 20 nm, dan np80 seperti batang dengan panjang rata-rata 80 nm dan lebar 20 nm. m-HAP juga berbentuk hampir bulat dan berdiameter sekitar 12 m. Semua partikel memiliki muatan permukaan negatif di L-DMEM. Telah dikemukakan bahwa nilai negatif dari potensi zeta memiliki efek menguntungkan yang signifikan pada perlekatan dan proliferasi sel-sel tulang, serta ikatan tulang langsung dan pembentukan tulang baru [22, 23]. Partikel, yang diamati dalam L-DMEM, memiliki kecenderungan untuk beragregasi dalam sistem air. Ukuran hidrodinamik mereka juga diuji, yang mungkin juga menjadi faktor penting yang mempengaruhi perilaku biologis mereka.
Karakterisasi HAP. Mikrograf TEM dari a np20 dan b np80, dan mikrograf SEM c m-HAP. d Karakterisasi HAP (n = 6). Singkatan:TEM mikroskop elektron transmisi, SEM pemindaian mikroskop elektron, HA hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP berukuran mikro
Toksisitas Tidak Langsung HAP Terhadap hWJ-MSC
Untuk menilai toksisitas tidak langsung HAP pada hWJ-MSC, viabilitas sel diukur melalui uji MTS. CM dengan 50 µg/mL HANP dapat secara signifikan merangsang viabilitas hWJ-MSC setelah 24 jam dan 72 jam dan terutama pada 24 jam. Namun, CM dengan 100 g/mL HANP menurunkan viabilitas sel sebesar 15-20% dibandingkan dengan kontrol setelah 72 jam. Selain itu, CM dengan 25 µg/mL np20, tetapi bukan np80, merangsang viabilitas sel setelah 24 jam. Fenomena ini menegaskan bahwa 50 µg/mL HANPs adalah konsentrasi subsitotoksik yang digunakan dalam semua eksperimen berikutnya (Gbr. 3).
Toksisitas tidak langsung HAP terhadap hWJ-MSC. Kelangsungan hidup hWJ-MSC yang dikultur secara tidak langsung dengan HAP diukur untuk a 24 dan b 72 jam. *P < 0,05; **P < 0.01 versus kontrol. Kelompok kontrol terdiri dari sel-sel yang diinkubasi dalam CM tanpa pengobatan HAP, dan viabilitas sel dinormalisasi sebagai persentase dari kontrol. Singkatan:HAP partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP berukuran mikro, hWJ-MSC tali pusat manusia Sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton
Efek Osteoinduktif Tidak Langsung dari HAP pada hWJ-MSC
Untuk mengidentifikasi efek osteoinduktif tidak langsung dari HANPs pada hWJ-MSCs, ekspresi gen osteogenik dinilai dengan analisis RT-PCR kuantitatif. Tingkat transkrip untuk faktor transkripsi terkait kerdil 2 (RUNX-2) pada kelompok HANP, terutama np20, menunjukkan peningkatan yang mencolok dari Hari 7 hingga Hari 21 (Gbr. 4a). Ekspresi gen kolagen tipe I (Col I) pada kelompok np20 menunjukkan peningkatan dari Hari ke-7 hingga Hari ke-21, sedangkan kelompok np80 menunjukkan peningkatan yang berkelanjutan dari Hari ke-7 hingga Hari ke-14 (Gbr. 4b). Osteocalcin (OCN) mRNA jelas diregulasi dalam kelompok HANP pada Hari ke-14, menunjukkan tingkat percepatan osteogenesis (Gbr. 4c). Tingkat mRNA alkaline phosphatase (ALP) jelas meningkat pada kelompok HANP (Gbr. 4d), menunjukkan diferensiasi osteogenik dari hWJ-MSC. Namun, kelompok m-HAP menunjukkan perubahan terbatas dalam hal tingkat ketiga gen osteogenik ini dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 4). Selain itu, ekspresi penanda pluripotensi, NANOG, OCT3/4, dan SOX2, menurun pada kelompok HANP dibandingkan dengan kontrol (Gbr. 4e-g), menyiratkan bahwa hWJ-MSC pada kelompok HANP telah berdiferensiasi, terutama pada grup np20. Hasil serupa diperoleh dengan analisis Western blot (Gbr. 5c, d), yang menunjukkan bahwa kelompok np 20 secara tidak langsung dapat meningkatkan ekspresi RUNX-2 dan COL I di hWJ-MSC.
Efek tidak langsung HAP pada ekspresi gen terkait diferensiasi osteogenik. a RUNX-2, b Kol I, c OCN, d ALP, e NANOG, f 3 Oktober, dan g Tingkat gen SOX2 dalam hWJ-MSC yang dikultur dengan CM untuk waktu yang ditentukan. *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001 versus kelompok kontrol;
&P < 0,05;
&&P < 0.01;
&&&P < 0.001 versus kelompok m-HAP;
#P < 0,05;
##P < 0.01 versus kelompok np20. Sel yang diinkubasi dalam media osteogenik tanpa perlakuan HAP digunakan sebagai kelompok kontrol. Singkatan:HAP partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP berukuran mikro, hWJ-MSC tali pusat manusia Sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton, RUNX-2 faktor transkripsi 2 terkait kerdil, Col I kolagen tipe I, OCN osteokalsin, ALP alkali fosfatase, SOX 2 HMG-box 2 terkait SRY
Efek tidak langsung dari HAP pada deposisi kalsium ekstraseluler dan aktivitas ALP. hWJ-MSC diinkubasi dalam media osteogenik selama 14 hari. a Deposisi kalsium ekstraseluler kemudian divisualisasikan melalui pewarnaan ARS; b Aktivitas ALP dari hWJ-MSC dinilai melalui pewarnaan ALP, bilah skala:200 μm. c Analisis Western blot menunjukkan ekspresi RUNX-2 dan COL I dari hWJ-MSCs dalam media osteogenik pada hari ke 7. d Pengukuran densitometri RUNX-2 dan COL I dari bagian (c ). Sel yang diinkubasi dalam media osteogenik tanpa perlakuan HAP digunakan sebagai kelompok kontrol. *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001 versus kelompok kontrol;
&P < 0,05;
&&&P < 0.001 versus kelompok m-HAP;
###P < 0.001 versus kelompok np20. Singkatan:HAP partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP berukuran mikro, hWJ-MSC tali pusat manusia Sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton, ALP alkali fosfatase
Untuk mengamati secara visual efek osteoinduktif tidak langsung dari HANPs pada hWJ-MSCs, sel-sel diinkubasi dengan media osteogenik yang ditunjukkan selama 14 hari, diikuti oleh pewarnaan ARS dan ALP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, b, peningkatan jumlah nodul termineralisasi dan aktivitas ALP yang lebih tinggi dari hWJ-MSC diamati pada kelompok HANP dibandingkan dengan m-HAP dan kelompok kontrol. Selain itu, m-HAP, mirip dengan kontrol, menunjukkan efek terbatas pada diferensiasi osteogenik dari hWJ-MSC.
HAPs Mengaktifkan ERK1/2 Pensinyalan di hWJ-MSC Secara Tidak Langsung Dikultur Bersama dengan HUVEC
Untuk menyelidiki efek pada fungsi parakrin HUVECs oleh HAPs, uji imunofluoresensi dan ELISA digunakan untuk mengidentifikasi kemungkinan protein yang mempromosikan diferensiasi osteogenik dari hWJ-MSCs. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6a–c, produksi HIF-1α intraseluler dan ekstraseluler secara signifikan difasilitasi oleh HANP (terutama np20), sementara ada efek terbatas m-HAP pada produksinya.
HAP mengaktifkan pensinyalan ERK1 / 2 dalam hWJ-MSC yang secara tidak langsung dikultur bersama dengan HUVEC. a Imunofluoresensi HIF-1α dilakukan pada HUVEC yang diobati dengan/tanpa HAP selama 18 jam. b Intensitas fluoresensi HIF-1α dari bagian (a ). c Konsentrasi ekstraseluler HIF-1α dalam media kultur HUVEC yang diobati dengan/tanpa HAP selama 18 jam diukur melalui ELISA. Bilah skala:20 μm. *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0,001 versus kontrol;
##P < 0.01;
###P < 0.001 versus kelompok np20. Sel tanpa perlakuan HAP digunakan sebagai kelompok kontrol. hWJ-MSC dirawat dengan CM selama 24 jam. d Analisis Western blot menunjukkan aktivasi kinase kunci di jalur ERK1/2. e Pengukuran densitometri p-ERK1/2 dari bagian (b ). **P < 0.01; ***P < 0,001 versus kontrol;
##P < 0.01,
###P < 0.001 versus kelompok 2-MeOE2( −). Sel yang diinkubasi dalam CM tanpa perlakuan HAP digunakan sebagai kelompok kontrol. Singkatan:HAP partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP berukuran mikro, hWJ-MSC tali pusat manusia Sel punca mesenkimal yang diturunkan dari jeli Wharton, HUVECs sel endotel vena umbilikalis manusia, ERK kinase yang diatur sinyal ekstraseluler, HIF-1α faktor yang diinduksi hipoksia 1α
Untuk lebih akurat memahami jalur pensinyalan diferensiasi hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α, kami memeriksa regulator utama jalur ERK1/2 melalui analisis Western blot. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6d, e, sementara kadar protein total ERK1/2 tetap tidak berubah, kadar p-ERK1/2 jelas meningkat pada hWJ-MSC yang dikultur dengan HANP, dan ini terutama benar pada kelompok np20. Namun, m-HAP memiliki sedikit efek pada level p-ERK1/2 di hWJ-MSCs, mirip dengan efeknya pada produksi HIF-1α di HUVECs. Yang penting, peningkatan kadar p-ERK1/2 dalam hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α dapat diblokir oleh 2-MeOE2, penghambat HIF-1α spesifik, yang menunjukkan bahwa HIF-1α berfungsi di hulu jalur pensinyalan ERK1/2 di hWJ-MSC.
HIF-1α Mempromosikan Diferensiasi Osteogenik hWJ-MSC melalui Jalur ERK1/2
Untuk menentukan apakah HIF-1α diperlukan untuk stimulasi yang diamati dari diferensiasi osteogenik hWJ-MSC, penghambat HIF-1α spesifik (2-MeOE2) diterapkan pada kultur sel ini. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 7, deposisi matriks termineralisasi dan aktivitas ALP dari kelompok yang diberi perlakuan 2-MeOE2 (+) hWJ-MSC yang dikultur dalam media osteogenik melemah, menunjukkan bahwa HIF-1α sangat diperlukan untuk diferensiasi osteogenik hWJ- MSC. Berdasarkan hasil ini, kami mengeksplorasi lebih lanjut peran jalur ERK1/2 dalam diferensiasi osteogenik dari hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α. Deposisi matriks termineralisasi dan aktivitas ALP dalam hWJ-MSC yang dikultur dengan media osteogenik ditekan setelah pemberian PD98059, penghambat MEK spesifik.
HIF-1α mempromosikan diferensiasi osteogenik hWJ-MSC melalui jalur ERK1/2. hWJ-MSC diinkubasi dalam media osteogenik dengan atau tanpa PD98059 selama 14 hari. a Deposisi kalsium ekstraseluler divisualisasikan melalui pewarnaan ARS. b Aktivitas ALP dari hWJ-MSC dinilai melalui pewarnaan ALP. Bilah skala:200 μm. c Analisis kuantitatif matriks kalsium ekstraseluler. *P < 0,05; **P < 0.01; ***P < 0.001 versus control;
#P < 0,05;
###P < 0.001 versus the np20 group. Cells incubated in osteogenic medium without HAPs and PD98059 treatment were used as the control group. Abbreviations:HAPs hydroxyapatite particles, m-HAP micro-sized HAP particles, hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HUVECs human umbilical vein endothelial cells, ERK extracellular signal-regulated kinase, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase
Two-Stage Cell-Lineage Models
To quantitatively reveal the intrinsic connection between the concentration of HIF and osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, 0–4000 pg/mL of HIF-1α was used to treat eight groups of hWJ-MSCs. A two-stage cell-lineage mathematical model was used to analyze the proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation rates of these hWJ-MSCs treated with different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8a, fitting data were employed to obtain the simulated formula (\(\frac{d}{{d_{0} }} =\frac{1}{{0.14H^{2} - 0.43H + 1}}\)) and curve (blue curve), showing that the differentiation rate first increased and then decreased with the increase in HIF concentration. More specifically, the differentiation rate reached a peak at 1500 pg/mL HIF-1α.
Two-stage cell-lineage models. hWJ-MSCs were incubated in a defined concentration of HIF-1α for the indicated times. a Relative differentiation rates of hWJ-MSCs at different concentrations of HIF-1α, b relative ALP activity (differentiation degrees of hWJ-MSCs) and relative osteoblast cells on different culture days. c Three-dimensional surface of differentiation degree evolving with time and HIF-1α. Cell number with an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate), as well as d 0, e 375, and f 1500 pg/mL HIF-1α. Abbreviations:hWJ-MSCs human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells, HIF-1α hypoxia-inducible factor 1α, ALP alkaline phosphatase
According to our study, the concentrations of HIF-1α produced by HUVECs in the control, m-HAP, np80, and np20 groups were 240, 300, 325, and 375 pg/mL, respectively. The black square represents the differentiation rate promoted by 240, 300, 325, and 375 pg/mL HIF-1α, and this matches well with the simulated curve. In addition, the differentiation degrees of the hWJ-MSCs (relative ALP activity) treated with different concentrations of HIF-1α increased similarly increased with time. Therefore, in order to simplify the model, we consider their growth patterns to be similar or even identical. We found that the increase in ALP activity from Day 0 to Day 7 was proportional to the number of osteoblasts, and osteoblast cells reached their peak at the platform period. Therefore, after fitting the ALP activity with the relative osteoblasts cell number curve (osteoblasts cell number / maximum osteoblasts cell number), the maximum of ALP activity was predicted and relative ALP activity (ALP activity/ maximum of ALP activity), representing the differentiation degree, was acquired (Fig. 8b). Combining these two studies, the three-dimensional surface of the differentiation degree evolving with time and HIF-1α was obtained (Fig. 8c).
In order to estimate the optimal culture time, it was necessary to simulate cell numbers. After elucidating the differentiation rate under different concentrations of HIF-1α, we simulated the size of each population. The simulation utilized an initial seeding density of 1500 cells per well (in a 96-well plate) using different concentrations of HIF-1α. As shown in Fig. 8d–f, the experimental data (black square) match well with the simulated total cell numbers (blue curve), which is a sum of the number of hWJ-MSCs and osteoblasts, and this supports the ability of this model to predict the number of hWJ-MSCs and osteoblasts at any time point. Moreover, the osteoblast cell number approached the platform period at 21, 18, and 15 days with 0, 375, and 1500 pg/mL HIF-1α, respectively. This model provides the optimum culture time for guiding tissue engineering, and it also provides direct evidence that HIF-1α accelerates the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs.
Diskusi
With recent advances in nanobiomaterials, nano-based artificial bone substitutes have been an area of intense investigation. The accumulating evidence suggests that there are complex interactions between cells and nanobiomaterials due to their capacity to penetrate cell membranes and increase internal retention times [24, 25]. A previous study revealed that collagen/alginate nanofilms can adsorb onto the MSC membrane to activate intracellular signaling cascades and promote osteogenic differentiation [26]. Elegant experiments by Wu and his colleagues clearly demonstrated that TiO2 nanotubes can improve vascularization and osteogenic differentiation by facilitating paracrine effects and cell junctions via EC-MSC interactions [27]. For the purpose of developing excellent candidates for bone tissue engineering, it is necessary to clarify the direct crosstalk between nano-based bone substitutes and cells implicated in bone repair as well as their indirect interactions. However, our current understanding of this is still limited. In the present study, we utilized an indirect co-culture model to further elucidate the biological effects of HANPs on MSCs in regard to the indirect interactions mediated by ECs.
Cytotoxicity is a primary issue for assessing the biocompatibility of any nanobiomaterial. Although our previous study found that HANPs did not directly influence the viability or apoptosis of hWJ-MSCs, they may still exert different impacts via the mediation of other cells [28]. Thus, it was necessary to evaluate the cytotoxic effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Interestingly, after incubation in CM for 24 h and 72 h, hWJ-MSC viability was maintained and even elevated in the 0–50 µg/mL HANP groups, especially in the np20 group, indicating the existence of effector molecules in the CM. When the concentration of HANPs reached 100 µg/mL, they became cytotoxic to the hWJ-MSCs. However, 0–100 µg/mL m-HAP had no influence on hWJ-MSC viability (Fig. 3). Jiang dkk. have shown that engineered nanoparticles of a particular size can have distinct endocytic routes and kinetics associated with altered downstream signaling involved in regulating target cell functions [29]. In our previous study, we showed that np20 and np80 were endocytosed by HUVECs, and this was followed by morphologic changes and the appearance of large vacuoles, indicating the activated state of the HUVECs. Additionally, np20, with their faster uptake speed and increased accumulation, might result in a stronger activation of HUVECs, possibly resulting in increased hWJ-MSC viability via paracrine signaling. Conversely, few m-HAPs can be endocytosed by HUVECs, and this might account for their limited influence on the metabolism of hWJ-MSCs [9].
To further explore the potential osteoinductive effect of activated HUVECs, a subcytotoxic dose of 50 µg/mL HAPs was used in subsequent studies. The CM collected from the activated HUVECs promoted extracellular calcium deposition, ALP activity, and osteogenic proteins expression in hWJ-MSCs, as well as the mRNA expression of osteogenic genes (Figs. 4, 5). Runx2, an essential transcription factor involved in specifying the osteoblast lineage [30], showed a substantial enhancement in the np20 group, indicating a strong osteoinductive effect on hWJ-MSCs (Fig. 4a and Fig. 5c, d). The np20 group demonstrated a 1.5-fold improvement in COLI expression at Day 7 (Figs. 4b, 5c, d) and a double increase at Day 14, which implied the presence of additional differentiated osteoblasts in the HANP-treated groups (Fig. 4b) [30]. OCN is a mature stage bone marker [31], and this gene showed a significant increase in the HANP groups at Day 14 (Fig. 4c), indicating that np20 and np80 can accelerate bone maturation compared to m-HAP. ALP is an early marker of osteoblast differentiation, and it obviously increased with culture time in each group, especially the np20 group, revealing that additional transformation occurred from MSCs to osteoblasts (Fig. 4d). Pluripotency markers, NANOG, OCT3/4, and SOX2 imply the capacity for differentiation [32]. As shown in Fig. 4e–g, the decreased expression in the genes of the HANP groups implied that most of the hWJ-MSCs in HAP groups had transformed into osteoblasts.
Our data demonstrated that the endocytosis of HANPs by HUVECs was associated with an improved osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. However, the cause of this outcome is currently unclear. In terms of the paracrine function of HUVECs, we focused on soluble differentiation-inducing proteins in the supernatant of activated HUVECs. HIF-1α signaling is essential in coupling ossification and angiogenesis during bone regeneration [33, 34]. Heikal et al. reported that injured ECs secrete more HIF-1α even under normoxia conditions [35]. It has also been shown that exposure to HANPs inhibits the angiogenic ability of HUVECs [9]. Thus, we measured the concentrations of HIF-1α in the CM, and the results showed that the HIF-1α content increased in the HANP treatment groups compared to the m-HAP and control groups (Fig. 6a). To identify the role of HIF-1α in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, we used 2-MeOE2, which is a specific HIF-1α inhibitor, was used. The decreased concentration of HIF-1α paralleled the impaired mineralized matrix deposition and ALP activity in these hWJ-MSCs, indicating that HANPs can promote the HIF-1α production of HUVECs to facilitate the osteogenesis of hWJ-MSCs (Fig. 7).
To properly apply HANPs for use in bone tissue engineering, it is necessary to gain further insights into the mechanisms by which HANPs promote the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs mediated by HUVECs. The ERK1/2 pathway is downstream of HIF-1α [36] and is fundamental to the differentiation of MSCs [37]. In this work, the concentrations of HIF-1α in the CM coincide well with the p-ERK1/2 levels in the hWJ-MSCs (Fig. 6b, c). When 2-MeOE2 was applied, the p-ERK1/2 expression in the hWJ-MSCs failed to be activated, indicating that HIF-1α functioned upstream of ERK1/2 signaling. To directly address the role of ERK1/2 signaling in the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs, PD98059, a specific MEK inhibitor, was used. The suppression of ERK1/2 signaling resulted in the lowest osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. One possible reason for this occurrence is that the ERK1/2 pathway plays a key role in both HIF-1α signaling and in the apoptosis and proliferation signaling pathways, which could be responsible for the observed changes in osteogenic differentiation in these cells [38, 39]. Additionally, this could also be related to the presence of vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is one of the downstream effectors of HIF-1α signaling [33], and it can also promote the osteogenic differentiation of MSCs via activation of the ERK1/2 pathway [37]. Our previous study found that np20 induced the production of VEGF in HUVECs [9]; therefore, it is possible that the suppression of the ERK1/2 pathway may result in inhibition of VEGF, which would lead to the decreased osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. According to the available experimental results, we can summarize as follows. HANPs are able to more optimally process better direct [5] and indirect osteoinductive effects than m-HAPs. Compared to autogenous bone grafts and bone allografts, there is an extensive source of HANP and without secondary damage and potential immunogenicity. However, compared to m-HAPs, HANPs can suppress the angiogenic ability of HUVECs [9] and exhibit slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion.
Recently, growing evidence has demonstrated the importance of HIF-1α in the bone regeneration. However, few studies have been able to quantitatively predict the MSC differentiation rate under specific initial conditions, such as the HIF-1α concentration. Taking cell proliferation, apoptosis, and osteogenic differentiation into account, we present a mathematical model that combines a two-stage cell lineage with HIF-1α that is highly correlated with our experimental data. By fitting the differentiation rate of hWJ-MSCs in 0–4000 pg/mL HIF-1α, we acquired the equations for describing the differentiation rate, HIF-1α concentration, and time. As shown in Fig. 8d, this model can depict the cell number map under different HIF-1α concentrations, so that it is possible to explore the intrinsic dynamics of the two-stage system [40]. Additionally, this model mathematically validates the effect of HIF-1α on the osteogenic differentiation of hWJ-MSCs. Moreover, based on a multi-stage cell-lineage model and logistic model, our model is sufficiently stable to enable long-term predictions without falling into the trap of population unlimited explosion [41].
By using the existing experimental data, both the cell number and differentiation rate can be predicted with a defined initial cell seeding density and HIF-1α concentration. As such, the optimum incubation time is also obtained. Consequently, we can predict the optimum concentration of HIF-1α and determine the most optimal time for osteogenesis, which is important for efficient tissue engineering. A two-stage cell-lineage model is applicable for predicting the proliferation and differentiation of stem cells, which have two cell lineages. On this basis, the model founded on the initial conditions and existing experimental data can be established to identify the optimum culture conditions in vitro, which will assist in optimizing bone repair in vivo.
Kesimpulan
In this study, we explored the specific biological effects of HANPs on hWJ-MSCs mediated by HUVECs. Compared to m-HAPs, both np20 and np80 showed slight cytotoxicity in both a time- and dose-dependent fashion. Importantly, the size of the HANPs appeared to have no significant impact on this cytotoxicity. Our data also showed that HANPs, especially np20, were capable of facilitating HUVECs to secrete increased levels of HIF-1α, which directly correlated with the enhanced osteogenic differentiation of hWJ-MSCs via the activation of the ERK1/2 pathway (Fig. 9). More remarkably, the results from the two-stage cell-lineage model suggested that HIF-1α exerted a dose-dependent stimulatory effect on the osteogenic differentiation rate of hWJ-MSCs. Additionally, the optimum concentration of HIF-1α and incubation time were estimated based on the initial conditions using an in vitro model, which could be invaluable in the future for tissue engineering applications. Collectively, these observations provide evidence that HANPs may improve bone regeneration by modulating cell–cell interactions.
A schematic illustration of the possible mechanisms
Ketersediaan data dan materi
Kumpulan data yang digunakan dan dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
Singkatan
HA:
Hydroxyapatite
HANPs:
HA nanoparticles
hWJ-MSCs:
Human umbilical cord Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells
