Respons Osteoblas terhadap Lapisan Mikroporous yang Didoping Tembaga pada Titanium untuk Peningkatan Integrasi Tulang
Abstrak
Karena sifat mekanik yang sangat baik dan biokompatibilitas yang baik, paduan titanium telah menjadi topik penelitian yang populer di bidang implan logam medis. Namun, permukaan paduan titanium tidak menunjukkan aktivitas biologis, yang dapat menyebabkan integrasi yang buruk antara antarmuka implan titanium dan antarmuka jaringan tulang dan selanjutnya dapat menyebabkan implan terlepas. Oleh karena itu, inertness biologis permukaan adalah salah satu masalah yang harus diatasi oleh paduan titanium untuk menjadi bahan implan ortopedi yang ideal. Modifikasi permukaan dapat meningkatkan sifat biologis titanium, sehingga meningkatkan efek osseointegrasinya. Tembaga adalah elemen jejak penting bagi tubuh manusia, dapat meningkatkan pembentukan tulang dan memainkan peran penting dalam menjaga struktur fisiologis dan fungsi pertumbuhan dan perkembangan tulang dan tulang. Dalam penelitian ini, lapisan tembaga-titanium dioksida mikropori dibuat pada permukaan titanium dengan oksidasi busur mikro. Berdasarkan evaluasi karakteristik permukaannya, diamati adhesi, proliferasi dan diferensiasi sel MC3T3-E1. Batang titanium ditanamkan ke dalam kondilus femoralis kelinci, dan integrasi lapisan dan jaringan tulang dievaluasi. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa lapisan mikropori tembaga-titanium dioksida memiliki struktur berpori hampir tiga dimensi, dan tembaga dimasukkan ke dalam lapisan tanpa mengubah struktur lapisan. Eksperimen in vitro menemukan bahwa pelapisan dapat meningkatkan adhesi, proliferasi, dan diferensiasi sel MC3T3-E1. Eksperimen in vivo lebih lanjut menegaskan bahwa lapisan mikropori titanium tembaga-titanium dioksida dapat mempromosikan osseointegrasi implan titanium. Sebagai kesimpulan, pelapis mikropori tembaga-titanium dioksida dapat dibuat dengan oksidasi mikroarc, yang dapat meningkatkan aktivitas biologis dan biokompatibilitas titanium, mendorong pembentukan tulang baru dan menunjukkan sifat osteoinduktif yang baik. Oleh karena itu, penggunaan pelapis ini dalam ortopedi memiliki aplikasi klinis yang potensial.
Pengantar
Bahan implan jaringan keras medis harus memiliki sifat mekanik yang sesuai, seperti kekuatan, modulus elastisitas, ketahanan aus dan ketahanan lelah, sehingga implan dapat menanggung beban fisiologis area implan untuk waktu yang lama. Pada saat yang sama, bahan tersebut harus memiliki biokompatibilitas dan bahkan bioaktivitas yang baik agar implan dapat membentuk kombinasi yang baik dengan jaringan fisiologis area implantasi tanpa menimbulkan reaksi yang merugikan pada tubuh manusia. Titanium murni dan paduan titanium memiliki sifat mekanik dan biokompatibilitas yang baik dan saat ini merupakan bahan implan logam yang paling banyak digunakan.
Setelah implan ditanamkan, serangkaian reaksi biokimia pertama kali terjadi pada permukaan material, dan karakteristik permukaan memainkan peran penting dalam respons implan terhadap lingkungan internal. Struktur mikro dan komposisi kimia permukaan implan dapat mengubah adsorpsi protein, dan protein mengatur adhesi sel dan pada akhirnya menentukan fungsinya [1]. Meskipun titanium dan paduan titanium adalah bahan implan ortopedi yang paling banyak digunakan, titanium tidak memiliki aktivitas biologis. Setelah implantasi di dalam tubuh, tidak dapat membentuk ikatan kimia dengan jaringan tulang di area implantasi. Titanium dan paduan titanium terutama mengandalkan interlocking mekanis untuk mencapai retensi [2] dan tidak kondusif untuk fungsi fisik jangka panjang di dalam tubuh.
Lapisan permukaan implan titanium dapat melengkapi sifat mekanik titanium dan mengatasi kekurangannya terkait dengan aktivitas biologis yang buruk; yaitu, titanium sebagai substrat dapat memberikan sifat mekanik, dan elemen dengan struktur permukaan dan aktivitas biologis yang baik digunakan sebagai pelapis. Lapisan ini menyediakan aktivitas biologis, dan penelitian di area ini telah menjadi hotspot penelitian.
Saat ini, teknologi yang digunakan untuk pembuatan pelapis bioaktif pada permukaan logam terutama meliputi penyemprotan plasma, deposisi berbantuan sinar ion, deposisi elektroforesis, deposisi uap fisik laser berdenyut, oksidasi mikroarc, deposisi sputtering magnetron, sol-gel, pelapisan laser langsung dan ablasi laser [3,4,5,6,7,8,9,10]. Diantaranya, teknologi penyemprotan plasma memiliki aplikasi komersial; namun, teknologi pelapisan saat ini masih belum dapat memenuhi persyaratan klinis, terutama karena masalah berikut:fase bioaktif pelapis memiliki kristalinitas rendah dan bioaktivitas buruk; kekuatan ikatan antara lapisan dan substrat tidak baik; bahan internal lapisan mudah larut, yang mempengaruhi stabilitas jangka panjang lapisan dalam tubuh; dan proses persiapan pelapisan terlalu rumit, kondisi proses ketat, biaya tinggi, dan efisiensi rendah [11].
Oksidasi busur mikro, teknologi modifikasi permukaan efektif yang saat ini banyak digunakan dalam modifikasi permukaan implan logam, menggunakan efek sintering instan dari suhu tinggi dan tekanan tinggi plasma; permukaan material tidak hanya menghasilkan permukaan yang kasar dan berpori, tetapi elemen biologis aktif juga dapat dimasukkan ke dalam lapisan. Permukaan material yang dimodifikasi oleh teknologi oksidasi busur mikro dapat secara signifikan meningkatkan morfologi permukaan, kekasaran, hidrofobisitas dan energi permukaan material matriks dan sifat fisik dan kimia lainnya sehingga aktivitas biologis dan biokompatibilitas material sangat meningkat. Osseointegrasi antara bahan impor dan jaringan tulang sangat penting [12].
Tembaga (Cu) adalah elemen jejak penting dalam tubuh manusia yang memiliki berbagai fungsi, termasuk mempromosikan pertumbuhan osteoblas dan mempromosikan ekspresi faktor pertumbuhan endotel vaskular di jaringan intima, yang bermanfaat untuk adhesi dan proliferasi endotel vaskular. sel. Cu juga meningkatkan reaksi peroksidasi lipid, menghambat sintesis DNA aktif bakteri dan enzim terkait yang mengganggu metabolisme energi bakteri dan tidak mudah menyebabkan resistensi obat [13]; lebih penting lagi, ion tembaga dalam kisaran konsentrasi tertentu diakui memiliki aktivitas biologis tinggi dan sifat antibakteri yang sangat baik. Oleh karena itu, ion tembaga telah terbukti memiliki biokompatibilitas yang baik ketika digunakan dalam desain biomaterial [14].
Interaksi antara sel dan implan merupakan faktor penting dalam menginduksi pembentukan antarmuka osseointegrasi. Interaksi ini sebagian besar tergantung pada sifat material permukaan implan, seperti komposisi kimia permukaan, energi permukaan, muatan permukaan, dan morfologi permukaan. Interaksi antara sel dan implan ini dapat mempengaruhi adhesi sel, proliferasi dan diferensiasi. Permukaan berpori telah terbukti meningkatkan adhesi sel, proliferasi dan diferensiasi, dan implan yang didoping dengan ion anorganik (seng, strontium, magnesium, dll.) juga telah terbukti mendorong osseointegrasi [15, 16].
Proses peralatan oksidasi busur mikro sederhana, dan sifat lapisan yang disiapkan dapat disesuaikan. Pelapis yang didoping dengan ion yang berbeda dapat dibuat dengan mengubah komposisi elektrolit. Tembaga memainkan peran penting dalam organisme. Jumlah ion tembaga yang tepat dalam lapisan dapat meningkatkan proliferasi osteoblas dan menghambat adhesi bakteri permukaan. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami menyiapkan Cu–TiO2 mikropori2 pelapisan pada permukaan titanium dan digunakan dalam percobaan sel in vitro dan hewan percobaan untuk mengamati dan menganalisis pengaruh Cu–TiO mikro2 pelapisan pada aktivitas permukaan dan biokompatibilitas titanium. Kami juga berusaha untuk mengeksplorasi kelayakan mikropori Cu–TiO2 pelapisan sebagai jenis baru bahan pelapis implan untuk meningkatkan adhesi, proliferasi dan diferensiasi osteogenik sel MC3T3-E1 dan mempromosikan pembentukan dan osseointegrasi tulang baru pada antarmuka tulang implan untuk meletakkan dasar teoretis dan eksperimental untuk aplikasi klinis Cu–TiO berpori mikro2 lapisan pada permukaan implan titanium.
Bahan dan Metode
Persiapan dan Karakterisasi Sampel
Melalui pemotongan kawat, titanium diolah menjadi sampel dengan diameter 12 mm dan ketebalan 1 mm. Implan dibuat menjadi batang titanium dengan diameter 3 mm dan panjang 8 mm. Amplas dihaluskan dan dicuci dengan aseton dan air deionisasi untuk menyiapkan pelapis. Dalam penelitian ini, catu daya oksidasi mikroarc berdaya rendah buatan sendiri digunakan; tegangan oksidasi busur mikro adalah 450 V, mode arus konstan, waktu oksidasi busur mikro adalah 5 mnt, dan frekuensinya 1000 Hz.
Kelompok kontrol kosong diberi label Ti, dan kalsium asetat dan kalsium gliserofosfat digunakan sebagai larutan elektrolit dasar. Sampel Ti setelah oksidasi mikro dalam larutan elektrolit dasar diberi label dengan TCP, dan sampel setelah oksidasi mikro busur dengan kandungan oksida tembaga yang berbeda dalam larutan elektrolit dasar diberi label dengan TCP Cu I dan TCP Cu II (Tabel 1).
Mikroskop elektron pemindaian emisi lapangan (FE-SEM) digunakan untuk mengamati morfologi permukaan sampel, spektroskopi dispersif energi (EDS) digunakan untuk mengamati distribusi elemen pada permukaan pelapis, dan profiler kekasaran permukaan digunakan untuk mengevaluasi kekasaran sampel yang berbeda. Difraksi sinar-X (XRD) dan spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) digunakan untuk mengamati komposisi unsur dan struktur mikro fase pelapisan dan keadaan kimia.
Budaya Sel
Sel MC3T3-E1 (diekstraksi dari sel tengkorak tikus) digunakan untuk pengujian sel in vitro. Sel-sel diinkubasi dalam MEM dengan 10% serum janin sapi pada 37 ℃ dalam 5% CO2 . Ketika sel-sel menyatu dan tumbuh hingga kepadatan 80%, mereka dicerna dan dilewatkan dengan tripsin 0,25%. Bagian ketiga digunakan untuk eksperimen sel.
Pewarnaan Hidup/Mati
Sitotoksisitas masing-masing kelompok dievaluasi dengan pewarnaan fluoresensi hidup / mati. Kepadatan penyemaian sel adalah 1,5 × 10
4
sel/cm
2
. Setelah 3 hari kultur, sampel dibilas dengan PBS steril dan diperlakukan sesuai dengan kit viabilitas/sitotoksisitas hidup/mati. Sitotoksisitas bahan diamati dengan mikroskop fluoresensi.
Adhesi dan Proliferasi Sel
Sel-sel diinokulasi pada permukaan masing-masing kelompok dengan kepadatan 1,5 × 10
4
sel/cm
2
. Setelah diinkubasi selama 1 jam, 2 jam, dan 6 jam, sel dibilas dengan PBS dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 30 menit. Setelah dibilas dengan PBS, 40 L zat pewarna DAPI diteteskan ke permukaan sampel selama 10 menit untuk menghindari pewarnaan ringan, dan sampel diamati dan dicitrakan dengan mikroskop laser confocal.
Kepadatan penyemaian sel dan metode kultur sama seperti di atas, dan aktivitas proliferasi sel diukur dengan CCK-8 kit 1, 3, dan 10 hari setelah kultur sel.
Ekspresi Gen Terkait Diferensiasi Osteogenik
Kepadatan inokulasi sel dan metode kultur sama seperti di atas. Sel dikumpulkan 1, 3, dan 10 hari setelah inokulasi, dan PCR kuantitatif waktu nyata digunakan untuk mendeteksi tingkat mRNA dari gen terkait diferensiasi osteogenik (termasuk BMP , COL-I, ALP dan OCN ). Tingkat ekspresi gen target dinormalisasi dengan gen rumah tangga GAPDH . Set primer tercantum dalam Tabel 2.
Hewan dan Pembedahan
Eksperimen hewan telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional dari Rumah Sakit Rakyat Provinsi Guizhou. Enam belas kelinci dewasa, baik jantan maupun betina, dengan berat 3,6 kg (3,2–3,9 kg) dibeli dari Pusat Hewan Eksperimental Universitas Soochow dan dibagi menjadi kelompok eksperimen dan kelompok kontrol (masing-masing 8 ekor kelinci). Anestesi intravena dilakukan dengan natrium pentobarbital 3% (0,1 mL per kilogram berat badan). Setelah persiapan kulit, kulit difiksasi dan didesinfeksi secara rutin. Sayatan memanjang dibuat di kondilus femoralis lateral untuk mengekspos kondilus lateral. Menggunakan bor listrik bedah, sebuah lubang dengan diameter 2,7 mm dan kedalaman 6 mm dibor pada permukaan yang rata. Dua set batang titanium ditanamkan ke dalam cacat tulang (kiri pada kelompok eksperimen, dan kanan pada kelompok kontrol), dan penisilin diberikan selama 3 hari berturut-turut setelah operasi untuk mencegah infeksi.
Uji Mikro-CT
Setelah operasi, kelinci disimpan di kandang terpisah, dan mereka bebas makan dan minum air. Pada 4 w dan 8 w pasca operasi, 8 kelinci di-eutanasia dengan embolisasi udara. Kondilus femoralis kelinci yang mengandung batang titanium pada kelompok eksperimen dan kelompok kontrol dihilangkan, ukuran sampel dipangkas, sampel difiksasi formalin, dan pemindaian mikro-CT digunakan untuk rekonstruksi tiga dimensi. Region of interest (ROI) ditetapkan menggunakan perangkat lunak Micro-CT, dan fraksi volume tulang dari region of interest (volume tulang/volume total, BV/TV %) diukur.
Evaluasi Histologis dengan Pewarnaan Toluidine Blue dan Fuchsin-Methylene Blue
Sampel didehidrasi dengan alkohol gradien (70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 100%). Sampel dehidrasi yang tertanam dengan metil metakrilat. Setelah penanaman berhasil, sampel dipotong dan dirapikan, difiksasi pada alat pengiris dengan perekat untuk dipotong, dan terakhir dipoles dengan amplas hingga ketebalan irisan kira-kira 20-30 m. (1) Pewarnaan biru toluidin:pewarna biru toluidin ditambahkan ke permukaan irisan, dan irisan dicelup dalam penangas air. Pewarna permukaan dikeringkan dengan kertas saring, dibilas, dan dikeringkan secara alami di udara. Film ditutup rapat dan diamati di bawah mikroskop cahaya. (2) Pewarnaan Fuchsin-methylene blue:metodenya sama dengan pewarnaan toluidine blue. Pertama, larutan pewarnaan metilen biru ditambahkan ke permukaan irisan untuk pewarnaan, dikeringkan di udara dan dibilas. Kemudian, irisan direndam dalam larutan pewarna fuchsin untuk pewarnaan, dikeringkan secara alami di udara, disegel dan diamati.
Analisis statistik
Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi yang ditentukan oleh software SPSS 16.0. ANOVA satu arah dan uji SNK digunakan untuk membandingkan perbedaan antar kelompok. P < 0,05 menunjukkan perbedaan yang signifikan.
Hasil
Morfologi Permukaan, Fasa, dan Komposisi Unsur Kimia Sampel
Gambar 1 menunjukkan morfologi permukaan SEM dari sampel yang berbeda. Morfologi kelompok Ti dan kelompok lainnya berbeda nyata. Kelompok Ti tidak memiliki lubang di permukaan, dan permukaannya relatif datar, hanya menyisakan beberapa goresan. Grup TCP memiliki morfologi permukaan oksidasi mikroarc yang khas, dan permukaannya ditutupi dengan pori-pori mikro dengan ukuran berbeda. Pori-pori mikro ini berpotongan satu sama lain dan memiliki perkiraan "struktur tiga dimensi". Pori-pori besar dan kecil bersarang satu sama lain, dan pori-pori tidak memiliki aturan tetap. Bentuknya tidak beraturan. Selain itu, ada bekas luka bakar di celah di antara lubang. Mirip dengan morfologi permukaan kelompok TCP, permukaan kelompok TCP Cu I dan TCP Cu II juga ditutupi oleh mikropori berbentuk tidak teratur, dan tidak ada perbedaan yang jelas dalam morfologi permukaan antara kelompok. Doping tembaga tidak mempengaruhi struktur dan morfologi mikropori.
Morfologi permukaan Ti, TCP, CP Cu I dan TCP Cu II
Gambar 2 menunjukkan pemetaan dan diagram EDS dari Cu–TiO berpori mikro2 pelapisan Seperti yang terlihat pada diagram EDS, Cu–TiO yang berpori mikro2 pelapis terdiri dari Cu, Ti, Ca, P dan O. Larutan yang mengandung Cu, Ca, dan P sepenuhnya dimasukkan ke dalam pelapis. Lebih penting lagi, kami tidak menemukan unsur beracun dan berbahaya lainnya. Hasil pemetaan mikropori Cu–TiO2 lapisan menunjukkan bahwa tembaga, kalsium dan fosfor tersebar merata di lapisan.
Pemetaan dan diagram EDS dari Cu–TiO2 pelapis (TCP Cu II)
Gambar 3 menunjukkan pola XRD Ti, TCP, TCP Cu I, dan TCP Cu II. Semua pelapis terutama Ti, rutil dan anatase. Lebih penting lagi, CuO muncul di mikropori Cu–TiO2 lapisan, yang menunjukkan bahwa tembaga ada dalam bentuk CuO.
Pola XRD dari Ti, TCP, TCP CuI dan TCP CuII
Gambar 4 adalah gambar XPS dari Cu–TiO yang berpori mikro2 lapisan. Gambar 3a menunjukkan spektrum penuh Cu–TiO berpori mikro2 pelapisan ditentukan dengan spektroskopi fotoelektron sinar-X, yang serupa dengan hasil EDS, kecuali titanium, oksigen, kalsium, dan fosfor. Selain puncak karakteristik tembaga, ada juga puncak karakteristik tembaga. Puncak di Ti2p spektrum sesuai dengan TiO2 , dan puncak Cu2p pada 932,7 eV dianggap sebagai indikasi CuO [17, 18].
Gambar XPS dari Cu-TiO mikro2 lapisan. a Spektrum XPS, b Ti2p , c Cu2p , d Ca2p , e P2p dan f O1s spektrum
Gambar 5 menunjukkan morfologi profilometer dari sampel yang berbeda. Kecuali untuk sampel Ti, morfologi permukaan profilometer dari masing-masing kelompok adalah serupa, yang menunjukkan struktur rongga pori bertingkat seperti vulkanik. Analisis lebih lanjut terhadap kekasaran Ra masing-masing kelompok menunjukkan bahwa kekasaran TCP, TCP CuI dan TCP CuII lebih besar dibandingkan dengan Ti. Kekasaran TCP, TCP CuI dan TCP CuII serupa, dan perbedaannya tidak signifikan, yang menunjukkan bahwa oksidasi busur mikro meningkatkan kekasaran Ti, tetapi doping tembaga tidak mempengaruhi kekasaran sampel.
Morfologi profilometer dari sampel yang berbeda
Adhesi dan Proliferasi Sel
Gambar 6a menunjukkan gambar sel yang melekat pada 1, 2 dan 6 jam setelah pewarnaan dengan DAPI. Gambar 6b jumlah sel MC3T3-E1 yang menempel pada permukaan sampel yang berbeda pada waktu yang berbeda. Jumlah sel yang melekat dalam kelompok sampel yang berbeda pada titik waktu yang berbeda diatur dalam urutan berikut:TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Dibandingkan dengan kelompok Ti dan TCP, jumlah sel yang melekat pada kelompok TCP Cu I dan TCP Cu II meningkat secara signifikan. Oleh karena itu, Cu–TiO2 micro yang berpori mikro pelapis dapat secara signifikan meningkatkan adhesi sel.
Adhesi dan proliferasi sel MC3T3-E1 pada permukaan sampel yang berbeda. a Gambar yang melekat pada sel pada 1, 2 dan 6 jam setelah pewarnaan dengan DAPI, b diagram batang sel yang melekat dan c diagram batang proliferasi sel (Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 5. **p < 0.01 dibandingkan dengan grup TCP)
Gambar 6c menunjukkan proliferasi sel MC3T3-E1 pada permukaan sampel yang berbeda pada waktu yang berbeda. Mirip dengan tren adhesi sel di atas, proliferasi sel dari kelompok TCP Cu I dan TCP Cu II secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok Ti dan TCP. Morfologi permukaan mikropori Cu–TiO2 pelapisan dan ion tembaga bersama-sama mendorong proliferasi sel.
Gambar 7 menunjukkan hasil pewarnaan EdU. Rasio inti EdU-positif mengikuti urutan ini:TCP CuII > TCP CuI > TCP > Ti. Dibandingkan dengan kelompok Ti, proliferasi sel dalam kelompok TCP CuII berbeda secara signifikan.
Pewarnaan EdU diukur setelah 3 hari kultur (Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 5. **p < 0.01 dibandingkan dengan grup TCP)
Pewarnaan Hidup/Mati
Sitokompatibilitas adalah persyaratan dasar bahan implan. Pewarnaan fluoresen hidup/mati dapat mengevaluasi sitotoksisitas dan biokompatibilitas bahan. Gambar 8 menunjukkan hasil pewarnaan sel hidup/mati setelah sel dikultur pada permukaan sampel yang berbeda selama 3 hari. Hanya ada beberapa sel mati (merah) pada permukaan setiap kelompok sampel, menunjukkan tidak ada sitotoksisitas yang jelas. Doping tembaga dalam Cu–TiO berpori mikro2 pelapisan tidak jelas meningkatkan sitotoksisitas, dan memiliki kompatibilitas sel yang baik.
Pewarnaan sel hidup/mati pada permukaan sampel yang berbeda (Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 5. **p < 0.01 dibandingkan dengan grup TCP)
Ekspresi Gen Diferensiasi Osteogenik
Gambar 9 menunjukkan tingkat ekspresi mRNA dari gen diferensiasi osteogenik (BMP , OCN , ALP dan COL-I ) pada sel permukaan setiap kelompok sampel pada titik waktu yang berbeda. Seiring waktu, ekspresi gen diferensiasi osteogenik pada permukaan setiap kelompok sampel secara bertahap meningkat. Pada saat yang sama, ekspresi masing-masing kelompok gen menunjukkan tren berikut:TCP Cu II > TCP Cu I > TCP > Ti. Dibandingkan dengan kelompok Ti dan TCP, ekspresi gen diferensiasi terkait tulang yang terdiri dari TCP Cu I dan TCP Cu II ditingkatkan secara signifikan, menunjukkan bahwa Cu–TiO2 mikropori. pelapisan dapat meningkatkan diferensiasi osteogenik.
Ekspresi mRNA BMP , OCN , ALP dan COL-I setelah 1, 3 dan 10 hari inkubasi (Data disajikan sebagai mean ± SD, n = 5. *p < 0.05 dibandingkan dengan grup TCP, **p < 0.01 dibandingkan dengan grup TCP)
Pengamatan Bruto dan Analisis Mikro-CT
Gambar 10 menunjukkan hasil observasi kasar dan rekonstruksi mikro-CT pada kondilus femoralis. Pengamatan kasar menunjukkan bahwa implan pada kedua kelompok berada di tengah kondilus femoralis pada 4 dan 8 minggu dengan posisi yang baik, tidak ada infeksi yang jelas dan tidak ada implan yang kendur. Rekonstruksi tiga dimensi mikro-CT menunjukkan bahwa seiring waktu, jaringan tulang baru pada permukaan kedua kelompok sampel pada minggu ke-8 lebih besar daripada pada minggu ke-4, dan pada titik waktu yang berbeda, jaringan tulang baru terbentuk di permukaan. dari Cu–TiO yang berpori mikro2 implan titanium berlapis, dan jumlahnya lebih besar dari kelompok kontrol. Dengan membandingkan fraksi volume tulang dari kedua kelompok, fraksi volume tulang (BV/TV) Cu–TiO berpori mikro2 titanium berlapis secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok kontrol kosong. Cu–TiO2 berpori mikro2 -titanium berlapis dapat mempromosikan osseointegrasi implan titanium.
Pengamatan kasar dan rekonstruksi mikro-CT pada kondilus femoralis diamati pada 4 dan 8 minggu setelah implantasi
Evaluasi Histologis
Gambar 11 menunjukkan hasil pewarnaan toluidine blue dan fuchsin-methylene blue. Tidak ada selubung serat yang terlihat pada antarmuka implan tulang, yang menunjukkan bahwa implan titanium tidak memiliki reaksi inflamasi pada antarmuka dengan tulang. Celah putih dapat dilihat pada celah antarmuka tulang implan titanium pada kedua kelompok. Lebar celah putih pada kelompok kontrol lebih besar dari Cu–TiO mikropori2 titanium berlapis. Semakin lebar celahnya, semakin lemah induksi jaringan tulang baru oleh implan. Pewarnaan biru toluidin menunjukkan pita biru pada celah antarmuka tulang implan, yang merupakan tulang baru. Cu–TiO2 berpori mikro2 titanium dilapisi memiliki lebih banyak jaringan tulang daripada kelompok kontrol, menunjukkan bahwa Cu–TiO2 mikro2 pelapisan dapat lebih mempromosikan osteogenesis dan memiliki efek osseointegrasi yang lebih baik. Matriks tulang di sekitar mikropori Cu–TiO2 titanium dilapisi lebih tebal dan terus menerus, dan jaringan tulang meningkat secara signifikan. Sebaliknya, kelompok kontrol memiliki lebih sedikit tulang. Hasil ini menunjukkan bahwa Cu–TiO yang mikro2 titanium yang dilapisi dapat meningkatkan osteogenesis dengan lebih baik dan memiliki efek osseointegrasi yang lebih baik.
Pewarnaan toluidine blue dan fuchsin-methylene blue pada pembentukan tulang baru pada 4 dan 8 minggu setelah implantasi
Diskusi
Titanium logam dan paduannya banyak digunakan dalam kedokteran gigi, bedah plastik, dan bidang lainnya karena sifat mekanik dan biokompatibilitasnya yang sangat baik; namun, titanium sebagai implan hanya dapat digabungkan secara pasif dengan jaringan tulang. Kombinasi ini sering kali merupakan kombinasi mekanis, yang cenderung melonggarkan dan tenggelamnya implan, yang menyebabkan kegagalan implan. Saat ini, metode modifikasi permukaan implan terutama digunakan untuk meningkatkan kemampuan osseointegrasinya [19]. Permukaan implan yang ideal harus memiliki osteokonduktivitas dan osteoinduktivitas, biokompatibilitas yang baik, dan mendorong pembentukan osseointegrasi antara implan dan jaringan tulang [20]. Dalam penelitian ini, kami menyiapkan Cu–TiO2 mikropori yang inovatif2 pelapisan pada permukaan titanium, dengan harapan dapat meningkatkan aktivitas biologis dan biokompatibilitas titanium serta mengatasi kekurangan implan titanium dalam aplikasi klinis saat ini.
Ion tembaga dan titanium dioksida telah terbukti memiliki aktivitas biologis yang baik [21]. Dalam penelitian ini, Cu–TiO2 berpori mikro2 pelapis yang dibuat dengan oksidasi mikro pada permukaan titanium menunjukkan keuntungan terbesar dari ikatan yang erat antara pelapis dan substrat titanium, yang telah dikonfirmasi dalam literatur [22]. Kekuatan ikatan yang baik dari lapisan oksidasi busur mikro sangat erat kaitannya dengan proses pembentukan. Dalam proses oksidasi mikro, oksidasi kimia, oksidasi elektrokimia, dan oksidasi plasma hidup berdampingan. Di bawah aksi suhu tinggi seketika dan tekanan tinggi yang dihasilkan oleh pelepasan busur, permukaan titanium tumbuh di permukaan substrat dengan cara "pertumbuhan", terutama substrat oksida. Lapisan keramik, pelapis, dan gigi taring substrat terhuyung-huyung, dan mereka memiliki kekuatan ikatan yang baik [23].
Karakteristik permukaan bahan biologis secara langsung mempengaruhi karakteristik biologis bahan. Lapisan oksidasi microarc menyajikan morfologi permukaan kasar dan berpori di bawah mikroskop elektron. Morfologinya terutama terdiri dari pori-pori mikro dengan ukuran berbeda yang saling berpenetrasi satu sama lain. Pori-pori kecil ini terbentuk dalam proses oksidasi busur mikro, permukaan logam dipecah di bawah tegangan tinggi, dan sintering suhu tinggi instan di zona busur mikro langsung mengoksidasi dan mensinter matriks titanium menjadi film keramik dengan struktur fase keramik kristal. , di mana gangguan listrik terjadi. Mikropori yang diamati di bawah mikroskop elektron terbentuk. These rough and porous structures can not only increase the attachment area of tissue cells, but these interpenetrating micropores are also equivalent to a three-dimensional scaffold structure, which can induce bone tissue to grow into the pores and promote cell adhesion and extension. Pan et al. [24] prepared micro/nanohierarchical structured TiO2 coatings on polished titanium by micro-arc oxidation and found that the coatings were favorable for the adhesion and extension of MG63 cells. Zhang et al. [25] prepared a Si–TiO2 coating by micro-arc oxidation, and further study showed that the adhesion of MC3T3-E1 cells on this silicon-containing TiO2 coating was significantly higher than that on a Si-free TiO2 coating and pure Ti.
The greatest advantage of the microarc oxidation coating is that the ions in the electrolyte solution can be introduced into the coating during the microarc oxidation process. In this study, the EDS analysis results of the coating surface showed that the microporous Cu–TiO2 coating is mainly composed of Cu, Ca, P, O and Ti elements, of which titanium comes from the matrix, calcium and phosphorus come from the basic electrolyte solution, and the copper ions in the electrolyte are deposited in the coating along with the formation of the ceramic film. The calcium and phosphorus components on the surface of the implant can not only improve the surface properties of the material but also induce bone formation. In addition to calcium and phosphorus, the copper ions in the microporous Cu–TiO2 coating have good biocompatibility and biological activity. Copper-doped coatings on the surface of implants have also been reported in the literature. Astasov-Frauenhoffer et al. [26] deposited copper on Ti via a spark-assisted anodization method and confirmed that the viability of the bacterial cells was strongly inhibited. Zong et al. [27] combined anodization and magnetron sputtering to combine copper into TiO2 nanotubes and prepare copper (Cu) into TiO2 NTAs (Cu–Ti–O NTAs), and further study showed that Cu–Ti–O NTAs have excellent long-term antibacterial ability and favorable angiogenic activity.
Biocompatibility is the minimum requirement for measuring implants and is also the basic guarantee for implant safety. In this study, biologically active copper was introduced into the surface of titanium implants through microarc oxidation; however, copper ions, as heavy metal ions, have potential toxicity. Therefore, we must consider whether the microporous Cu–TiO2 coating is cytotoxic. In this study, live/dead cell staining was used to evaluate the microporous Cu–TiO2 coating. The results showed no obvious cytotoxicity on the surface of the microporous Cu–TiO2 coating on the titanium surface, and good cell compatibility was observed. We speculate that this finding may be related to the low copper content of the coating. Huang et al. [28] fabricated gap-bridging chitosan–gelatin nanocomposite coatings incorporated with different amounts of copper (Cu; 0.01, 0.1, 1, and 10 mM for Cu I, II, III, and IV groups, respectively) on Ti and demonstrated that the activities of bone marrow stromal cells were not impaired on Cu-doped coatings except for the Cu IV group.
Cell adhesion and proliferation are the basis of implant osseointegration in the later stage. The more cells that adhere and proliferate on the surface of the implant, the better the effect of implant-bone interface osseointegration. The results of this study showed that on the first day after the material surface was inoculated, the amount of cell adhesion on the surface of the samples of each group differed, and the amount of adhesion on the surface of the microporous Cu–TiO2 coating group increased significantly. The number of cells that adhered to the sample surface gradually increased, but the number of cells that adhered to the group with microporous Cu–TiO2 coating was significantly greater than that of the other two groups. The difference was statistically significant, indicating that the microporous Cu–TiO2 coating was doped with copper ions. A porous, rough surface is most conducive to cell adhesion. Similar to cell adhesion, cell proliferation on the surface of each group of materials also showed similar results. Our research results are similar to previous reports [29].
In addition to adhesion and proliferation, the degree of cell differentiation on the surface of the material can further reflect the performance of the implant's osseointegration. The osteogenic differentiation marker genes ALP , BMP , RUNX2 , OCN and COL-I can reflect cell differentiation. In this study, as time went by, the expression of BMP, OCN, ALP and COL-I on the surface of each group of samples increased, but the expression of the microporous Cu–TiO2 coating group was significantly higher than that of the control group. This finding is closely related to the promotion of osteogenic differentiation by copper ions. Komarova et al. [30] prepared Zn- and Cu-containing CaP-based coatings by microarc oxidation on Ti and showed that low amounts of Cu and Zn in the coatings promoted high motility of human adipose-derived multipotent mesenchymal stromal cells and subsequent ability to differentiate into osteoblasts.
Osseointegration is the key to the success or failure of the implant. This means that there is no fibrous tissue between the implant and the bone tissue. There is direct contact between the implant and the bone tissue, and it can directly bear stress to realize the relationship between the implant and the bone tissue, establishing a functional connection. The osseointegration between orthopedic implants and bone tissue is affected by many factors, such as the initial stability of the implant and the mechanical properties of the implant material, implant surface properties, biocompatibility, biological activity and the condition of the surrounding bone tissue [31].
An ideal implant position and a stable biomechanical environment are the prerequisite and basis for the osseointegration of the implant-bone interface. In this study, the femoral condyle was chosen to be implanted with a copper-doped microporous coating because the abundant blood supply and sufficient bone volume at the femoral condyle can provide a good anatomical basis and a relatively stable mechanical environment for the implant. Moreover, the femoral condyle is mostly cancellous bone. After implantation, bone formation and the effect of implant-bone interface osseointegration can be more intuitively evaluated.
Micro-CT is currently a common method for observing the osteogenesis performance of implants and is also an effective method for evaluating the osseointegration between implants and bone tissue. Bone microstructure is visualized through three-dimensional reconstruction and the region of interest (ROI) analysis with the assistance of related software to obtain the relevant parameters of new bone tissue. Among all the parameters, BV/TV represents the total amount of bone formation and is an important indicator reflecting the osseointegration of the implant. In this study, we chose BV/TV as the detection index. Four weeks after implantation, the BV/TV of the microporous Cu–TiO2 coating group was higher than that of the control group. Eight weeks after implantation, the BV/TV values of the microporous Cu–TiO2 coating group and the control group were higher than those at 4 weeks, and the BV/TV of the microporous Cu–TiO2 coating group was higher than that of the control group. On the basis of micro-CT detection, we performed histological observation and quantitative analysis of the bone tissue around the implant through hard tissue slices. The results of VG staining showed that the microporous Cu–TiO2 coating group formed more new bone than the control group, and the new bone that formed around it was in direct contact with the internal implant without fibrous tissue infiltration. These results indicate that microporous Cu–TiO2 coating on the titanium surface can promote the osseointegration of titanium implants. This finding is similar to previous in vitro studies. The rough, porous structure produced by microarc oxidation mimics the micro/nanostructure of normal bone tissue. More importantly, biologically active copper ions promote bone tissue regeneration. Under the action of these common factors, bone tissue regeneration on the surface of the implant is promoted. Our research results are consistent with literature reports. Milan et al. [32] designed a multifunctional Cu/a-C:H thin coating deposited on Ti–6Al–4 V alloy (TC4) via magnetron sputtering and found that the coating composition can stimulate angiogenesis and osteogenesis and control the host response, thereby increasing the success rate of implants.
Conclusion
In summary, we prepared a microporous Cu–TiO2 coating on a titanium surface by microarc oxidation. The surface of the coating has a porous structure with pores of different sizes and interconnected pores. The coating increases the surface roughness of Ti and copper is evenly distributed on the surface of the coating. In vitro studies revealed that the coating has no obvious cytotoxicity and can promote the adhesion, proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells. In vivo experiments further confirmed that the coating can induce the formation of new bone tissue and promote osseointegration at the titanium implant-bone interface. In view of the biological activity in vivo and in vitro, we believe that the microporous Cu–TiO2 coating on the surface of titanium implants has potential clinical application value in orthopedics.
