Microwave-Assisted Chitosan-Functionalized Graphene Oxide sebagai Nanosistem Penghantaran Obat Intraseluler Terkendali untuk Aktivitas Antitumor Sinergis
Abstrak
Untuk mencapai kemanjuran antitumor yang lebih baik, sangat penting untuk meningkatkan efisiensi penghantaran obat antikanker dalam menargetkan sel kanker. Dalam karya ini, nanosheets graphene oxide (ChrGO) yang difungsikan dengan kitosan dibuat melalui reduksi yang dibantu gelombang mikro, yang digunakan pada sistem nano pengiriman intraseluler untuk agen obat antikanker dalam sel kanker payudara. Penelitian pemuatan dan pelepasan obat menunjukkan bahwa adriamycin dapat dimuat dan dilepaskan secara efisien dari nanosheet ChrGO. Pelepasan obat yang lebih sedikit selama pengiriman dan biokompatibilitas yang lebih baik dari ChrGO/adriamycin secara signifikan meningkatkan keamanan dan kemanjuran terapeutiknya dalam sel BT-474 yang diekspresikan secara berlebihan oleh HER2. Selanjutnya, ChrGO/adriamycin dalam kombinasi dengan trastuzumab menunjukkan aktivitas antitumor sinergis dalam sel BT-474, yang menunjukkan kemanjuran terapeutik yang unggul dibandingkan dengan masing-masing obat saja. Sel yang diobati dengan trastuzumab (5 μg/mL) atau ChrGO/adriamycin yang setara (5 μg/mL) masing-masing menghasilkan 54,5% dan 59,5% kematian sel, sedangkan pengobatan kombinasi dengan trastuzumab dan ChrGO/adriamycin menghasilkan 88,5% sel yang dramatis. kematian. Terapi bertarget ganda menunjukkan apoptosis yang lebih tinggi, menunjukkan kemanjuran terapeutik yang unggul karena adanya mekanisme aksi yang berbeda. Pengobatan gabungan ChrGO/adriamycin dan trastuzumab dalam sel BT-474 menginduksi penghentian siklus sel dan apoptosis, yang pada akhirnya menyebabkan kematian sel kanker yang bertambah. Pekerjaan ini telah memberikan fabrikasi ChrGO yang dibantu gelombang mikro dengan mudah sebagai sistem nano pengiriman obat intraseluler yang terkontrol dan ditargetkan, yang diharapkan menjadi terapi baru yang menjanjikan untuk mengobati sel kanker payudara yang diekspresikan berlebihan oleh HER2.
Pengantar
Reseptor HER2 adalah anggota dari keluarga reseptor EGFR yang memediasi pertumbuhan dan diferensiasi sel kanker dan sangat diekspresikan pada 20-30% kanker payudara manusia, yang mengarah ke fenotipe tumor metastatik dan prognosis yang buruk [1]. HER2 juga diekspresikan secara berlebihan pada sekitar 20% kanker lambung manusia [2]. Trastuzumab, antibodi terapeutik monoklonal yang dimanusiakan, menunjukkan keuntungan terapeutik yang menjanjikan sebagai terapi lini pertama pada pasien kanker payudara yang diekspresikan berlebihan oleh HER2 [3]. Namun, tingkat respons keseluruhan terhadap trastuzumab tetap sederhana:15-30% bila diobati sebagai terapi tunggal dan 50-75% bila digunakan dalam pengobatan kombinasi dengan obat kemoterapi [4]. Di antara pasien yang merespon terhadap trastuzumab, sebagian besar dari mereka akhirnya berkembang setelah respon awal dan mendapatkan resistensi dari waktu ke waktu setelah pengobatan terus menerus [5]. Oleh karena itu, penting dan perlu untuk mengembangkan terapi baru tambahan untuk pasien dengan ekspresi berlebih HER2 untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup secara keseluruhan.
Antrasiklin masih berfungsi sebagai tulang punggung pengobatan kanker. Untuk agen antrasiklin, penghambat topoisomerase II adriamycin telah banyak digunakan untuk mengobati banyak kanker, seperti kanker payudara, paru-paru dan limfoid [6]. Adriamycin memiliki khasiat yang efektif dalam pengobatan pasien kanker payudara yang diekspresikan HER2, karena kedekatan antara gen HER2 dan gen topoisomerase II [7]. Terlepas dari manfaat klinis yang diamati dengan terapi berbasis antrasiklin pada kanker payudara, disfungsi jantung telah membatasi aplikasi terapeutik yang lebih luas. Dalam uji klinis, trastuzumab dalam kombinasi dengan adriamycin menunjukkan kemanjuran yang signifikan, sementara kardiotoksisitas yang sangat bergantung pada dosis adalah masalah yang harus dipecahkan [8]. Pelepasan berkelanjutan agen kemoterapi pada jaringan target kanker diakui sebagai solusi yang baik untuk menurunkan dosis yang diperlukan untuk kemanjuran terapeutik dan meningkatkan profil keamanan [9]. Untuk mencapai kemanjuran antitumor yang lebih baik tetapi efek samping yang lebih sedikit, ada kebutuhan mendesak untuk meningkatkan efisiensi penghantaran obat antikanker dalam menargetkan sel kanker.
Nanomaterial berbasis graphene oxide (GO) telah menunjukkan harapan besar dalam pengiriman terkontrol agen kemoterapi [10]. Sejumlah penelitian telah menunjukkan bahwa toksisitas GO dikaitkan dengan fungsionalisasi permukaannya [11]. Baru-baru ini, agen ramah lingkungan, seperti kitosan dan PEG, telah dilaporkan memfungsikan GO dengan gugus fungsi permukaan yang kurang beracun [12, 13]. Stabilitas koloid nanopartikel dalam media biologis sangat penting untuk pengembangan sistem penghantaran obat yang efektif dan aman untuk penggunaan klinis [14]. Nanosheet GO yang difungsikan telah mendapatkan perhatian besar dalam aplikasi biomedis karena sifatnya seperti biokompatibilitas dan stabilitas. Sebagai kandidat yang sangat baik untuk biomaterial berbasis graphene, stabilitas koloid GO atau rGO penting untuk mengendalikan kinerja pembawa obat. GO yang difungsikan poli (etilena glikol) menunjukkan sifat koloid yang ditingkatkan dalam media kultur sel [15]. P. Khanra melaporkan metode baru untuk reduksi simultan dan biofungsionalisasi GO dengan menggunakan sel ragi sebagai biokatalis reduktif [16, 17]. Avinav G menyajikan biosintesis satu pot GO dengan memanfaatkan ekstrak ragi selama proses autoklaf [18]. Perlakuan sonikasi lembar GO berukuran mikrometer selama berjam-jam menghasilkan lembar nano GO, yang menunjukkan stabilitas koloid lebih tinggi dibandingkan GO berukuran mikrometer biasa [19]. Meskipun penelitian sebelumnya menunjukkan potensi tinggi GO untuk biomaterial, nanosheet GO yang difungsikan secara bio dengan kitosan dengan reduksi bantuan gelombang mikro menggunakan ekstrak ragi bebas sel belum dipelajari sampai sekarang. Untuk tujuan ini, struktur graphene oxide (ChrGO) yang difungsikan dengan kitosan baru dibangun oleh sistem sintesis gelombang mikro yang mudah yang menggunakan ekstrak ragi sebagai reduktor. Selain itu, fungsionalisasi GO yang efektif dengan kitosan biokompatibel menyediakan platform potensial untuk pemuatan dan pengiriman obat yang efisien. Studi pemuatan dan pelepasan obat menunjukkan bahwa adriamycin dimuat dan dilepaskan secara efisien dari nanosheet ChrGO. Komposit ChrGO/adriamycin menunjukkan aktivitas antitumor yang signifikan dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Khususnya, pengobatan kombinasi dengan ChrGO/adriamycin dan trastuzumab menghasilkan efek penghambatan pertumbuhan yang ditingkatkan pada sel BT-474 dibandingkan dengan monoterapi. Kemanjuran antitumor sinergis dari agen-agen ini terungkap dimediasi melalui penghentian siklus sel dan apoptosis, yang pada akhirnya menyebabkan kematian sel kanker. Pekerjaan ini melaporkan rute yang menjanjikan untuk produksi komposit ChrGO yang cepat dan hemat biaya, yang memberikan agen kemoterapi dengan cara yang dikontrol secara spatiotemporal untuk pengobatan kanker yang efisien (Skema 1).
Biofungsionalisasi berbantuan gelombang mikro dan reduksi oksida grafit sebagai sistem nano penghantaran obat terkontrol untuk terapi bertarget ganda dalam sel BT-474 yang diekspresikan berlebihan oleh HER2
Bahan dan Metode
Materi
Bubuk grafit diperoleh dari Qingdao Huatai Tech (Qingdao, Cina). Kitosan dan adriamycin dibeli dari Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). Trastuzumab dibeli dari Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Swiss). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM) dan serum janin sapi (FBS) dibeli dari Invitrogen Corporation (Camarillo, USA). Mikrofon
®
Filter ultra sentrifugal dibeli dari Merck Millipore. CellTiter 96
®
kit uji proliferasi sel larutan satu larutan dan Caspase-Glo
®
Kit sistem pengujian 3/7 diperoleh dari Promega Corporation (Madison, AS). Ragi roti kering diperoleh dari AB/Mauri Co., Ltd. BT-474 dan garis sel Cos-7 diperoleh dari Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). Media Luria–Bertani dibeli dari Sangon Biotech Co., Ltd. Semua bahan kimia adalah kelas analitis dan tersedia secara komersial tanpa pemurnian lebih lanjut.
Reduksi Berbantuan Microwave pada GO yang Difungsikan dengan Kitosan
Graphite oxide (GO) dibuat dari serpihan grafit asli menggunakan metode Hummer yang dimodifikasi [14]. Untuk mendapatkan satu lapisan GO berukuran nano, GO dieksfoliasi dengan probe ultrasonik (Scientz, China) yang beroperasi pada 800 W selama 8 jam. Akhirnya, GO yang terkelupas didispersikan dalam air deionisasi untuk digunakan lebih lanjut. Lembaran nano kitosan-GO (ChrGO) yang direduksi sebagian disintesis melalui reduksi GO yang dibantu gelombang mikro dengan larutan berair kitosan menggunakan sistem sintesis gelombang mikro. Ekstrak ragi bebas sel digunakan untuk biosintesis ChrGO melalui reduksi yang dibantu gelombang mikro. Pertama, sel ragi yang ditebar diaktifkan dengan cara inokulasi ke dalam media Luria–Bertani dan pengocokan pada 135 rpm selama 18 jam pada suhu 25 °C. Sel ragi yang diaktifkan dipindahkan ke dalam larutan sukrosa 2% yang dikocok pada 135 rpm selama 6 jam lagi pada suhu 25 °C. Selanjutnya, 6 mL ekstrak ragi bebas sel diperoleh dengan pemisahan sentrifugal pada 2000 rpm selama 5 menit. Kemudian, 50 mg kitosan dilarutkan dalam 25 mL larutan asam asetat 2% (v/v) dan dicampur dengan ekstrak ragi [20]. Larutan GO 5 mg ditambahkan di bawah pengadukan magnet yang kuat. Akhirnya, larutan yang telah disiapkan dipindahkan ke peralatan sintesis gelombang mikro NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) untuk reaksi gelombang mikro. Skema pemanasan untuk sistem gelombang mikro melibatkan pemanasan hingga 80 °C selama 5 menit dan menahan suhu selama 5 menit lagi. ChrGO yang diperoleh dimurnikan dengan filter MWCO 100 kDa (Millipore, USA) dan dikeringkan-beku untuk digunakan lebih lanjut.
Karakterisasi
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari GO berukuran nano diperoleh pada mikroskop elektron transmisi JEM-2100 dengan tegangan akselerasi 200 kV (JEOL, Jepang). Spektrum ultraviolet–tampak (UV–Vis) diperoleh dengan menggunakan spektrofotometer UV/Vis/NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA). Spektrum inframerah transformasi Fourier (FTIR) dikumpulkan dengan menggunakan pemindaian spektrometer FTIR Vertex 70 dari 4000 hingga 400 cm
−1
dengan sampel disiapkan sebagai pelet KBr (Bruker, Jerman). Spektrum Raman direkam menggunakan mikroskop Raman Senterra R200-L dengan panjang gelombang eksitasi 532 nm (Bruker Optics, Jerman). Pola difraksi sinar-X (XRD) diperiksa oleh difraktometer Bruker D8 Advance (Bruker, Jerman). Elemen permukaan direkam menggunakan spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD dengan radiasi Al Ka monokromatik (1486,6 eV) (Shimadzu, Jepang). Analisis termogravimetri (TGA) dilakukan pada TGA PerkinElmer Pyris 1 pada laju pemanasan 5 °C/menit dari 30 hingga 800 °C dalam atmosfer nitrogen (PerkinElmer, USA). Muatan permukaan komposit diukur dengan instrumen Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, UK).
Pemuatan dan Pelepasan Obat
Empat miligram nanopartikel ChrGO disuspensikan dalam 20 mL larutan air adriamycin (0,4 mg/mL). Setelah sonikasi selama 0,5 jam, pengadukan dilakukan dalam gelap selama 24 jam, menghindari cahaya. Adriamycin yang tidak dimuat dihilangkan dengan penyaringan sentrifugasi melalui filter MWCO Amicon 50-kDa (Millipore, USA) dan dicuci dengan saline buffer fosfat (PBS, pH 8,0) sampai supernatan menjadi tidak berwarna. Konsentrasi adriamycin ditentukan menggunakan kurva konsentrasi adriamycin standar dengan spektrometri UV–Vis pada 490 nm dengan SpectraMax
®
Pembaca pelat mikro M5 (Perangkat Molekuler, AS). Jumlah adriamycin yang dimuat ke ChrGO ditentukan dengan absorbansi UV-Vis dengan mengukur konsentrasi hilangnya adriamycin dalam supernatan Amicon
®
Filter sentrifugal ultra-15 mL.
Karakteristik pelepasan adriamycin dari ChrGO dipelajari. ChrGO yang mengandung adriamycin direndam dalam 10 mL larutan buffer PBS. Pada interval tertentu, 2 mL larutan adriamycin yang dilepaskan terlepas dari ChrGO dikumpulkan dengan filtrasi sentrifugasi melalui filter Amicon MWCO 50 kDa (Millipore, USA). Volume larutan ChrGO/adriamycin dijaga konstan dengan menambahkan 2 mL larutan buffer PBS segar setelah setiap pengambilan sampel. Jumlah adriamycin yang dilepaskan dari ChrGO diukur dengan absorbansi UV–Vis pada 490 nm oleh SpectraMax
®
Pembaca pelat mikro M5 (Perangkat Molekuler, AS). Studi pelepasan diselidiki dalam larutan pH yang berbeda (nilai pH 5 dan 7,4).
Analisis Biokompatibilitas dan Uji Khasiat Terapi
Sel BT-474 dan Cos-7 dipelihara dalam RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS atau DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS, masing-masing, dan dikultur dalam atmosfer yang dilembabkan dengan 5% CO2 pada 37 °C. Uji biokompatibilitas GO dan ChrGO dilakukan pada sel BT-474 atau Cos-7 melalui uji sitotoksisitas sel. Sel dilapisi ke dalam pelat datar 96-sumur dengan kepadatan 3 × 10
4
sel per sumur dan diprainkubasi selama 18 jam sebelum perawatan dengan GO dan ChrGO. Kemudian, pengenceran agen yang diuji ditambahkan ke sel dan diinkubasi selama 24 jam. Kelangsungan hidup sel ditentukan oleh CellTiter 96
®
satu larutan berair. Absorbansi diukur pada 490 nm dengan SpectraMax
®
Pembaca pelat mikro M5 (Perangkat Molekuler, AS).
Kemanjuran kompleks ChrGO/adriamycin sendiri atau dalam pengobatan kombinasi dengan trastuzumab pada proliferasi dalam sel BT-474 diselidiki dengan uji penghambatan proliferasi [16]. Sel-sel BT-474 dilapisi ke dalam pelat datar 96-sumur dengan kepadatan 1 × 10
4
sel per sumur dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian, kompleks ChrGO/adriamycin sendiri atau dalam pengobatan kombinasi dengan trastuzumab diperkenalkan ke sel BT-474 dalam media kultur. Setelah inkubasi 96 jam, sel-sel yang hidup ditentukan oleh CellTiter 96
®
satu larutan berair. Absorbansi diukur dengan SpectraMax
®
Pembaca pelat mikro M5 pada 490 nm (Perangkat Molekuler, AS). Data dianalisis dengan one way ANOVA. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Analisis Siklus Sel dan Uji Apoptosis
Untuk analisis siklus sel, sel BT-474 dilapisi ke dalam pelat enam sumur dengan kepadatan 5 × 10
5
sel per sumur dan dibiarkan menempel selama 16 jam. Sel diperlakukan dengan kompleks ChrGO/adriamycin saja atau dalam kombinasi dengan trastuzumab selama 24 jam. Sel BT-474 dipanen dan difiksasi dengan etanol 70% (v/v) pada 4 °C selama 24 jam. Sel BT-474 terfiksasi diwarnai dengan larutan propidium iodida (15 μg/mL) yang mengandung ribonuklease A (10 μg/mL) pada suhu 25 °C selama satu jam. Kemudian, sel-sel dianalisis dengan flow cytometer (BD Biosciences, USA). Untuk uji apoptosis, sel BT-474 diunggulkan ke dalam pelat 96-sumur berdinding putih dengan kepadatan 2 × 10
4
sel per sumur dan dibiarkan menempel selama 18 jam. Sel diperlakukan dengan kompleks ChrGO/adriamycin, trastuzumab saja atau dalam pengobatan kombinasi selama 24 jam. Kemudian, media kultur dibuang, dan 100 L Caspase-Glo
®
Reagen 3/7 ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi di RT selama 2 jam. Pendaran diukur dengan SpectraMax
®
Pembaca pelat mikro M5 (Perangkat Molekuler, AS). Hasil dianalisis dengan one-way ANOVA. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Semua studi dilakukan sesuai dengan pedoman dan peraturan yang relevan.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi
Morfologi lembaran GO yang disintesis dicirikan oleh mikroskop elektron transmisi (TEM). Gambar 1a menunjukkan distribusi ukuran seragam nanosheet GO di bawah 100 nm, dengan ukuran rata-rata sekitar 45 nm. Kepadatan elektron yang tinggi dari GO menunjukkan kontras yang lebih baik dibandingkan dengan kitosan, yang hampir tidak terlihat karena kerapatan elektronnya yang rendah dan sifatnya yang terhidrasi [21]. Karena luas permukaan yang lebih tinggi, GO skala nano atau lembaran GO yang dikurangi telah banyak digunakan sebagai pembawa obat [22]. Pola difraksi elektron area terpilih (SAED) pada Gambar 1c menampilkan cincin konsentris, yang menunjukkan adanya sifat polikristalin yang sesuai dengan grafena oksida [23].
a Gambar TEM perbesaran rendah dari nanosheet GO, b gambar TEM resolusi tinggi dari nanosheet dan c pola SAED khas nanosheet GO
Untuk menstabilkan nanosheet GO dalam larutan fisiologis, nanosheet GO yang difungsikan dengan kitosan disiapkan dengan reduksi berbantuan gelombang mikro menggunakan sistem gelombang mikro [24]. GO-kitosan (ChrGO) tereduksi yang dihasilkan dianalisis dengan spektrometri UV-Vis. Gambar 2a menunjukkan spektrum UV–Vis GO dan ChrGO. GO menunjukkan puncak penyerapan yang tajam pada 230 nm dan bahu pada 300 nm, yang dianggap berasal dari π –π * transisi ikatan C=C aromatik dan n –π * transisi ikatan C=O, masing-masing [25, 26]. Setelah kitosan dicangkokkan ke GO, puncak pada 230 nm bergeser merah menjadi 270 nm untuk ChrGO, dan bahu pada 300 nm jelas menghilang, yang dianggap berasal dari restorasi parsial konjugasi elektronik di antara atom karbon aromatik [27]. Larutan hitam dari ChrGO yang disintesis ditunjukkan pada Gambar. 2b, yang menunjukkan pembentukan graphene oxide (p-rGO) yang tereduksi sebagian. Baik nanosheet GO dan ChrGO terdispersi dengan baik dalam H2 . yang terdeionisasi O. Stabilitas koloid turunan GO atau GO dalam larutan berair sangat penting untuk aplikasi biomedisnya. Hasilnya menunjukkan bahwa kitosan terkonjugasi dengan GO setelah reduksi.
a Spektrum UV–Vis dari nanosheet GO dan ChrGO dalam larutan berair, b foto-foto nanosheet GO dan ChrGO yang disintesis
Spektroskopi FTIR dilakukan untuk mengkarakterisasi struktur GO, kitosan dan ChrGO (Gbr. 3a). Puncak karakteristik GO terletak pada 3440 cm
−1
dan 1376 cm
−1
, sesuai dengan ikatan O-H dan C-OH, masing-masing. Puncaknya pada 1072 cm
−1
ditugaskan untuk getaran peregangan C-N-C. Terlihat jelas, puncak molekul kitosan pada 2912 cm
−1
dan 2848 cm
−1
dikaitkan dengan getaran peregangan CH3 – dan –CH2 – [28, 29]. P-rGO yang difungsikan dengan kitosan menghasilkan ikatan baru, yang mengarah ke puncak baru dalam spektrum ChrGO. Ada penurunan intensitas pita C=O yang signifikan pada 1636 cm
−1
di ChrGO dibandingkan dengan di GO, yang menunjukkan bahwa proses reduksi menghilangkan gugus GO yang mengandung oksigen [30]. Spektrum FTIR dari ChrGO mengkonfirmasi keberhasilan konjugasi kitosan pada GO. Selain itu, spektroskopi Raman digunakan untuk mengkarakterisasi sifat elektronik dan struktur graphene. Pita G dianggap berasal dari E2g fonon sp
2
domain karbon, sedangkan pita D ditetapkan untuk getaran sp
3
domain atom karbon dan atom karbon tidak teratur. Intensitas pita D menunjukkan karakteristik kelainan dan cacat pada lembaran karbon [31]. Pengurangan lembar nano GO juga dianalisis dalam rasio sinyal pita D versus pita G [32]. Spektrum Raman perwakilan GO menunjukkan dua puncak karakteristik pita D (1341 cm
−1
) dan pita G (1591 cm
−1
) pada Gbr. 3b. Perubahan intensitas relatif ID /IG nilai menggambarkan perubahan keadaan konjugasi elektronik GO dalam proses reduksi [33]. Pergeseran pita D menunjukkan keberhasilan fungsionalisasi GO yang dikurangi. Nilai ID /AkuG meningkat dari 0,99 (GO) menjadi 1,12 (ChrGO), yang dianggap berasal dari pengenalan sp3 cacat setelah fungsionalisasi dan pemulihan yang tidak lengkap dari struktur karakteristik graphene [34]. Pengamatan ini sesuai dengan laporan sebelumnya dan menyarankan pembentukan graphene yang difungsikan dengan kitosan [16].
a Spektrum FTIR GO, ChrGO dan kitosan, b Spektrum Raman dari GO dan ChrGO
Komposisi permukaan ChrGO dikonfirmasi oleh XPS. Pemindaian penuh spektrum XPS dari ChrGO menunjukkan tiga puncak pada 284, 399 dan 533 eV, yang masing-masing ditetapkan untuk C1, N1 dan O1 (Gbr. 4a). Analisis unsur relatif menunjukkan peningkatan kadar oksigen dan nitrogen ChrGO, dengan penurunan terkait kandungan karbon dibandingkan dengan GO. Spektrum C1s resolusi tinggi dari ChrGO yang ditunjukkan pada Gambar. 4b menunjukkan empat puncak yang terpisah, sesuai dengan C–C atau C=C (sp
2
, 284,7 eV), C-O (epoksi/hidroksil, 286,4 eV), C=O (sp
3
, 288,2 eV) dan ikatan O=C–O (karboksilat, 289,1 eV). Munculnya puncak amida di ChrGO memberikan bukti untuk fungsionalisasi kitosan di GO [35]. Gugus fungsi hidrofilik yang melimpah di permukaan membuat ChrGO sangat larut dalam larutan berair, yang konsisten dengan hasil FTIR. Biomolekul seperti asam amino reduktif dan asam alfa-linolenat dalam ekstrak ragi mungkin memiliki peran penting dalam fabrikasi ChrGO yang dibantu gelombang mikro [20].
a Survei spektrum XPS GO dan ChrGO, b spektrum resolusi tinggi dari C1
Pola difraksi sinar-X (XRD) GO dan ChrGO disajikan pada Gambar 5a. Dalam spektrum GO XRD, puncak utama pada 110° dan puncak lemah pada 20,7° dengan jelas menunjukkan struktur grafit. Puncak difraksi fitur pada 110° sesuai dengan bidang (001) GO, yang menunjukkan keberhasilan sintesis GO [36]. Benjolan kecil antara 20° dan 24° menunjukkan bagian grafit, yang dianggap berasal dari grafit murni yang tidak teroksidasi [37]. Dengan berfungsinya kitosan, puncak (001) GO menghilang, sedangkan puncak difraksi luas pada 21,4° menjadi menonjol. Pergeseran ini dapat dikaitkan dengan pengurangan GO, di mana pengurangan membuat paket rGO lebih ketat daripada GO. Refleksi (002) sampel ChrGO sangat luas, menunjukkan bahwa sampel tersusun sangat buruk di sepanjang arah penumpukan, yang mungkin dianggap berasal dari reduksi GO yang tidak lengkap [33]. Perilaku dekomposisi GO, kitosan dan ChrGO telah dipelajari dengan analisis gravitasi termal (TGA) [38]. Kurva TGA dari ChrGO, GO dan kitosan ditunjukkan pada Gambar 5b, yang diukur dalam atmosfer nitrogen. GO mulai menurunkan berat badan di bawah 100 °C, yang dikaitkan dengan eliminasi air bebas yang teradsorpsi dalam struktur tumpukan [39]. GO kehilangan 42% beratnya dalam kisaran 191–231 °C, yang terkait dengan dekomposisi gugus yang mengandung oksigen labil. Laju penurunan berat ChrGO pada 100–250 °C secara signifikan lebih rendah daripada GO, dan jelas bahwa ChrGO menunjukkan pola dekomposisi yang berbeda dibandingkan dengan GO. Eliminasi termal ChrGO dan kitosan murni terjadi dari 250 hingga 440 °C, yang terkait dengan depolimerisasi dan pirolisis gugus fungsi yang lebih stabil, seperti unit glikosidik kitosan dan gugus karboksil [40]. Dibandingkan dengan GO, ChrGO stabil secara termal dan memberikan penurunan berat yang besar sebesar 36% pada tahap dekomposisi pertama pada 250–440 °C, sedangkan sedikit penurunan berat yang ditampilkan untuk GO. Penurunan berat badan yang signifikan di wilayah suhu tinggi 450-800 °C disebabkan oleh degradasi termal kerangka karbon, yang dapat dianggap berasal dari residu kitosan dan biomolekul dari ekstrak ragi seperti asam amino [41].
a Pola XRD GO dan ChrGO, b Kurva TGA dari GO, kitosan dan ChrGO
Muatan permukaan GO dan ChrGO diukur dengan instrumen Malvern Zeta Nano ZS-90, yang merupakan parameter penting stabilitas koloid. Kepadatan muatan permukaan yang lebih tinggi pada nanosheet GO menciptakan dispersi koloid yang lebih stabil [42]. Seperti yang ditunjukkan pada File tambahan 1:Gbr. S1, potensi zeta GO menurun secara monoton dari − 10,7 mV pada pH 3 menjadi 35,5 mV pada pH 11, yang mengkonfirmasi muatan negatif pada permukaan nanosheet GO. Nilai potensial zeta untuk ChrGO secara komparatif kurang dari potensi GO pada pH apa pun mulai dari 3 hingga 11. Lembar nano ChrGO menunjukkan stabilitas di seluruh rentang nilai pH, sementara koloid GO tereduksi dilaporkan kurang stabil dalam air deionisasi karena meningkat π –π menumpuk di permukaan terdeoksigenasi [43]. Meskipun beberapa gugus amina bebas terdapat pada permukaan kitosan [44], potensi zeta yang lebih tinggi dari ChrGO tidak tercapai. Nilai potensial zeta yang lebih rendah dari ChrGO dapat dianggap berasal dari molekul asam amino negatif yang melimpah dari ekstrak ragi, yang meningkatkan stabilitas koloid dalam larutan fisiologis [20]. Permukaan ChrGO yang bermuatan negatif membuatnya berpotensi untuk digunakan dalam pemuatan dan pengiriman obat.
Biokompatibilitas ChrGO As-Synthesized
Biokompatibilitas ChrGO yang disintesis penting untuk aplikasinya dalam penghantaran obat. Sitotoksisitas sel ChrGO dan GO diselidiki dengan uji sitotoksisitas. Sel Cos-7 dan sel BT-474 diinkubasi dengan adanya ChrGO atau GO selama 24 jam. Hasil sitotoksisitas sel ditunjukkan pada Gambar 6. Dapat disimpulkan bahwa ChrGO tidak menunjukkan sitotoksisitas sel yang jelas pada sel Cos-7 dan BT-474. Bahkan pada konsentrasi 100 μg/mL, viabilitas sel di atas 90%. Namun, GO menunjukkan sitotoksisitas sel yang signifikan dengan cara yang bergantung pada dosis, dengan hanya kelangsungan hidup sel 73,0 ± 0,5% dan 71,0 ± 0,5% untuk sel Cos-7 dan BT-474 pada konsentrasi masing-masing 100 μg/mL. Hasilnya menunjukkan bahwa kitosan yang difungsikan pada permukaan GO menunjukkan sitotoksisitas yang sangat rendah dan meningkatkan biokompatibilitas. Fungsionalisasi permukaan GO dengan makromolekul telah dilaporkan sangat melemahkan efek sitotoksiknya [45]. Hu dkk. melaporkan bahwa serum janin sapi dalam media sel secara nyata menurunkan sitotoksisitas sel GO pada sel kanker paru non-sel kecil A549 [46].
Biokompatibilitas GO dan ChrGO. Berbagai konsentrasi nanopartikel dikultur dengan a Cos-7 sel dan b sel BT-474, dan pengaruhnya terhadap viabilitas sel telah ditentukan
Memuat dan Melepaskan obat
Aplikasi biomedis potensial dari ChrGO sebagai pembawa obat diukur dengan perilaku pemuatan dan pelepasan obat. Karakteristik struktural turunan graphene sangat efektif untuk penghantaran obat aromatik karena luas permukaan spesifiknya yang sangat besar. Adriamycin adalah salah satu kemoterapi tumor utama terhadap berbagai keganasan hematologi dan tumor padat dan sering digunakan sebagai model obat untuk mengevaluasi sistem pengiriman obat turunan graphene [47]. Kapasitas pemuatan adriamycin ke nanosheet ChrGO diverifikasi oleh karakteristik puncak absorbansi UV-Vis adriamycin pada 490 nm. Seperti yang diharapkan, efisiensi pemuatan maksimum adriamycin yang terikat pada nanosheet ChrGO setinggi 169,8%, yang sebagian disebabkan oleh luas permukaan besar dari nanosheet ChrGO. Nanokomposit ChrGO/adriamycin yang mengandung adriamycin mudah didispersikan ke dalam buffer fisiologis, menampilkan larutan transparan dengan warna sedikit kemerahan.
Untuk mengeksplorasi profil pelepasan adriamycin dari kompleks ChrGO/adriamycin, nilai pH PBS yang berbeda diperkenalkan untuk meniru lingkungan sel tumor. File tambahan 1:Gbr. S2 menunjukkan profil pelepasan kumulatif adriamycin dari ChrGO/adriamycin pada pH 5 dan 7,4. Adriamycin yang dilepaskan dari ChrGO/adriamycin ditandai dengan pelepasan awal yang cepat dan kemudian tahap pelepasan yang lebih lambat dalam larutan pH 5,0 PBS. Pelepasan kumulatif adriamycin adalah 6,5% dalam 3 jam pertama dan kemudian menunjukkan peningkatan yang lambat menjadi 26,7% dalam 96 jam pada pH 5,0. Sebaliknya, persentase adriamycin dari ChrGO/adriamycin meningkat lebih lambat dan lebih rendah pada pH 7,4, menunjukkan persentase pelepasan adriamycin dari 2,5% dalam 3 jam sebelumnya menjadi 7,4% dalam 96 jam. Studi sebelumnya telah menunjukkan profil pelepasan obat dari GO yang difungsikan sangat lambat dalam media pada pH 7,4 [48]. Protonasi gugus karboksil pada ChrGO menurunkan penumpukan -π, ikatan H dan interaksi elektrostatik antara adriamycin dan ChrGO, memfasilitasi pelepasan adriamycin dalam media asetat [49]. Sensitivitas pH memberikan potensi ChrGO/adriamycin untuk penghantaran obat spesifik lokasi, yang selanjutnya meningkatkan sitotoksisitas dalam sel tumor.
Kemanjuran Terapi Kompleks ChrGO/Adriamycin
Kemanjuran terapeutik kompleks ChrGO/adriamycin dalam sel kanker BT-474 yang diekspresikan berlebihan oleh HER2 diselidiki dengan uji penghambatan proliferasi. Ekspresi berlebih dari reseptor HER2 memiliki peran kunci dalam transformasi sel kanker payudara BT-474. Pengobatan dengan trastuzumab saja, antibodi monoklonal anti-HER2, menghasilkan penghambatan pertumbuhan yang signifikan dari sel BT-474 [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.
a In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0.01, ***p < 0.001
To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.
Cell Cycle Analysis and Apoptosis
To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].
a Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p < 0.01, ***p < 0.001
To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.
Kesimpulan
In the present work, the chitosan-functionalized graphene oxide nanosheets were structured with microwave-assisted reduction, which demonstrated biocompatibility and good dispersion stability. The as-prepared nanocomposites showed high efficiency of drug encapsulation and delivery. The ChrGO/adriamycin nanosheets displayed significant growth inhibition of BT-474 in a dose-dependent manner. The combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in superior therapeutic efficacy in BT-474 cells compared to that with each agent alone. The results are favourable for the development of intracellular nanocarriers to deliver drugs in a controlled manner, which is expected to improve the therapeutic effect on HER2-overexpressing cancer therapies.
Ketersediaan data dan materi
Kumpulan data yang mendukung kesimpulan dari studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
