Nanofiber Gelatin/Polykaprolakton Ditingkatkan Sulfat Kondroitin: Rangka Antitrombogenik dengan Afinitas Endotel Unggul untuk Rekayasa Jaringan Pembuluh Darah

Abstrak

Nanofiber polimer elektrospun telah menarik perhatian besar dalam rekayasa jaringan pembuluh darah. Namun, bahan nanofiber konvensional dengan defisiensi endotelisasi yang lambat dan trombosis tidak efektif dalam mempromosikan perbaikan dan regenerasi jaringan pembuluh darah. Di sini, nanofiber komposit gelatin (Gt)/polykaprolakton (PCL) biomimetik yang menyertakan berbagai jumlah sulfat kondroitin (CS) dikembangkan melalui teknologi elektrosputing untuk menyelidiki efeknya terhadap antitrombogenisitas dan afinitas sel endotel. Konsentrasi CS yang bervariasi pada nanofiber PG mempengaruhi morfologi dan diameter serat. Nanofiber CS/Gt/PCL memiliki porositas yang sesuai (~ 80%) dan penyerapan larutan PBS (hingga 650%). Pengenalan CS pada nanofiber Gt/PCL sangat meningkatkan properti antikoagulannya, memanjangkan waktu gerinnahan, dan memfasilitasi respons sel. Khususnya, nanofiber 10%CS/Gt/PCL menampilkan penambatan sel, elongasi, dan proliferasi yang menguntungkan. Dengan demikian, nanofiber Gt/PCL yang mengandung sejumlah CS dapat menjadi kandidat yang sangat baik sebagai rangka rekayasa jaringan yang menjanjikan dalam perbaikan dan regenerasi pembuluh darah.

Pendahuluan

Perkembangan bahan nanofiber telah menarik perhatian sebagai rangka biomimetik dalam perbaikan dan regenerasi jaringan karena fitur fisikokimia (bio) uniknya, termasuk struktur serat ultrafine mirip matriks selular ekstraseluler (ECM), properti mekanis yang unggul, luas permukaan spesifik yang besar, dan porositas tinggi dengan konektivitas [1, 2]. Telah dibuktikan bahwa struktur nanofiber memainkan peran kunci dalam mediasi respons seluler, seperti penambatan sel, morfologi (misalnya, penyebaran, perataan, elongasi, dll.), susunan, migrasi, proliferasi, fenotipe, dan diferensiasi melalui panduan kontak [3,4,5]. Meskipun berbagai strategi nanofabrikasi (misalnya, nanoskiving, sintesis templat, pemisahan fasa, dll.) telah menyediakan teknologi yang tersedia untuk memproduksi bahan nanofiber, elektrosputing adalah salah satu metode paling efektif untuk memproduksi nanofiber dari berbagai bahan (logam, keramik, polimer, bahan komposit, dll.) pada skala industri [6,7,8].

Selain sinyal (bio)fisik, pemilihan biomaterial yang sesuai dapat secara signifikan mempengaruhi aktivitas sel serta perbaikan dan regenerasi jaringan [9]. Beberapa fitur utama, seperti kompatibilitas biologik, bioresorpsi, properti mekanis, dan fungsi bio, harus dipertimbangkan [9, 10]. Dibandingkan komposit alami/alami dan sintetis/sintetik, bahan nanofiber komposit yang terdiri dari polimer alami dan sintetis telah menerima lebih banyak perhatian karena kombinasi fitur biologis yang unggul dari polimer alami dan kekuatan mekanis dari polimer sintetis [9]. Di antara mereka, kombinasi gelatin (Gt)/polykaprolakton (PCL) adalah salah satu sistem hibrid alami-sintetik yang paling representatif dan banyak digunakan dalam rekayasa jaringan pembuluh darah [11,12,13,14]. Namun, nanofiber komposit Gt/PCL masih memiliki beberapa keterbatasan, seperti endotelisasi yang lambat dan trombosis. Baru-baru ini, sulfat kondroitin (CS) adalah polisakarida bersulfat yang mengandung glikosaminoglikan dan galaktosamin, yang telah dibuktikan memiliki afinitas penambatan yang tinggi pada sel endotel (ECs), interaksi yang lemah dengan protein dan trombosit, serta repulsi elektrostatik terhadap komponen darah yang bermuatan negatif [15,16,17]. Selain itu, CS dapat mencegah apoptosis sel dan memfasilitasi penyembuhan luka vaskular [18, 19]. Oleh karena itu, nanofiber elektrosput Gt/PCL (PG) yang menyertakan CS akan menjadi kandidat yang sangat baik sebagai rangka rekayasa jaringan bio-instrukturatif untuk perbaikan dan regenerasi pembuluh darah.

Dalam karya ini, nanofiber komposit PG biomimetik yang mengandung berbagai rasio CS dikembangkan melalui elektrosputing satu tahap. Morfologi, fitur kimia, porositas, dan degradasi nanofiber komposit CS/PG terdeteksi dengan berbagai teknik karakterisasi. Antikoagulan nanofiber komposit PG/CS dievaluasi. Selanjutnya, nanofiber komposit ini dengan berbagai rasio CS ditanami dengan sel endotel aortik manusia (HAECs) untuk menyelidiki efeknya terhadap respons seluler.

Materi dan Metode

Materi

CS (trachea sapi, tipe A, kekuatan: 95%) disediakan oleh Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Cina). PCL diperoleh dari Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (Cina). Gt (kulit sapi, tipe B) diperoleh dari Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (Cina). Kit waktu tromboplastin parsial diaktifkan (APTT) dibeli dari Leigen Biotechnology Co., Ltd (Cina). Asam asetat (kekuatan: 99,5%) dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Cina). Sel endotel aortik manusia (HAECs) diperoleh dari rumah sakit afiliasi Universitas Qingdao (Cina). Medium kultur Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), serum fetal sapi (FBS), 0,25% tripsin–EDTA dibeli dari Biological Industries (Israel). Semua reagen dibeli dari Sigma Aldrich (Cina) kecuali dinyatakan lain. Air yang digunakan dalam semua eksperimen adalah air deionisasi.

Elektrosputing Nanofiber

PCL (10% b/v) dilarutkan dalam asam asetat dengan pengadukan mekanis pada suhu ruangan selama 4 jam. Gt (10% b/v) dilarutkan dalam asam asetat 90% dengan pengadukan konstan selama 2 jam. CS dengan berbagai konsentrasi ditambahkan ke dalam larutan Gt dan diaduk lembut pada suhu ruangan selama 1 jam untuk mendapatkan larutan homogen yang mengandung 5, 10, dan 15 wt.% CS relatif terhadap konsentrasi polimer total. Kemudian, larutan PG disiapkan dengan mencampur dua larutan di atas dalam rasio berat 50/50 (w/w) dengan pengadukan selama 2 jam, disebut sebagai 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG.

Larutan homogen yang disiapkan ditesapkan pada proses elektrosputing, dilengkapi dengan serinjuk 1 mL dengan jarum 21 G dan kolektor yang ditutupi oleh foil aluminium. Dalam studi ini, jarak antara piring kolektor dan ujung jarum ditetapkan pada sekitar 18 cm, tegangan diatur pada 23 kV, dan larutan polimer dipompa dengan laju 1 mL/h. Semua larutan di-elektrosputing dalam instrumen elektrosputing (Teknologi, Tk602TH, Cina) pada suhu ruangan dan kelembaban yang dikontrol dengan hati-hati (< 40%). Sebelum eksperimen lebih lanjut, sampel ditempatkan dalam oven pengering vakum selama setidaknya 72 jam untuk menghapus pelarut yang tersisa.

Mikroskop Elektron Pemindai (SEM) dan Mikroskop Elektron Transmisi (TEM)

Morfologi rangka nanofiber CS@PG diselidiki oleh SEM (VEGAS, TESCAN, Czech) pada tegangan percepatan 20 kV pada suhu ruangan. Diameter nanofiber (n = 100) lebih lanjut diukur dari gambar SEM menggunakan perangkat lunak analisis gambar (Image J).

Pengamatan TEM dan analisis spektroskopi X-dispersif energi (EDS) dilakukan menggunakan JEOL JEM-2100 plus (Jepang).

Spektroskopi Inframerah Transformasi Fourier (FTIR)

FTIR dilakukan oleh spektrometer FTIR Nicolet iN10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) untuk mengevaluasi grup fungsional karakteristik CS, nanofiber PG, dan nanofiber CS@PG. Spektra sampel direkam dalam mode transmisi atas rentang panjang gelombang 4000–500 cm⁻¹ dengan resolusi 2 cm⁻¹.

Porositas dan Serapan Larutan Salin Fosfat (PBS)

Porositas nanofiber dilakukan dengan metode perpindahan cairan. Pertama, berat kering nanofiber ditimbang sebagai W₁. Kemudian, empat kelompok nanofiber direndam dalam etanol selama 2 jam pada 25 °C dan ditimbang sebagai W₂. Etanol pada permukaan sampel dihapus dengan kertas filter, dan berat sampel kemudian dicatat sebagai W₃. Porositas nanofiber dihitung dengan rumus berikut:

$${\text{Porosity}}\left( \% \right) = \left( {W_{3} - W_{1} } \right)/\left( {W_{3} - W_{2} } \right) \times 100$$

Untuk uji serapan larutan PBS, nanofiber yang diperoleh ditimbang dalam keadaan kering dan dicatat sebagai Wd. Kemudian, nanofiber direndam dalam PBS selama 24 jam pada 25 °C dan berat dalam keadaan basah dicatat sebagai Ww setelah menghilangkan cairan berlebih pada permukaan sampel. Rasio pengembungan dapat diukur dengan persamaan berikut:

$${\text{PBS}}\;{\text{absorption}}\left( \% \right) = \left( {W_{{\text{W}}} - W_{{\text{d}}} } \right)/W_{{\text{d}}} \times 100$$

Semua nilai dalam eksperimen di atas diekspresikan sebagai mean ± SD (n = 3).

Perilaku Degradasi In Vitro

Untuk menentukan resistensi nanofiber yang diperoleh terhadap lisozim, degradasi sampel diukur pada waktu yang dijadwalkan (1, 4, 7, 10, dan 14 hari). Berat awal nanofiber dicatat sebagai Wᵢ. Kemudian, sampel direndam dalam larutan PBS (pH 7,4) yang mengandung lisozim (500 μg/mL) dan diinkubasi in vitro pada 37 °C. Pada interval degradasi yang ditentukan, setiap kelompok sampel diambil dan dicuci dengan air deionisasi, lalu di-freeze-dried untuk mendapatkan berat akhir (Wf). Larutan lisozim diganti tiga kali seminggu. Sisa massa (%) dari rangka nanofiber diestimasi sebagai didefinisikan dalam rumus berikut:

$${\text{Mass}}\;{\text{remaining}}\left( \% \right) = \left( {1 - \frac{{w_{i} - w_{f} }}{{w_{i} }}} \right) \times 100\%$$

Untuk mengevaluasi perilaku degradasi sampel setelah 7 hari, morfologi nanofiber diamati oleh SEM.

Analisis Kompatibilitas Darah

Waktu Gerinnahan

Waktu tromboplastin parsial diaktifkan (APTT) digunakan untuk mengevaluasi aktivitas jalur intrinsik dan umum koagulasi melalui pengujian waktu gerinnahan plasma tidak mengandung trombosit (PPP) setelah diinkubasi dengan nanofiber elektrosputing pada coverslip. Untuk ini, darah yang diantikoagulan (sekitar 10 mL) dikumpulkan dan difugenasi pada 3000 rpm selama 20 menit untuk mendapatkan plasma tidak mengandung trombosit (PPP). Setiap sampel diinkubasi dengan 200 μL PPP selama 10 menit pada 37 °C dan dianalisis menggunakan kit APTT sesuai petunjuk produsen (n = 3).

Uji Hemolisis

Rata-rata hemolisis dievaluasi dengan mengukur konsentrasi hemoglobin yang dilepaskan ke dalam fase larutan dari eritrosit dalam darah utuh yang dicairkan yang diekspos pada nanofiber elektrosputing. Sampel pada coverslip ditempatkan secara individu dalam papan 24-lubang dan direndam dalam 2 mL PBS pada 37 °C selama 30 menit. Kelompok kontrol negatif hanya mengandung 2 mL PBS, sementara kelompok kontrol positif terdiri dari 2 mL air deionisasi untuk tujuan menginduksi lisis eritrosit maksimum (n = 3 untuk setiap grup pengujian). Kemudian, 40 μL darah utuh segar yang diantikoagulan di atas ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 60 menit pada 37 °C, setelahnya suspensi dipindahkan ke tabung sentrifug dan difugenasi pada 100× g selama 5 menit. Supernatan dianalisis untuk mengukur absorbansi pada 570 nm menggunakan pembaca mikropapan (SynergyH1/H1M, BioTek, Cina).

Trombogenicitas

Potensi trombogenik dievaluasi in vitro setelah inkubasi sampel elektrosputing dengan plasma kaya trombosit (PRP). PRP disiapkan oleh sentrifugasi (1500 rpm, 20 menit) dan separuh atas plasma dibuang. Kemudian, nanofiber pada coverslip diinkubasi dalam 100 μL PRP pada 37 °C selama 2 jam dan dicuci lembut dengan PBS tiga kali untuk eksperimen selanjutnya. Untuk mengevaluasi aktivitas trombosit setelah diinkubasi dengan PRP, nanofiber elektrosputing disimpan dalam DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS selama 2 jam dan 24 jam, dan kemudian kit assay CCK-8 digunakan untuk mengukur kelangsungan hidup trombosit pada nanofiber. CCK-8 (20 μL) ditambahkan ke 200 μL medium DMEM bebas serum pada papan 24-lubang dan diinkubasi selama 1 jam. Akhirnya, suspensi diukur oleh pembaca mikropapan pada panjang gelombang 450 nm.

Kultur Sel dan Kelangsungan Hidup Sel

Sel endotel aortik manusia (HAECs) dikultur dalam DMEM yang dilengkapi dengan FBS (10%, v/v), dan streptomisin/penisilin (1%, v/v) dalam atmosfer 37 °C dan 5% CO₂. Medium kultur diganti tiga kali seminggu. Sel biasanya diisolasi oleh 0,05% tripsin/EDTA selama 3 menit, difugenasi pada 1000 rpm, dan disuspendasi dalam medium segar untuk melakukan passaging sel atau penanaman sel.

Sebelum penanaman sel, semua bahan nanofiber dalam papan 24-lubang dikarantina dengan radiasi UV selama 1 jam dan direndam dalam etanol 75% (v/v, %) selama 1 jam. Kemudian, nanofiber dicuci empat kali dengan larutan PBS dan direndam dalam DMEM selama 12 jam dalam inkubator CO₂. Sel ditanam dengan densitas 1 × 10⁴ sel per lubang pada nanofiber dan medium diganti setiap hari. Setelah dikultur bersama selama 24 jam, sel dicuci dengan larutan PBS tiga kali dan kemudian diwarnai dengan kit pewarnaan ganda Calcein-AM/PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Shanghai, Cina). PI digunakan untuk mewarnai sel mati dan Calcein-AM mewarnai sel hidup.

Morfologi Sel pada Nanofiber

Untuk mengamati penambatan sel pada nanofiber, morfologi sel diamati setelah dikultur bersama selama 24 jam oleh Mikroskop Fluoresensi (Nikon A1 MP, Jepang). Pertama, sel difiksikan dengan paraformaldehida 4% pada suhu ruangan selama 30 menit. Kemudian, larutan Triton X-100 0,5% digunakan selama 5 menit untuk mempermeabilisasi membran sel. Akhirnya, 4′6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) digunakan untuk mewarnai inti sel dan rhodamine-phalloidin digunakan untuk mewarnai F-aktin. Analisis kuantitatif (densitas sel, luas sel tunggal, elongasi sel) lebih lanjut dilakukan dengan Image J.

Proliferasi Sel

Aktivitas proliferasi sel pada nanofiber komposit dilakukan dengan kit Assay CCK-8. HAECs ditanam pada nanofiber dengan densitas 8 × 10³ sel/lubang. Medium kultur diganti setiap dua hari. Setelah 1, 4, 7 hari kultur bersama, sel dicuci dengan larutan PBS untuk menghapus sel yang tidak menempel. Kemudian, 20 μL CCK-8 dan medium lengkap dalam rasio volume 1:10 ditambahkan ke papan 24-lubang selama 1 jam dalam inkubator. Absorbansi diuji oleh Elisa Reader pada 450 nm.

Pewarnaan sel dengan DAPI dan rhodamine-phalloidin dilakukan dengan Mikroskop Fluoresensi untuk mengamati langsung perubahan jumlah sel setelah dikultur bersama dengan berbagai nanofiber selama dua hari dan enam hari.

Analisis Statistik

Semua sampel dalam eksperimen diproses dalam tiga kali pengulangan. Semua data direpresentasikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Analisis statistik sampel ditentukan oleh analisis variansi satu arah (ANOVA) untuk membandingkan perbedaan dengan signifikansi ditetapkan pada p < 0,05.

Hasil dan Pembahasan

Persiapan dan Karakterisasi Nanofiber CS@PG

Gambar 1 menampilkan diagram skematis proses elektrosputing untuk rangka nanofiber CS@PG dan evaluasi in vitro dari antikoagulan dan citokompatibilitas. Untuk mengembangkan rangka jaringan vaskular terakro untuk mempromosikan proliferasi sel endotel, berbagai rasio CS (5, 10, dan 15 wt%) disisipkan ke dalam larutan PG (10%, v/v) untuk memproduksi nanofiber komposit melalui proses elektrosputing.

SEM dilakukan untuk mengamati struktur nanofiber elektrosput CS@PG. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2, gambar SEM nanofiber PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG menunjukkan arsitektur serat padat, yang berisi serat yang kontinu, halus, dan berukuran nano dengan teknik elektrosputing. Nanofiber PG (Gambar 2a) menampilkan banyak irreguler pada serat melalui proses elektrosputing, dengan diameter rata-rata 406,01 ± 146,28 nm. Ini dapat dijelaskan bahwa larutan elektrosputing 10% b/v memiliki viskositas rendah, yang mengakibatkan pembentukan nanofiber tidak homogen yang mengandung irreguler [20]. Dengan peningkatan jumlah CS dalam larutan polimer dari 5 hingga 10% wt., nanofiber homogen tanpa irreguler dapat dicapai karena viskositas larutan yang meningkat (Gambar 2b, c). Dengan demikian, 5%CS@PG dan 10%CS@PG menunjukkan diameter rata-rata yang lebih kecil yaitu 382,35 ± 152,99 nm dan 300,29 ± 100,85 nm, masing-masing. Hasil ini terutama karena peningkatan konten CS secara beruntun meningkatkan konduktivitas larutan elektrosputing [20]. Namun, ketika konsentrasi polimer mencapai 15%, viskositas larutan polimer terlalu tinggi untuk diregangkan dalam medan listrik. Pada laju aliran yang sama 1 mL/h seperti kelompok sebelumnya, kami mengamati bahwa pada tegangan 23 kV, fenomena penyumbatan ujung jarum muncul dan konus Taylor tidak dapat diamati. Oleh karena itu, laju aliran larutan elektrosputing dan tegangan yang diterapkan disesuaikan menjadi 0,9 mL/h dan 20 kV, masing-masing. Nanofiber 15%CS@PG berhasil diproduksi dengan diameter rata-rata 266,92 ± 105,43 nm.

Seperti digambarkan dalam Gambar 3a, ditemukan bahwa CS terdistribusi secara seragam dalam nanofiber 5%CS@PG dan 10%CS@PG. Namun, agregasi CS terdeteksi pada serat 15%CS@PG. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3b, analisis elemen EDX dilakukan untuk mendeteksi kandungan sulfur pada serat yang disiapkan. Seperti yang diharapkan, kandungan sulfur meningkat dengan peningkatan konsentrasi CS dalam serat yang diperoleh.

Analisis Spektra FTIR

Analisis spektra FTIR dilakukan untuk menentukan puncak serapan karakteristik grup kimia dari rangka nanofiber yang disiapkan. Spektra FTIR PG dan CS dianggap sebagai kelompok kontrol untuk dibandingkan dengan kelompok nanofiber CS@PG. Dalam spektrum PG, puncak serapan kuat yang muncul pada 3300 cm⁻¹ dan 2935 cm⁻¹ dapat diatribusikan pada getaran gerangan –NH₂ dan –OH, serta gerangan asimetris CH₂, masing-masing. Beberapa puncak serapan karakteristik muncul pada 1652 cm⁻¹ (amida I) untuk getaran gerangan C=O, 1542 cm⁻¹ (amida II) untuk getaran lenturan N–H, 1441 cm⁻¹ untuk gerangan CH₂, dan 1267 cm⁻¹ (amida III) untuk getaran gerangan C–N [21, 22]. Spektrum CS menampilkan puncak serapan karakteristik pada 1245 cm⁻¹, yang mewakili getaran gerangan S=O dalam SO₄²⁻ yang bermuatan negatif [23, 24].

Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, spektra FTIR nanofiber 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG menunjukkan puncak karakteristik PCL, Gt, dan CS bersama-sama. Dibandingkan dengan spektrum kelompok PG, kelompok CS@PG menunjukkan puncak karakteristik CS pada 1245 cm⁻¹, dan intensitas puncak CS meningkat dengan kehadiran CS dalam nanofiber. Temuan ini mengonfirmasi kehadiran konten CS yang bervariasi dalam nanofiber elektrosput CS@PG.

Porositas, Rasio Pengembungan, dan Degradasi Nanofiber

Porositas serat yang tinggi menunjukkan bahwa materi memiliki konektivitas yang baik, yang menguntungkan difusi oksigen dan nutrisi ke dalam pori dan memfasilitasi infiltrasi sel [25, 26]. Gambar 5a menampilkan porositas film nanofiber. Porositas nanofiber yang diperoleh yang mengandung berbagai rasio CS sekitar hingga 80%. Arsitektur pori tinggi yang diperoleh oleh nanofiber elektrosputing dapat meniru ECM alami, sehingga menyediakan mikroambiente 3D yang menguntungkan bagi sel [27]. Telah dilaporkan bahwa rangka dalam rekayasa jaringan dengan porositas hingga 80% bermanfaat untuk transportasi nutrisi dan metabolit.

Rasio serapan larutan PBS dari rangka nanofiber CS@PG dibandingkan untuk mengevaluasi efek CS terhadap penyerapan PBS film. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 5b, rasio serapan PBS rangka PG adalah 586,34 ± 49,44%, dan nanofiber 5%CS@PG dan 10%CS@PG adalah 492,86 ± 21,99% dan 510,04 ± 69,55%, masing-masing. Rasio serapan PBS kelompok 15%CS@PG (665,07 ± 59,81%) secara signifikan lebih tinggi dibandingkan dengan 5% CS@PG dan 10%CS@PG. Hasil ini menunjukkan bahwa peningkatan konten CS dalam nanofiber komposit dapat meningkatkan properti penyerapan PBS film, yang mungkin disebabkan oleh hidrofili yang tinggi pada molekul CS yang mengandung grup hidrofilis (karbosil dan hidroksil) [28].

Data eksperimen degradabilitas in vitro digambarkan dalam Gambar 5c, dan ditemukan bahwa dengan peningkatan rasio CS, laju degradasi rangka nanofiber CS@PG juga meningkat. Ini mungkin dikaitkan dengan kehadiran grup SO₄²⁻ [29]. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 5c, laju degradasi sebagian besar rangka mulai meningkat setelah 7 hari, dan hasil degradasi pada hari ke-14 adalah 8,45%, 11,39%, 13,97%, dan 15,10% untuk nanofiber rangka PG, 5% CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG, masing-masing. Gambar SEM rangka nanofiber (Gambar 5d) menunjukkan pengembungan ringan setelah direndam dalam larutan PBS selama 7 hari. Gambar SEM menunjukkan bahwa nanofiber yang dikembangkan cukup stabil untuk menghindari degradasi dan ekspansi yang serius hingga 7 hari, sehingga mempengaruhi respons sel in vivo atau in vitro.

Evaluasi Hemokompatibilitas

APTT adalah metode sederhana dan andal untuk mendeteksi darah atau plasma melalui mekanisme koagulasi intrinsik. APTT diuji untuk mengukur pengaruh nanofiber elektrosputing terhadap kemungkinan penundaan gerinnahan darah. Waktu gerinnahan yang terdeteksi oleh APTT menunjukkan penurunan yang signifikan secara statistik dalam waktu gerinnahan antara kontrol PG dan nanofiber 5%CS@PG dan 10%CS@PG. Sebaliknya, APTT yang diperpanjang ditemukan setelah inkubasi nanofiber 15%CS@PG dengan PPP, yang menunjukkan fitur antikoagulan yang ditingkatkan. Seperti yang disajikan dalam Gambar 6a, pengaruh koagulasi darah bergantung pada diameter sampel nanofiber. Waktu gerinnahan APTT terendah ditemukan setelah interaksi dengan nanofiber 5%CS@PG dan APTT tertinggi dengan elektrosputing 10%CS@PG, serupa dengan tingkat hemolisis. Waktu gerinnahan diperpanjang dengan peningkatan rasio CS.

Menurut ASTM F756-00 (2000), rata-rata hemolisis biomaterial harus di bawah 5% [30]. Tingkat hemolisis dalam studi ini dilakukan menggunakan assay warna dari hemoglobin yang dilepaskan dari eritrosit dan dapat dihitung dengan persamaan: Hemolisis (%) = (OD_sam − OD_neg)/(OD_pos − OD_neg) × 100%. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 6b, semua sampel non-hemolitik dan tidak mengakibatkan hemolisis yang signifikan (tingkat hemolisis kurang dari 5%).

Data eksperimen kelangsungan hidup trombosit ditampilkan dalam Gambar 6c. Setelah 2 jam, aktivitas metabolik trombosit yang menempel adalah yang tertinggi dengan nilai maksimal yang tercapai setelah interaksi PRP dengan nanofiber, terutama nanofiber PG. Menariknya, setelah 24 jam, aktivitas trombosit berkurang pada semua sampel. Hasil ini mungkin disebabkan oleh aktivasi trombosit yang cepat oleh struktur nanofiber, yang mengakibatkan konsumsi dan pelepasan faktor pertumbuhan yang cepat dibandingkan dengan aktivasi trombosit yang stabil dan jangka panjang saat kontak dengan permukaan halus [31]. Usia normal trombosit sekitar 8–10 hari, dan akan berpendek saat trombosit mulai diaktifkan.

Pewarnaan Sel Hidup/Mati

Pengaruh CS terhadap citokompatibilitas nanofiber dieksplorasi melalui evaluasi kelangsungan hidup, morfologi adesif, dan proliferasi HAECs pada nanofiber selama 6 hari. Sel yang menempel dinilai menggunakan kit pewarnaan ganda Calcein-AM/PI, pewarnaan DAPI, dan kit assay CCK-8.

Gambar 7a–e menunjukkan gambar fluoresensi HAECs hidup dan mati yang menempel pada berbagai nanofiber. Calcein-AM (hijau) dan PI (merah) digunakan untuk mewarnai sel hidup dan sel mati, masing-masing. Dapat diamati bahwa sel hidup menempel pada nanofiber komposit CS@PG, yang menunjukkan bahwa nanofiber yang mengandung berbagai rasio CS tidak beracun bagi HAECs. Analisis kuantitatif lebih lanjut dari jumlah sel hidup/mati pada nanofiber dilakukan oleh Image J (Gambar 7f). Dibandingkan dengan proporsi sel hidup dan mati pada nanofiber PG, tiga kelompok lain PG yang mengandung berbagai rasio CS, terutama kelompok 10%CS@PG dan 15%CS@PG menunjukkan persentase sel hidup yang lebih besar, dan persentase meningkat seiring dengan peningkatan konsentrasi CS. Hasil ini menunjukkan bahwa kehadiran CS dalam nanofiber menguntungkan untuk mempertahankan kelangsungan hidup sel [32].

Perilaku Adesif Sel pada Nanofiber

Rangka nanofiber dengan citokompatibilitas yang baik dianggap sebagai persyaratan utama untuk pembentukan pembuluh darah. PCL dengan bioresorpsi yang baik dan Gt alami dengan citokompatibilitas yang unggul banyak digunakan dalam rekayasa jaringan dengan berbagai struktur, termasuk hidrogel, nanofiber elektrosputing, dan rangka tiga dimensi [21, 33, 34]. Morfologi HAECs pada nanofiber komposit dan interaksi sel-bahan pada 24 jam diamati oleh mikroskop fluoresensi. Densitas sel 10%CS@PG dan 15%CS@PG secara signifikan lebih tinggi daripada PG dan 5%CS@PG, yang menunjukkan bahwa penambahan CS pada tingkat yang lebih tinggi memfasilitasi penambatan sel. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 8c, luas sel tunggal 5%CS@PG dan 15%CS@PG lebih besar dari kelompok nanofiber lainnya. Namun, elongasi sel 10%CS@PG secara signifikan lebih tinggi daripada PG, 5%CS@PG, dan 15%CS@PG (Gambar 8d). Hasil ini dapat dijelaskan bahwa penambahan CS pada konsentrasi 10% dapat memfasilitasi penyebaran HAECs. Ditemukan bahwa HAECs dapat menempel, menyebar, dan tumbuh dengan baik pada nanofiber komposit, terutama 10%CS@PG dan 15%CS@PG. Dengan demikian, dua bahan nanofiber ini dapat dianggap sebagai kandidat vaskular yang aman dan menjanjikan untuk aplikasi klinis.

Proliferasi Sel

Pertumbuhan dan kelangsungan hidup sel pada nanofiber CS@PG diselidiki in vitro oleh mikroskop fluoresensi dan tes CCK-8 (Gambar 9a–c). Rangka elektrosput PG dipilih sebagai kontrol positif. Hasil tes CCK-8 untuk berbagai film nanofiber ditampilkan dalam Gambar 9c. Pada 2, 4, 6 hari kultur sel, jumlah sel meningkat seiring waktu kultur untuk semua kelompok. Pada hari ke-6, nilai OD nanofiber 10%CS@PG secara signifikan lebih tinggi daripada rangka PG. Perbandingan proliferasi sel 5%CS@PG, 10%CS@PG, dan 15%CS@PG menunjukkan bahwa laju proliferasi sel meningkat dengan kehadiran CS dalam nanofiber komposit dalam rentang tertentu. Namun, kemampuan proliferasi sel juga dipengaruhi oleh morfologi permukaan bahan nanofiber. Karena nanofiber 15%CS@PG menunjukkan viskositas yang kuat karena rasio CS yang lebih tinggi dalam larutan polimer elektrosputing, proliferasi sel mungkin terpengaruh.

Kesimpulan

Secara ringkas, nanofiber komposit CS@PG biomimetik berhasil diproduksi menggunakan teknologi elektrosputing. Morfologi dan diameter serat yang berubah diperoleh dengan mengubah konsentrasi CS pada nanofiber PG. Nanofiber CS@PG memiliki porositas yang sesuai (~ 80%) dan serapan larutan PBS (hingga 650%). Penggabungan CS pada nanofiber PG secara signifikan meningkatkan properti antikoagulannya, memanjangkan waktu gerinnahan, dan meningkatkan respons seluler. Khususnya, nanofiber 10%CS@PG menampilkan penambatan sel, elongasi, dan proliferasi yang menguntungkan. Oleh karena itu, nanofiber komposit PG yang disisipkan dengan sejumlah CS menghambat trombogenicitas dan meningkatkan respons sel endotel, yang dapat dikembangkan sebagai rangka rekayasa jaringan yang menjanjikan untuk perbaikan dan regenerasi pembuluh darah.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama studi ini termasuk dalam artikel ini.