Chondroitin Sulfate/Polycaprolactone/Gelatin Electrospun Nanofibers dengan Antitrombogenisitas dan Peningkatan Afinitas Sel Endotel sebagai Perancah Potensial untuk Rekayasa Jaringan Pembuluh Darah

Bahan dan Metode

Materi

CS (trakea sapi, tipe A, kemurnian:95%) dipasok oleh Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (China). PCL diperoleh dari Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (Cina). Gt (kulit sapi, tipe B) diperoleh dari Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (Cina). Kit waktu tromboplastin parsial teraktivasi (APTT) dibeli dari Leigen Biotechnology Co., Ltd (China). Asam asetat (kemurnian:99,5%) dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Cina). Sel-sel endotel aorta manusia (HAECs) diperoleh dari rumah sakit yang berafiliasi dengan Universitas Qingdao (Cina). Media kultur Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), serum janin sapi (FBS), 0,25% tripsin–EDTA dibeli dari Biological Industries (Israel). Semua reagen dibeli dari Sigma Aldrich (Cina) kecuali dinyatakan lain. Air yang digunakan dalam semua eksperimen dideionisasi.

Elektrospinning dari Nanofibers

PCL (10% b/v) dilarutkan dalam asam asetat dengan pengadukan mekanik pada suhu kamar selama 4 jam. Gt (10% b/v) dilarutkan dalam 90% asam asetat dengan pengadukan konstan selama 2 jam. CS dalam konsentrasi yang berbeda ditambahkan ke dalam larutan Gt dan diaduk perlahan pada suhu kamar selama 1 jam untuk mendapatkan larutan homogen yang mengandung 5, 10, dan 15% berat CS relatif terhadap konsentrasi total polimer. Kemudian, larutan PG dibuat dengan mencampurkan dua larutan di atas dengan perbandingan berat 50/50 (b/b) sambil diaduk selama 2 jam, disebut sebagai 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG .

Larutan homogen yang telah disiapkan dikenai proses electrospinning, dilengkapi dengan spuit 1 mL dengan jarum 21 G dan kolektor yang dilapisi aluminium foil. Dalam penelitian ini, jarak antara pelat kolektor dan ujung jarum ditetapkan sekitar 18 cm, tegangan diatur pada 23 kV, dan larutan polimer dipompa keluar dengan kecepatan 1 mL/jam. Semua larutan dielektrospun dalam instrumen electrospinning (Technology, Tk602TH, China) pada suhu kamar dan kelembaban yang dikontrol dengan hati-hati (< 40%). Sebelum eksperimen lebih lanjut, sampel dimasukkan ke dalam oven pengering vakum setidaknya selama 72 jam untuk menghilangkan pelarut yang tersisa.

Scanning Electron Microscopy (SEM) dan Transmission Electron Microscope (TEM)

Morfologi perancah nanofibrous CS@PG diselidiki oleh SEM (VEGAS, TESCAN, Ceko) pada tegangan akselerasi 20 kV pada suhu kamar. Diameter serat nano (n = 100) selanjutnya diukur dari gambar SEM menggunakan perangkat lunak analisis gambar (Image J).

Pengamatan TEM dan analisis spektroskopi sinar-X (EDS) dispersi energi dilakukan menggunakan JEOL JEM-2100 plus (Jepang).

Spektroskopi Inframerah Transformasi Empat (FTIR)

FTIR dilakukan oleh spektrometer FTIR Nicolet iN10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) untuk mengevaluasi gugus fungsi karakteristik dari CS, PG nanofiber, dan CS@PG nanofibers. Spektrum sampel direkam dengan mode transmisi pada rentang panjang gelombang 4000–500 cm ⁻¹ dengan resolusi 2 cm ⁻¹ .

Porositas dan Penyerapan Larutan Phosphate-Buffered Saline (PBS)

Porositas nanofibers dilakukan dengan menggunakan metode perpindahan cair. Pertama, berat kering serat nano ditimbang sebagai W₁ . Kemudian, empat kelompok serat nano direndam dalam etanol selama 2 jam pada suhu 25 °C dan ditimbang sebagai W₂ . Etanol pada permukaan sampel dihilangkan dengan kertas saring, kemudian bobot sampel dicatat sebagai W₃ . Porositas nanofibers dihitung dengan rumus berikut:

Untuk uji penyerapan larutan PBS, nanofiber yang diperoleh ditimbang dalam keadaan kering dan dicatat sebagai Wd. Kemudian, nanofibers direndam dalam PBS selama 24 jam pada suhu 25 °C dan berat pada keadaan basah dicatat sebagai Ww setelah menghilangkan kelebihan cairan pada permukaan sampel. Rasio pembengkakan dapat diukur dengan persamaan berikut:

Semua nilai dalam eksperimen di atas dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3).

Perilaku Degradabilitas In Vitro

Untuk menentukan ketahanan nanofibers yang diperoleh terhadap lisozim, degradabilitas sampel diukur pada waktu yang dijadwalkan (1, 4, 7, 10, dan 14 hari). Berat awal serat nano dicatat sebagai W_i . Kemudian sampel direndam dalam larutan PBS (pH 7,4) yang mengandung lisozim (500 g/mL) dan diinkubasi secara in vitro pada suhu 37°C. Pada interval degradasi yang telah ditentukan, setiap kelompok sampel dihilangkan dan dicuci dengan air deionisasi, dan dikeringkan-beku untuk mendapatkan berat akhir (W _f ). Larutan lisozim diganti tiga kali seminggu. Massa yang tersisa (%) dari perancah nanofibrous diperkirakan seperti yang didefinisikan dalam rumus berikut:

Untuk mengevaluasi perilaku degradasi sampel setelah 7 hari, morfologi serat nano diamati dengan SEM.

Analisis Kompatibilitas Darah

Waktu Koagulasi

Waktu tromboplastin parsial teraktivasi (APTT) digunakan untuk menilai aktivitas jalur koagulasi intrinsik dan umum melalui pengujian waktu pembekuan plasma miskin-platelet (PPP) setelah inkubasi dengan nanofiber electrospun pada kaca penutup. Untuk ini, darah antikoagulan (sekitar 10 mL) dikumpulkan dan disentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit untuk mendapatkan plasma miskin trombosit (PPP). Setiap sampel diinkubasi dengan 200 L PPP selama 10 menit pada 37°C dan dianalisis menggunakan kit APTT mengikuti instruksi pabrik (n = 3).

Uji Hemolisis

Laju hemolisis dievaluasi dengan mengukur konsentrasi hemoglobin yang dilepaskan ke dalam fase larutan dari eritrosit dalam darah utuh yang diencerkan yang terpapar dengan nanofiber electrospun. Sampel pada kaca penutup ditempatkan satu per satu ke dalam pelat 24-sumur dan direndam dalam 2 mL PBS pada suhu 37 °C selama 30 menit. Kelompok kontrol negatif hanya mengandung 2 mL PBS, sedangkan kelompok kontrol positif terdiri dari 2 mL air deionisasi untuk tujuan menginduksi lisis maksimal eritrosit (n = 3 untuk setiap kelompok pengujian). Kemudian, 40 L darah segar antikoagulan yang disebutkan di atas ditambahkan ke dalam setiap sumur dan diinkubasi selama 60 menit pada 37 °C, setelah itu suspensi dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan disentrifugasi pada 100x g selama 5 mnt. Supernatan diukur absorbansinya pada 570 nm menggunakan pembaca lempeng mikro (SynergyH1/H1M, BioTek, China).

Trombogenisitas

Potensi trombogenik dievaluasi secara in vitro setelah inkubasi sampel electrospun dengan plasma kaya trombosit (PRP). PRP disiapkan dengan sentrifugasi (1500 rpm, 20 menit) dan setengah bagian atas plasma dibuang. Kemudian, nanofibers pada kaca penutup diinkubasi dalam 100 L PRP pada suhu 37 °C selama 2 jam dan dibilas dengan PBS tiga kali untuk eksperimen selanjutnya. Untuk mengevaluasi aktivitas trombosit setelah diinkubasi dengan PRP, nanofiber electrospun disimpan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS selama 2 jam dan 24 jam, dan kemudian kit uji CCK-8 digunakan untuk mengukur viabilitas trombosit pada nanofiber. CCK-8 (20 L) ditambahkan ke 200 L medium DMEM bebas serum di piring 24-sumur dan diinkubasi selama 1 jam. Terakhir, suspensi diukur dengan pembaca pelat mikro pada panjang gelombang 450 nm.

Kultur Sel dan Viabilitas Sel

Sel endotel aorta manusia (HAEC) dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan FBS (10%, v/v), dan streptomisin/penisilin (1%, v/v) dalam suasana 37 °C dan 5% CO₂ . Media kultur diganti tiga kali seminggu. Sel umumnya diisolasi dengan 0,05% tripsin/EDTA selama 3 menit, disentrifugasi pada 1000 rpm, dan disuspensikan dalam media segar untuk melakukan bagian sel atau penyemaian sel.

Sebelum penyemaian sel, semua bahan nanofibrous dalam pelat 24-sumur disterilkan di bawah penyinaran UV selama 1 jam dan direndam dalam etanol 75% (v/v, %) selama 1 jam. Kemudian, serat nano dibilas empat kali dengan larutan PBS dan direndam dalam DMEM selama 12 jam dalam CO₂ inkubator. Sel-sel diunggulkan dengan kepadatan 1 × 10 ⁴ sel per sumur pada serat nano dan media diganti setiap hari. Setelah kultur bersama 24 jam, sel dicuci dengan larutan PBS tiga kali dan kemudian diwarnai dengan Kit pewarnaan Ganda Calcein-AM/PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, China). PI digunakan untuk menodai sel mati dan Calcein-AM untuk sel hidup.

Morfologi Sel pada Nanofiber

Untuk mengamati adhesi sel pada serat nano, morfologi sel diamati setelah dikultur bersama 24 jam dengan Mikroskop Fluoresensi (Nikon A1 MP, Jepang). Pertama, sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% pada suhu kamar selama 30 menit. Kemudian, larutan Triton X-100 0,5% digunakan selama 5 menit untuk permeabilisasi membran sel. Akhirnya, 4′6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) digunakan untuk mewarnai inti sel dan rhodamin-phalloidin digunakan untuk mewarnai F-aktin. Analisis kuantitatif (kepadatan sel, area sel tunggal, pemanjangan sel) selanjutnya dilakukan dengan Image J.

Proliferasi Sel

Aktivitas proliferasi sel pada nanofiber komposit dilakukan dengan CCK-8 Assay Kit. HAEC diunggulkan pada serat nano dengan kepadatan 8 × 10 ³ sel / sumur. Media kultur diganti setiap dua hari. Setelah 1, 4, 7 hari kultur bersama, sel dicuci dengan larutan PBS untuk menghilangkan sel yang tidak melekat. Kemudian, 20 L CCK-8 dan medium lengkap dengan perbandingan volume 1:10 ditambahkan ke dalam 24-well plate selama 1 jam di inkubator. Absorbansi diuji oleh Elisa Reader pada 450 nm.

Pewarnaan sel dengan DAPI dan rhodamin-phalloidin dilakukan dengan Mikroskop Fluoresensi untuk mengamati secara langsung perubahan jumlah sel setelah dikultur bersama dengan serat nano yang berbeda selama dua hari dan enam hari.

Analisis Statistik

Semua sampel dalam percobaan diproses dalam rangkap tiga. Semua data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis statistik sampel ditentukan dengan analisis varians satu arah (ANOVA) untuk membandingkan perbedaan dengan signifikansi yang ditetapkan pada p < 0,05.

Hasil dan Diskusi

Persiapan dan Karakterisasi Nanofiber CS@PG

Gambar 1 menampilkan diagram skema dari proses electrospinning untuk scaffold nanofibrous CS@PG dan evaluasi in vitro antikoagulasi dan sitokompatibilitas. Untuk mengembangkan perancah jaringan vaskular yang direkayasa untuk mempromosikan proliferasi sel endotel, rasio CS yang berbeda (5, 10, dan 15% berat) dimasukkan ke dalam solusi PG (10%, v/v) untuk serat nano komposit fabrikasi melalui proses elektrospinning.

Ilustrasi skema pembuatan serat nano dan evaluasi in vitro

SEM dilakukan untuk mengamati struktur nanofibers elektrospun CS@PG. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, gambar SEM dari serat nano PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG menunjukkan arsitektur berserat padat, mengandung serat kontinu, halus, dan berskala nano dengan teknik electrospinning . Serat nano PG (Gbr. 2a) menampilkan banyak manik-manik tidak beraturan pada serat nano melalui proses electrospinning, yang memiliki diameter rata-rata 406.01 ± 146.28 nm. Dapat dijelaskan bahwa 10% b/v larutan electrospun menunjukkan viskositas yang rendah, menghasilkan pembentukan serat nano yang tidak homogen yang mengandung manik-manik [20]. Dengan meningkatkan jumlah CS dalam larutan polimer dari 5 menjadi 10% berat, serat nano homogen tanpa butiran apapun dapat dicapai karena viskositas larutan yang meningkat (Gbr. 2b, c). Sejalan dengan itu, 5%CS@PG, dan 10%CS@PG menunjukkan diameter rata-rata yang lebih kecil, masing-masing 382,35 ± 152,99 nm dan 300,29 ± 100,85 nm. Hasil ini terutama karena peningkatan konten CS meningkatkan konduktivitas larutan electrospinning [20]. Namun, ketika konsentrasi polimer mencapai 15%, viskositas larutan polimer terlalu tinggi untuk diregangkan dalam medan listrik. Pada laju aliran yang sama 1 mL/jam seperti kelompok sebelumnya, kami mengamati bahwa di bawah tegangan yang diberikan 23 kV, fenomena obstruksi ujung jarum muncul dan kerucut Taylor tidak dapat diamati. Oleh karena itu, laju aliran larutan electrospun dan tegangan yang diberikan masing-masing disesuaikan menjadi 0,9 mL/jam dan 20 kV. Serat nano CS@PG 15% berhasil diproduksi dengan diameter rata-rata 266,92 ± 105,43 nm.

Gambar SEM dan distribusi diameter perancah elektrospun CS @ PG pada rasio CS yang berbeda. a PG, b 5%CS@PG, c 10%CS@PG, d 15%CS@PG

Seperti yang digambarkan pada Gambar. 3a, ditemukan bahwa CS terdistribusi secara merata dalam serat nano 5%CS@PG dan 10%CS@PG. Namun, agregasi CS terdeteksi dalam serat 15% CS @ PG. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3b, analisis unsur EDX dilakukan untuk mendeteksi kandungan belerang dari serat yang disiapkan. Seperti yang diharapkan, kandungan belerang meningkat dengan meningkatnya konsentrasi CS dalam serat yang diperoleh.

Gambar TEM (a ) dan analisis elemen EDX dari perancah elektrospun CS@PG pada rasio CS yang berbeda, yaitu, PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG

Analisis Spektrum FTIR

Analisis spektrum FTIR dilakukan untuk menentukan puncak serapan karakteristik dari kelompok kimia perancah nanofibrous disiapkan. Spektrum FTIR dari PG dan CS dianggap sebagai kelompok kontrol untuk dibandingkan dengan kelompok nanofiber CS@PG. Dalam spektrum PG, pita serapan kuat yang muncul pada 3300 cm ⁻¹ dan 2935 cm ⁻¹ dapat dikaitkan dengan –NH₂ dan vibrasi ulur –OH, dan CH₂ peregangan asimetris, masing-masing. Beberapa puncak serapan karakteristik muncul pada 1652 cm ⁻¹ (amida I) untuk getaran regangan C=O, 1542 cm ⁻¹ (amida II) untuk getaran tekuk N–H, 1441 cm ⁻¹ untuk CH₂ peregangan, dan 1267 cm ⁻¹ (amida III) untuk getaran regangan C–N [21, 22]. Spektrum CS menampilkan pita serapan karakteristik pada 1245 cm ⁻¹ , mewakili getaran regangan S=O pada SO yang bermuatan negatif₄ ²⁻ [23, 24].

Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, spektrum FTIR dari serat nano 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG menunjukkan puncak karakteristik PCL, Gt, dan CS bersama-sama. Dibandingkan dengan spektrum grup PG, grup CS@PG menunjukkan pita karakteristik CS pada 1245 cm ⁻¹ , dan intensitas pita CS meningkat dengan adanya CS dalam serat nano. Temuan ini mengkonfirmasi adanya berbagai konten CS dalam nanofiber electrospun CS@PG.

Spektrum FT-IR dari perancah elektrospun CS@PG

Porositas, Rasio Pembengkakan, dan Degradabilitas Nanofibers

Porositas tinggi dari serat menunjukkan bahwa bahan tersebut memiliki interkonektivitas yang sangat baik, yang kondusif untuk difusi oksigen dan nutrisi ke dalam pori-pori dan mendorong infiltrasi sel [25, 26]. Gambar 5a menampilkan porositas film nanofibrous. Porositas serat nano yang diperoleh mengandung rasio CS yang berbeda kira-kira hingga 80%. Arsitektur berpori tinggi yang diperoleh oleh nanofiber electrospun dapat meniru ECM alami, sehingga memberikan lingkungan mikro 3D yang menguntungkan untuk sel [27]. Telah dilaporkan bahwa perancah dalam rekayasa jaringan dengan porositas hingga 80% bermanfaat untuk transportasi nutrisi dan metabolit.

a Porositas nanofibers disiapkan. b Penyerapan PBS dari nanofibers disiapkan. c Sisa massa serat nano CS@PG setelah degradasi dalam larutan PBS hingga 14 hari. d Mikrograf SEM film nanofibrous dalam larutan PBS pada suhu 37 °C selama 7 hari

Rasio penyerapan PBS dari perancah nanofibrous CS @ PG dibandingkan untuk mengevaluasi efek CS pada penyerapan PBS dari film. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5b, rasio penyerapan PBS dari perancah PG adalah 586,34 ± 49,44%, dan serat nano 5%CS@PG dan 10%CS@PG masing-masing adalah 492,86 ± 21,99% dan 510,04 ± 69,55%. Rasio penyerapan PBS dari 15% kelompok CS@PG (665,07 ± 59,81%) secara signifikan lebih tinggi daripada 5% CS@PG dan 10%CS@PG. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan kandungan CS dalam nanofiber komposit dapat meningkatkan sifat serapan PBS dari film, yang mungkin disebabkan oleh tingginya hidrofilisitas pada molekul CS yang mengandung gugus hidrofilik (karboksil dan hidroksil) [28].

Data percobaan degradabilitas in vitro digambarkan pada Gambar 5c, dan ditemukan bahwa dengan peningkatan rasio CS, laju degradasi scaffold nanofibrous CS@PG juga meningkat. Ini mungkin dikaitkan dengan keberadaan SO₄ ²⁻ kelompok [29]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5c, tingkat degradasi sebagian besar perancah mulai meningkat setelah 7 hari, dan hasil degradasi pada hari ke-14 adalah 8,45%, 11,39%, 13,97%, dan 15,10% untuk PG, 5% CS@PG, 10 %CS@PG, dan 15% CS@PG nanofibrous scaffold, masing-masing. Gambar SEM dari perancah nanofibrous (Gbr. 5d) menunjukkan sedikit pembengkakan setelah direndam dalam larutan PBS selama 7 hari. Gambar SEM menunjukkan bahwa serat nano yang dikembangkan cukup stabil untuk menghindari degradasi dan ekspansi serius hingga 7 hari, sehingga memengaruhi respons sel in vivo atau in vitro.

Evaluasi Hemokompatibilitas

APTT adalah metode sederhana dan dapat diandalkan untuk mendeteksi darah atau plasma melalui mekanisme koagulasi intrinsik. APTT diuji untuk mengukur pengaruh nanofibers electrospun pada kemungkinan penundaan pembekuan darah. Waktu pembekuan yang dideteksi oleh APTT menunjukkan penurunan waktu koagulasi yang signifikan secara statistik antara PG kontrol dan 5%CS@PG dan 10%CS@PG nanofibers. Sebaliknya, APTT yang berkepanjangan ditemukan setelah inkubasi 15% CS@PG nanofibers dengan PPP, yang menunjukkan peningkatan fitur antikoagulan. Seperti yang disajikan pada Gambar. 6a, dampak pembekuan darah bergantung pada diameter sampel nanofiber. Waktu koagulasi APTT terendah ditemukan setelah interaksi dengan 5%CS@PG nanofibrous dan APTT tertinggi dengan electrospun 10%CS@PG, serupa dengan derajat hemolisis. Waktu koagulasi diperpanjang dengan peningkatan rasio CS.

a APTT dari serat nano CS@PG. b Tingkat hemolisis sampel. c Aktivitas metabolisme trombosit pada serat nano. n = 3, *p < 0,05

Menurut ASTM F756-00 (2000), laju hemolisis dari biomaterial harus < 5% [30]. Derajat hemolisis pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan uji kolorimetri pelepasan hemoglobin dari eritrosit dan dapat dihitung dengan persamaan:Hemolisis (%) = (OD_sam OD_neg )/(OD_pos OD_neg ) × 100%. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6b, semua sampel non-hemolitik dan tidak menyebabkan hemolisis yang mencolok (laju hemolisis kurang dari 5%).

Data percobaan viabilitas trombosit ditunjukkan pada Gambar 6c. Setelah 2 jam, aktivitas metabolisme trombosit yang menempel adalah yang tertinggi dengan nilai maksimal yang dicapai setelah interaksi PRP dengan serat nano, khususnya serat nano PG. Menariknya, setelah 24 jam, aktivitas trombosit berkurang di semua sampel. Hasil ini dapat disebabkan oleh aktivasi trombosit yang cepat oleh struktur serat nano, menghasilkan konsumsi yang cepat dan pelepasan faktor pertumbuhan dibandingkan dengan aktivasi trombosit yang stabil dan jangka panjang pada kontak dengan permukaan halus [31]. Masa hidup normal trombosit adalah sekitar 8–10 hari, dan akan dipersingkat saat trombosit mulai aktif.

Pewarnaan Sel Hidup/Mati

Pengaruh CS pada sitokompatibilitas serat nano dieksplorasi oleh viabilitas sel, morfologi perekat, dan proliferasi evaluasi HAEC ke serat nano selama 6 hari. Sel-sel yang menempel dinilai menggunakan kit pewarnaan ganda Calcein-AM/PI, pewarnaan DAPI, dan kit pengujian CCK-8.

Gambar 7a–e menunjukkan gambar fluoresensi HAEC hidup dan mati yang dipasang pada serat nano yang berbeda. Calcein-AM (hijau) dan PI (merah) masing-masing digunakan untuk mewarnai sel hidup dan sel mati. Dapat diamati bahwa sel-sel hidup dilekatkan pada nanofiber komposit CS @ PG, menunjukkan bahwa nanofibers yang mengandung rasio CS yang berbeda tidak memiliki toksisitas terhadap HAEC. Analisis kuantitatif lebih lanjut dari jumlah sel hidup/mati pada serat nano diperiksa oleh Image J (Gbr. 7f). Dibandingkan dengan proporsi sel hidup dan mati pada serat nano PG, tiga kelompok PG lainnya yang mengandung rasio CS yang berbeda, terutama kelompok 10% CS@PG dan 15% CS@PG menunjukkan persentase sel hidup yang lebih besar, dan persentasenya meningkat dengan meningkatnya konsentrasi CS. Hasil ini menunjukkan bahwa keberadaan CS dalam nanofibers bermanfaat untuk mempertahankan viabilitas sel [32].

Viabilitas sel HAEC pada perancah CS@PG. a Pelat kultur jaringan (TCP), b PG, c 5%CS@PG, d 10%CS@PG, e 15%CS@PG, f Persentase jumlah sel Hidup/Mati dari scaffold nanofibrous yang berbeda, n = 3

Perilaku Adhesi Sel pada Serat Nano

Scaffolds nanofibrous dengan biokompatibilitas yang baik dianggap sebagai persyaratan utama untuk pembentukan pembuluh darah. PCL dengan biodegradabilitas yang baik dan Gt alami dengan biokompatibilitas yang sangat baik telah banyak digunakan dalam rekayasa jaringan dengan struktur yang berbeda, termasuk hidrogel, nanofibers electrospun, dan perancah tiga dimensi [21, 33, 34]. Morfologi HAEC pada nanofiber komposit dan interaksi bahan sel pada 24 jam diamati dengan mikroskop fluoresensi. Kepadatan sel 10%CS@PG dan 15%CS@PG secara statistik signifikan daripada PG dan 5%CS@PG, menunjukkan bahwa penambahan CS pada tingkat yang lebih tinggi mendorong adhesi sel. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 8c, area sel tunggal 5%CS@PG dan 15%CS@PG lebih besar daripada kelompok serat nano lainnya. Namun, pemanjangan sel 10%CS@PG secara signifikan lebih tinggi daripada PG, 5%CS@PG, dan 15%CS@PG (Gbr. 8d). Hasil ini dapat menjelaskan bahwa penambahan CS pada konsentrasi 10% dapat memfasilitasi penyebaran HAECs. Ditemukan bahwa HAEC dapat menempel, menyebar, dan tumbuh dengan baik pada serat nano komposit, terutama 10%CS@PG dan 15%CS@PG. Dengan demikian, kedua bahan nanofiber ini dapat dianggap sebagai kandidat bahan vaskular yang aman dan menjanjikan dalam aplikasi klinis.

a Morfologi perekat sel HAEC pada perancah CS@PG (DAPI:inti sel; Rhodamin-Phalloidin:sitoskeleton). b Kepadatan sel. c Area sel tunggal, d Pemanjangan sel dalam berbagai kelompok serat nano

Proliferasi Sel

Pertumbuhan sel dan viabilitas pada serat nano CS@PG diselidiki secara in vitro dengan mikroskop fluoresensi dan uji CCK-8 (Gbr. 9a-c). Perancah PG electrospun dipilih sebagai kontrol positif. Hasil uji CCK-8 untuk film nanofibrous yang berbeda ditampilkan pada Gambar. 9c. Dalam 2, 4, 6 hari kultur sel, jumlah sel meningkat seiring waktu kultur untuk semua kelompok. Pada hari ke-6, nilai OD 10% CS@PG nanofibers secara signifikan lebih tinggi daripada perancah PG. Perbandingan proliferasi sel 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG menunjukkan bahwa tingkat proliferasi sel meningkat seiring kehadiran CS dalam serat nano komposit dalam kisaran tertentu. Namun, kemampuan proliferasi sel juga dipengaruhi oleh morfologi permukaan bahan nanofibrous. Karena serat nano CS@PG 15% menunjukkan viskositas yang kuat karena rasio CS yang lebih tinggi dalam larutan polimer elektrospinning, proliferasi sel mungkin terpengaruh.

a HAEC berkembang biak pada serat nano yang terdeteksi oleh pewarnaan sel selama 2, 6 hari, b Kepadatan sel pada perancah nanofibrous pada 2, 6 hari, n = 3, *p < 0,05, c Uji CCK-8 setelah HAEC dikultur pada PG, dan nanofiber CS@PG pada 2, 4, 6 hari

Kesimpulan

Singkatnya, nanofiber komposit CS @ PG biomimetik berhasil dibuat menggunakan teknologi electrospinning. Perubahan morfologi dan diameter serat diperoleh dengan memvariasikan konsentrasi CS dalam serat nano PG. Nanofiber CS@PG memiliki porositas yang sesuai (~ 80%) dan penyerapan larutan PBS (hingga 650%). Penggabungan CS dalam nanofibers PG secara signifikan meningkatkan sifat antikoagulannya, memperpanjang waktu koagulasinya, dan meningkatkan respons seluler. Khususnya, serat nano CS @ PG 10% menunjukkan adhesi sel, pemanjangan, dan proliferasi yang menguntungkan. Oleh karena itu, serat nano komposit PG yang digabungkan dengan sejumlah CS menghambat antitrombogenisitas dan meningkatkan respons sel endotel, yang dapat dikembangkan sebagai perancah rekayasa jaringan yang menjanjikan dalam perbaikan dan regenerasi pembuluh darah.

Ketersediaan data dan materi

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini disertakan dalam artikel ini.

MicroRNA-326-5p yang Dipulihkan Menghambat Apoptosis Neuronal dan Melemahkan Kerusakan Mitokondria melalui Menekan STAT3 pada Iskemia/Cedera Reperfusi Serebral Nanopartikel Biokompatibel sebagai Platform untuk Meningkatkan Khasiat Antitumor Kombinasi Cisplatin–Tetradrine