Nanopartikel Hidroksiapatit Meningkatkan Osteogenesis MSC melalui Interaksi Sel Endotel
Abstrak
Nano-hidroksiapatit (nano-HA) telah menarik perhatian besar dalam bidang medis regeneratif. Interaksi sel endotel (EC) dengan sel mesenchymal (MSC) diperlukan untuk rekonstruksi tulang, tetapi bagaimana nano-HA berinteraksi dalam proses ini masih tidak diketahui. Di sini, kami menyelidiki sytotoksisitas dan efek osteoinduktif nanopartikel HA (HANPs) pada MSC menggunakan model kultur indirek yang dimediasi oleh EC dan menyoroti mekanisme di baliknya. Ditemukan bahwa pada dosis substytotoksis, HANPs meningkatkan kelangsungan hidup dan ekspresi gen osteoblast, serta nodul mineral dan produksi fosfatase alkaline MSC. Fenomena ini bergantung pada HIF-1α yang dihasilkan oleh EC, yang memicu kaskad sinyal ERK1/2. Selain itu, model matematis keturunan sel dua tahapan dirancang untuk menganalisis secara kuantitatif dampak HIF-1α terhadap diferenciasi osteogenik MSC. Model ini menunjukkan bahwa HIF-1α memiliki efek stimulasi yang bergantung pada dosis terhadap tingkat diferenciasi osteogenik MSC hingga 1500 pg/mL, yang sejalan dengan hasil di atas. Data kami menyiratkan bahwa interaksi kooperatif antara HANPs, EC, dan MSC kemungkinan besar berfungsi untuk merangsang regenerasi tulang. Selain itu, model keturunan sel dua tahapan adalah sistem in vitro yang berguna untuk mengevaluasi pengaruh potensial molekul efektor dalam rekayasa jaringan tulang.
Pendahuluan
Rekonstruksi cacat tulang yang disebabkan oleh trauma, kelainan bawaan, atau resesi bedah menantang bedah ortopedi [1]. Hidroksiapatit (HA), keramik bioaktif representatif, telah digunakan sebagai pengganti tulang [2]. Namun, properti mekanis dan osteoinduktif yang tidak diinginkan membatasi aplikasi klinisnya [3]. Dalam beberapa tahun terakhir, nano-HA telah menunjukkan bioaktivitas yang lebih optimal dan kinerja mekanis yang ditingkatkan karena karakteristik bionik uniknya dan telah menarik minat signifikan dalam bidang biomedis yang terkait dengan medis regeneratif [4]. Saat nano-HA ditanamkan pada cacat tulang, berbagai sel yang terlibat dalam perbaikan tulang akan terpapar padanya. Sebagai upaya serupa, diperlukan untuk menilai perilaku biologis nano-HA. Beberapa bukti telah secara langsung menunjukkan bahwa nanopartikel HA (HANPs) dapat ditelan oleh sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia (hWJ-MSCs) dan sel osteoblast, yang mengarah pada diferenciasi osteogenik yang ditingkatkan [5,6,7]. Dua et al. sebelumnya melaporkan kemampuan HANPs untuk mempromosikan integrasi kartilase rekayasa ke dalam kartilase baru [8]; sebaliknya, HANPs menghambat kemampuan angiogenik sel endotel tali pusat manusia (HUVECs) [9]. Dalam hal kesehatan manusia, pemahaman yang lebih komprehensif tentang dampak HANPs pada regenerasi tulang diperlukan, dan aplikasi berkelanjutan dari tulang buatan nano-basis rekayasa menambah urgensi studi tersebut.
Regenerasi tulang tidak terlepas dari invasi pembuluh darah baru. EC adalah selapir dalam sistem pembuluh darah yang berfungsi untuk mengirimkan darah secara pasif dan juga berperan dalam menginduksi, menentukan, dan memandu regenerasi organ serta menjaga homeostase dan metabolisme [10, 11]. MSC adalah bagian dari nis endotelial dan memiliki kemampuan pembaharuan diri dan multi-diferensi di bawah induksi mikroenvironment fisiologis dan biokimia tertentu di dalam nis tempat tinggalnya [12]. Tsai et al. menemukan bahwa EC dapat mengeluarkan endotelin-1 untuk mengarahkan MSC terhadap diferenciasi garis osteo- dan kondro [13]. Selain itu, Saleh et al. menggunakan analisis data microarray untuk mengidentifikasi protein yang dikeluarkan HUVEC dan jalur sinyal bersilang terkait yang berinteraksi dengan reseptor membran MSC untuk meningkatkan proliferasi dan diferenciasi osteogenik [14]. Dalam rekayasa jaringan tulang, HANPs dapat bersentuhan dengan pembuluh darah baru dan ditelan oleh EC, yang telah terbukti mengubah fungsi fisiologis sel-sel ini [9, 15]. Ini juga dapat mempengaruhi sel progenitor tulang di sekitarnya dan mempengaruhi perbaikan tulang dengan mengubah sinyal parakrin. Namun, sementara dampak langsung HANPs pada MSC telah dieksplorasi, masih kurang pemahaman yang jelas apakah HANPs dapat secara tidak langsung menginduksi diferenciasi osteogenik MSC melalui EC, yang esensial untuk pemahaman kita tentang efek HANPs terkait perbaikan tulang.
Dalam penelitian ini, untuk memperoleh wawasan lebih dalam tentang efek biologis HANPs pada interaksi antara EC dan MSC, model kultur indirek dirancang menggunakan HUVEC dan hWJ-MSC. Dengan menggunakan sistem ini, efek sytotoksis dan osteoinduktif HANPs pada hWJ-MSC melalui sinyal parakrin yang dimediasi HUVEC dinilai. Untuk mengidentifikasi faktor kunci yang mempengaruhi interaksi sel endotel-MSC yang diinduksi HANP, faktor larutan dalam sobrenatan HUVEC yang telah ditangkal HANP dievaluasi dengan penekanan pada mekanisme terkait pada tingkat gen dan protein. Hasilnya menunjukkan bahwa faktor dapat diakibatkan hipoksia (HIF)-1α memainkan peran krusial dalam interaksi ini.
Untuk mengamati dan memprediksi secara kuantitatif dampak HIF-1α pada proses osteogenesis, model matematis yang menggabungkan keturunan sel dua tahapan dengan HIF-1α dirancang. Di sini, dengan menganalisis data empiris, model keturunan sel dua tahapan digunakan untuk memprediksi jumlah MSC dan tingkat diferenciasi pada setiap titik waktu, berdasarkan kepadatan tanam sel awal dan konsentrasi HIF-1α yang ditentukan, dan ini kemudian dapat memberikan saran yang tepat untuk kondisi kultur awal dan waktu inkubasi. Hasil penelitian ini akan membantu membangkitkan terang pada interaksi antara pengganti tulang berbasis nano dan sistem biologis, yang dapat digunakan untuk mempromosikan pengembangan biomaterial inovatif untuk digunakan dalam medis regeneratif.
Bahan dan Metode
Persiapan dan Karakterisasi Partikel
HANPs pada 20 nm (np20), 20*80 nm (np80) dan partikel HA mikro (m-HAP) dengan kemurnian ≥ 99,0% dibeli dari Nanjing Emperor Nano Material Company Ltd (Nanjing, China). Ukuran dan bentuk partikel dilihat menggunakan mikroskopi transmisi elektron (TEM; FEI Tecnai G2 Spirit Bio-Twin, FEI, Hillsboro, OR, AS) dan mikroskopi elektron indra (SEM; LEO1530VP, Jerman). Ukuran hidrodinamik dan potensi zeta partikel HA (HAP) ditentukan melalui Zetasizer Nano ZS90 dan Mastersizer 3000 (Malvern Instruments, Malvern, Inggris).
Persiapan dan Kultur Sel
Semua protokol eksperimental disetujui oleh Komite Etika Universitas Kedokteran Nanjing. HUVEC dan hWJ-MSC diambil dari tali pusat manusia segar, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, setelah mendapatkan persetujuan tertulis dari donor [16, 17]. Secara singkat, tali pusat dan vena tali pusat dicuci dengan larutan garam fosfat (PBS) yang mengandung 1% penisilin dan streptomisin (PS; Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, Pasching, Austria). Kemudian, vena tali pusat diisi dengan kolagenase I 0,1% (Sigma, St. Louis, MO, AS) dan diinkubasi selama 15 menit pada 37 °C. Setelah dikumpulkan, HUVEC dikultur dalam medium EC (ECM) (Sciencell, San Diego, CA, AS).
Selanjutnya, pembuluh darah dikeluarkan, dan jelly Wharton dipotong menjadi potongan 1 mm2 dan kemudian ditempatkan dalam botol kultur jaringan 25 cm2 (Corning Incorporated, Corning, NY, AS). Sel-sel ini diinkubasi dalam L-DMEM (GIBCO Life Technology, Grand Island, NY, AS) yang dilengkapi dengan 10% serum fetal sapi (GIBCO) dan 1% PS.
hWJ-MSC dievaluasi untuk mengonfirmasi fenotipe menggunakan antisatwa monoklonal terhadap CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD51, dan CD105 (BD Biosciences, San Jose, CA, AS). HUVEC dievaluasi menggunakan faktor vWilbrand (vWF; Shanghai ChangDao Biotech Co, Ltd., Shanghai China). HUVEC antara pasase 3–7 dan hWJ-MSC antara pasase 3–5 digunakan dalam eksperimen ini.
Selanjutnya, suspensi partikel pada 1 mg/mL dalam PBS diencerkan dalam L-DMEM hingga konsentrasi akhir. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1, HUVEC diinkubasi dalam konsentasi HAP yang ditunjukkan selama 18 jam. Medium kultur diinginkan pada 15.000 rpm pada 4 °C selama 15 menit, dan sobrenatan yang dilengkapi dengan 10% FBS digunakan sebagai medium kondisi (CM) untuk hWJ-MSC untuk melakukan eksperimen berikutnya. CM terdiri dari medium osteogenik yang dilengkapi dengan cairan induksi osteogenik, yang mengandung 10 mM β-glicerofosfat, 50 μg/mL asam askorbat-2-fosfat, dan 0,1 μM deksametason (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, AS). Selain itu, 2-metoksiestradiol (2-MeOE2) (Selleck Chemicals, Houston, TX, AS) digunakan sebagai inhibitor HIF-1α spesifik. Dalam grup 2-MeOE2(+), hWJ-MSC dikultur dengan CM dari HUVEC yang telah dirawati sebelumnya dengan 5 μM 2-MeOE2 selama 40 menit sebelum penambahan HAP. PD98059 digunakan sebagai inhibitor MEK spesifik. Dalam grup PD98059, hWJ-MSC dikultur dengan CM yang mengandung 5 μM PD98059.
Ilustrasi kultur indirek HAPs/hWJ-MSCs yang dimediasi oleh HUVECs. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, HUVECs sel endotel vena tali pusat manusia
Penentuan Kelangsungan Hidup dan Jumlah Sel
Kelangsungan hidup sel dinilai menggunakan MTS Assay Kit (MTS; Bestbio, Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). hWJ-MSC dibiarkan menempel selama 24 jam dan kemudian dikultur dengan CM selama 24 dan 72 jam. Serapan formazan dievaluasi pada 490 nm menggunakan pembaca mikroplak (SpectraMax M2; Molecular Devices LLC, Sunnyvale, CA, AS). Serapan juga dikonversi menjadi jumlah sel menggunakan kurva kalibrasi standar dalam kondisi yang sama.
Reaksi Rantai Polimerase Kuantitatif Waktu Nyata (RT-PCR)
Reagen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, AS) digunakan untuk mengisolasi RNA total dari sel hWJ-MSC yang diinkubasi dalam CM untuk waktu yang ditentukan. DNA komplementer ditranskripsi dari 1,0 µg RNA menggunakan PrimeScript First Strand cDNA Synthesis kit (TaKaRa, Tokyo, Jepang) dalam termosiklus T3 (Mastercycler 5333; Eppendorf, Hamburg, Jerman). Tingkat ekspresi gen yang ditentukan dianalisis menggunakan FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) kit (Roche, Basel, Swiss) pada sistem amplifikasi waktu nyata kuantitatif (7900HT Fast; Applied Biosystems, Foster City, CA, AS). Ekspresi mRNA relatif dari gen target dinormalisasi ke GAPDH dan kemudian ditentukan menggunakan metode \(2^{{ - \Delta \Delta C_{t} }}\). Urutan primer untuk gen target tercantum dalam Tabel 1.
Pewarnaan dan Analisis Kuantitatif Alizarin Red S (ARS)
hWJ-MSC dikultur dalam plat 12 lobang dengan medium osteogenik hingga 14 hari, dan kemudian mineralisasi matriks seluler luar diamati menggunakan pewarnaan ARS (Leagene, Leagene Biotechnology, Beijing, China) setelah. Secara singkat, sampel diperbaiki dengan alkohol etil murni selama 15 menit dan kemudian diwarnai dalam 1% (b/v) ARS (pH, 4,2) pada suhu ruangan selama 5 menit. Sel yang diwarnai dicuci dua kali dengan air tisu ganda dan kemudian difoto. Untuk analisis kuantitatif proses mineralisasi, 300 µL klorida cetilpiridinium monohidrat 10% (b/v) (BOMEI, BOMEI Biotechnology, Hefei, China) ditambahkan ke setiap lobang, dan plat diinkubasi selama 30 menit. Secara total 90 µL dari setiap sampel dipindahkan ke plat 96 lobang, dan serapan kemudian diukur pada 405 nm dalam triplikat.
Pewarnaan dan Analisis Kuantitatif Fosfatase Alkaline (ALP)
Setelah hWJ-MSC dikultur dalam plat 12 lobang dengan medium osteogenik hingga 14 hari, pewarnaan ALP dilakukan menggunakan BCIP/NBT Alkaline Phosphatase Color Development Kit (Beyotime). Secara singkat, hWJ-MSC diperbaiki dalam paraformaldehida 4%. Kemudian, sampel diwarnai dalam campuran nitro-blu tetrazolium dan 5-bromo-4-kloro-3-indosil-fosfat selama 4 jam dan difoto. Untuk mengkuantifikasi sintesis ALP, sel dilisis dalam larutan lisis RIPA dingin (Beyotime) selama 30 menit. Lisat sel diinginkan pada 12.000 rpm pada 4 °C selama 10 menit, dan sobrenatan dianalisis secara kuantitatif ALP menggunakan ALP Assay kit (Beyotime). Serapan diukur dalam triplikat pada 405 nm dan dikonversi menjadi aktivitas ALP menggunakan kurva standar.
Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
HUVEC ditanam pada 2 × 105 sel/lobang. CM dikumpulkan dari HUVEC yang dikultur dengan HAP selama 18 jam (File tambahan 1), dan sobrenatan dianalisis ELISA (Gambar 1). Kit ELISA HIF-1α manusia (Anhui Joyee Biotechnics, Anhui, China) digunakan sesuai dengan instruksi pabrikan.
Imunofluoresensi
HUVEC ditanam pada slide dalam plat 12 lobang (7,6 × 104 sel/lobang). Setelah paparan CM selama 18 jam, sel diperbaiki dalam paraformaldehida 4% (Biosharp, Beijing, China) dan dipermeabilisir dengan Triton X‐100 0,1% (Beyotime) dalam PBS sebelum diinkubasi dengan antisatwa anti-HIF-1α 1% [EPR16897](ab179483, Abcam, Inggris) selama semalam pada 4 ℃. Selanjutnya, sel diinkubasi dengan 1% CoraLite594—terkonjugasi Kambing Anti-Kelinci IgG(H + L) (Proteintech, AS) dalam kegelapan selama 1 jam. Kemudian, inti sel diwarnai dengan DAPI (Beyotime, Shanghai, China), yang ditambahkan ke sel dan bereaksi selama 30 detik. Sampel diperiksa menggunakan mikroskop konfokal laser (Olympus, Jepang). Intensitas fluoresensi dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak analisis ImageJ v.1.4 (Bethesda, MD, AS).
Analisis Western Blot
hWJ-MSC diinkubasi dalam CM selama 24 jam (kinase sinyal teratur ekstraseluler (ERK)1/2, p-ERK1/2) atau dalam medium osteogenik selama 7 hari (faktor transkripsi terkait runt (RUNX)-2, kolagen tipe 1/kolagen 1 (COL I)). Kemudian, sel dilisis dalam larutan lisis RIPA selama 30 menit. Lisat sel diinginkan, dan sobrenatan disimpan pada −20 °C untuk analisis. Setelah SDS-PAGE 12%, protein ditransfer ke membran difluorida polyvinyliden (PVDF). Antisatwa primer yang digunakan adalah anti-p-ERK1/2, anti-ERK1/2, anti-RUNX-2, anti-COL I, dan GAPDH (1:1.000, antisatwa polyclonal kelinci; Cell Signaling Technology, Boston, MA, AS). Setelah menghilangkan antisatwa yang tidak terikat, membran diinkubasi dengan antisatwa sekunder selama 1 jam. Sinyal pada membran terdeteksi menggunakan sistem citra gel kemiluminesensi (LAS4000M; GE Healthcare Biosciences AB, Uppsala, Swedia). Rasio p-ERK terhadap ERK dan RUNX-2/COL I terhadap GAPDH dikuantifikasi menggunakan perangkat lunak analisis ImageJ v.1.4 (Bethesda).
Penilaian Apopto Sel
hWJ-MSC ditanam dengan kepadatan 105 sel per lobang dalam plat 6 lobang. Sel yang menempel diobati dengan konsentrasi HIF-1α yang ditentukan untuk waktu yang ditentukan. Sel kemudian dikumpulkan dan dilabeli dengan FITC-Annexin V dan PI (Fcmacs, Nanjing, China) selama 15 menit dalam kegelapan. Semua sampel diuji menggunakan citometer aliran FACScan (BD Bioscience, San Jose, CA, AS). Data dianalisis menggunakan FlowJo v10 (BD Biosciences).
Model Keturunan Sel Dua Tahapan
Dengan mempertimbangkan potensi besar HAP dan kesulitan dalam menganalisis sistem kultur bersama, diperlukan model matematis yang dapat menyediakan analisis kuantitatif dan prediksi yang dapat dipercaya untuk memahami peran HIF-1α dalam diferenciasi osteogenik hWJ-MSC.
hWJ-MSC dikultur dengan 0, 300, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, dan 4000 pg/mL HIF-1α serta cairan induksi osteogenik. Setelah memasang data pada konsentrasi ini, kami menggunakan konsentrasi HIF-1α (yang dihasilkan oleh HUVEC) dalam grup kontrol, m-HAP, np80, dan np20 (240, 300, 325, dan 375 pg/mL, masing-masing) untuk menguji persamaan pemasangan menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AS). Untuk menyederhanakan model, kami menganggap pola pertumbuhan yang serupa pada konsentrasi HIF-1α yang berbeda identik. Tingkat diferenciasi rata-rata digunakan untuk memasang persamaan waktu-tingkat diferenciasi. Tingkat proliferasi, tingkat apopto, dan tingkat diferenciasi osteogenik hWJ-MSC dalam grup yang berbeda terdeteksi pada waktu yang ditentukan.
Model keturunan sel dua tahapan yang disederhanakan, yang serupa dengan model keturunan sel multi-tahapan [18, 19], dirancang berdasarkan data eksperimental. C0 dan C1 mewakili jumlah sel hWJ-MSC dan sel terminal, masing-masing. C0 dan C1 ditentukan oleh:
Di sini, p, yang dipengaruhi oleh HIF-1α dan waktu, mewakili probabilitas replikasi hWJ-MSC. Secara berseberangan, d = 1 − p adalah tingkat diferenciasi yang dapat diperoleh dengan memasang data sel yang diestimasi dan eksperimental. Parameter v0 mengukur seberapa cepat sel membelah pada setiap tahap keturunan (khususnya, v = ln2/c, di mana c adalah durasi siklus sel). Tingkat apopto sel terminal dilambangkan dengan A. Untuk kesederhanaan, kami mengabaikan bahwa tingkat apopto akan bervariasi seiring waktu, dan oleh karena itu, A = 4,5% adalah konstanta. K melambangkan kapasitas lingkungan karena sel tidak dapat mengalami proliferasi tak terbatas [20]. HIF-1α meningkatkan tingkat diferenciasi hWJ-MSC, yang mengarah pada tingkat diferenciasi yang dimodelkan oleh:
$$\begin{aligned} d & = \frac{{d_{0} }}{{1 + (r*H)^{m} }} \\ p & = 1 - d \\ \end{aligned}$$
Di sini, H mewakili konsentrasi HIF-1α; d0 menunjukkan tingkat diferenciasi pada 0 pg/mL HIF-1α; r mewakili intensitas regulasi (di sini, mewakili intensitas regulasi HIF-1α pada MSC); dan m sesuai dengan koefisien Hill [21], yaitu hubungan antara tingkat diferenciasi MSC dan konsentrasi HIF-1α.
Analisis Statistik
Semua data yang memenuhi persyaratan normalitas dan homosedastisitas dinyatakan sebagai rata-rata ± deviasi standar (SD) dari tiga atau lebih eksperimen independen. Perangkat lunak SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, AS) digunakan untuk melakukan analisis statistik melalui one-way ANOVA atau two-way ANONA. Nilai P < 0,05 dianggap secara statistik signifikan. Analisis statistik disajikan menggunakan GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, La Jolla, CA).
Hasil
Karakterisasi HAPs
Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2, HAP disiapkan dengan ukuran dan bentuk tertentu. Diameter np20 dengan bentuk mendekati bola adalah 20 nm secara rata-rata, dan np80 berbentuk batang dengan panjang rata-rata 80 nm dan lebar 20 nm. m-HAP juga berbentuk mendekati bola dan sekitar 12 μm dalam diameter. Semua partikel memiliki muatan permukaan negatif dalam L-DMEM. Dianjurkan bahwa nilai zeta potensi negatif memiliki efek yang signifikan dan menguntungkan pada pelepasan dan proliferasi sel tulang, serta ikatan tulang langsung dan pembentukan tulang baru [22, 23]. Partikel, yang diamati dalam L-DMEM, cenderung mengagregasi dalam sistem air. Ukuran hidrodinamiknya juga diuji, yang mungkin juga merupakan faktor penting yang mempengaruhi perilaku biologisnya.
Karakterisasi HAPs. Mikrograf TEM dari a np20 dan b np80, dan mikrograf SEM dari c m-HAP. d Karakterisasi HAPs (n = 6). Singkatan: TEM mikroskopi transmisi elektron, SEM mikroskopi elektron indra, HA hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro
Toksisitas Tidak Langsung HAP terhadap hWJ-MSC
Untuk menilai toksisitas tidak langsung HAP pada hWJ-MSC, kelangsungan sel diukur melalui ensai MTS. CM dengan 50 µg/mL HANP secara signifikan merangsang kelangsungan hWJ-MSC setelah 24 jam dan 72 jam dan terutama pada 24 jam. Namun, CM dengan 100 µg/mL HANP menurunkan kelangsungan sel sebesar 15–20% dibandingkan kontrol setelah 72 jam. Selain itu, CM dengan 25 µg/mL np20, tetapi bukan np80, merangsang kelangsungan sel setelah 24 jam. Fenomena ini mengonfirmasi bahwa 50 µg/mL HANP adalah konsentrasi substytotoksis yang digunakan dalam semua eksperimen berikutnya (Gambar 3).
Toksisitas tidak langsung HAP terhadap hWJ-MSC. Kelangsungan hWJ-MSC yang dikultur tidak langsung dengan HAP diukur untuk a 24 dan b 72 jam. *P < 0,05; **P < 0,01 versus kontrol. Grup kontrol terdiri dari sel yang diinkubasi dalam CM tanpa perawatan HAP, dan kelangsungan sel dinormalisasi sebagai persentase kontrol. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia
Efek Osteoinduktif Tidak Langsung HAP pada hWJ-MSC
Untuk mengidentifikasi efek osteoinduktif tidak langsung HANP pada hWJ-MSC, ekspresi gen osteogenik dinilai melalui analisis RT-PCR kuantitatif. Tingkat transkripsi faktor transkripsi terkait runt 2 (RUNX-2) dalam grup HANP, terutama np20, menunjukkan peningkatan yang signifikan dari Hari 7 hingga Hari 21 (Gambar 4a). Ekspresi gen kolagen tipe I (Col I) dalam grup np20 menunjukkan peningkatan dari Hari 7 hingga Hari 21, sementara grup np80 menunjukkan peningkatan yang berkelanjutan dari Hari 7 hingga Hari 14 (Gambar 4b). mRNA osteokalcin (OCN) jelas diupregulasi dalam grup HANP pada Hari 14, yang mengindikasikan laju osteogenesis yang dipercepat (Gambar 4c). Tingkat mRNA fosfatase alkaline (ALP) jelas meningkat dalam grup HANP (Gambar 4d), yang mengindikasikan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Namun, grup m-HAP menunjukkan perubahan terbatas dalam tingkat ketiga gen osteogenik ini dibandingkan dengan grup kontrol (Gambar 4). Selain itu, ekspresi penanda pluripotensi, NANOG, OCT3/4, dan SOX2, menurun dalam grup HANP dibandingkan kontrol (Gambar 4e–g), yang mengindikasikan bahwa hWJ-MSC dalam grup HANP telah terdiferensiasi, terutama dalam grup np20. Hasil serupa diperoleh melalui analisis Western blot (Gambar 5c, d), yang mengindikasikan bahwa grup np20 dapat secara tidak langsung meningkatkan ekspresi RUNX-2 dan COL I pada hWJ-MSC.
Efek tidak langsung HAP pada ekspresi gen terkait diferenciasi osteogenik. a RUNX-2, b Col I, c OCN, d ALP, e NANOG, f OCT3/4, dan g SOX2 tingkat gen pada hWJ-MSC yang dikultur dengan CM untuk waktu yang ditentukan. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 versus grup kontrol; &P < 0,05; &&P < 0,01; &&&P < 0,001 versus grup m-HAP; #P < 0,05; ##P < 0,01 versus grup np20. Sel yang diinkubasi dalam medium osteogenik tanpa perawatan HAP digunakan sebagai grup kontrol. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, RUNX-2 faktor transkripsi terkait runt 2, Col I kolagen tipe I, OCN osteokalcin, ALP fosfatase alkaline, SOX 2 SRY-related HMG-box 2
Efek tidak langsung HAP pada depo kalsium ekstraseluler dan aktivitas ALP. hWJ-MSC diinkubasi dalam medium osteogenik selama 14 hari. a Depo kalsium ekstraseluler kemudian divisualisasikan melalui pewarnaan ARS; b aktivitas ALP hWJ-MSC dinilai melalui pewarnaan ALP, skala bar: 200 μm. c Analisis Western blot menunjukkan ekspresi RUNX-2 dan COL I pada hWJ-MSC dalam medium osteogenik pada hari 7. d Pengukuran densitometri RUNX-2 dan COL I dari bagian (c). Sel yang diinkubasi dalam medium osteogenik tanpa perawatan HAP digunakan sebagai grup kontrol. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 versus grup kontrol; &P < 0,05; &&&P < 0,001 versus grup m-HAP; ###P < 0,001 versus grup np20. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, ALP fosfatase alkaline
Untuk mengamati secara visual efek osteoinduktif tidak langsung HANP pada hWJ-MSC, sel diinkubasi dengan medium osteogenik yang ditentukan selama 14 hari, diikuti dengan pewarnaan ARS dan ALP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 5a, b, jumlah nodul mineral yang lebih banyak dan aktivitas ALP yang lebih tinggi pada hWJ-MSC diamati dalam grup HANP dibandingkan dengan grup m-HAP dan kontrol. Selain itu, m-HAP, mirip dengan kontrol, menunjukkan efek terbatas pada diferenciasi osteogenik hWJ-MSC.
HAP Mengaktifkan Sinyal ERK1/2 pada hWJ-MSC yang Dikultur Tidak Langsung dengan HUVEC
Untuk menyelidiki efek pada fungsi parakrin HUVEC oleh HAP, imunofluoresensi dan ensai ELISA digunakan untuk mengidentifikasi protein potensial yang mempromosikan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6a–c, produksi HIF-1α intrakeluler dan ekstraseluler secara signifikan ditingkatkan oleh HANP (terutama np20), sementara ada efek terbatas dari m-HAP pada produksinya.
HAP mengaktifkan sinyal ERK1/2 pada hWJ-MSC yang dikultur tidak langsung dengan HUVEC. a Imunofluoresensi HIF-1α dilakukan pada HUVEC yang diobati dengan/tanpa HAP selama 18 jam. b Intensitas fluoresensi HIF-1α dari bagian (a). c Konsentrasi ekstraseluler HIF-1α dalam medium kultur HUVEC yang diobati dengan/tanpa HAP selama 18 jam diukur melalui ELISA. Skala bar: 20 μm. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 versus kontrol; ##P < 0,01; ###P < 0,001 versus grup np20. Sel tanpa perawatan HAP digunakan sebagai grup kontrol. hWJ-MSC diobati dengan CM selama 24 jam. d Analisis Western blot yang menunjukkan aktivasi regulator kunci dalam jalur ERK1/2. e Pengukuran densitometri p-ERK1/2 dari bagian (b). **P < 0,01; ***P < 0,001 versus kontrol; ##P < 0,01, ###P < 0,001 versus grup 2-MeOE2(−). Sel yang diinkubasi dalam CM tanpa perawatan HAP digunakan sebagai grup kontrol. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, HUVECs sel endotel vena tali pusat manusia, ERK kinase sinyal teratur ekstraseluler, HIF-1α faktor dapat diakibatkan hipoksia 1α
Untuk memahami lebih akurat jalur sinyal diferenciasi hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α, kami memeriksa regulator kunci jalur ERK1/2 melalui analisis Western blot. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 6d, e, sementara tingkat protein total ERK1/2 tetap tidak berubah, tingkat p-ERK1/2 jelas meningkat pada hWJ-MSC yang dikultur dengan HANP, dan ini terutama terjadi pada grup np20. Namun, m-HAP memiliki efek sedikit terhadap tingkat p-ERK1/2 pada hWJ-MSC, mirip dengan efeknya pada produksi HIF-1α pada HUVEC. Pentingnya, tingkat p-ERK1/2 yang meningkat pada hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α dapat dicegah oleh 2-MeOE2, inhibitor HIF-1α spesifik, yang mengindikasikan bahwa HIF-1α berfungsi di atas jalur sinyal ERK1/2 pada hWJ-MSC.
HIF-1α Memromosikan Diferensi Osteogenik hWJ-MSC melalui Jalur ERK1/2
Untuk menentukan apakah HIF-1α diperlukan untuk stimulasi yang diamati pada diferenciasi osteogenik hWJ-MSC, inhibitor HIF-1α spesifik (2-MeOE2) diterapkan pada kultur sel ini. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7, depo matriks mineral dan aktivitas ALP pada hWJ-MSC yang diobati 2-MeOE2(+) yang dikultur dalam medium osteogenik melemah, yang mengindikasikan bahwa HIF-1α tidak tergantikan untuk diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Berdasarkan hasil ini, kami lebih menjelajahi peran jalur ERK1/2 dalam diferenciasi osteogenik hWJ-MSC yang diaktifkan oleh HIF-1α. Depo matriks mineral dan aktivitas ALP pada hWJ-MSC yang dikultur dengan medium osteogenik ditekan setelah pemberian PD98059, inhibitor MEK spesifik.
HIF-1α memromosikan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC melalui jalur ERK1/2. hWJ-MSC diinkubasi dalam medium osteogenik dengan atau tanpa PD98059 selama 14 hari. a Depo kalsium ekstraseluler divisualisasikan melalui pewarnaan ARS. b Aktivitas ALP hWJ-MSC dinilai melalui pewarnaan ALP. Skala bar: 200 μm. c Analisis kuantitatif depo matriks kalsium ekstraseluler. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 versus kontrol; #P < 0,05; ###P < 0,001 versus grup np20. Sel yang diinkubasi dalam medium osteogenik tanpa perawatan HAP dan PD98059 digunakan sebagai grup kontrol. Singkatan: HAPs partikel hidroksiapatit, m-HAP partikel HAP mikro, hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, HUVECs sel endotel vena tali pusat manusia, ERK kinase sinyal teratur ekstraseluler, HIF-1α faktor dapat diakibatkan hipoksia 1α, ALP fosfatase alkaline
Model Keturunan Sel Dua Tahapan
Untuk mengungkap secara kuantitatif hubungan intrinsik antara konsentrasi HIF dan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC, 0–4000 pg/mL HIF-1α digunakan untuk merawat delapan grup hWJ-MSC. Model matematis keturunan sel dua tahapan digunakan untuk menganalisis tingkat proliferasi, apopto, dan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC ini yang dirawati dengan berbagai konsentrasi HIF-1α. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8a, data pemasangan digunakan untuk mendapatkan rumus simulasi (\(\frac{d}{{d_{0} }} = \frac{1}{{0.14H^{2} - 0.43H + 1}}\)) dan kurva (kurva biru), yang menunjukkan bahwa tingkat diferenciasi pertama meningkat dan kemudian menurun seiring dengan peningkatan konsentrasi HIF. Secara lebih spesifik, tingkat diferenciasi mencapai puncak pada 1500 pg/mL HIF-1α.
Model keturunan sel dua tahapan. hWJ-MSC diinkubasi dalam konsentasi HIF-1α yang ditentukan untuk waktu yang ditentukan. a Tingkat diferenciasi relatif hWJ-MSC pada berbagai konsentrasi HIF-1α, b aktivitas ALP relatif (tingkat diferenciasi hWJ-MSC) dan sel osteoblast relatif pada hari kultur yang berbeda. c Permukaan tiga dimensi dari tingkat diferenciasi yang berevolusi dengan waktu dan HIF-1α. Jumlah sel dengan kepadatan tanam awal 1500 sel per lobang (dalam plat 96 lobang), serta d 0, e 375, dan f 1500 pg/mL HIF-1α. Singkatan: hWJ-MSCs sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia, HIF-1α faktor dapat diakibatkan hipoksia 1α, ALP fosfatase alkaline
Menurut studi kami, konsentrasi HIF-1α yang dihasilkan oleh HUVEC dalam grup kontrol, m-HAP, np80, dan np20 masing-masing adalah 240, 300, 325, dan 375 pg/mL. Persegi hitam mewakili tingkat diferenciasi yang dipromosikan oleh 240, 300, 325, dan 375 pg/mL HIF-1α, dan ini cocok baik dengan kurva simulasi. Selain itu, tingkat diferenciasi hWJ-MSC (aktivitas ALP relatif) yang dirawati dengan berbagai konsentrasi HIF-1α meningkat secara serupa seiring waktu. Oleh karena itu, untuk menyederhanakan model, kami menganggap pola pertumbuhan mereka serupa atau bahkan identik. Kami menemukan bahwa peningkatan aktivitas ALP dari Hari 0 hingga Hari 7 sebanding dengan jumlah sel osteoblast, dan sel osteoblast mencapai puncaknya pada periode platform. Oleh karena itu, setelah memasang aktivitas ALP dengan kurva jumlah sel osteoblast relatif (jumlah sel osteoblast / jumlah sel osteoblast maksimum), maksimum aktivitas ALP diprediksi dan aktivitas ALP relatif (aktivitas ALP / maksimum aktivitas ALP), yang mewakili tingkat diferenciasi, diperoleh (Gambar 8b). Dengan menggabungkan kedua studi ini, permukaan tiga dimensi dari tingkat diferenciasi yang berevolusi dengan waktu dan HIF-1α diperoleh (Gambar 8c).
Untuk memperkirakan waktu kultur yang optimal, diperlukan mensimulasikan jumlah sel. Setelah menguraikan tingkat diferenciasi pada berbagai konsentrasi HIF-1α, kami mensimulasikan ukuran setiap populasi. Simulasi menggunakan kepadatan tanam awal 1500 sel per lobang (dalam plat 96 lobang) menggunakan berbagai konsentrasi HIF-1α. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8d–f, data eksperimental (persegi hitam) cocok baik dengan jumlah sel total yang disimulasikan (kurva biru), yang merupakan jumlah dari jumlah hWJ-MSC dan sel osteoblast, dan ini mendukung kemampuan model ini untuk memprediksi jumlah hWJ-MSC dan sel osteoblast pada setiap titik waktu. Selain itu, jumlah sel osteoblast mendekati periode platform pada 21, 18, dan 15 hari dengan 0, 375, dan 1500 pg/mL HIF-1α, masing-masing. Model ini memberikan waktu kultur yang optimal untuk memandu rekayasa jaringan, dan juga memberikan bukti langsung bahwa HIF-1α mempercepat diferenciasi osteogenik hWJ-MSC.
Pembahasan
Dengan perkembangan terbaru dalam nanomaterial biologis, pengganti tulang buatan berbasis nano telah menjadi bidang penelitian yang intensif. Bukti yang semakin menumpuk menunjukkan bahwa ada interaksi kompleks antara sel dan nanomaterial biologis karena kapasitasnya untuk menembusi membran sel dan meningkatkan waktu retensi internal [24, 25]. Studi sebelumnya mengungkapkan bahwa nanofilm kolagen/alginat dapat terserap pada membran MSC untuk mengaktifkan kaskad sinyal intrakeluler dan memromosikan diferenciasi osteogenik [26]. Eksperimen elegan oleh Wu dan rekan-rekannya secara jelas menunjukkan bahwa nanotipa TiO2 dapat meningkatkan vaskularisasi dan diferenciasi osteogenik dengan memfasilitasi efek parakrin dan juncak sel melalui interaksi EC-MSC [27]. Untuk tujuan mengembangkan kandidat unggul untuk rekayasa jaringan tulang, diperlukan untuk mengklarifikasi crosstalk langsung antara pengganti tulang berbasis nano dan sel yang terlibat dalam perbaikan tulang serta interaksi tidak langsung mereka. Namun, pemahaman saat ini tentang hal ini masih terbatas. Dalam studi ini, kami menggunakan model kultur tidak langsung untuk lebih menguraikan efek biologis HANP pada MSC terkait interaksi tidak langsung yang dimediasi oleh EC.
Sytotoksisitas adalah isu utama untuk menilai biokompatibilitas nanomaterial biologis apa pun. Meskipun studi kami sebelumnya menemukan bahwa HANP tidak secara langsung mempengaruhi kelangsungan atau apopto hWJ-MSC, mereka mungkin masih menimbulkan dampak yang berbeda melalui mediasi sel lain [28]. Oleh karena itu, diperlukan untuk mengevaluasi efek sytotoksik HANP pada hWJ-MSC yang dimediasi oleh HUVEC. Menariknya, setelah diinkubasi dalam CM selama 24 jam dan 72 jam, kelangsungan hWJ-MSC tetap terjaga dan bahkan meningkat dalam grup HANP 0–50 µg/mL, terutama dalam grup np20, yang mengindikasikan adanya molekul efektor dalam CM. Saat konsentrasi HANP mencapai 100 µg/mL, mereka menjadi sytotoksik pada hWJ-MSC. Namun, 0–100 µg/mL m-HAP tidak mempengaruhi kelangsungan hWJ-MSC (Gambar 3). Jiang et al. telah menunjukkan bahwa nanopartikel rekayasa dengan ukuran tertentu dapat memiliki jalur endositosis dan kinetik yang berbeda yang terkait dengan sinyal hilir yang diubah yang terlibat dalam mengatur fungsi sel target [29]. Dalam studi kami sebelumnya, kami menunjukkan bahwa np20 dan np80 ditelan oleh HUVEC, dan diikuti oleh perubahan morfologis dan penampakan vaculo besar, yang mengindikasikan status yang diaktifkan HUVEC. Selain itu, np20, dengan kecepatan penyerapan yang lebih cepat dan akumulasi yang meningkat, mungkin menghasilkan aktivasi HUVEC yang lebih kuat, yang berpotensi menghasilkan kelangsungan hWJ-MSC yang ditingkatkan melalui sinyal parakrin. Sebaliknya, hanya sedikit m-HAP yang dapat ditelan oleh HUVEC, dan ini mungkin mengakibatkan pengaruhnya yang terbatas pada metabolisme hWJ-MSC [9].
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut potensi efek osteoinduktif HUVEC yang diaktifkan, dosis substytotoksik 50 µg/mL HAP digunakan dalam studi berikutnya. CM yang dikumpulkan dari HUVEC yang diaktifkan memromosikan depo kalsium ekstraseluler, aktivitas ALP, dan ekspresi protein osteogenik pada hWJ-MSC, serta ekspresi mRNA gen osteogenik (Gambar 4, 5). Runx2, faktor transkripsi esensial yang terlibat dalam menentukan garis osteoblast [30], menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam grup np20, yang mengindikasikan efek osteoinduktif yang kuat pada hWJ-MSC (Gambar 4a dan Gambar 5c, d). Grup np20 menunjukkan perbaikan 1,5 kali lipat dalam ekspresi COLI pada Hari 7 (Gambar 4b, 5c, d) dan peningkatan ganda pada Hari 14, yang menyiratkan kehadiran sel osteoblast yang berbeda lebih banyak dalam grup yang diobati HANP (Gambar 4b) [30]. OCN adalah penanda tulang matang [31], dan gen ini menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam grup HANP pada Hari 14 (Gambar 4c), yang mengindikasikan bahwa np20 dan np80 dapat mempercepat pematangan tulang dibandingkan m-HAP. ALP adalah penanda awal diferenciasi osteoblast, dan ini jelas meningkat seiring waktu kultur di setiap grup, terutama grup np20, yang mengungkapkan bahwa transformasi tambahan terjadi dari MSC menjadi osteoblast (Gambar 4d). Penanda pluripotensi, NANOG, OCT3/4, dan SOX2 menyiratkan kapasitas untuk diferenciasi [32]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4e–g, penurunan ekspresi gen dalam grup HANP menyiratkan bahwa sebagian besar hWJ-MSC dalam grup HAP telah bertransformasi menjadi osteoblast.
Data kami menunjukkan bahwa endositosis HANP oleh HUVEC terkait dengan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC yang ditingkatkan. Namun, penyebab hasil ini saat ini tidak jelas. Dalam hal fungsi parakrin HUVEC, kami berfokus pada protein larutan yang menginduksi diferenciasi dalam sobrenatan HUVEC yang diaktifkan. Sinyal HIF-1α esensial dalam mengkaitkan osifikasi dan angiogenesis selama regenerasi tulang [33, 34]. Heikal et al. melaporkan bahwa EC yang cedera mengeluarkan lebih banyak HIF-1α bahkan dalam kondisi normoksia [35]. Telah juga ditunjukkan bahwa paparan HANP menghambat kemampuan angiogenik HUVEC [9]. Oleh karena itu, kami mengukur konsentrasi HIF-1α dalam CM, dan hasilnya menunjukkan bahwa konten HIF-1α meningkat dalam grup perawatan HANP dibandingkan dengan grup m-HAP dan kontrol (Gambar 6a). Untuk mengidentifikasi peran HIF-1α dalam diferenciasi osteogenik hWJ-MSC, kami menggunakan 2-MeOE2, yang merupakan inhibitor HIF-1α spesifik. Penurunan konsentrasi HIF-1α sejajar dengan penurunan depo matriks mineral dan aktivitas ALP pada hWJ-MSC ini, yang mengindikasikan bahwa HANP dapat memromosikan produksi HIF-1α HUVEC untuk memfasilitasi osteogenesis hWJ-MSC (Gambar 7).
Untuk menerapkan HANP dengan tepat untuk digunakan dalam rekayasa jaringan tulang, diperlukan untuk memperoleh wawasan lebih dalam tentang mekanisme di mana HANP memromosikan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC yang dimediasi oleh HUVEC. Jalur ERK1/2 berada di bawah HIF-1α [36] dan adalah dasar untuk diferenciasi MSC [37]. Dalam karya ini, konsentrasi HIF-1α dalam CM cocok baik dengan tingkat p-ERK1/2 pada hWJ-MSC (Gambar 6b, c). Saat 2-MeOE2 diterapkan, ekspresi p-ERK1/2 pada hWJ-MSC gagal diaktifkan, yang mengindikasikan bahwa HIF-1α berfungsi di atas sinyal ERK1/2. Untuk secara langsung menanggapi peran sinyal ERK1/2 dalam diferenciasi osteogenik hWJ-MSC, PD98059, inhibitor MEK spesifik, digunakan. Penindasan sinyal ERK1/2 menghasilkan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC terendah. Satu alasan mungkin untuk hal ini adalah jalur ERK1/2 memainkan peran kunci dalam sinyal HIF-1α dan dalam jalur sinyal apopto serta proliferasi, yang mungkin bertanggung jawab atas perubahan yang diamati dalam diferenciasi osteogenik pada sel-sel ini [38, 39]. Selain itu, ini juga mungkin terkait dengan kehadiran faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF). VEGF adalah salah satu efektor hilir dari sinyal HIF-1α [33], dan ini juga dapat memromosikan diferenciasi osteogenik MSC melalui aktivasi jalur ERK1/2 [37]. Studi kami sebelumnya menemukan bahwa np20 memicu produksi VEGF pada HUVEC [9]; oleh karena itu, mungkin bahwa penindasan jalur ERK1/2 dapat menghasilkan inhibisi VEGF, yang akan mengarah pada penurunan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Menurut hasil eksperimental yang tersedia, kami dapat meringkas sebagai berikut. HANP mampu memproses efek osteoinduktif langsung [5] dan tidak langsung yang lebih optimal dibandingkan m-HAP. Dibandingkan dengan gratur tulang autolog dan alograft tulang, ada sumber HANP yang luas dan tanpa cedera sekunder serta potensi imunogenisitas. Namun, dibandingkan dengan m-HAP, HANP dapat menekan kemampuan angiogenik HUVEC [9] dan menunjukkan sytotoksisitas ringan baik bergantung pada waktu maupun dosis.
Akhir-akhir ini, bukti yang semakin bertambah telah menunjukkan pentingnya HIF-1α dalam regenerasi tulang. Namun, hanya sedikit studi yang dapat memprediksi secara kuantitatif tingkat diferenciasi MSC pada kondisi awal tertentu, seperti konsentrasi HIF-1α. Dengan mempertimbangkan proliferasi sel, apopto, dan diferenciasi osteogenik, kami menyajikan model matematis yang menggabungkan keturunan sel dua tahapan dengan HIF-1α yang sangat berkaitan dengan data eksperimental kami. Dengan memasang tingkat diferenciasi hWJ-MSC pada 0–4000 pg/mL HIF-1α, kami memperoleh persamaan untuk menggambarkan tingkat diferenciasi, konsentrasi HIF-1α, dan waktu. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8d, model ini dapat menggambarkan peta jumlah sel pada berbagai konsentrasi HIF-1α, sehingga memungkinkan untuk menjelajahi dinamika intrinsik sistem dua tahapan [40]. Selain itu, model ini secara matematis memvalidasi efek HIF-1α pada diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Selain itu, berdasarkan model keturunan sel multi-tahapan dan model logistik, model kami cukup stabil untuk memungkinkan prediksi jangka panjang tanpa jatuh ke dalam jebakan peledakan populasi tak terbatas [41].
Dengan menggunakan data eksperimental yang ada, baik jumlah sel maupun tingkat diferenciasi dapat diprediksi dengan kepadatan tanam sel awal dan konsentrasi HIF-1α yang ditentukan. Sebagai upaya serupa, waktu inkubasi optimal juga diperoleh. Akibatnya, kami dapat memprediksi konsentrasi HIF-1α optimal dan menentukan waktu yang paling optimal untuk osteogenesis, yang penting untuk rekayasa jaringan yang efisien. Model keturunan sel dua tahapan berlaku untuk memprediksi proliferasi dan diferenciasi sel akar yang memiliki dua keturunan sel. Berdasarkan ini, model yang didasarkan pada kondisi awal dan data eksperimental yang ada dapat dirancang untuk mengidentifikasi kondisi kultur in vitro yang optimal, yang akan membantu mengoptimalkan perbaikan tulang in vivo.
Kesimpulan
Dalam studi ini, kami menjelajahi efek biologis spesifik HANP pada hWJ-MSC yang dimediasi oleh HUVEC. Dibandingkan dengan m-HAP, baik np20 maupun np80 menunjukkan sytotoksisitas ringan baik bergantung pada waktu maupun dosis. Pentingnya, ukuran HANP tampaknya tidak memiliki dampak signifikan pada sytotoksisitas ini. Data kami juga menunjukkan bahwa HANP, terutama np20, mampu memfasilitasi HUVEC untuk mengeluarkan tingkat HIF-1α yang lebih tinggi, yang berkorelasi langsung dengan diferenciasi osteogenik hWJ-MSC yang ditingkatkan melalui aktivasi jalur ERK1/2 (Gambar 9). Yang lebih menakjubkan lagi, hasil dari model keturunan sel dua tahapan menyiratkan bahwa HIF-1α memiliki efek stimulasi yang bergantung pada dosis pada tingkat diferenciasi osteogenik hWJ-MSC. Selain itu, konsentrasi HIF-1α optimal dan waktu inkubasi diperkirakan berdasarkan kondisi awal menggunakan model in vitro, yang dapat sangat berharga di masa depan untuk aplikasi rekayasa jaringan. Secara kolektif, pengamatan ini memberikan bukti bahwa HANP dapat meningkatkan regenerasi tulang dengan memodulasi interaksi sel-sel.
Ilustrasi skematis dari mekanisme yang mungkin
Ketersediaan Data dan Bahan
Data yang digunakan dan dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis tanggung jawab atas permintaan yang wajar.
Singkatan
HA:
Hidroksiapatit
HANPs:
Nanopartikel HA
hWJ-MSCs:
Sel mesenchymal yang berasal dari jelly tali pusat manusia
