Nanopartikel Fosfor Hitum Meningkatkan Diferensiasi Osteogenik Sel Stem Mesenkimal Ektoder melalui Regulasi Naik TG2

Abstrak

Nanopartikel fosfor hitum (BP) pada konsentrasi bio-aman mengaktifkan transglutaminase 2 (TG2) dan mengupregulasi komponen matriks ekstraseluler (ECM), sehingga mempercepat diferensiasi osteogenik sel stem mesenkimal ektoder (EMSC). BP menunjukkan kompatibilitas biologis dan biodegradabilitas yang baik, menjadikannya aditif yang menjanjikan untuk rangka teknusi jaringan tulang. In vitro, BP (2–4 µg mL⁻¹) secara signifikant meningkatkan penanda osteogenik (RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2) tanpa mempengaruhi proliferasi. Penghambatan TG2 membatalkan efek ini, mengonfirmasi mekanisme yang bergantung pada TG2. Temuan ini mendukung potensi klinis BP dalam strategi regenerasi tulang.

Pendahuluan

Perbaikan tulang yang efektif memerlukan material yang osteokonduktif, osteoinduktif, dan osteointegratif. Autograft dan allograft tradisional memiliki ketersediaan yang terbatas dan membawa risiko infeksi. Perkembangan terbaru dalam biomaterial—terutama keramik pelepasan ion dan polimer bioaktif—telah meningkatkan hasil, namun material yang secara alami menyediakan fosfat dan mempromosikan mineralisasi masih sulit ditemukan.

Fosfor hitum (BP), alotrop dua dimensi berlapis, telah menarik perhatian karena jarak band yang dapat disesuaikan, mobilitas penangkap yang tinggi, dan biodegradasi yang cepat menjadi ion fosfat yang tidak berbahaya. Pekerjaan sebelumnya telah menunjukkan bahwa nanosheet BP meningkatkan mineralisasi dengan menyediakan donor fosfat, namun mekanisme seluler masih kurang dipahami. Sel stem mesenkimal ektoder (EMSC), yang diambil dari selang hidung dewasa, menawarkan sumber sel multipotent yang mudah diakses dan non-invasif yang mampu diferensiasi osteogenik.

Kami menyelidiki apakah BP dapat berfungsi sebagai pemicu osteoinduktif untuk EMSC dan mendelineasikan jalur yang mendasarinya, dengan fokus pada TG2—enzim kunci yang bersilang protein ECM dan mengatur diferensiasi osteoblast.

Bahan dan Metode

Persiapan Nanopartikel Fosfor Hitum

BP bulk (20 mg) disperse dalam NaOH/NMP terpuas, dihaluskan secara mekanis, dan di-sonikasi (6 jam) dalam mandi es. Setelah difilter (100 µm) dan difugenasi kecepatan tinggi (13.000 rpm, 10 menit, 4 °C), suspensi BP stabil diperoleh. Ukuran partikel (132 nm) dan potensial zeta (−23,7 mV) dikonfirmasi oleh DLS; SEM mengonfirmasi morfologi lembar 100–150 nm. Spektra Raman dan XRD memverifikasi kemurnian fasa BP.

Isolasi dan Kulture EMSC

Tikus Sprague-Dawley dewasa dianesteshi, dan mucosa septa hidung diambil. Jaringan didigesti (0,25 % tripsin, 37 °C, 25 menit) dan dilewatkan melalui saringan 100 µm. Sel diperluas dalam DMEM/F12 + 10 % FBS, 100 U mL⁻¹ penitsilin, 100 µg mL⁻¹ streptomisin. Sel Paragraf 3 digunakan untuk semua uji; imunofluoresensi mengonfirmasi >95 % ekspresi nestin dan vimentin.

Diferensiasi Osteogenik

EMSC ditanam pada 3.000 sel cm⁻² dan diinduksi dengan medium osteogenik (10 % FBS, 0,1 mM deksametason, 0,2 mM asam askorbat) selama 14 hari (tanpa β-glicerofosfat untuk menghindari kebingungan). Staining fosfat alkali (ALP) dan Alizarin Red S (ARS) menilai diferensiasi awal dan akhir, masing-masing. RT-qPCR mengukur RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 pada hari 7 dan 14.

Viabilitas dan Proliferasi Sel

Assay CCK-8 mengevaluasi toksisitas BP (0–512 µg mL⁻¹) setelah 24 jam. Staining Ki-67 mengukur proliferasi. Konsentrasi ≤32 µg mL⁻¹ tidak sitotoksik; 2 dan 4 µg mL⁻¹ dipilih untuk studi fungsional.

Studi Mekanisme

Western blotting mengukur TG2, fibronectin (FN), laminin (LN), OCN, OPN, COL-I. Antibodi neutralizing TG2 (10 µg mL⁻¹) diterapkan untuk mengonfirmasi terlibatnya jalur. Analisis statistik menggunakan uji t Student dan ANOVA (p < 0,05). Semua eksperimen dilakukan secara triplik.

Hasil

Karakterisasi BP

DLS menunjukkan distribusi ukuran yang sempit (100–200 nm, puncak 132 nm). Potensial zeta −23,7 mV mengonfirmasi stabilitas koloid. Gambar SEM cocok dengan data DLS. Puncak Raman pada 362,3, 438,5, 466,9 cm⁻¹ mengonfirmasi struktur BP; XRD menunjukkan ukuran kristal rata-rata 102,7 nm.

Fenotipe EMSC

Imunofluoresensi mucosa hidung mengungkapkan sel nestin⁺ dalam lamina propria. EMSC Paragraf 3 menampilkan morfologi fibroblastic dan >95 % positif nestin/vimentin. Di bawah induksi osteogenik, staining ARS menunjukkan deposit mineral pada hari 28; induksi adipogenik menghasilkan staining Oil Red O pada hari 21.

Biocompatibilitas

Assay CCK-8 menunjukkan tidak ada kehilangan viabilitas yang signifikan hingga 32 µg mL⁻¹. Staining Ki-67 mengonfirmasi proliferasi yang tidak berubah pada 2 dan 4 µg mL⁻¹.

Peningkatan Osteogenik oleh BP

Staining ARS menunjukkan nodul kalsium yang lebih besar dan lebih teratur pada grup 2 dan 4 µg mL⁻¹ dibandingkan kontrol (p < 0,05). Aktivitas ALP meningkat pada hari 7 dalam sel yang diperlakukan BP (p > 0,05 antara 2 vs 4 µg mL⁻¹). RT-qPCR menunjukkan regulasi naik yang signifikan RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 pada hari 14 dalam grup BP (p < 0,01).

Mekanisme Bergantung pada TG2

Western blotting menunjukkan peningkatan sekitar 2 kali TG2 seluler dan ekstraseluler dalam sel yang diperlakukan BP. FN dan LN juga meningkat. Neutralisasi TG2 membatalkan deposit ARS, aktivitas ALP, dan ekspresi OCN, OPN, COL-I yang diinduksi BP. Data ini mengonfirmasi bahwa BP mempromosikan osteogenesis melalui regulasi naik TG2 dan pengorganisasian ECM.

Pembahasan

Studi kami menunjukkan bahwa BP aman diintegrasikan ke dalam millieu osteogenik EMSC pada konsentrasi di bawah 32 µg mL⁻¹. Nanopartikel ini menyediakan sumber fosfat yang cepat, memfasilitasi mineralisasi, sementara secara bersamaan mengaktifkan TG2—enzim multifungsi yang bersilang protein ECM dan memodulasi sinyal integrin. Enrichment ECM yang dihasilkan (FN, LN, COL-I) kemungkinan meningkatkan interaksi sel-matriks, yang lebih mendorong komitmen osteogenik. Temuan ini selaras dengan laporan sebelumnya bahwa nanomaterial BP mempercepat perbaikan tulang dengan menyampaikan ion fosfat dan merangsang aktivitas osteoblast.

Meskipun kerentanan BP terhadap oksidasi dapat membatasi stabilitas, biodegradasi yang cepat menjadi fosfat yang tidak berbahaya mengurangi risiko akumulasi jangka panjang. Meskipun demikian, studi in vivo diperlukan untuk mengonfirmasi keamanan dan efikasi dalam model hewan dan untuk mengoptimalkan desain rangka untuk translasi klinis.

Kesimpulan

Nanopartikel fosfor hitum, yang dihasilkan melalui proses grinding-ultrasonik yang dapat diskalakan, secara aman meningkatkan diferensiasi osteogenik yang dimediasi TG2 dari EMSC in vitro. Hasil ini mendukung pengintegrasiannya ke dalam rangka tulang yang dirancang teknusi jaringan. Kerja prklinis di masa depan harus mengevaluasi farmakokinetik, distribusi biodaya, dan hasil terapeutik dalam model cacat tulang.

Ketersediaan Data dan Bahan

Data tersedia dari penulis tanggung jawab atas permintaan yang wajar.