Fabrikasi dan Karakterisasi Grafena Oksida Fungsional Taurin dengan 5-Fluorouracil sebagai Sistem Penghantaran Obat Antikanker
Abstrak
Baru-baru ini, sistem nanocarrier untuk obat kanker, terutama sistem penghantaran obat berbasis GO, telah menjadi keuntungan bagi pasien kanker. Dalam penelitian ini, kami memilih Tau untuk memfungsikan permukaan GO untuk meningkatkan biokompatibilitasnya. Pertama, GO skala nano disintesis dengan metode Hummer yang dimodifikasi dan metode pengupasan ultrasonik. Pembawa grafena oksida termodifikasi taurin (Tau-GO) disintesis dengan metode kimia untuk mendapatkan Tau-GO yang memiliki dispersibilitas dan stabilitas yang baik dalam air, dengan potensi zeta − 38,8 mV dan ukuran partikel 242 nm. Berdasarkan kriteria evaluasi efisiensi enkapsulasi, formulasi optimal ditentukan untuk menggabungkan Tau-GO dan 5-FU dengan ikatan non-kovalen. 5-FU-Tau-GO lebih stabil di lingkungan netral daripada di lingkungan asam, dan dengan respons PH tertentu dan efek pelepasan berkelanjutan. In vivo, kami membandingkan pemberian oral dan intravena 5-FU dan 5-FU-Tau-GO, masing-masing, menggunakan tes farmakokinetik dan parameter terkait dan menunjukkan bahwa pemberian oral atau intravena 5-FU-Tau-GO memperpanjang waktu aksi 5 -FU dalam tubuh dan meningkatkan bioavailabilitasnya. Selain itu, penghambatan sel HepG2 yang diukur dengan uji MTT, menunjukkan bahwa IC50 nilai 5-FU adalah 196 ± 8,73 μg/mL, dan IC50 nilai 5-FU-Tau-GO adalah 65,2 ± 0,7 μg/mL, menunjukkan bahwa 5-FU-Tau-GO lebih kuat melawan sel HepG2 dan memiliki efek penghambatan yang lebih kuat pada sel kanker. Efek pada morfologi sel yang diukur dengan pewarnaan AO/EB juga menunjukkan bahwa 5-FU-Tau-GO tidak hanya mengganggu sel, tetapi juga menginduksi apoptosis secara signifikan dibandingkan dengan 5-FU. Kami juga memverifikasi dengan desain berbantuan komputer bahwa Tau-GO dapat mengikat lebih baik ke 5-FU daripada ke GO yang tidak dimodifikasi, dan bahwa sistem 5-FU-Tau-GO yang terbentuk lebih stabil, dan kondusif untuk transfer dan pelepasan 5- FU in vivo.
Pengantar
Kemoterapi masih merupakan metode umum yang digunakan dalam pengobatan berbagai jenis kanker [1]. Kendala yang signifikan dari sebagian besar agen kemoterapi adalah ketidakmampuan mereka untuk menembus jaringan tumor, pada konsentrasi yang efektif, atau efek samping yang tidak diinginkan pada jaringan normal [2]. Oleh karena itu, para ilmuwan telah memusatkan upaya mereka untuk mengembangkan sistem penghantaran obat yang kuat yang dapat mencapai tingkat pelepasan obat yang terkendali dalam jaringan tumor untuk memastikan penghantaran dan terapi obat yang efektif.
Banyak bahan berukuran nano termasuk liposom [3], polimer [4], nanopartikel [5], dendrimer [6], misel [7], dan graphene oxide [8, 9] telah dikembangkan untuk pengiriman berbagai obat. Di antara nanomaterial ini, graphene oxide (GO) adalah nanomaterial karbon baru yang secara kimia terkelupas dari grafit teroksidasi dan menunjukkan beberapa sifat fisik dan kimia yang menarik, seperti gugus fungsi yang melimpah, luas permukaan spesifik yang besar, jumlah pemuatan obat yang tinggi, dan penyebaran yang sangat baik. kemampuan dalam air [10,11,12]. Selain itu, sebagian besar hasil percobaan in vitro menunjukkan bahwa konsentrasi GO yang rendah dapat digunakan sebagai substrat untuk pertumbuhan sel dan untuk mengaktifkan sel imun. Oleh karena itu, GO telah banyak digunakan dalam diagnosis penyakit [13], pencitraan dan pelacakan sel kanker [14], terapi fototermal kanker [15], rekayasa jaringan [16], pengiriman obat yang ditargetkan [17], dan terutama, sebagai anti- pembawa obat tumor [18, 19]. Namun, beberapa kelompok penelitian telah melaporkan bahwa konsentrasi GO yang tinggi memiliki efek sitotoksik yang jelas dalam studi pra-klinis dan klinis. Mekanisme yang GO menghasilkan efek toksik in vivo adalah melalui stres oksidatif dan kelebihan produksi spesies oksigen reaktif intraseluler, menginduksi apoptosis sel dan menyebabkan peradangan parah, edema paru dan pembentukan granuloma [20]. Oleh karena itu, sangat penting untuk menyelesaikan masalah toksisitas GO.
Dilaporkan, fungsionalisasi ikatan kovalen atau non-kovalen dapat mengurangi interaksi hidrofobik yang kuat antara GO dan sel. Hal ini ditunjukkan oleh beberapa penelitian yang menunjukkan bahwa fungsionalisasi GO meningkatkan biokompatibilitasnya dan hampir menghilangkan toksisitasnya secara in vivo dan in vitro.Yang et al. mempelajari, untuk pertama kalinya, biodistribusi jangka panjang dari PEG-GO yang terkonjugasi secara kovalen pada tikus menggunakan metode radiolabeling, dan hasilnya menunjukkan bahwa PEG-GO dapat diekskresikan secara bertahap dari tikus, kemungkinan dalam urin dan feses [21]. Zhang dkk. membandingkan DEX yang difungsikan GO dengan GO dan menemukan bahwa GO-DEX dapat sangat mengurangi toksisitas sel dan sebagian besar dibersihkan dari tikus dalam waktu seminggu [22]. Selain itu, pengikatan non-kovalen GO ke pluronic F127 menghasilkan kelarutan dan stabilitas jinak dalam kondisi fisiologis, dan toksisitas rendah [23]. Meskipun beberapa polimer atau molekul telah digunakan untuk memfungsikan GO, hasil yang signifikan telah dicapai dalam bidang ini. Namun, upaya masih diperlukan untuk mengembangkan metode sederhana untuk membangun pembawa obat berbasis GO biokompatibel yang baik.
Taurin (Tau) adalah asam amino semi esensial dengan stabilitas dan kelarutan air yang baik. Tau dapat mencegah penyakit kardiovaskular dan serebrovaskular, menjaga fungsi visual, melindungi sel, dan mengatur kekebalan. Sejumlah penelitian telah mengusulkan bahwa Tau memiliki sifat antitumor melalui upregulation atau downregulation dari faktor ekspresi yang memainkan peran penting dalam berbagai kanker, termasuk kanker paru-paru, perut, kolorektal, dan payudara [24]. Dengan demikian, GO yang difungsikan oleh Tau dapat memberikan peran yang unggul sebagai pembawa obat anti-tumor. Dalam artikel ini, kami menggunakan, untuk pertama kalinya, kovalen Tau yang memfungsikan GO sebagai pembawa nano dan mengevaluasi sitotoksisitasnya secara in vitro. Selanjutnya, 5-fluorouracil (5-FU) digunakan sebagai obat antikanker yang dimuat secara non-kovalen pada permukaan Tau-GO untuk membangun sistem penghantaran obat. 5-FU-Tau-GO tidak hanya dapat mengurangi efek samping pada jaringan normal tetapi juga meningkatkan ketersediaan hayati obat. Akibatnya, Tau-GO berhasil dikembangkan sebagai bahan nano berbasis GO baru yang mungkin memiliki aplikasi biomedis yang signifikan di masa depan.
Eksperimen dan Metode
Materi
Bubuk grafit, phosphate buffered saline (PBS) dan dimethyl sulfoxide (DMSO) dibeli dari Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Karbodiimida (EDC), N-hidroksisuksinimida (NHS), asam klorida (HCl) dan hidrogen peroksida (H2 O2 30%) dibeli dari Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurin (Tau), 5-fluorouracil (5-FU), sel hepatoma manusia (HepG2), larutan penisilin-streptomisin dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; asam sulfat (H2 JADI4 98%) dan kalium permanganat (KMnO4 ) dibeli dari Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; natrium nitrat (NaNO3 ) dan natrium dodesil sulfat (SDS-Na) dibeli dari Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT dibeli dari Sigma-Aldrich, Inc; DMEM dibeli dari HyClone, Inc; Tikus-tikus itu dibeli dari Pusat Hewan Eksperimental Benxi Changsheng. Semua reagen dan bahan kimia lainnya murni secara analitik dan tersedia secara komersial.
Sintesis GO
GO dibuat dari bubuk grafit sesuai dengan metode Hummer yang dimodifikasi. Pertama, 168 mL asam sulfat 98% ditambahkan di sepanjang dinding labu dari labu leher tiga yang ditempatkan dalam penangas es dengan termometer, dan 5 g grafit dan 4 g natrium nitrat ditambahkan ketika suhu mencapai 5 °C. Kemudian, 22,5 g kalium permanganat ditambahkan perlahan-lahan secara bertahap selama 1 jam dan suhu dijaga di bawah 5 °C. Setelah itu labu leher tiga dipindahkan ke penangas minyak dan campuran yang diperoleh direaksikan pada suhu 35 °C selama 30 menit, kemudian suhu dinaikkan menjadi 65 °C dan reaksi diaduk selama 30 menit. Mengikuti langkah ini, suhu dinaikkan menjadi 85 °C dan campuran direaksikan lebih lanjut selama 1 jam untuk mendapatkan pasta ungu-cokelat. Campuran ini didiamkan di ruang selama 1 minggu, dipindahkan ke gelas kimia dengan 700 mL air panas, dan hidrogen peroksida 30% ditambahkan tetes demi tetes sampai menjadi coklat kekuningan. Campuran disentrifugasi pada 10.000 rpm, dicuci dengan air panas, dan proses ini diulang beberapa kali sampai pH supernatan 7,0. Akhirnya, produk dikeringkan dalam pengering beku vakum dan nano GO diperoleh.
Sintesis Tau-GO
50 mg GO yang ditimbang secara akurat dilarutkan dalam 50 mL air suling, dan 150 mg EDC dan 100 mg NHS ditambahkan untuk mengaktifkan GO dengan ultrasonikasi dalam penangas air es selama 20 menit. Selanjutnya, 10 mL larutan Tau (0,1 g/mL) perlahan ditambahkan (tetes demi setetes) ke dalam larutan berair GO yang telah disiapkan, dan pH diatur menjadi 6–7 oleh HCl dan terus diaduk selama 24 jam pada ruangan dalam gelap. Produk dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit dan dicuci 3 kali dengan air suling. Tau-GO dikumpulkan setelah pengeringan beku.
Pemuatan 5-FU
Sejumlah 20 ml larutan Tau-GO diultrasonikasi selama 2 jam. Jumlah 5-FU yang ditimbang secara akurat dilarutkan dalam air suling dalam jumlah yang sesuai, dan perlahan-lahan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam larutan Tau-GO yang telah disiapkan sambil diaduk pada suhu kamar, kemudian disonikasi pada suhu 30 °C dalam gelap selama 1,5 jam. Produk disentrifugasi pada 5000 rpm selama 10 menit pada 4 °C. Sedimen bagian bawah dicuci dengan 20 mL air suling dan disentrifugasi (5000 rpm selama 10 menit pada 4 °C), dan proses ini diulang 3 kali. Lapisan bawah dibekukan-kering, supernatan ditempatkan dalam gelas kimia, ditimbang volumenya, konsentrasi 5-FU ditentukan dengan HPLC 1200 (Agilent, USA). Kondisi deteksi adalah sebagai berikut:kolom kromatografi:C18 (4,6 × 250 nm, 5 μm); suhu kolom:25 °C; fase gerak:0,1% KH2 PO4 larutan dengan pH 5,5; laju aliran:1,0 mL/mnt; volume injeksi:20μL; dan panjang gelombang pengukuran:265 nm. Rasio enkapsulasi (EE) dan efisiensi pemuatan obat (LE) diperoleh dengan rumus berikut:
Dosis total 5-FU tercatat sebagai M1 , konsentrasi dan volume 5-FU gratis dicatat sebagai C1 dan L1 , dan konsentrasi pembawa dicatat sebagai C0 .
Karakterisasi
Untuk mengkarakterisasi nanokomposit yang disiapkan, spektrum inframerah transformasi Fourier (FT-IR) dipindai dari 4000 hingga 400 cm
−1
pada spektrometer IRAffinity-1 (Shimadzu, Jepang) untuk mengkonfirmasi interaksi. Spektrum serapan UV-vis direkam pada Spektrofotometer Pemindaian UV-3600 (Shimadzu, Jepang). Sampel dilarutkan dalam air suling dan ukuran partikel, potensi zeta dan nilai PDI diperoleh pada instrumen Nano-ZS 90 Nano (Malvern, UK). Morfologi sampel dianalisis menggunakan mikroskop elektron transmisi JEM-2100 (TEM) (JEOL, Jepang). Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan dengan menggunakan penganalisis termogravimetri (NETZSCH, Jerman) pada laju pemanasan 10 °C/menit dari 0 hingga 800 °C di bawah atmosfer nitrogen. Pengukuran XRD sampel dilakukan dengan difraktometer sinar-X (Bruker, Jerman) dengan radiasi CuKα tembaga (λ = 1.5406 Å) dalam sudut lebar dengan sudut 2θ. Pengukuran XPS dilakukan menggunakan Omicron ESCA Probe dengan Al Karadiation monokrom (Thermo, Amerika).
Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan obat in vitro dilakukan pada pH 1,2 (lingkungan simulasi lambung), pH 6,5 (lingkungan sel kanker hati simulasi) dan pH 7,4 (lingkungan fisiologis simulasi) pada 37 °C (suhu tubuh simulasi). Singkatnya, 15 mg 5-FU-Tau-GO ditempatkan ke dalam membran dialisis, direndam dalam 50 mL larutan buffer yang mengandung 0,1% SDS-Na dengan pH 1,2, 6,5 dan 7,4. Semua sampel ditempatkan dalam penangas air bergoyang terus menerus dengan kecepatan 100 rpm dan pada suhu 37 °C. Pada titik waktu yang telah ditentukan (0 menit, 5 menit, 10 menit, 20 menit, 30 menit, 1 jam, 1,5 jam, 2 jam, 2,5 jam, 3 jam, 4 jam, 8 jam, 12 jam, 24 jam, 48 jam dan 72 jam), 1 mL setiap sampel diambil dan diganti dengan 1 mL larutan buffer segar yang mengandung 0,1% SDS-Na untuk mempertahankan volume media pelepas yang sama. Media yang dilepaskan disentrifugasi dan dianalisis menggunakan 1200 HPLC.
Studi Sitotoksisitas In Vitro
Pengujian MTT
Uji MTT digunakan untuk mengevaluasi sitotoksisitas 5-FU, Tau-GO, dan 5-FU-Tau-GO. Secara singkat, sel-sel HepG2 hepatoma manusia dikultur dalam media DEME, dilengkapi dengan 10% FBS dan 1% antibiotik (larutan penisilin-streptomisin) pada 37 °C dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 . Sel-sel disemai ke dalam pelat 96-sumur dengan kepadatan 5 × 10
3
sel per sumur yang berisi 100 μL media DEME, dilengkapi dengan FBS dan antibiotik. Pelat ditempatkan selama 24 jam ke dalam ruang bersuhu 37°C yang mengandung 5% CO2 . Setelah itu, media tumbuh dikeluarkan dan diisi kembali dengan 100 L media segar yang berisi berbagai konsentrasi (5, 10, 20, 40, 60, 80 dan 100 g/ml) 5-FU, Tau-GO, 5-FU- Tau-GO, masing-masing. Setelah inkubasi 24 jam, sel diperlakukan dengan larutan MTT 20 μL dan selanjutnya diinkubasi selama 4 jam. Selanjutnya, media diaspirasi, dan kristal formazan dilarutkan dalam 150 L DMSO. Terakhir, pelat sumur dikocok pada suhu 37°C selama 15 menit dalam osilator suhu konstan. Kepadatan optik (OD) setiap sampel diukur pada 570 nm menggunakan pembaca pelat mikro. Percobaan dilakukan dalam rangkap tiga. Tingkat penghambatan sel dihitung dari hasil menggunakan rumus berikut:
di mana ODkontrol adalah absorbansi yang diperoleh oleh sel kontrol yang tidak diberi perlakuan, ODdiperlakukan adalah absorbansi yang diperoleh oleh sel-sel yang dirawat.
Pengujian Pewarnaan AO/EB
Pewarnaan ganda AO/EB digunakan untuk mengevaluasi perubahan morfologi sel yang diperlakukan dengan 5-FU, Tau-GO, dan 5-FU-Tau-GO. Secara singkat, sel HepG2 dalam fase pertumbuhan logaritmik diunggulkan dalam pelat 6-sumur dengan kepadatan 10.000 sel per sumur dan dikultur dalam inkubator pada suhu 37 °C dan di bawah 5% CO2 suasana. Setelah 24 jam, sel diperlakukan dengan konsentrasi tetap 5-FU, Tau-GO, atau 5-FU-Tau-GO, dan selanjutnya diinkubasi selama 24 jam. Media di setiap sumur dihilangkan dan sel dicuci dua kali dengan PBS. Selanjutnya, 1 mL PBS yang dilengkapi dengan 40 μL pewarna fluoresen (1 mg/mL AO dan 1 mg/mL EB dicampur dengan perbandingan 1:1) ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 10 menit tanpa cahaya. Sel-sel yang diwarnai diamati di bawah mikroskop fluoresensi dan gambar diambil secara acak.
Studi Farmakokinetik
Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan kebijakan dan prinsip yang dirumuskan oleh Komite Etik dan Perlindungan Hewan. Sebanyak 24 tikus SD jantan, dengan berat badan 230-270 g, dipuasakan selama 12 jam dan dibagi secara acak menjadi 4 kelompok sebelum pemberian obat. Kelompok A dan B disuntik secara intravena dengan larutan 5-FU dan 5-FU-Tau-GO, dan kelompok C dan D masing-masing diberi larutan 5-FU dan 5-FU-Tau-GO. Semua kelompok menerima dosis 20 mg/kg. Setelah pemberian obat, sampel darah (sekitar 0,5 mL) dikumpulkan ke dalam tabung antikoagulasi pada titik waktu tertentu (15 menit, 1 jam, 2 jam, 4 jam, 6 jam, 8 jam, 12 jam, 16 jam, 24 jam, dan 48 jam). H). Sampel plasma dipisahkan dengan sentrifugasi pada 7500 rpm dan pada 4 °C selama 10 menit. Kemudian, 200 μL plasma dan 50 mg (NH4 )2 JADI4 digabungkan dalam tabung (10 μL 40 μg/mL larutan standar internal 5-BrU, dikeringkan dengan nitrogen dalam penangas air 40 °C, divorteks selama 5 menit dan disentrifugasi pada 10800 rpm selama 3 menit. Selanjutnya, tabung itu ditambahkan dengan 900 L larutan etil asetat/isopropanol (85:15, v/v), divorteks selama 3 menit dan disentrifugasi pada 10800 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan dikeringkan dengan nitrogen, ditambahkan 100 μL fase gerak dan tabung divorteks selama 1 menit. Akhirnya, larutan yang dihasilkan dari supernatan diukur dengan 1200 HPLC.
Simulasi Dinamika Molekuler
Simulasi dinamika molekul terutama digunakan untuk menganalisis gaya interaksi antara obat dan pembawa dan perilaku difusi obat. Struktur kimia 5-FU dibangun menggunakan Chemdraw of chem office 2014, dan struktur Tau-GO dan GO dilakukan dalam modul Pembangun Polimer dan Molekul menggunakan perangkat lunak simulasi molekul Materials Studio (versi 7.0, Accelrys Inc. , AS). Semua senyawa yang dibangun secara geometris dioptimalkan di bawah medan gaya COMPASS II, dan konformasi dengan energi terendah dipilih sebagai konformasi yang stabil. A 10 ps, NVT equilibration dilakukan untuk setiap sistem. Simulasi dilakukan dengan 100 ps MD untuk mendapatkan struktur yang seimbang pada 298 K dan 101,325 kPa dengan ukuran langkah 1 fs. Akhirnya, perpindahan kuadrat rata-rata (MSD) dan kepadatan energi kohesif (CED) diperoleh untuk setiap sistem, dan koefisien difusi (D) diberikan oleh rumus berikut:
di mana d adalah dimensi sistem, \(r\overrightarrow {\left( t \right)}\) dan \(r\overrightarrow {\left( 0 \right)}\) adalah vektor posisi molekul obat pada waktu t dan 0, berturut-turut, \(\left[ {\left. {r\overrightarrow {\left( t \right)} - r\overrightarrow {\left( 0 \right)} } \right]} \right.^{ 2}\) singkatan dari MSD.
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi
Konjugat Tau-GO dibuat oleh ikatan amida GO dan Tau. Sintesis nanokomposit yang berhasil divalidasi oleh spektrum FT-IR (Gbr. 1). Kehadiran fungsi oksigen pada GO dikonfirmasi oleh puncak absorbansi pada –OH (~ 3405 cm
−1
), C=O (1723 cm
−1
), C=C (1628 cm
−1
) dan C–OH (1391 cm
−1
). Hasil ini membuktikan persiapan GO yang sukses (Gbr. 1a) [25]. Selain beberapa puncak karakteristik GO, puncak baru pada 1638 cm
−1
dan 3427 cm
−1
sesuai dengan kelompok amida, dan 1164 cm
−1
dan 1085 cm
−1
sesuai dengan –SO. Spektrum Tau-GO dengan jelas menunjukkan bahwa Tau telah difungsikan pada permukaan GO (Gbr. 1b). Pada Gambar. 2b, puncak karakteristik –SO3 pada 1164 cm
−1
dibanjiri oleh aksi ikatan hidrogen dan tidak terlihat dalam spektrum FT-IR. Oleh karena itu, 5-FU berhasil dimuat ke Tau-GO.
Spektrum FT-IR GO (a ) dan Tau-GO (b )
Spektrum FT-IR Tau-GO (a ) dan 5-FU-Tau-GO (b )
Spektrum penyerapan GO UV–Vis ditunjukkan pada Gambar. 3. Puncak penyerapan yang jelas pada 234 nm dikaitkan dengan transisi –π* dari ikatan C=C graphene. Selain itu, puncak bahu 300 nm dianggap berasal dari transisi n–π* dari ikatan graphene oksida C=O pada karboksil atau gugus karbonil. Dua puncak serapan yang khas terbukti menjadi persiapan GO yang sukses.
Spektrum UV GO
Ukuran GO, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO ditunjukkan pada Gambar 4. Potensi zeta GO, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO ditunjukkan pada Gambar 5. lembar GO kira-kira 221 nm dan nilai PDI kira-kira 0,188, menunjukkan bahwa GO yang disiapkan memiliki distribusi yang seragam dan stabilitas yang baik. Potensi zeta kira-kira 33,3 mV, menunjukkan bahwa muatan negatif terutama disebabkan oleh adanya banyak gugus yang mengandung oksigen di permukaan. Ketika GO dimodifikasi dengan Tau melalui ikatan amida, gugus amino menggantikan beberapa gugus karboksil dan –SO3 memiliki kemampuan ionisasi yang lebih kuat dalam larutan, potensi zeta menurun dan menjadi 38,8 mV. Ukuran dan nilai PDI Tau-GO kira-kira 242 nm dan 0,190. Selanjutnya, 5-FU dimuat ke Tau-GO dengan ikatan non-kovalen. Potensi zeta kira-kira − 26,7 mV dan nilai absolutnya lebih besar dari 20 mV. Selain itu, ukuran dan nilai PDI 5-FU-Tau-GO sekitar 264 nm dan 0,182, hal ini menunjukkan bahwa gaya tolak menolak elektrostatik antar partikel besar, yang tidak mudah menyebabkan agregasi atau pengendapan, dan Tau memiliki kelarutan dalam air yang baik. , GO juga memiliki kelarutan air yang baik karena permukaannya dimodifikasi oleh gugus fungsi yang mengandung oksigen. Penggunaan pembawa Tau-GO untuk memuat 5-FU secara signifikan meningkatkan kelarutan air dari 5-FU, sehingga 5-FU-Tau-GO dapat terdispersi secara stabil dalam larutan berair.
Ukuran partikel GO (a ), Tau-GO (b ), dan 5-FU-Tau-GO (c )
Potensi Zeta dari GO (a ), Tau-GO (b ), dan 5-FU-Tau-GO (c )
Morfologi GO, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO dicirikan oleh TEM (Gbr. 6). GO adalah struktur datar dengan kerutan di permukaan, menggambarkan bahwa itu adalah struktur dua dimensi planar (Gbr. 6a). Dibandingkan dengan GO, ukuran Tau-GO sedikit meningkat, tetapi masih menunjukkan struktur pipih (Gbr. 6b). Gambar 5-FU-Tau-GO menunjukkan bahwa material tidak beragregasi atau berubah dengan struktur pipih awal GO yang tetap utuh (Gbr. 6c). Akibatnya, Tau-GO dan 5-FU-Tau-GO memiliki stabilitas yang baik.
TEM GO (a ), Tau-GO (b ) dan 5-FU-Tau-GO (c )
Analisis termogravimetri digunakan untuk mengukur komposisi komposit. Kurva TGA GO dan Tau-GO ditunjukkan pada Gambar 7. GO dan Tau-GO memiliki massa sisa 39,73% dan 34,22% dalam atmosfer nitrogen 800 °C. Oleh karena itu, ketika membandingkan nilai perubahan bobot, kandungan Tau di Tau-GO ditentukan sekitar 13%.
TAG GO dan Tau-GO
Pola XRD Tau, GO dan Tau-GO ditunjukkan pada Gambar 8. Puncak karakteristik GO dapat diamati pada 10,7° dari nilai 2θ, yang menegaskan pembentukan GO dengan oksidasi lengkap untuk oksidasi kimia yang kuat dan proses pengelupasan. . Setelah difungsikan dengan Tau pada permukaan GO, pola difraksi puncak sedikit menurun pada nilai 2θ 8.2. Artinya GO telah berhasil difungsikan oleh Tau.
Pola XRD Tau, Tau-GO dan GO
Spektrum C1s XPS dari GO dan Tau-GO ditunjukkan pada Gambar 9. Spektrum C1s XPS dari GO menunjukkan bahwa ada tingkat oksidasi yang cukup besar, dengan adanya empat atom karbon yang sesuai dengan gugus fungsi yang berbeda. Spektrum C1s XPS Tau-GO juga menunjukkan atom karbon yang sama ini. Selain itu, munculnya puncak komponen terkait ikatan C-N dikaitkan dengan gugus amino, gugus amida. Hasil ini juga menunjukkan bahwa GO berhasil difungsikan oleh Tau.
Pola C1s XPS GO dan Tau-GO
Perilaku Pemuatan dan Pelepasan Obat
5-FU diadsorpsi ke nanocarrier Tau-GO melalui interaksi non-kovalen. Kurva kalibrasi 5-FU adalah y = 62.135x + 21,873 (r = 0.9999), dan kisarannya adalah dari 6,5 ~ 250 µg/mL. Rasio enkapsulasi (EE) dan efisiensi pemuatan obat (LE) ditentukan oleh konsentrasi obat yang tidak terikat untuk mengevaluasi kinerja pemuatan obat. Hasil penelitian menunjukkan bahwa EE meningkat dengan meningkatnya konsentrasi obat, dan nilai EE tertinggi adalah 83,2%. Menurut rumus, LE adalah 33,7%, yaitu 508,52 μg 5-FU dapat teradsorpsi pada 1 mg Tau-GO. Oleh karena itu, Tau-GO merupakan pembawa obat yang menjanjikan yang dapat mencapai beban obat yang besar. Mekanisme yang mungkin dari kapasitas pemuatan 5-FU yang tinggi ke Tau-GO dapat diringkas dengan penjelasan berikut:pertama, Tau digunakan untuk memfungsikan GO dan memperkenalkan gugus fungsi aktif (–SO3 ). –JADI3 memiliki kemampuan ionisasi yang kuat dalam larutan, yang mengurangi aglomerasi antara GO dan memfasilitasi pemuatan 5-FU ke Tau-GO. Kedua, potensi Zeta 5-FU-Tau-GO adalah 12,1 mV berbeda dari Tau-GO, yang menunjukkan bahwa 5-FU dimuat ke permukaan Tau-GO, dan interaksi elektrostatik memainkan peran penting dalam pemuatan 5-FU. Terakhir, ada banyak bentuk ikatan hidrogen antara pembawa 5-FU dan Tau-GO, termasuk –COOH di Tau-GO dan –NH– di 5-FU, –COOH di Tau-GO dan-dalam 5-FU C=O , –OH pada Tau-GO dan –NH– pada 5-FU, –OH pada Tau-GO dan –C=O pada 5-FU, –COOH dan 5-FU pada Tau-GO –F pada Tau-GO, – COOH dalam Tau-GO dan –F dalam 5-FU, ikatan hidrogen ini membuat 5-FU-Tau-GO stabil dalam larutan.
Pelepasan kumulatif in vitro 5-FU dari 5-FU-Tau-GO, pada suhu 37 °C dalam larutan PBS pH 1,2, 6,5 dan 7,4 (mensimulasikan lingkungan lambung, lingkungan sel kanker hati, dan lingkungan fisiologis, masing-masing) ditunjukkan pada Gambar 10. Ditemukan bahwa perilaku pelepasan 5-FU dipengaruhi oleh nilai pH lingkungan. Dalam buffer pH 7,4, pelepasan obat lambat dan terus menerus, dan jumlah total obat yang dilepaskan sekitar 70,84% setelah 72 jam. Sebaliknya, jumlah obat yang dilepaskan pada pH 7,4 secara signifikan lebih rendah daripada pada pH 1,2 dan pH 6,5 pada titik waktu yang sama. Pemuatan obat total yang dilepaskan dari 5-FU-Tau-GO dapat dicapai masing-masing sekitar 90,29% dan 85,75% dan pada pH 1,2 dan pH 6,5. Ini dapat dikaitkan dengan interaksi -π dan ikatan hidrogen antara 5-FU dan Tau-GO. Semakin rendah nilai pH, semakin tinggi derajat protonasi ikatan hidrogen. Oleh karena itu, kekuatan ikatan hidrogen dikendalikan oleh nilai pH, yang menyebabkan pelepasan 5-FU. Sistem penghantaran obat yang peka terhadap pH ini memainkan peran penting dalam obat anti-tumor dan dapat mencapai pelepasan obat ke dalam sel tumor.
Kurva pelepasan in vitro 5-FU-Tau-GO dalam salin fosfat pada 37 °C
Studi Sitotoksisitas In Vitro
Untuk mengevaluasi potensi toksisitas dan kemanjuran terapi tumor dari nanocarrier, viabilitas sel in vitro dilakukan dalam sel HepG2 menggunakan uji MTT (Gbr. 11). Tau-GO tidak menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan pada konsentrasi yang berbeda. Setelah pemuatan 5-FU, 5-FU-Tau-GO menunjukkan efek penghambatan yang jelas, dan dengan cara yang tergantung pada dosis, oleh karena itu, nanocarrier memiliki kemampuan untuk memberikan obat antitumor. IC50 nilai 5-FU-Tau-GO adalah 65,2 ± 0,7 μg/mL, yang lebih beracun daripada 5-FU gratis (196 ± 8,73 μg/mL). Ini mungkin karena kapasitas taurin untuk menginduksi apoptosis pada sel tumor, sehingga secara tidak langsung meningkatkan efek penghambatan 5-FU pada sel. Selanjutnya, dapat dilihat dari percobaan pelepasan in vitro bahwa 5-FU yang dimuat pada Tau-GO dapat dilepaskan secara bertahap di dalam sel. Oleh karena itu, waktu efektif 5-FU-Tau-GO pada sel lebih lama daripada 5-FU bebas, dan dengan demikian menghasilkan penghambatan yang lebih baik.
The viability of different concentrations of 5-FU, Tau-GO, and 5-FU-Tau-GO
AO fluorescent agent could emit green fluorescence when it passed through intact cell membranes and stained nuclei, while EB only marked the nucleus of damaged cells that emitted a red/orange fluorescence. The cells with early and late apoptosis presented greenish yellow or orange nuclei with the AO/EB stain, respectively. Therefore, AO/EB staining was performed to investigate whether the cells death was associated with apoptosis using characteristics of cell morphological changes. The results obtained from the AO/EB staining are presented in Fig. 12. Control cells were in spindle shape and with green nuclei. In the cell group that was cultured with Tau-GO alone, small parts of the nuclei were invaginated and with dark green or orange-red staining. Significant orange or red apoptotic cells with chromatin fragments and apoptotic bodies were observed in the 5-FU alone group. Compared with 5-FU, 5-FU-Tau-GO caused more damage to HepG2 cell morphology, which not only broke the cells, but also caused a large amount of apoptosis in cancer cells. As can be seen from the pictures, almost all the cells that were treated with 5-FU-Tau-GO, had morphological changes, a large number of cell debris and apoptotic bodies, indicating that the 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system had a good killing effect on HepG2 cells.
The AO/EB of control (a ), Tau-GO (b ), 5-FU (c ), and 5-FU-Tau-GO (d )
Pharmacokinetic Studies
The pharmacokinetic studies of 5-FU and 5-FU-Tau-GO were performed in SD rats. The profiles of 5-FU concentration in plasma vs. time, following oral administration, are presented in Fig. 13a. We found that the tendency of the two curves was similar, but the 5-FU plasma concentration from the 5-FU-Tau-GO nanocarrier was higher than that from the 5-FU alone and this was observed at each measured time point. Figure 13b shows the 5-FU in vivo release profiles via tail vein. The 5-FU-Tau-GO could achieve sustained drug release over 24 h, and the drug concentration gradually decreased in the first few hours, indicating that 5-FU was slowly released.
In vivo pharmacokinetic standard curves of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through oral administration (a ). In vivo pharmacokinetic standard curve of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through intravenous injection (b )
The two-compartment model was used to analyze the pharmacokinetic parameters of oral or intravenous administration in rats. The pharmacokinetic parameters are presented in Table 1. Compared with the 5-FU, the 5-FU-Tau-GO showed higher T1/2β that were 2.3 times by oral administration, and 3.0 times by intravenous injection, respectively. Moreover, the area under the concentration time curve (AUC0−t ) of 5-FU-Tau-GO nanocomplexes was roughy 2.1-fold higher through the oral administration, and 2.8-fold higher through intravenous injection when compared to that of the 5-FU solution, respectively. Therefore, we concluded that 5-FU-Tau-GO could significantly extend 5-FU retention time in vivo and improve bioavailability. In addition, the T1/2β of the 5-FU-Tau-GO nanocomplexes that were orally administered (1.67 ± 1.15 h), was longer than that of the intravenous injection (1.33 ± 0.64 h); however, the AUC0−t of oral administration (36.02 ± 1.83 mg/L*h) was lower than that of intravenous injection (96.50 ± 8.70 mg/L*h). These results might be due to two aspects:on the one hand, when administered by intravenous injection, the drug directly enters the blood system for circulation and without passing through the gastrointestinal barrier for redistribution; on the other hand, because 5-FU easily causes a certain damage to the gastrointestinal system, it may also affect the effective use of drugs in the body.
MD Simulations
The docking and molecular dynamics of unmodified GO, Tau-GO and 5-FU were simulated by molecular docking and molecular dynamics simulation. The molecular docking results of GO, Tau-GO and 5-FU are shown in Fig. 14, where it can be seen that the bond lengths of 5-FU and GO and Tau-GO are 3.66 Å and 2. 602 Å, respectively. Moreover, from the calculation results, the binding energies of 5-FU to GO and Tau-GO were 47.69 kcal/mol and 25.04 kcal/mol, respectively. These indicated that the binding force of Tau-GO and 5-FU was stronger than that of GO and 5-FU. This is due to Tau polar atoms, such as S and N, forming a stronger non-covalent bond with 5-FU, that makes the force between Tau-GO and 5-FU stronger.
The Molecular docking of GO sheets with 5-FU (a ). The molecular docking of Tau-GO with 5-FU (b )
The diagrams of the molecular dynamics simulation of GO, Tau-GO and 5-FU were shown in Fig. 15. According to the calculation results, the CED of 5-FU-GO and 5-FU-Tau-GO were 2.67*10
8
and 2.83*10
8
, masing-masing. These results showed a stronger interaction between the drug and the Tau-GO. The graphs between MSD and time were plotted (Fig. 16) to obtain the diffusion coefficient via MSD. The drug diffusion coefficients were obtained by the slope divided by 6 as follows:0.094m
2
/s and 0.058 m
2
/s. These show that the force between Tau-GO and 5-FU is stronger, which is consistent with the results of the molecular docking. Therefore, the functionalized GO makes the entire carrier more abundant in atoms and groups; Therefore, making the non-covalent bond with 5-FU stronger, and the entire system more stable.
Snapshots of the GO and 5-FU at the end of the MD (a ). Snapshots of the Tau-GO and 5-FU at the end of the MD (b )
The drug MSD profiles of the GO and 5-FU (a ), Tau-GO and 5-FU (b )
Conclusions
In summary, we successfully prepared a Tau-GO nanocomposite through a simple chemical method. GO functionalization with Tau has a good stability and improves its biocompatibility. The unique structure and brilliant properties of Tau-GO nanocarriers offer great opportunities for the loading and delivery of 5-FU. The 5-FU-Tau-GO has a potential anti-tumor ability and an excellent circulation time of drugs. Therefore, we believe that the modification of GO by the carrier Tau for 5-FU loading, is an effective and applicable tool for constructing a 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system for the delivery of anticancer drugs and anti-tumor therapy.
Ketersediaan Data dan Materi
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
