Pelepasan Berturut-turut Penghambat Jaringan Metalloproteinase-1 Melalui Sistem Pengiriman Berbasis Grafena Oksida Dapat Mempromosikan Regenerasi Kulit

Bahan dan Metode

Budaya Sel

Fibroblas tikus dibeli dari Institute of Biochemistry and Cell Biology, CAS (Shanghai, China), dan dibiakkan dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, GibcoBRL, Gaithersburg, MD, USA) yang mengandung 10% (v /v ) serum janin sapi (FBS, Gibco). Media diganti setiap 2 hari. Semua sel disimpan pada suhu 37 °C.

Karakterisasi GO

Serpihan GO dibeli dari Chengdu Organic Chemicals Co., Ltd. Chinese Academy of Science (Chengdu, Cina) dan dikarakterisasi menggunakan pemindaian mikroskop elektron (SEM, JSM-6701F, JEOL, Tokyo, Jepang) setelah pelapisan platinum. Sampel dipindai di bawah mikroskop elektron pemindaian (Hitachi S3000N) pada tegangan percepatan 15 kV. Distribusi ukuran serpihan GO ditentukan dengan spektrofotometer berbasis potensi listrik zeta (Zetasizer 3000 HSA, Malvern, UK). Morfologi serpihan GO ditentukan menggunakan mikroskop kekuatan atom (AFM, MultiMode, VEECO, USA) ditambah dengan mikroskop terbalik (mikroskop terbalik IX71, Olympus, Tokyo, Jepang). Analisis gravimetri termal dan kalorimetri pemindaian diferensial dilakukan menggunakan penganalisis termogravimetri TGA/DSC (Pyris 1 TGA, Perkin-Elmer, USA) dengan menempatkan sampel dalam panci alumina dan menerapkan tanjakan pemanasan dari 25 hingga 1100 °C pada 10 °C/ min.

Adsorpsi TIMP-1 di GO

Serpihan GO diberi label dengan 1,1-dioctadecyl-3,3,3,3-tetram-ethylindocarbocyanine perchlorate (DiI, red, Sigma) sebelum adsorpsi TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, Cina) rekombinan manusia. Untuk adsorpsi TIMP-1, fluorescein isothiocyanate (FITC, green, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)-terkonjugasi TIMP-1 (Huaan Co., Hangzhou, China) dan GO berlabel DiI ditambahkan ke phosphate-buffered saline (PBS). ) dan diinkubasi selama 4 jam pada 4°C. Rasio GO terhadap TIMP-1 rekombinan adalah 1:1 berat. Untuk menentukan pemuatan TIMP-1 pada GO, TIMP-1 (1 μg) ditambahkan ke 20 μl PBS yang mengandung GO dan diinkubasi selama 4 jam pada 4 °C. TIMP-1 yang diadsorpsi ke GO divisualisasikan menggunakan mikroskop confocal pemindaian laser (mikroskop terbalik IX81-FV1000, Olympus). Untuk mengonfirmasi adsorpsi TIMP-1 ke GO, spektroskopi inframerah transformasi Fourier (FTIR) dilakukan menggunakan spektroskopi Nicolet 5700 (ThermoFisher Co., SGE, Australia) pada pelet (berdiameter 10 mm) yang dibuat dengan mencampur 2 mg GO dengan 100 mg KBr dan pengepresan untuk menghasilkan pelet yang akan dianalisis. Spektrum dianalisis setelah koreksi dasar oleh perangkat lunak EZ OMNIC (Nicolet).

Kinetika Pelepasan Protein TIMP-1

Profil pelepasan TIMP-1 dari berbagai konsentrasi GO (10, 20, dan 30 g/ml) ditentukan menggunakan uji imunosorben terkait-enzim manusia TIMP-1 spesifik komersial (ELISAs, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, AMERIKA SERIKAT). Setelah inkubasi selama 4 jam pada 4°C, ELISA supernatan menunjukkan bahwa hampir semua TIMP-1 teradsorpsi di GO. GO yang dimuat TIMP-1 ditangguhkan dalam cawan kultur 60 mm yang berisi 1,5 ml PBS. Cawan kemudian diinkubasi pada suhu 37°C. Pada berbagai titik waktu, supernatan dikumpulkan setelah pengadukan terus menerus dan buffer segar ditambahkan ke cawan kultur. Konsentrasi TIMP-1 manusia dalam supernatan ditentukan dengan ELISA.

GO Biocompatibility Assay

Dua puluh mikrogram per mililiter serpihan GO yang diisi dengan konsentrasi TIMP-1 20 g/ml ditambahkan ke kultur fibroblas tikus, dan sel dikultur selama 6, 24, 48, dan 72 jam. Viabilitas sel dievaluasi dengan menggunakan uji penghitungan sel-8 (CCK8) seperti yang dijelaskan dalam instruksi pabrik. Absorbansi sampel dinyatakan sebagai nilai absorbansi pada 450 nm (n = 5 untuk setiap grup).

Karakterisasi Aliran Sitometrik

Fibroblas dipanen dengan trypsinization dan diberi label dengan Hoechst 33258 dan Annexin-V-FITC/PI. Aktivitas siklus sel dan apoptosis sel selanjutnya ditentukan oleh kit analisis flow cytometry (Lianke, Hangzhou, Cina). Pelabelan dilakukan selama 30 menit pada 4 ° C dengan adanya reagen pemblokiran (Lianke, Hangzhou, Cina), diikuti dengan dua langkah pencucian menggunakan PBS. Setelah mencuci dan memperbaiki, setidaknya 10 ⁴ sel diakuisisi dan dianalisis. Analisis aliran cytometric dilakukan dengan menggunakan Becton Dickinson FACSCanto II.

Eksperimen Dalam Vivo

Semua prosedur eksperimental dilakukan sesuai dengan pedoman NIH di Amerika Serikat. Hewan untuk prosedur eksperimental telah disetujui oleh Komite Etika Universitas Zhejiang. Tikus Sprague-Dawley jantan berumur empat minggu diberikan operasi defek kulit (SDS) seperti yang dijelaskan sebelumnya (Gbr. 4a) [22]. Ukuran defek kulit adalah 10 mm × 10 mm. Setelah operasi, hewan-hewan itu dikembalikan ke kandang masing-masing. Empat belas hari setelah SDS, hewan secara acak dibagi menjadi empat kelompok dan terapi dimulai. Injeksi lokal agen kontrol (hanya 4 ml PBS), agen GO (4 ml GO dengan PBS, 1:20), agen TIMP-1 (4 ml TIMP-1 dengan PBS 1:20), atau agen TIMP-1-GO (4 ml GO dengan TIMP-1, 1:1 v /dengan ) diberikan secara subkutan. Suntikan dilakukan setiap minggu di sekitar cacat kulit (total 4 poin, masing-masing 1 ml) dengan total dua perawatan selama rentang 2 minggu. Tikus dikorbankan 4 minggu setelah operasi (Gbr. 4a). Kulit yang diregenerasi dibedah, dimasukkan ke dalam parafin, dan diperiksa dengan pewarnaan hematoxylin-eosin dan pewarnaan Masson.

Analisis Histologi dan Imunohistokimia

Kulit yang diregenerasi difiksasi dalam formalin 4% selama 72 jam. Kemudian, sampel didekalsifikasi dalam asam format 9% selama 2 minggu pada suhu kamar. Sampel kulit didehidrasi dengan etanol bertingkat. Bagian berturut-turut diwarnai dengan hematoxylin-eosin (HE) dan Masson. Ekspresi CD34 pada defek kulit dianalisis dengan pewarnaan imunohistokimia. Bagian-bagian itu di-dewax dalam xilena dan dihidrasi melalui alkohol bergradasi. Setelah diblokir dengan serum kambing 1% (pengenceran 1:100, Sigma), bagian tersebut diinkubasi dengan antibodi primer terhadap CD34 (Abcam, Cambridge, UK) semalaman pada suhu 4 °C. Setelah dicuci dengan PBS sebanyak tiga kali, bagian tersebut diinkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam pada suhu 37°C. Pewarnaan dikembangkan dengan larutan 3,3′-diaminobenzidine (DAB) (Dako, Hamburg, Jerman). Regenerasi kulit diamati oleh tiga pengamat terlatih. Bagian imunohistokimia dipentaskan menggunakan persentase DBA.

Analisis Statistik

Semua eksperimen diulang tiga kali, dan data disajikan sebagai rata-rata ± standar deviasi. ANOVA satu arah dan uji post hoc Student-Newman-Keuls menentukan tingkat signifikansi. p nilai yang kurang dari 0,05 dan 0,01 masing-masing dianggap signifikan dan sangat signifikan. Analisis statistik dilakukan dengan SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, USA).

Hasil

Karakterisasi GO

Representasi 2D gambar GO ditampilkan di AFM (Gbr. 1a). Sebuah SEM menunjukkan bahwa serpihan GO adalah lembaran berbentuk tidak beraturan (Gbr. 1b). Distribusi ukuran serpihan GO diukur dengan spektrofotometer berbasis potensial listrik. Intensitas distribusi ukuran terbesar adalah 1140 nm, dan volume intensitas terbesar GO adalah 10.674.1 nm (Gbr. 2a).

penyerapan GO. a Representasi 2D dari gambar GO ditampilkan di AFM. b SEM menunjukkan bahwa serpihan GO adalah lembaran berbentuk tidak beraturan. Serpihan GO adalah lembaran berbentuk tidak beraturan. c Distribusi ukuran serpihan GO. Intensitas terbesar adalah 1140 nm dan volume intensitas terbesar adalah 10.674.1 nm

Karakterisasi GO dan TIMP-1-GO. a TIMP-1 diserap ke GO. Analisis mengungkapkan bahwa 75 ± 1,2% GO diserap ke TIMP-1. b Profil rilis kumulatif TIMP-1 dicatat. TIMP-1 yang disematkan di GO mewakili sistem yang sesuai untuk rilis TIMP-1 yang berkepanjangan sekitar 40 hari. c Komposisi kimia antara GO dan TIMP-1-GO diselidiki menggunakan spektroskopi FTIR. Bentuk gelombang dan puncak gelombang GO berbeda nyata dengan TIMP-1-GO. d Kurva analisis gravimetri termal menunjukkan tidak ada perbedaan besar antara GO dan TIMP-1-GO dari 50 hingga 800 °C. Kurva analisis gravimetri termal menunjukkan tidak ada perbedaan yang berarti antara kontrol GO dan TIMP-1-GO

Adsorpsi TIMP-1 di GO

Berikut ini adalah inkubasi TIMP-1 terkonjugasi FITC (hijau) dan GO berlabel DiI (merah) dalam PBS selama 4 jam; TIMP-1 diadsorpsi ke GO. Analisis mengungkapkan bahwa 75 ± 1,2% GO diserap ke TIMP-1 setelah 4 jam, yang menunjukkan bahwa GO secara efisien mengikat protein TIMP-1 (Gbr. 1c). Kami menyelidiki komposisi kimia TIMP-1-GO menggunakan spektroskopi FTIR (Gbr. 2b). Bentuk gelombang dan puncak gelombang GO berbeda nyata dengan TIMP-1-GO. Kami menyelidiki lebih lanjut analisis gravimetri termal antara kontrol GO dan TIMP-1-GO (Gbr. 2d). Kurva analisis gravimetri termal menunjukkan tidak ada perbedaan yang berarti antara kontrol GO dan TIMP-1-GO.

Rilis TIMP-1

Berbagai konsentrasi TIMP-1 (grup 1 3 μg/ml, grup 2 2 μg/ml, dan grup 3 10μg/ml) dimuat ke GO. Profil rilis kumulatif TIMP-1 ditunjukkan pada Gambar. 2c. Pelepasan TIMP-1-GO 2 μg/ml mencapai pelepasan kumulatif 50% lebih cepat dibandingkan dengan dosis TIMP-1 10 dan 30 μg/ml. TIMP-1 terus dirilis selama sekitar 40 hari. Hal ini menunjukkan bahwa penerapan TIMP-1 yang disematkan di GO dapat mewakili sistem yang sesuai untuk rilis TIMP-1 yang berkepanjangan (Gbr. 2c).

Proliferasi dan Viabilitas Sel di TIMP-1-GO

Proliferasi dan viabilitas fibroblas tikus yang dikultur dalam kontrol, GO dan TIMP-1, tidak jauh berbeda dari sel yang ditumbuhkan dalam sampel TIMP-1-GO yang berbeda (p> 0,05). Siklus sel dan apoptosis fibroblas yang dikultur dalam kontrol, GO dan TIMP-1, tidak jauh berbeda dari sel yang ditumbuhkan dalam sampel TIMP-1-GO (p> 0,05) (Gbr. 3a–c).

Pengaruh TIMP-1-GO pada proliferasi dan viabilitas sel fibroblas tikus. a Viabilitas fibroblas yang dikultur dalam kelompok yang berbeda tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan pada titik waktu yang berbeda (p> 0,05). b Siklus sel fibroblas tidak berbeda secara signifikan dibandingkan dengan sel yang tumbuh pada kelompok yang berbeda (p> 0,05). c Apoptosis sel fibroblas tidak berbeda secara signifikan dengan sel yang tumbuh pada kelompok yang berbeda (p> 0,05)

Efikasi TIMP-1-GO dalam Model Luka Kulit Eksisi

TIMP-1-GO diberikan secara subkutan pada tikus untuk menentukan apakah itu dapat meningkatkan penyembuhan luka percobaan. Empat minggu setelah operasi, dibandingkan dengan kelompok kontrol, kelainan kulit yang diobati dengan TIMP-1-GO menunjukkan perbedaan yang signifikan pada titik terminal (p < 0,05), sedangkan kelainan kulit yang diobati dengan TIMP-1 menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol dan kelompok GO pada titik terminal (p < 0,05). Selanjutnya, kelompok TIMP-1-GO menunjukkan efek terapeutik yang ditingkatkan dalam regenerasi folikel rambut (p < 0,05). Cacat kulit yang diobati dengan TIMP-1 menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol dan kelompok GO pada titik terminal (p < 0,05) (Gbr. 4b).

Percobaan in vivo. a Skema dan SDS dan model. b Analisis histologis dan imunohistokimia in vivo (1 cm). Serat kolagen kontinu terlihat pada kelompok TIMP-1-GO. c Penilaian kuantitatif mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara kontrol dan GO dibandingkan dengan TIMP-1 dan TIMP-1-GO (p < 0,05). Folikel rambut dari kelompok yang berbeda berbeda secara signifikan (p < 0,05). Cacat kulit yang diobati dengan TIMP-1 menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan kelompok kontrol dan kelompok GO secara semi-kuantitatif (p < 0,05)

Analisis Histologi dan Imunohistokimia

Gambaran histologis regenerasi kulit setelah perawatan dengan PBS ditampilkan pada Gambar 4b. Gambaran pada kelompok kontrol setelah cacat kulit menunjukkan serat kolagen rusak yang terlihat pada spesimen 4 minggu setelah perawatan. Sebaliknya, serat kolagen kontinu terlihat pada kelompok TIMP-1-GO pada titik waktu yang sama dan menunjukkan perbedaan statistik dibandingkan dengan kelompok kontrol. Fitur imunohistokimia vaskularisasi setelah pengobatan TIMP-1-GO ditampilkan pada Gambar. 3c. Sel subkutan CD34+ terlihat pada spesimen setelah 4 minggu pada kelompok yang diobati dengan TIMP-1-GO. Penilaian kuantitatif mengungkapkan perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol dan kelompok perlakuan TIMP-1-GO (p < 0,05) (Gbr. 4c).

Diskusi

Dalam penelitian ini, kami telah menganalisis pendekatan baru yang potensial untuk meningkatkan perbaikan luka eksisi dengan menggabungkan protein TIMP-1 rekombinan dengan pelepasan terkontrol dari GO. GO telah menunjukkan biokompatibilitas yang baik secara in vitro. Dan TIMP-1 terbukti terus dirilis dari kendaraan GO hingga 40 hari. Kombinasi TIMP-1 dengan GO terbukti meningkatkan vaskularisasi dan regenerasi kolagen dalam model cacat kulit eksperimental.

Berbagai bahan biomedis telah dievaluasi sebagai sarana terapi untuk pengiriman agen dalam regenerasi jaringan. Kendaraan seperti kolagen, sutra, titanium, semen kalsium fosfat, dan asam polilaktat-asam poliglikolat cenderung menghasilkan pelepasan cepat agen biologis yang mungkin tidak diinginkan dalam beberapa pengaturan terapi [23]. Oleh karena itu, kemampuan vektor biomedis untuk memberikan pelepasan molekul biologis yang terus menerus secara lambat dapat dilihat sebagai fitur penting. Persyaratan kualitas ini adalah fleksibel yang digunakan untuk memuat obat dengan bantuan muatan listrik [24]. Graphene oxide (GO) memberikan efek "off-start" yang telah menunjukkan kegunaan untuk pelepasan lambat berbagai agen biologis baik in vitro dan in vivo [25,26,27]. Di sini, kami menunjukkan bahwa GO dapat digunakan untuk mengerahkan pelepasan berkelanjutan protein TIMP-1 manusia rekombinan. Interaksi antara hidrofobik π domain GO dan interaksi elektrostatik dapat mengaktifkan domain GO yang bermuatan negatif dan memungkinkan penyerapan protein TIMP-1 yang efisien ke GO melalui daerah hidrofobik bagian dalam. Pelepasan panjang TIMP-1 dari GO sangat ideal untuk revaskularisasi yang diperlukan dalam perbaikan luka dermal.

Disarankan bahwa partikel karbon dengan konsentrasi lebih dari 50 mg/ml mungkin disimpan dalam jaringan [28]. Wang dkk. menyarankan bahwa ini dapat menyebabkan reaksi inflamasi karena diameternya yang sangat kecil namun area permukaan fungsional GO yang besar [29]. Berbeda dengan penelitian sebelumnya, deposisi GO tidak terdeteksi dalam penelitian kami. Mengingat kurangnya efek samping yang terlihat di sini, potensi negatif nanopartikel GO tidak dapat didukung. Studi lebih lanjut telah menyarankan pada graphene termasuk respon biologis dan uji keamanan [30].

Penelitian tentang pengaruh interaksi oksida graphene pada sel merupakan isu penting. Grafena adalah bahan biomedis yang baru dikembangkan yang sifat-sifatnya menunjukkan penggunaannya dalam banyak aplikasi biologis. Namun, potensi biologi struktur karbon dua dimensi/toksikologi graphene dan interaksi biologis umum tidak sepenuhnya dipahami, yang akan memerlukan studi tambahan yang ekstensif.

Kesimpulan

Graphene oxide (GO) menunjukkan biokompatibilitas berkelanjutan ketika digunakan sebagai kendaraan untuk pengiriman TIMP-1 rekombinan yang lambat. TIMP-1 terbukti terus dilepaskan dari GO hingga 40 hari, dan kombinasi TIMP-1 dengan GO terbukti mendorong revaskularisasi dan regenerasi kolagen dalam model regenerasi kulit.

Charge Spliting In Situ Recorder (CSIR) untuk Pemeriksaan Real-Time Efek Pengisian Plasma dalam Proses FinFET BEOL Mengontrol Pertumbuhan Kawat Nano Indium Selenide (In2Se3) Keseragaman Tinggi melalui Proses Anil Termal Cepat pada Suhu Rendah