Akhir-akhir ini, sistem pengiriman obat untuk obat kanker, terutama sistem pengiriman obat berbasis GO, telah menjadi berkah bagi pasien kanker. Dalam studi ini, kami memilih Tau untuk fungsionalisasi permukaan GO untuk meningkatkan kompatibilitas biologisnya. Pertama, GO skala nano disintesis dengan metode Hummer yang dimodifikasi dan metode stripping ultrasonik. Pembawa grafen oksida modifikasi taurin (Tau-GO) disintesis dengan metode kimia untuk mendapatkan Tau-GO yang memiliki disperansi dan stabilitas yang baik dalam air, dengan potensial zeta − 38,8 mV dan ukuran partikel 242 nm. Berdasarkan kriteria evaluasi efisiensi enkapsulasi, formulasi optimal ditentukan untuk menggabungkan Tau-GO dan 5-FU melalui ikatan non-kovalen. 5-FU-Tau-GO lebih stabil dalam lingkungan netral dibandingkan lingkungan asam, dan memiliki respons pH serta efek pelarutan berkelanjutan. Dalam tubuh, kami membandingkan pengiriman oral dan intravena 5-FU dan 5-FU-Tau-GO, masing-masing, menggunakan uji farmakokinetika dan parameter terkait dan menunjukkan bahwa pengiriman oral atau intravena 5-FU-Tau-GO mempertahankan waktu kerja 5-FU dalam tubuh dan meningkatkan bioavailabilitasnya. Selain itu, inhibisi sel HepG2 yang diukur dengan uji MTT, menunjukkan bahwa nilai IC50 dari 5-FU adalah 196 ± 8,73 μg/mL, dan nilai IC50 dari 5-FU-Tau-GO adalah 65,2 ± 0,7 μg/mL, mengindikasikan bahwa 5-FU-Tau-GO lebih efektif terhadap sel HepG2 dan memiliki efek inhibisi yang lebih kuat pada sel kanker. Efek pada morfologi sel yang diukur dengan pewarnaan AO/EB juga menunjukkan bahwa 5-FU-Tau-GO tidak hanya merusak sel, tetapi juga secara signifikan menginduksi apoptosis dibandingkan 5-FU. Kami juga memverifikasi dengan desain assisted by computer bahwa Tau-GO dapat terikat lebih baik ke 5-FU daripada GO yang tidak dimodifikasi, dan bahwa sistem 5-FU-Tau-GO yang terbentuk lebih stabil, dan mendukung transfer dan pelarutan 5-FU dalam tubuh.
Pendahuluan
Terapi kimia masih merupakan metode umum yang digunakan dalam pengobatan berbagai kanker [1]. Hambatan signifikan dari sebagian besar agen terapi kimia adalah ketidakmampuan mereka untuk menembusi jaringan tumor pada konsentrasi yang efektif, atau efek samping yang tidak diinginkan pada jaringan normal [2]. Oleh karena itu, ilmuwan telah berkonsentrasi pada pengembangan sistem pengiriman obat yang efektif yang dapat mencapai laju pelarutan obat yang terkontrol dalam jaringan tumor untuk memastikan pengiriman obat dan terapi yang efektif.
Banyak bahan berukuran nano termasuk liposom [3], polimer [4], nanopartikel [5], dendrimer [6], miksel [7], dan grafen oksida [8, 9] telah dikembangkan untuk pengiriman berbagai obat. Di antara nanomaterial ini, grafen oksida (GO) adalah nanomaterial karbon baru yang dioksidasi dari grafit dan menunjukkan beberapa properti fisik dan kimia yang menarik, seperti grup fungsional yang melimpah, luas permukaan spesifik yang besar, muatan obat yang tinggi, dan kemampuan dispersi yang baik dalam air [10,11,12]. Selain itu, sebagian besar hasil eksperimen in vitro menunjukkan bahwa konsentrasi GO yang rendah dapat digunakan sebagai substrat untuk pertumbuhan sel dan untuk mengaktifkan sel imun. Oleh karena itu, GO telah digunakan secara luas dalam diagnosis penyakit [13], citra dan pelacakan sel kanker [14], terapi fototermal kanker [15], rekayasa jaringan [16], pengiriman obat terarah [17], dan terutama, sebagai pembawa obat anti-tumor [18, 19]. Namun, beberapa kelompok penelitian telah melaporkan bahwa konsentrasi GO yang tinggi memiliki efek sitotoksik yang jelas dalam studi preklinis dan klinis. Mekanisme dengan GO menghasilkan efek toksik dalam tubuh adalah melalui stres oksidatif dan produksi berlebihan spesies reaktif oksigen seluler, menginduksi apoptosis sel dan menyebabkan peradangan yang parah, edema paru-paru, dan pembentukan granuloma [20]. Oleh karena itu, sangat penting untuk mengatasi masalah toksisitas GO.
Terpelaporkan, fungsionalisasi ikatan kovalen atau non-kovalen dapat mengurangi interaksi hidrofobik yang kuat antara GO dan sel. Ini telah divisualisasikan oleh beberapa studi yang menunjukkan bahwa fungsionalisasi GO meningkatkan kompatibilitas biologisnya dan hampir menghilangkan toksisitasnya in vivo dan in vitro. Yang et al. mempelajari, untuk pertama kalinya, distribusi biodistribusi jangka panjang dari PEG-GO yang dikonjugasi kovalen dalam tikus menggunakan metode radiolabeling, dan hasilnya menunjukkan bahwa PEG-GO dapat gradualmente diekskresi dari tikus, kemungkinan dalam urine dan feses [21]. Zhang et al. membandingkan GO fungsionalis DEX dengan GO dan menemukan bahwa GO-DEX dapat secara signifikan mengurangi toksisitas sel dan sebagian besar dibersihkan dari tikus dalam seminggu [22]. Selain ini, ikatan non-kovalen GO dengan pluronic F127 menghasilkan keberlanjutan dan stabilitas yang baik dalam kondisi fisiologis, dan toksisitas rendah [23]. Meskipun beberapa polimer atau molekul telah digunakan untuk fungsionalisasi GO, hasil yang signifikan telah dicapai dalam bidang ini. Namun, upaya masih diperlukan untuk mengembangkan metode sederhana untuk konstruksi pembawa obat berbasis GO yang kompatibel biologis yang baik.
Taurin (Tau) adalah asam amino semi-esensial dengan stabilitas dan keterlarutan air yang baik. Tau dapat mencegah penyakit jantung dan pembuluh darah, memelihara fungsi visual, melindungi sel, dan mengatur keimunan. Banyak studi telah mengusulkan bahwa Tau memiliki properti anti-tumor melalui regulasi naik atau turunnya ekspresi faktor yang memainkan peran penting dalam berbagai kanker, termasuk kanker paru-paru, lambung, kolorektal, dan payudara [24]. Oleh karena itu, GO fungsionalis Tau dapat berperan yang unggul sebagai pembawa obat anti-tumor. Dalam artikel ini, kami menggunakan, untuk pertama kalinya, GO fungsionalis kovalen Tau sebagai nanokarrier dan mengevaluasi sitotoksisitasnya in vitro. Selanjutnya, 5-fluorouracil (5-FU) digunakan sebagai obat antikanker yang dimuat non-kovalen pada permukaan Tau-GO untuk membangun sistem pengiriman obat. 5-FU-Tau-GO tidak hanya dapat mengurangi efek samping pada jaringan normal tetapi juga meningkatkan bioavailabilitas obat. Akibatnya, Tau-GO berhasil dikembangkan sebagai nanomaterial berbasis GO baru yang dapat memiliki aplikasi biomedis yang signifikan di masa depan.
Eksperimen dan Metode
Bahan
Bubuk grafit, buffered saline fosfat (PBS) dan dimetil sulfoksida (DMSO) dibeli dari Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Karbodiimida (EDC), N-hidroksisuccinimida (NHS), asam klorida (HCl) dan peroksida hidrogen (H2O2 30%) dibeli dari Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurin (Tau), 5-fluorouracil (5-FU), sel hepatoma manusia (HepG2), larutan penicilin–streptosim dan serum fetus sapi (FBS) dibeli dari Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; asam sulfat (H2SO4 98%) dan permanganat kalium (KMnO4) dibeli dari Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; nitrat natrium (NaNO3) dan lauril sulfat natrium (SDS-Na) dibeli dari Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT dibeli dari Sigma-Aldrich, Inc; DMEM dibeli dari HyClone, Inc; Tikus dibeli dari Benxi Changsheng Experimental Animal Center. Semua reagen dan kimia lainnya adalah kelas analitik dan tersedia secara komersial.
Sintesis GO
GO disiapkan dari bubuk grafit sesuai dengan metode Hummer yang dimodifikasi. Pertama, 168 mL asam sulfat 98% ditambahkan sepanjang dinding kolong leher tiga yang ditempatkan dalam mandi es dengan termometer, dan 5 g grafit serta 4 g nitrat natrium ditambahkan ketika suhu mencapai 5 °C. Kemudian, 22,5 g permanganat kalium ditambahkan secara bertahap selama 1 jam dan suhu dipertahankan di bawah 5 °C. Setelah itu, kolong leher tiga dipindahkan ke mandi minyak dan larutan yang dihasilkan bereaksi pada 35 °C selama 30 menit, kemudian suhu ditingkatkan ke 65 °C dan reaksi diaduk selama 30 menit. Berikutnya, suhu ditingkatkan ke 85 °C dan larutan bereaksi lebih lanjut selama 1 jam untuk menghasilkan pasta ungu-koklat. Larutan ini dibiarkan berdiri pada suhu ruangan selama 1 minggu, dipindahkan ke gelas dengan 700 mL air panas, dan peroksida hidrogen 30% ditambahkan secara titik hingga menjadi warna coklat keemasan. Larutan diusap pada 10.000 rpm, dicuci dengan air panas, dan proses ini diulang beberapa kali hingga pH surnat adalah 7,0. Akhirnya, produk dikeringkan dalam freeze dryer vakum dan GO nano diperoleh.
Sintesis Tau-GO
Tepat 50 mg GO ditimbang dengan akurat dilarutkan dalam 50 mL air tisu, dan 150 mg EDC dan 100 mg NHS ditambahkan untuk mengaktifkan GO melalui ultrasonikasi dalam mandi air es selama 20 min. Selanjutnya, 10 mL larutan air Tau (0,1 g/mL) ditambahkan secara lambat (titik) ke dalam larutan air GO yang disiapkan, dan pH disesuaikan ke 6–7 oleh HCl dan terus diaduk selama 24 jam pada suhu ruangan dalam kegelapan. Produk dikumpulkan dengan usap pada 5000 rpm selama 10 menit dan dicuci 3 kali dengan air tisu. Tau-GO dikumpulkan setelah freeze drying.
Pemuatan 5-FU
Jumlah 20 ml larutan Tau-GO diultrasonikasi selama 2 jam. Jumlah 5-FU yang ditimbang dengan akurat dilarutkan dalam jumlah air tisu yang sesuai, dan ditambahkan secara lambat titik ke larutan Tau-GO yang disiapkan dengan pengadukan pada suhu ruangan, kemudian diultrasonik pada 30 °C dalam kegelapan selama 1,5 jam. Produk diusap pada 5000 rpm selama 10 menit pada 4 °C. Endapan bawah dicuci dengan 20 mL air tisu dan diusap (5000 rpm selama 10 menit pada 4 °C), dan proses diulang 3 kali. Lapisan bawah di-freeze-dried, surnat ditempatkan dalam gelas, diukur volumenya, konsentrasi 5-FU ditentukan oleh HPLC 1200 (Agilent, AS). Kondisi deteksi adalah sebagai berikut: kolom kromatografi: C18 (4,6 × 250 nm, 5 μm); suhu kolom: 25 °C; fasa seluler: larutan KH2PO4 0,1% dengan pH 5,5; laju aliran: 1,0 mL/min; volume injeksi: 20μL; dan panjang gelombang pengukuran: 265 nm. Rasio enkapsulasi (EE) dan efisiensi pemuatan obat (LE) diperoleh dengan rumus berikut:
Total dosis 5-FU dicatat sebagai M1, konsentrasi dan volume 5-FU bebas dicatat sebagai C1 dan L1, dan konsentrasi pembawa dicatat sebagai C0.
Karakterisasi
Untuk mengkarakterisasi nanokomposit yang disiapkan, spektrum inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dipindai dari 4000 hingga 400 cm⁻¹ pada spektrometer IRAffinity-1 (Shimadzu, Jepang) untuk mengonfirmasi interaksi. Spektrum penyerapan UV–vis direkam pada UV-3600 Scanning Spectrophotometer (Shimadzu, Jepang). Sampel dilarutkan dalam air tisu dan ukuran partikel, potensial zeta, dan nilai PDI diperoleh pada Nano-ZS 90 Nano instrument (Malvern, Inggris). Morfologi sampel dianalisis menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-2100 (TEM) (JEOL, Jepang). Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan menggunakan analyzer termogravimetri (NETZSCH, Jerman) dengan laju pemanasan 10 °C/min dari 0 hingga 800 °C dalam suasana nitrogen. Pengukuran XRD sampel dilakukan oleh difraktometer sinar X (Bruker, Jerman) dengan radiasi CuKα (λ = 1,5406 Å) dalam sudut lebar dengan sudut 2θ. Pengukuran XPS dilakukan menggunakan Omicron ESCA Probe dengan monokromasi Al Karadiation (Thermo, AS).
Peluaran Obat In Vitro
Peluaran obat in vitro dilakukan pada pH 1,2 (lingkungan lambung simulasi), pH 6,5 (lingkungan sel kanker hati simulasi) dan pH 7,4 (lingkungan fisiologis simulasi) pada 37 °C (suhu tubuh simulasi), masing-masing. Secara singkat, 15 mg 5-FU-Tau-GO ditempatkan dalam membran dihalisis, direndam dalam 50 mL larutan buffer yang berisi SDS-Na 0,1% dengan pH 1,2, 6,5 dan 7,4. Semua sampel ditempatkan dalam mandi air bergetar terus menerus dengan kecepatan 100 rpm dan suhu 37 °C. Pada titik waktu yang ditentukan (0 menit, 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit, 1 jam, 1,5 jam, 2 jam, 2,5 jam, 3 jam, 4 jam, 8 jam, 12 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam), 1 mL dari setiap sampel diambil dan diganti dengan 1 mL larutan buffer segar yang berisi SDS-Na 0,1% untuk mempertahankan volume yang sama dari medium pelarutan. Medium yang dilepaskan diusap dan dianalisis menggunakan HPLC 1200.
Studi Sitotoksisitas In Vitro
Uji MTT
Uji MTT digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas 5-FU, Tau-GO, dan 5-FU-Tau-GO. Secara singkat, sel hepatoma manusia HepG2 dikultur dalam medium DEME, dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% antibiotik (larutan penicilin–streptosim) pada 37 °C dalam atmosfer lembap 5% CO2. Sel ditanam pada plate 96-lubang dengan densitas 5 × 10³ sel per lubang yang berisi 100 μL medium DEME, dilengkapi dengan FBS dan antibiotik. Plate ditempatkan selama 24 jam dalam ruangan lembap 37 °C yang berisi 5% CO2. Setelah itu, medium pertumbuhan dikeluarkan dan diisi ulang dengan 100 μL medium segar yang berisi konsentrasi berbeda (5, 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 μg/ml) dari 5-FU, Tau-GO, 5-FU-Tau-GO, masing-masing. Setelah inkubasi 24 jam, sel diperlakukan dengan 20 μL larutan MTT dan diinkubasi lebih lanjut selama 4 jam. Selanjutnya, medium dihisap, dan kristal formazan dilarutkan dalam 150 μL DMSO. Akhirnya, plate lubang digetar pada 37 °C selama 15 min dalam osilator suhu konstan. Kepadatan optik (OD) dari setiap sampel diukur pada 570 nm menggunakan pembaca plate mikro. Eksperimen dilakukan tiga kali. Rasio inhibisi sel dihitung dari hasil menggunakan rumus berikut:
di mana OD_kontrol adalah absorbansi yang diperoleh oleh sel kontrol tanpa perlakuan, OD_diperlakukan adalah absorbansi yang diperoleh oleh sel yang diperlakukan.
Uji Pewarnaan AO/EB
Pewarnaan ganda AO/EB digunakan untuk mengevaluasi perubahan morfologi sel yang diperlakukan dengan 5-FU, Tau-GO, dan 5-FU-Tau-GO. Secara singkat, sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik ditanam pada plate 6-lubang dengan densitas 10.000 sel per lubang dan dikultur dalam inkubator pada 37 °C dan di bawah atmosfer 5% CO2. Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan konsentrasi tetap 5-FU, Tau-GO, atau 5-FU-Tau-GO, dan diinkubasi lebih lanjut selama 24 jam. Medium di setiap lubang dikeluarkan dan sel dicuci dua kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL PBS yang dilengkapi dengan 40 μL pewarna fluorescent (1 mg/mL AO dan 1 mg/mL EB dicampur dengan rasio 1:1) ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi selama 10 min tanpa cahaya. Sel yang diwarnai diamati di bawah mikroskop fluorescent dan gambar diambil secara acak.
Studi Farmakokinetika
Semua eksperimen hewan dilakukan sesuai dengan kebijakan dan prinsip yang diformulasikan oleh Komite Etika Perlindungan Hewan. Secara total 24 tikus SD jantan, dengan berat badan 230-270 g, dipuasa selama 12 jam dan dibagi secara acak ke dalam 4 grup sebelum pemberian obat. Grup A dan B diuntalkan secara intravena dengan larutan 5-FU dan 5-FU-Tau-GO, dan grup C dan D diberikan larutan 5-FU dan 5-FU-Tau-GO secara oral, masing-masing. Semua grup menerima dosis 20 mg/kg. Setelah pemberian obat, sampel darah (sekitar 0,5 mL) dikumpulkan ke dalam tabung anticoagulan pada titik waktu yang diberikan (15 min, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 6 jam, 8 jam, 12 jam, 16 jam, 24 jam, dan 48 jam). Sampel plasma dipisahkan dengan usap pada 7500 rpm dan pada 4 °C selama 10 min. Kemudian, 200 μL plasma dan 50 mg (NH4)2SO4 digabungkan dalam tabung (10 μL larutan standar internal 5-BrU 40 μg/mL, dikeringkan dengan nitrogen dalam mandi air 40 °C, diwartex selama 5 min dan diusap pada 10800 rpm selama 3 min. Selanjutnya, tabung ditambahkan dengan 900 μL larutan asetat etil/iso-propanol (85:15, v/v), diwartex selama 3 min dan diusap pada 10800 rpm selama 15 min. Surnat dikeluarkan dan dikeringkan dengan nitrogen, 100 μL fasa seluler ditambahkan dan tabung diwartex selama 1 min. Akhirnya, larutan yang dihasilkan yang dikumpulkan dari surnat diukur oleh HPLC 1200.
Simulasi Dinamika Molekuler
Simulasi dinamika molekuler terutama digunakan untuk menganalisis gaya interaksi antara obat dan pembawa serta perilaku difusi obat. Struktur kimia 5-FU dibangun menggunakan Chemdraw dari chem office 2014, dan struktur Tau-GO dan GO dilakukan dalam modul Polymer and Molecule Builders menggunakan perangkat lunak simulasi molekuler Materials Studio (versi 7.0, Accelrys Inc., AS). Semua senyawa yang dibangun dioptimalkan secara geometri di bawah medan gaya COMPASS II, dan konformasi dengan energi terendah dipilih sebagai konformasi stabil. Equilibrasi NVT 10 ps dilakukan untuk setiap sistem. Simulasi dilakukan dengan 100 ps MD untuk mendapatkan struktur yang seimbang pada 298 K dan 101,325 kPa dengan ukuran langkah 1 fs. Akhirnya, perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) dan densitas energi kohesif (CED) diperoleh untuk setiap sistem, dan koefisien difusi (D) diberikan oleh rumus berikut:
di mana d adalah dimensi sistem, r→(t) dan r→(0) adalah vektor posisi molekul obat pada waktu t dan 0, masing-masing, [r→(t) − r→(0)]² merupakan MSD.
Hasil dan Pembahasan
Karakterisasi
Konjugat Tau-GO dibuat melalui ikatan amid dari GO dan Tau. Sintesis nanokomposit yang berhasil divalidasi oleh spektrum FT-IR (Gambar 1). Kehadiran fungsionalitas oksigen pada GO dikonfirmasi oleh puncak absorbensi pada –OH (~ 3405 cm⁻¹), C=O (1723 cm⁻¹), C=C (1628 cm⁻¹) dan C–OH (1391 cm⁻¹). Hasil ini membuktikan penyediaan GO yang berhasil (Gambar 1a) [25]. Selain beberapa puncak karakteristik GO, puncak baru pada 1638 cm⁻¹ dan 3427 cm⁻¹ sesuai dengan grup amid, dan 1164 cm⁻¹ dan 1085 cm⁻¹ sesuai dengan –SO. Spektrum Tau-GO secara jelas menunjukkan bahwa Tau telah difungsionalkan pada permukaan GO (Gambar 1b). Dalam Gambar 2b, puncak karakteristik –SO3 pada 1164 cm⁻¹ ditimpa oleh tindakan ikatan hidrogen dan tidak terlihat dalam spektrum FT-IR. Oleh karena itu, 5-FU berhasil dimuat pada Tau-GO.
Spektrum FT-IR GO (a) dan Tau-GO (b)
Spektrum FT-IR Tau-GO (a) dan 5-FU-Tau-GO (b)
Spektrum penyerapan UV–Vis GO ditunjukkan dalam Gambar 3. Puncak absorbensi yang jelas pada 234 nm dikaitkan dengan transisi π–π* ikatan C=C grafen. Selain itu, puncak bahu 300 nm dikaitkan dengan transisi n–π* ikatan C=O grafen oksida pada grup karbosil atau karbonil. Kedua puncak absorbensi karakteristik terbukti sebagai persiapan GO yang berhasil.
Spektrum UV GO
Ukuran GO, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO ditunjukkan dalam Gambar 4. Potensial zeta GO, Tau-Go dan 5-FU-Tau-GO ditunjukkan dalam Gambar 5. Ukuran lembar GO sekitar 221 nm dan nilai PDI sekitar 0,188, yang mengindikasikan bahwa GO yang disiapkan memiliki distribusi yang seragam dan stabilitas yang baik. Potensial zeta sekitar − 33,3 mV, yang mengindikasikan bahwa muatan negatif terutama disebabkan oleh kehadiran banyak grup yang mengandung oksigen pada permukaan. Ketika GO dimodifikasi dengan Tau melalui ikatan amid, grup amino menggantikan beberapa grup karboksil dan –SO3 memiliki kemampuan ionisasi yang lebih kuat dalam larutan, potensial zeta menurun dan menjadi − 38,8 mV. Ukuran dan nilai PDI Tau-GO sekitar 242 nm dan 0,190. Selanjutnya, 5-FU dimuat ke Tau-GO melalui ikatan non-kovalen. Potensial zeta sekitar − 26,7 mV dan nilai absolutnya lebih besar dari 20 mV. Selain itu, ukuran dan nilai PDI 5-FU-Tau-GO sekitar 264 nm dan 0,182, ini mengindikasikan bahwa repulsi elektrostatis antara partikel besar, yang tidak mudah menyebabkan agregasi atau presipitasi, dan bahwa Tau memiliki keterlarutan air yang baik, GO juga memiliki keterlarutan air yang baik karena permukaannya dimodifikasi oleh grup yang mengandung oksigen. Penggunaan pembawa Tau-GO untuk memuat 5-FU secara signifikan meningkatkan keterlarutan air 5-FU, sehingga 5-FU-Tau-GO dapat tersebar secara stabil dalam larutan air.
Ukuran partikel GO (a), Tau-GO (b), dan 5-FU-Tau-GO (c)
Potensial zeta GO (a), Tau-GO (b), dan 5-FU-Tau-GO (c)
Morfologi GO, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO dikarakterisasi oleh TEM (Gambar 6). GO adalah struktur datar dengan kerutan pada permukaan, yang mengilustrasikan bahwa itu adalah struktur dua dimensi datar (Gambar 6a). Dibandingkan dengan GO, ukuran Tau-GO sedikit meningkat, tetapi masih menunjukkan struktur berlapis (Gambar 6b). Citra 5-FU-Tau-GO menunjukkan bahwa bahan tidak teragregasi atau berubah dengan struktur berlapis awal GO yang tetap utuh (Gambar 6c). Akibatnya, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO memiliki stabilitas yang baik.
TEM GO (a), Tau-GO (b) dan 5-FU-Tau-GO (c)
Analisis termogravimetri digunakan untuk mengukur komposisi komposit. Kurva TGA GO dan Tau-GO ditunjukkan dalam Gambar 7. GO dan Tau-GO memiliki sisa massa 39,73% dan 34,22% dalam suasana nitrogen pada 800 °C. Oleh karena itu, ketika membandingkan nilai perubahan massa, konten Tau dalam Tau-GO ditentukan sekitar 13%.
TGA GO dan Tau-GO
Pola XRD Tau, GO dan Tau-GO ditunjukkan dalam Gambar 8. Puncak karakteristik GO dapat diamati pada 10,7° dari nilai 2θ, yang mengonfirmasi pembentukan GO dengan oksidasi yang lengkap untuk proses oksidasi kimiawi kuat dan eksfoliasi. Setelah difungsionalkan dengan Tau pada permukaan GO, pola difraksi puncak sedikit menurun pada nilai 2θ 8,2. Ini berarti GO telah berhasil difungsionalkan oleh Tau.
Pola XRD Tau, Tau-GO dan GO
Spektrum C1s XPS GO dan Tau-GO ditunjukkan dalam Gambar 9. Spektrum C1s XPS GO menunjukkan bahwa ada tingkat oksidasi yang cukup, dengan kehadiran empat atom karbon yang sesuai dengan berbagai grup fungsional. Spektrum C1s XPS Tau-GO juga menunjukkan atom karbon yang sama. Selain itu, penampilan puncak komponen terkait ikatan C–N dikaitkan dengan grup amino, grup amid. Hasil ini juga menunjukkan bahwa GO berhasil difungsionalkan oleh Tau.
Pola C1s XPS GO dan Tau-GO
Perilaku Pemuatan dan Pelarutan Obat
5-FU diserap pada nanokarrier Tau-GO melalui interaksi non-kovalen. Kurva kalibrasi 5-FU adalah y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), dan rentangnya adalah 6,5 ~ 250 µg/mL. Rasio enkapsulasi (EE) dan efisiensi pemuatan obat (LE) ditentukan oleh konsentrasi obat yang tidak terikat untuk mengevaluasi performa pemuatan obat. Hasil menunjukkan bahwa EE meningkat dengan peningkatan konsentrasi obat, dan nilai tertinggi EE adalah 83,2%. Menurut rumus, LE adalah 33,7%, yaitu 508,52 μg 5-FU dapat diserap pada 1 mg Tau-GO. Oleh karena itu, Tau-GO adalah pembawa obat yang menjanjikan yang dapat mencapai muatan obat yang besar. Mekanisme yang mungkin dari kapasitas pemuatan tinggi 5-FU pada Tau-GO dapat diringkas dengan penjelasan berikut: pertama, Tau digunakan untuk fungsionalisasi GO dan memperkenalkan grup fungsional aktif (–SO3). –SO3 memiliki kemampuan ionisasi yang kuat dalam larutan, yang mengurangi agregasi antara GO dan memfasilitasi pemuatan 5-FU ke dalam Tau-GO. Kedua, potensial zeta 5-FU-Tau-GO berbeda 12,1 mV dari pada Tau-GO, yang mengindikasikan bahwa 5-FU dimuat pada permukaan Tau-GO, dan interaksi elektrostatis memainkan peran penting dalam pemuatan 5-FU. Terakhir, ada banyak bentuk ikatan hidrogen antara 5-FU dan pembawa Tau-GO, termasuk –COOH dalam Tau-GO dan –NH– dalam 5-FU, –COOH dalam Tau-GO dan C=O dalam 5-FU, –OH dalam Tau-GO dan –NH– dalam 5-FU, –OH dalam Tau-GO dan –C=O dalam 5-FU, –COOH dan 5-FU dalam Tau-GO –F dalam Tau-GO, –COOH dalam Tau-GO dan –F dalam 5-FU, ikatan hidrogen ini membuat 5-FU-Tau-GO stabil dalam larutan.
Peluaran kumulatif in vitro 5-FU dari 5-FU-Tau-GO, pada suhu 37 °C dalam larutan PBS pH 1,2, 6,5 dan 7,4 (simulasikan lingkungan lambung, lingkungan sel kanker hati dan lingkungan fisiologis, masing-masing) ditunjukkan dalam Gambar 10. Ditemukan bahwa perilaku pelarutan 5-FU dipengaruhi oleh nilai pH lingkungan. Dalam larutan buffer pH 7,4, pelarutan obat lambat dan berkelanjutan, dan jumlah total obat yang dilepaskan sekitar 70,84% setelah 72 jam. Sebaliknya, jumlah obat yang dilepaskan pada pH 7,4 secara signifikan lebih rendah daripada pada pH 1,2 dan pH 6,5 pada titik waktu yang sama. Total muatan obat yang dilepaskan dari 5-FU-Tau-GO dapat dicapai sekitar 90,29% dan 85,75% pada pH 1,2 dan pH 6,5, masing-masing. Ini dapat dikaitkan dengan interaksi π-π dan ikatan hidrogen antara 5-FU dan Tau-GO. Semakin rendah nilai pH, semakin tinggi tingkat protonasi ikatan hidrogen. Oleh karena itu, kekuatan ikatan hidrogen dikontrol oleh nilai pH, yang mengarah pada pelarutan 5-FU. Sistem pengiriman obat yang sensitif pH ini memainkan peran penting dalam obat anti-tumor dan dapat mencapai pelarutan obat ke dalam sel tumor.
Kurva pelarutan in vitro 5-FU-Tau-GO dalam saline fosfat pada 37 °C
Studi Sitotoksisitas In Vitro
Untuk mengevaluasi toksisitas potensial dan efikasi terapi tumor dari nanokarrier, kelayakan sel in vitro dilakukan pada sel HepG2 menggunakan uji MTT (Gambar 11). Tau-GO tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan pada konsentrasi yang berbeda. Setelah pemuatan 5-FU, 5-FU-Tau-GO menunjukkan efek inhibisi yang jelas, dan bergantung pada dosis, oleh karena itu, nanokarrier memiliki kemampuan untuk mengirim obat anti-tumor. Nilai IC50 dari 5-FU-Tau-GO adalah 65,2 ± 0,7 μg/mL, yang lebih toksik daripada 5-FU bebas (196 ± 8,73 μg/mL). Ini mungkin karena kemampuan taurin untuk menginduksi apoptosis pada sel tumor, sehingga secara tidak langsung meningkatkan efek inhibitor 5-FU pada sel. Selain itu, dapat dilihat dari uji pelarutan in vitro bahwa 5-FU yang dimuat pada Tau-GO dapat dilepaskan secara bertahap dalam sel. Oleh karena waktu efektif 5-FU-Tau-GO pada sel lebih lama daripada 5-FU bebas, dan sehingga menghasilkan inhibisi yang lebih baik.
Kelayakan berbagai konsentrasi 5-FU, Tau-GO, dan 5-FU-Tau-GO
Agen fluorescent AO dapat memancarkan fluoresensi hijau saat melewati membran sel yang utuh dan mewarnai inti, sementara EB hanya menandai inti sel yang rusak yang memancarkan fluoresensi merah/oranye. Sel dengan apoptosis awal dan akhir menunjukkan inti kuning kehijauan atau oranye dengan pewarnaan AO/EB, masing-masing. Oleh karena itu, pewarnaan AO/EB dilakukan untuk menyelidiki apakah kematian sel terkait dengan apoptosis menggunakan karakteristik perubahan morfologi sel. Hasil yang diperoleh dari pewarnaan AO/EB ditampilkan dalam Gambar 12. Sel kontrol berbentuk fusiform dan dengan inti hijau. Dalam grup sel yang dikultur dengan Tau-GO saja, sebagian kecil inti terserongkat dan dengan pewarnaan hijau gelap atau merah-oranye. Sel apoptosis yang signifikan berwarna oranye atau merah dengan fragmen kromatin dan tubuh apoptosis diamati dalam grup 5-FU saja. Dibandingkan dengan 5-FU, 5-FU-Tau-GO menyebabkan lebih banyak kerusakan pada morfologi sel HepG2, yang tidak hanya merusak sel, tetapi juga menyebabkan banyak apoptosis pada sel kanker. Seperti yang dapat dilihat dari gambar, hampir semua sel yang diperlakukan dengan 5-FU-Tau-GO, mengalami perubahan morfologi, banyak sisa sel dan tubuh apoptosis, yang mengindikasikan bahwa sistem pengiriman obat nano 5-FU-Tau-GO memiliki efek pembunuh yang baik pada sel HepG2.
AO/EB kontrol (a), Tau-GO (b), 5-FU (c), dan 5-FU-Tau-GO (d)
Studi Farmakokinetika
Studi farmakokinetika 5-FU dan 5-FU-Tau-GO dilakukan pada tikus SD. Profil konsentrasi 5-FU dalam plasma vs. waktu, setelah pemberian oral, ditampilkan dalam Gambar 13a. Kami menemukan bahwa kecenderungan dua kurva serupa, tetapi konsentrasi plasma 5-FU dari nanokarrier 5-FU-Tau-GO lebih tinggi daripada dari 5-FU saja dan ini diamati pada setiap titik waktu yang diukur. Gambar 13b menunjukkan profil pelarutan in vivo 5-FU melalui vena ekor. 5-FU-Tau-GO dapat mencapai pelarutan obat yang berkelanjutan selama 24 jam, dan konsentrasi obat secara bertahap menurun dalam beberapa jam pertama, mengindikasikan bahwa 5-FU dilepaskan secara lambat.
Kurva standar farmakokinetika in vivo 5-FU dan 5-FU-Tau-GO melalui pemberian oral (a). Kurva standar farmakokinetika in vivo 5-FU dan 5-FU-Tau-GO melalui suntikan intravena (b)
Model dua kompartemen digunakan untuk menganalisis parameter farmakokinetika pemberian oral atau intravena pada tikus. Parameter farmakokinetika ditampilkan dalam Tabel 1. Dibandingkan dengan 5-FU, 5-FU-Tau-GO menunjukkan T1/2β yang lebih tinggi yaitu 2,3 kali melalui pemberian oral, dan 3,0 kali melalui suntikan intravena, masing-masing. Selain itu, luas di bawah kurva konsentrasi-waktu (AUC0−t) dari kompleks nano 5-FU-Tau-GO sekitar 2,1 kali lebih tinggi melalui pemberian oral, dan 2,8 kali lebih tinggi melalui suntikan intravena dibandingkan dengan larutan 5-FU, masing-masing. Oleh karena itu, kami menyimpulkan bahwa 5-FU-Tau-GO dapat secara signifikan memperpanjang waktu retensi 5-FU in vivo dan meningkatkan bioavailabilitas. Selain itu, T1/2β dari kompleks nano 5-FU-Tau-GO yang diberikan secara oral (1,67 ± 1,15 jam), lebih lama daripada suntikan intravena (1,33 ± 0,64 jam); namun, AUC0−t dari pemberian oral (36,02 ± 1,83 mg/L*jam) lebih rendah daripada suntikan intravena (96,50 ± 8,70 mg/L*jam). Hasil ini mungkin disebabkan oleh dua aspek: satu, saat diberikan melalui suntikan intravena, obat langsung masuk ke sistem darah untuk sirkulasi tanpa melewati penghalang usus untuk redistribusi; di sisi lain, karena 5-FU mudah menyebabkan kerusakan tertentu pada sistem usus, ini juga dapat mempengaruhi penggunaan efektif obat dalam tubuh.
Simulasi MD
Penyusunan dan dinamika molekuler GO yang tidak dimodifikasi, Tau-GO dan 5-FU disimulasikan oleh penyusunan molekular dan simulasi dinamika molekuler. Hasil penyusunan molekular GO, Tau-GO dan 5-FU ditunjukkan dalam Gambar 14, di mana dapat dilihat bahwa panjang ikatan 5-FU dan GO dan Tau-GO adalah 3,66 Å dan 2,602 Å, masing-masing. Selain itu, dari hasil perhitungan, energi ikatan 5-FU ke GO dan Tau-GO adalah 47,69 kcal/mol dan 25,04 kcal/mol, masing-masing. Ini mengindikasikan bahwa gaya ikatan Tau-GO dan 5-FU lebih kuat daripada GO dan 5-FU. Ini disebabkan oleh atom polar Tau, seperti S dan N, membentuk ikatan non-kovalen yang lebih kuat dengan 5-FU, yang membuat gaya antara Tau-GO dan 5-FU lebih kuat.
Penyusunan molekular lembar GO dengan 5-FU (a). Penyusunan molekular Tau-GO dengan 5-FU (b)
Diagram simulasi dinamika molekuler GO, Tau-GO dan 5-FU ditunjukkan dalam Gambar 15. Menurut hasil perhitungan, CED dari 5-FU-GO dan 5-FU-Tau-GO adalah 2,67*10^8 dan 2,83*10^8, masing-masing. Hasil ini menunjukkan interaksi yang lebih kuat antara obat dan Tau-GO. Grafik antara MSD dan waktu dibuat (Gambar 16) untuk mendapatkan koefisien difusi melalui MSD. Koefisien difusi obat diperoleh dari kemiringan dibagi 6 sebagai berikut: 0,094 m²/s dan 0,058 m²/s. Ini menunjukkan bahwa gaya antara Tau-GO dan 5-FU lebih kuat, yang konsisten dengan hasil penyusunan molekular. Oleh karena itu, GO yang difungsionalkan membuat seluruh pembawa lebih melimpah dalam atom dan grup; Oleh karena itu, membuat ikatan non-kovalen dengan 5-FU lebih kuat, dan seluruh sistem lebih stabil.
Cuplikan GO dan 5-FU di akhir MD (a). Cuplikan Tau-GO dan 5-FU di akhir MD (b)
Profil MSD obat dari GO dan 5-FU (a), Tau-GO dan 5-FU (b)
Kesimpulan
Secara ringkasan, kami berhasil menyiapkan nanokomposit Tau-GO melalui metode kimia sederhana. Fungsionalisasi GO dengan Tau memiliki stabilitas yang baik dan meningkatkan kompatibilitas biologisnya. Struktur unik dan properti cemerlang dari nanokarrier Tau-GO menawarkan kesempatan besar untuk pemuatan dan pengiriman 5-FU. 5-FU-Tau-GO memiliki kemampuan anti-tumor yang potensial dan waktu sirkulasi obat yang sangat baik. Oleh karena itu, kami yakin bahwa modifikasi GO oleh pembawa Tau untuk pemuatan 5-FU adalah alat yang efektif dan dapat diterapkan untuk konstruksi sistem pengiriman obat nano 5-FU-Tau-GO untuk pengiriman obat antikanker dan terapi anti-tumor.
Ketersediaan Data dan Bahan
Dataset yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis yang bertanggung jawab atas permintaan yang wajar.
