Grafit Oksida Tepur Mikrogelap Terkait Chitosan untuk Pengiriman Adriamycin Terpadu dan Terapi Kanker Payudara Tingkat
Abstrak
Untuk mencapai efektivitas antitumor yang lebih baik, sangat mendesak untuk meningkatkan efisiensi pengiriman obat anticancer dalam menargetkan sel kanker. Dalam karya ini, nanosheet grafit oksida terkait chitosan (ChrGO) dibuat melalui reduksi yang dibantu mikrogelap, yang digunakan untuk sistem pengiriman intracelular agen obat anticancer pada sel kanker payudara. Penelitian pemuatan dan peluapan obat menunjukkan bahwa adriamycin dapat dimuat secara efisien dan dilapisi dari nanosheet ChrGO. Peluapan obat yang lebih sedikit selama pengiriman dan kompatibilitas biologik yang lebih baik dari ChrGO/adriamycin secara signifikan meningkatkan keamanan dan efektivitas terapeutiknya pada sel BT-474 yang overexpressi HER2. Selanjutnya, ChrGO/adriamycin dalam kombinasi dengan trastuzumab menunjukkan aktivitas antitumor sinergis pada sel BT-474, yang menunjukkan efektivitas terapeutik yang unggul dibandingkan setiap obat sendirian. Sel yang diobati dengan trastuzumab (5 μg/mL) atau ChrGO/adriamycin setara (5 μg/mL) masing-masing memicu kematian sel sebesar 54,5% dan 59,5%, sementara perawatan kombinasi dengan trastuzumab dan ChrGO/adriamycin menghasilkan kematian sel yang dramatis sebesar 88,5%. Terapi target dual menunjukkan apoptosis yang lebih tinggi, yang mengindikasikan efektivitas terapeutik yang unggul karena adanya mekanisme tindakan yang berbeda. Perawatan kombinasi ChrGO/adriamycin dan trastuzumab pada sel BT-474 menyebabkan siklus sel berhenti dan apoptosis, yang pada akhirnya mengarah pada kematian sel kanker yang ditingkatkan. Karya ini telah menyediakan pembuatan ChrGO yang mudah yang dibantu mikrogelap sebagai sistem pengiriman obat intracelular yang dapat dikontrol dan ditargetkan, yang diharapkan menjadi terapi baru yang menjanjikan untuk mengobati sel kanker payudara yang overexpressi HER2.
Pendahuluan
Resseptor HER2 adalah anggota dari keluarga resseptor EGFR yang memediasi pertumbuhan dan diferensiasi sel kanker dan secara tinggi overexpressi pada 20–30% kanker payudara manusia, yang mengarah pada fenotipe tumor metastatik dan prognosis buruk [1]. HER2 juga overexpressi pada sekitar 20% kanker lambung manusia [2]. Trastuzumab, anticor monoklonal terapeutik humanisasi, menunjukkan keuntungan terapeutik yang menjanjikan sebagai terapi garis pertama pada pasien kanker payudara yang overexpressi HER2 [3]. Namun, tingkat respons keseluruhan terhadap trastuzumab tetap moderat: 15–30% ketika diobati sebagai terapi tunggal dan 50–75% ketika digunakan dalam kombinasi dengan obat kimia [4]. Di antara pasien yang merespons terhadap trastuzumab, mayoritas mereka pada akhirnya progres setelah respons awal dan mengembangkan resistensi seiring waktu setelah perawatan berkelanjutan [5]. Maka dari itu, sangat penting dan perlu untuk mengembangkan terapi tambahan yang baru bagi pasien yang overexpressi HER2 untuk meningkatkan tingkat kelangsungan hidup keseluruhan.
Antrasiklin masih menjadi tulang punggung perawatan kanker. Untuk agen antrasiklin, inhibitor topoisomerase II adriamycin telah digunakan secara luas untuk mengobati banyak kanker, seperti kanker payudara, paru-paru dan limfoid [6]. Adriamycin memiliki efektivitas yang efektif dalam pengobatan pasien kanker payudara yang overexpressi HER2, karena kedekatan antara gen HER2 dan gen topoisomerase II [7]. Meskipun manfaat klinis yang diamati dengan terapi berbasis antrasiklin dalam kanker payudara, disfungsi jantung telah membatasi aplikasi terapeutik yang lebih luas. Dalam uji klinis, trastuzumab dalam kombinasi dengan adriamycin menunjukkan efektivitas yang signifikan, sementara kardiotoksisitas yang sangat bergantung pada dosis adalah masalah yang harus diatasi [8]. Peluapan sosten obat kimia pada jaringan target kanker diakui sebagai solusi yang baik untuk menurunkan dosis yang diperlukan untuk efektivitas terapeutik dan meningkatkan profil keamanan [9]. Untuk mencapai efektivitas antitumor yang lebih baik tetapi sedikit efek samping, ada kebutuhan mendesak untuk meningkatkan efisiensi pengiriman obat anticancer dalam menargetkan sel kanker.
Nanomaterial berbasis grafit oksida (GO) telah menunjukkan janji yang besar dalam pengiriman yang terkontrol agen kimia [10]. Banyak studi telah menunjukkan bahwa toksisitas GO terkait dengan fungsionalisasi permukaannya [11]. Terakhir, agen yang ramah lingkungan, seperti chitosan dan PEG, telah dilaporkan untuk fungsionalisasi GO dengan kelompok fungsi permukaan yang kurang beracun [12, 13]. Stabilitas koloidal nanopartikel dalam media biologis sangat penting untuk pengembangan sistem pengiriman obat yang efektif dan aman untuk penggunaan klinis [14]. Nanosheet GO yang difungsionalisasi telah mendapat banyak perhatian dalam aplikasi biomedis karena properti mereka seperti kompatibilitas biologik dan stabilitas. Sebagai calon yang baik untuk bahan biomaterial berbasis grafit, stabilitas koloidal GO atau rGO penting untuk mengontrol performa pembawa obat. GO yang difungsionalisasi pol (etilena glikol) menunjukkan properti koloidal yang ditingkatkan dalam media budaya sel [15]. P. Khanra melaporkan metode baru untuk reduksi dan biofungsionalisasi simultan GO dengan menggunakan sel yeast sebagai biokatalis redutif [16, 17]. Avinav G menyajikan biosintesis satu-tungku GO dengan menggunakan ekstrak yeast selama proses autoklaf [18]. Perlakuan ultrasonik pada lembar GO berukuran mikrometer selama jam menghasilkan nanosheet GO, yang menunjukkan stabilitas koloidal yang lebih tinggi dibandingkan GO mikrometer reguler [19]. Meskipun studi sebelumnya telah menunjukkan potensi tinggi GO untuk biomaterial, nanosheet GO yang difungsionalisasi bio dengan chitosan menggunakan reduksi yang dibantu mikrogelap dengan ekstrak yeast bebas sel belum diteliti sejauh ini. Untuk tujuan ini, struktur grafit oksida terkait chitosan (ChrGO) baru dibuat dengan sistem sintesis mikrogelap yang mudah yang menggunakan ekstrak yeast sebagai redutan. Selain itu, fungsionalisasi yang efektif GO dengan chitosan yang kompatibel biologis memberikan platform potensial untuk pemuatan dan pengiriman obat yang efisien. Studi pemuatan dan peluapan obat menunjukkan bahwa adriamycin dimuat secara efisien dan dilapisi dari nanosheet ChrGO. Komposit ChrGO/adriamycin menunjukkan aktivitas antitumor yang signifikan dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Khususnya, perawatan kombinasi dengan ChrGO/adriamycin dan trastuzumab menghasilkan efek inhibisi pertumbuhan yang ditingkatkan pada sel BT-474 dibandingkan dengan monoterapi. Efektivitas antitumor sinergis dari agen ini terungkap dimediasi melalui siklus sel berhenti dan apoptosis, yang pada akhirnya mengarah pada kematian sel kanker. Karya ini melaporkan jalur yang menjanjikan untuk produksi cepat dan hemat biaya komposit ChrGO, yang mengirimi agen kimia dengan cara yang terkontrol spasial-temporal untuk pengobatan kanker yang efisien (Skema 1).
Biofungsionalisasi dan reduksi grafit oksida yang dibantu mikrogelap sebagai sistem pengiriman obat yang terkontrol untuk terapi target dual pada sel BT-474 yang overexpressi HER2
Bahan dan Metode
Bahan
Serbuk grafit diperoleh dari Qingdao Huatai Tech (Qingdao, China). Chitosan dan adriamycin dibeli dari Aladdin Co., Ltd. (Shanghai, China). Trastuzumab dibeli dari Hoffmann-La Roche Ltd (Basel, Switzerland). Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) dan serum sapi fetus (FBS) dibeli dari Invitrogen Corporation (Camarillo, USA). Amicon® Ultra centrifugal filters dibeli dari Merck Millipore. CellTiter 96® aqueous one solution cell proliferation assay kit dan Caspase-Glo® 3/7 assay system kit diperoleh dari Promega Corporation (Madison, USA). Ragi kering diperoleh dari AB/Mauri Co., Ltd. Sel BT-474 dan Cos-7 diperoleh dari Cell Bank of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China). Media Luria–Bertani dibeli dari Sangon Biotech Co., Ltd. Semua kimia adalah grade analitis dan tersedia secara komersial tanpa pemurnian lebih lanjut.
Reduksi Grafit Oksida Terkait Chitosan yang Dibantu Mikrogelap
Grafit oksida (GO) disiapkan dari lembar grafit asli menggunakan metode Hummer yang dimodifikasi [14]. Untuk mendapatkan lapisan tunggal GO berukuran nano, GO diekfolias dengan ultrasonik probe (Scientz, China) yang beroperasi pada 800 W selama 8 jam. Terakhir, GO yang diekfoliasi dispersi dalam air deionisasi untuk digunakan lebih lanjut. Nanosheet chitosan–GO (ChrGO) yang sebagian direduksi disintesis melalui reduksi yang dibantu mikrogelap dari GO dengan larutan chitosan air menggunakan sistem sintesis mikrogelap. Ekstrak yeast bebas sel digunakan untuk biosintesis ChrGO melalui reduksi yang dibantu mikrogelap. Pertama, sel yeast yang disimpan diaktifkan dengan inokulasi ke dalam media Luria–Bertani dan digetarkan pada 135 rpm selama 18 jam pada 25 °C. Sel yeast yang diaktifkan dipindahkan ke dalam larutan sukrosa 2% digetarkan pada 135 rpm selama 6 jam lagi pada 25 °C. Selanjutnya, 6 mL ekstrak yeast bebas sel diperoleh melalui pemisahan sentrifugal pada 2000 rpm selama 5 menit. Kemudian, 50 mg chitosan dilarutkan dalam 25 mL larutan asam asetat 2% (v/v) dan dicampur dengan ekstrak yeast [20]. Larutan GO 5 mg ditambahkan di bawah pengadukan magnet yang kuat. Terakhir, larutan yang disiapkan dipindahkan ke dalam peralatan sintesis mikrogelap NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, China) untuk reaksi mikrogelap. Skema pemanasan untuk sistem mikrogelap melibatkan pemanasan ke 80 °C selama 5 menit dan mempertahankan suhu selama 5 menit lagi. ChrGO yang diperoleh dipurifikasi dengan filter 100-kDa MWCO (Millipore, USA) dan didinginkan beku untuk digunakan lebih lanjut.
Karakterisasi
Gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) dari GO berukuran nano diperoleh pada mikroskop elektron transmisi JEM-2100 dengan tegangan percepatan 200 kV (JEOL, Jepang). Spektra ultraviolet–visibel (UV–Vis) diperoleh menggunakan spectrophotometer UV/Vis/NIR Lambda 950 (Perkin-Elmer, USA). Spektra inframerah transformasi Fourier (FTIR) dikumpulkan dengan menggunakan spectrometer FTIR Vertex 70 memindai dari 4000 hingga 400 cm−1 dengan sampel disiapkan sebagai pellet KBr (Bruker, Jerman). Spektra Raman dicatat menggunakan mikroskop Raman Senterra R200-L dengan panjang gelombang excitasi 532 nm (Bruker Optics, Jerman). Pola difraksi sinar-X (XRF) diperiksa dengan difraktometer Bruker D8 Advance (Bruker, Jerman). Elemen permukaan dicatat menggunakan spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) Kratos AXIS Ultra DLD dengan radiasi Al Ka monokromatik (1486,6 eV) (Shimadzu, Jepang). Analisis gravimetrik termal (TGA) dilakukan pada PerkinElmer Pyris 1 TGA dengan laju pemanasan 5 °C/min dari 30 hingga 800 °C dalam atmosfer nitrogen (PerkinElmer, USA). Muatan permukaan komposit diukur dengan instrumen Malvern Zeta Nano ZS-90 (Malvern, Inggris).
Pemuatan dan Peluapan Obat
Empat miligram nanopartikel ChrGO ditangguhkan dalam 20 mL larutan adriamycin air (0,4 mg/mL). Setelah ultrasonik selama 0,5 jam, pengadukan dilakukan dalam gelap selama 24 jam, menghindari cahaya. Adriamycin yang tidak dimuat dihilangkan melalui filter sentrifugal Amicon 50-kDa MWCO (Millipore, USA) dan dicuci dengan larutan sal fosfat (PBS, pH 8,0) hingga nadir menjadi warna. Konsentrasi adriamycin ditentukan menggunakan kurva konsentrasi adriamycin standar dengan spektrometri UV–Vis pada 490 nm dengan pembaca mikropirang SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Jumlah pemuatan adriamycin pada ChrGO ditentukan dengan absorpsi UV–Vis dengan mengukur konsentrasi kehilangan adriamycin dalam nadir filter sentrifugal Amicon® Ultra-15 mL.
Karakteristik peluapan adriamycin ChrGO diteliti. ChrGO yang dimuat adriamycin direndam dalam 10 mL larutan buffer PBS. Pada interval waktu tertentu, 2 mL larutan adriamycin yang dilepaskan yang terlepas dari ChrGO dikumpulkan melalui filter sentrifugal Amicon 50-kDa MWCO (Millvern, USA). Volume larutan ChrGO/adriamycin dipertahankan konstan dengan menambahkan 2 mL larutan buffer PBS segar setelah setiap pengambilan sampel. Jumlah adriamycin yang dilepaskan dari ChrGO diukur dengan absorpsi UV–Vis pada 490 nm oleh pembaca mikropirang SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Studi peluapan dilakukan dalam larutan pH yang berbeda (nilai pH 5 dan 7,4).
Analisis Kompatibilitas Biologik dan Uji Efektivitas Terapeutik
Sel BT-474 dan Cos-7 dipertahankan dalam RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10% FBS atau DMEM yang dilengkapi dengan 10% FBS, masing-masing, dan dibudidayakan dalam atmosfer lembap 5% CO2 pada 37 °C. Uji kompatibilitas biologik GO dan ChrGO dilakukan pada sel BT-474 atau Cos-7 melalui uji sitotoksisitas sel. Sel ditempatkan pada pirang datar 96-lubang dengan densitas 3 × 104 sel per lubang dan diinkubasi sebelumnya selama 18 jam sebelum diobati dengan GO dan ChrGO. Kemudian, pelarutan agen yang diuji ditambahkan ke sel dan diinkubasi selama 24 jam lagi. Kehidupan sel ditentukan oleh CellTiter 96® aqueous one solution. Absorpsi diukur pada 490 nm oleh pembaca mikropirang SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA).
Efektivitas komposit ChrGO/adriamycin sendirian atau dalam kombinasi perawatan dengan trastuzumab terhadap proliferasi sel BT-474 diteliti dengan uji inhibi proliferasi [16]. Sel BT-474 ditempatkan pada pirang datar 96-lubang dengan densitas 1 × 104 sel per lubang dan diinkubasi selama 24 jam. Kemudian, komposit ChrGO/adriamycin sendirian atau dalam kombinasi perawatan dengan trastuzumab diperkenalkan ke sel BT-474 dalam media budaya. Setelah inkubasi 96 jam, sel yang hidup ditentukan oleh CellTiter 96® aqueous one solution. Absorpsi diukur dengan pembaca mikropirang SpectraMax® M5 pada 490 nm (Molecular Devices, USA). Data dianalisis dengan ANOVA satu arah. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Analisis Siklus Sel dan Uji Apoptosis
Untuk analisis siklus sel, sel BT-474 ditempatkan pada pirang enam lubang dengan densitas 5 × 105 sel per lubang dan diizinkan untuk menempel selama 16 jam. Sel diobati dengan komposit ChrGO/adriamycin sendirian atau dalam kombinasi dengan trastuzumab selama 24 jam. Sel BT-474 dipanen dan dikonstip dengan etanol 70% (v/v) pada 4 °C selama 24 jam. Sel BT-474 yang dikonstip diwarnai dengan larutan iodida propidium (15 μg/mL) yang berisi ribonuklease A (10 μg/mL) pada 25 °C selama satu jam. Kemudian, sel dianalisis dengan sitometer aliran (BD Biosciences, USA). Untuk uji apoptosis, sel BT-474 ditanam pada pirang 96-lubang dinding putih dengan densitas 2 × 104 sel per lubang dan diizinkan untuk menempel selama 18 jam. Sel diobati dengan komposit ChrGO/adriamycin, trastuzumab sendirian atau dalam kombinasi perawatan selama 24 jam. Kemudian, media buang dibuang, dan 100 µL reagen Caspase-Glo® 3/7 ditambahkan ke setiap lubang dan diinkubasi pada RT selama 2 jam. Luminesensi diukur oleh pembaca mikropirang SpectraMax® M5 (Molecular Devices, USA). Hasil dianalisis dengan ANOVA satu arah. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Semua studi dilakukan sesuai dengan pedoman dan peraturan yang relevan.
Hasil dan Pembahasan
Sintesis dan Karakterisasi
Morfologi lembar GO yang disintesis dikarakterisasi oleh mikroskop elektron transmisi (TEM). Gambar 1a mengungkapkan distribusi ukuran yang seragam dari nanosheet GO di bawah 100 nm, dengan ukuran rata-rata sekitar 45 nm. Kepadatan elektron tinggi GO menunjukkan kontras yang lebih baik dibandingkan chitosan, yang hampir tidak terlihat karena kepadatan elektron rendah dan sifat terhidrasi [21]. Karena luas permukaan yang lebih besar, lembar GO atau GO yang direduksi skala nano telah digunakan secara luas sebagai pembawa obat [22]. Pola difraksi elektron area terpilih (SAED) pada Gambar 1c menampilkan cincin konsentrik, yang menunjukkan keberadaan sifat policristal yang sesuai dengan grafit oksida [23].
a Gambar TEM pemendekan lembar GO, b gambar TEM resolusi tinggi nanosheet dan c pola SAED tipikal nanosheet GO
Untuk menstabilkan nanosheet GO dalam larutan fisiologis, nanosheet GO terkait chitosan disiapkan melalui reduksi yang dibantu mikrogelap menggunakan sistem mikrogelap [24]. ChrGO yang dihasilkan dianalisis dengan spektrometri UV–Vis. Gambar 2a menunjukkan spektrum UV–Vis GO dan ChrGO. GO menunjukkan puncak absorpsi tajam pada 230 nm dan bahu pada 300 nm, yang diatribusikan ke transisi π–π* ikatan aromatik C=C dan transisi n–π* ikatan C=O, masing-masing [25, 26]. Setelah chitosan digabung ke GO, puncak pada 230 nm redshift ke 270 nm untuk ChrGO, dan bahu pada 300 nm hilang secara nyata, yang diatribusikan ke pemulihan sebagian konjugasi elektron di antara atom karbon aromatik [27]. Larutan hitam ChrGO yang disintesis ditunjukkan pada Gambar 2b, yang mengindikasikan terbentuknya grafit oksida yang sebagian direduksi (p-rGO). Baik lembar GO maupun ChrGO terdisersai dengan baik dalam air deionisasi H2O. Stabilitas koloidal GO atau turunan GO dalam larutan air sangat penting untuk aplikasi biomedisnya. Hasilnya menunjukkan bahwa chitosan terkonjugasi dengan GO setelah reduksi.
a Spektra UV–Vis lembar GO dan ChrGO dalam larutan air, b foto lembar GO dan ChrGO yang disintesis
Spektroskopi FTIR dilakukan untuk mengkarakterisasi struktur GO, chitosan dan ChrGO (Gambar 3a). Puncak karakteristik GO terletak pada 3440 cm−1 dan 1376 cm−1, yang sesuai dengan ikatan O–H dan C–OH, masing-masing. Puncak pada 1072 cm−1 ditetapkan ke getaran peregangan C–N–C. Secara mencolok, puncak molekul chitosan pada 2912 cm−1 dan 2848 cm−1 diatribusikan ke getaran peregangan CH3– dan –CH2– [28, 29]. Grafit oksida yang sebagian direduksi yang difungsionalisasi dengan chitosan menghasilkan ikatan baru, yang mengarah pada puncak baru dalam spektrum ChrGO. Ada penurunan signifikan dalam intensitas band C=O pada 1636 cm−1 dalam ChrGO dibandingkan dengan GO, yang mengindikasikan bahwa proses reduksi menghapus kelompok yang mengandung oksigen dari GO [30]. Spektra FTIR ChrGO mengonfirmasi konjugasi yang berhasil chitosan pada GO. Selain itu, spektroskopi Raman digunakan untuk mengkarakterisasi properti elektronik dan struktur grafit. Band G diatribusikan ke fonon E2g dari domain karbon sp2, sedangkan band D ditetapkan ke getaran atom karbon sp3 dan atom karbon yang tidak teratur. Intensitas band D mengindikasikan karakteristik gangguan dan defek dalam lembar karbon [31]. Reduksi lembar GO juga dianalisis dalam rasio sinyal D terhadap band G [32]. Spektra Raman representatif GO menunjukkan dua puncak karakteristik band D (1341 cm−1) dan band G (1591 cm−1) pada Gambar 3b. Perubahan dalam intensitas relatif nilai ID/IG mengilustrasikan perubahan dalam keadaan konjugasi elektron GO dalam proses reduksi [33]. Pergeseran band D menunjukkan fungsionalisasi grafit oksida yang direduksi yang berhasil. Nilai ID/IG meningkat dari 0,99 (GO) ke 1,12 (ChrGO), yang diatribusikan ke pengenalan defek sp3 setelah fungsionalisasi dan pemulihan yang tidak lengkap dari struktur karakteristik grafit [34]. Observasi ini sesuai dengan laporan sebelumnya dan menunjukkan terbentuknya grafit terkait chitosan [16].
a Spektra FTIR GO, ChrGO dan chitosan, b Spektra Raman GO dan ChrGO
Komposisi permukaan ChrGO dikonfirmasi oleh XPS. Skema lengkap spektrum XPS ChrGO menunjukkan tiga puncak pada 284, 399 dan 533 eV, yang ditetapkan ke C1s, N1s dan O1s (Gambar 4a), masing-masing. Analisis elemen relatif menunjukkan peningkatan tingkat oksigen dan nitrogen ChrGO, dengan penurunan terkait dalam konten karbon dibandingkan GO. Spektra C1s resolusi tinggi ChrGO yang ditunjukkan pada Gambar 4b menunjukkan empat puncak terpisah, yang sesuai dengan ikatan C–C atau C=C (sp2, 284,7 eV), C-O (epoksid/hidroksil, 286,4 eV), C=O (sp3, 288,2 eV) dan O=C–O (karbosilat, 289,1 eV). Munculnya puncak amida dalam ChrGO memberikan bukti fungsionalisasi chitosan pada GO [35]. Kelompok fungsi hidrofilik yang melimpah pada permukaan membuat ChrGO sangat larut dalam larutan air, yang konsisten dengan hasil FTIR. Biomolekul seperti asam amino redutif dan asam alfa-linolenat dalam ekstrak yeast mungkin memiliki peran signifikan dalam pembuatan ChrGO yang dibantu mikrogelap [20].
a Spektra survei XPS GO dan ChrGO, b spektra resolusi tinggi C1s
Pola difraksi sinar-X (XRD) GO dan ChrGO ditampilkan pada Gambar 5a. Dalam spektrum XRD GO, puncak utama pada 11,0° dan puncak lemah pada 20,7° secara jelas menunjukkan struktur grafit. Puncak difraksi karakteristik pada 11,0° yang sesuai dengan bidang (001) GO, yang menunjukkan sintesis GO yang berhasil [36]. Kembung kecil antara 20° dan 24° menunjukkan moieti grafitik, yang diatribusikan ke grafit asli yang tidak teroksidasi [37]. Dengan fungsionalisasi chitosan, puncak (001) GO hilang, sedangkan puncak difraksi lebar pada 21,4° menjadi menonjol. Pergeseran ini dapat diatribusikan ke reduksi GO, di mana reduksi membuat rGO mengempaak lebih rapat dibandingkan GO. Refleksi (002) sampel ChrGO sangat lebar, yang mengindikasikan bahwa sampel sangat tidak teratur sepanjang arah tumpukan, yang mungkin diatribusikan ke reduksi yang tidak lengkap GO [33]. Perilaku dekomposisi GO, chitosan dan ChrGO telah diteliti oleh analisis gravimetrik termal (TGA) [38]. Kurva TGA ChrGO, GO dan chitosan ditunjukkan pada Gambar 5b, yang diukur dalam atmosfer nitrogen. GO mulai kehilangan berat di bawah 100 °C, yang diatribusikan ke eliminasi air bebas yang terserap dalam struktur tumpukan [39]. GO kehilangan 42% beratnya dalam rentang 191–231 °C, yang terkait dengan dekomposisi kelompok yang mengandung oksigen yang mudah terurai. Laju penurunan berat ChrGO pada 100–250 °C jauh lebih rendah daripada GO, dan jelas bahwa ChrGO menunjukkan pola dekomposisi yang berbeda dibandingkan GO. Eliminasi termal ChrGO dan chitosan murni terjadi dari 250 hingga 440 °C, yang terkait dengan depolimerisasi dan pirolisis kelompok yang lebih stabil, seperti unit glikosidik chitosan dan kelompok karboksil [40]. Dibandingkan dengan GO, ChrGO stabil termal dan memberikan penurunan berat utama sebesar 36% dalam tahap dekomposisi pertama pada 250–440 °C, sementara sedikit penurunan berat ditampilkan untuk GO. Penurunan berat yang signifikan pada daerah suhu tinggi 450–800 °C disebabkan oleh degradasi termal rangka karbon, yang mungkin diatribusikan ke sisa chitosan dan biomolekul dari ekstrak yeast seperti asam amino [41].
a Pola XRD GO dan ChrGO, b kurva TGA GO, chitosan dan ChrGO
Muatan permukaan GO dan ChrGO diukur oleh instrumen Malvern Zeta Nano ZS-90, yang merupakan parameter penting dari stabilitas koloidal. Kepadatan muatan permukaan yang lebih tinggi pada nanosheet GO menciptakan dispersi koloidal yang lebih stabil [42]. Seperti yang ditunjukkan pada File Tambahan 1: Gambar S1, potensial zeta GO menurun secara monoton dari − 10,7 mV pada pH 3 hingga − 35,5 mV pada pH 11, yang mengonfirmasi muatan negatif pada permukaan nanosheet GO. Nilai potensial zeta untuk ChrGO relatif lebih rendah daripada potensial GO pada setiap pH yang berkisar dari 3 hingga 11. Nanosheet ChrGO menunjukkan stabilitas di seluruh rentang nilai pH, sementara koloid GO yang direduksi dilaporkan kurang stabil dalam air deionisasi karena penumpukan π–π yang meningkat pada permukaan yang tidak beroksigen [43]. Meskipun beberapa kelompok amina bebas ada pada permukaan chitosan [44], potensial zeta yang lebih tinggi untuk ChrGO tidak tercapai. Nilai potensial zeta yang lebih rendah dari ChrGO dapat diatribusikan ke molekul asam amino negatif yang melimpah dari ekstrak yeast, yang meningkatkan stabilitas koloidal dalam larutan fisiologis [20]. Permukaan yang bermuatan negatif ChrGO membuatnya berpotensi dapat digunakan untuk pemuatan dan pengiriman obat.
Kompatibilitas Biologik ChrGO yang Disintesis
Kompatibilitas biologik ChrGO yang disintesis penting untuk aplikasinya dalam pengiriman obat. Sitotoksisitas ChrGO dan GO diteliti melalui uji sitotoksisitas. Sel Cos-7 dan BT-474 diinkubasi ke hadirnan ChrGO atau GO selama 24 jam. Hasil uji sitotoksisitas ditunjukkan pada Gambar 6. Dapat disimpulkan bahwa ChrGO tidak menunjukkan sitotoksisitas yang jelas pada sel Cos-7 dan BT-474. Bahkan pada konsentrasi 100 μg/mL, kehidupan sel di atas 90%. Namun, GO menunjukkan sitotoksisitas yang signifikan dengan cara yang bergantung pada dosis, dengan hanya 73,0 ± 0,5% dan 71,0 ± 0,5% kelangsungan sel untuk Cos-7 dan BT-474 pada konsentrasi 100 μg/mL, masing-masing. Hasilnya menunjukkan bahwa chitosan yang difungsionalisasi pada permukaan GO menunjukkan sitotoksisitas yang sangat rendah dan meningkatkan kompatibilitas biologik. Fungsionalisasi permukaan GO dengan makromolekul telah dilaporkan secara luar biasa mengurangi efek sitotoksisnya [45]. Hu et al. melaporkan bahwa serum sapi fetus dalam medium sel secara signifikan menurunkan sitotoksisitas GO pada sel kanker paru-paru sel non-seluler A549 [46].
Kompatibilitas biologik GO dan ChrGO. Berbagai konsentrasi nanopartikel dibudidayakan dengan a sel Cos-7 dan b sel BT-474, dan efeknya pada kehidupan sel ditentukan
Pemuatan dan Peluapan Obat
Potensi aplikasi biomedis ChrGO sebagai pembawa obat diukur oleh perilaku pemuatan dan peluapan obat. Ciri struktural turunan grafit sangat efektif untuk pengiriman obat aromatik karena luas permukaan spesifik yang sangat besar. Adriamycin adalah salah satu obat kemoterapi tumor primer untuk berbagai malignitas hematologis dan tumor padat dan sering digunakan sebagai obat model untuk mengevaluasi sistem pengiriman obat turunan grafit [47]. Kapasitas pemuatan adriamycin pada nanosheet ChrGO diverifikasi oleh puncak absorpsi UV–Vis karakteristik adriamycin pada 490 nm. Seperti yang diharapkan, efisiensi pemuatan maksimum adriamycin yang terikat pada nanosheet ChrGO mencapai 169,8%, yang sebagian diatribusikan ke luas permukaan yang besar dari nanosheet ChrGO. Nanokomposit ChrGO/adriamycin yang dimuat adriamycin mudah disperdi ke dalam buffer fisiologis, menampilkan larutan transparan dengan warna kemerahan ringan.
Untuk mengeksplorasi profil peluapan adriamycin dari kompleks ChrGO/adriamycin, nilai pH PBS yang berbeda diperkenalkan untuk meniru lingkungan sel tumor. File Tambahan 1: Gambar S2 menunjukkan profil peluapan kumulatif adriamycin dari ChrGO/adriamycin pada pH 5 dan 7,4. Adriamycin yang dilepaskan dari ChrGO/adriamycin ditandai oleh peluapan awal yang cepat dan kemudian tahap peluapan yang lebih lambat dalam larutan PBS pH 5,0. Peluapan kumulatif adriamycin adalah 6,5% dalam 3 jam pertama dan kemudian meningkat perlahan menjadi 26,7% dalam 96 jam pada pH 5,0. Sebaliknya, persentase adriamycin dari ChrGO/adriamycin meningkat lebih lambat dan lebih rendah pada pH 7,4, menampilkan persentase peluapan adriamycin dari 2,5% dalam 3 jam awal hingga 7,4% dalam 96 jam. Studi sebelumnya telah menunjukkan profil peluapan obat dari GO yang difungsionalisasi sangat lambat dalam medium pada pH 7,4 [48]. Protonasi kelompok karboksil pada ChrGO menurunkan penumpukan π–π, ikatan H dan interaksi elektrostatis antara adriamycin dan ChrGO, memfasilitasi peluapan adriamycin dalam medium asetat [49]. Sensitivitas pH memberikan ChrGO/adriamycin potensi untuk pengiriman obat yang spesifik lokasi, yang kemudian meningkatkan sitotoksisitas pada sel tumor.
Efektivitas Terapeutik Kompleks ChrGO/Adriamycin
Efektivitas terapeutik kompleks ChrGO/adriamycin dalam sel kanker BT-474 yang overexpressi HER2 diteliti melalui uji inhibi proliferasi. Overexpresi resseptor HER2 memiliki peran kunci dalam transformasi sel kanker payudara BT-474. Perawatan dengan trastuzumab sendirian, anticor monoklonal anti-HER2, menghasilkan inhibi pertumbuhan yang signifikan pada sel BT-474 [50]. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7a, setelah perawatan dengan kompleks ChrGO/adriamycin, kehidupan sel BT-474 menurun secara signifikan, menunjukkan efek toksis yang bergantung pada dosis. Selain itu, dibandingkan dengan adriamycin bebas, kompleks ChrGO/adriamycin menunjukkan performa yang kurang efektif dalam membunuh sel BT-474, yang diatribusikan ke difusi bertahap adriamycin yang dimuat daripada perawatan langsung dengan adriamycin bebas [51]. Namun, efektivitas terapeutik kompleks ChrGO/adriamycin mendekati adriamycin bebas seiring dengan peningkatan konsentrasi kompleks ChrGO/adriamycin, yang dapat dijelaskan oleh peluapan adriamycin yang sosten dari pembawa ChrGO.
a Kehidupan sel in vitro BT-474 yang diinkubasi dengan konsentrasi adriamycin bebas dan adriamycin yang dimuat dalam kompleks ChrGO/adriamycin, b sitotoksisitas kompleks ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) dalam kombinasi dengan trastuzumab (5 μg/mL) pada sel BT-474. Adria: adriamycin. **p < 0,01, ***p < 0,001
Untuk mempelajari apakah trastuzumab, anticor monoklonal anti-HER2, dapat meningkatkan aktivitas antitumor dari jumlah setara adriamycin yang dimuat pada ChrGO, sel BT-474 diobati dengan trastuzumab sendirian atau dalam kombinasi dengan ChrGO/adriamycin. Perawatan dengan trastuzumab sendirian menghasilkan inhibi proliferasi BT-474 yang signifikan, yang konsisten dengan laporan sebelumnya [52]. Terapi kombinasi dengan trastuzumab dan ChrGO/adriamycin menghasilkan efek inhibi pertumbuhan sel yang ditingkatkan, seperti yang ditunjukkan oleh pengurangan 88,5% dibandingkan dengan pengurangan 54,5% dengan trastuzumab sendirian (5 μg/mL) dan 59,5% dengan ChrGO/adriamycin setara sendirian (5 μg/mL) dibandingkan dengan kontrol negatif (Gambar 7b). Hasilnya menunjukkan bahwa sistem ChrGO dapat digunakan secara efektif untuk mengembangkan komposit untuk terapi kombinasi, dan perawatan kombinasi ChrGO/adriamycin dan trastuzumab menghasilkan pengurangan kehidupan sel yang moderat, tetapi signifikan, dibandingkan setiap obat sendirian.
Analisis Siklus Sel dan Apoptosis
Untuk menentukan apakah kompleks ChrGO/adriamycin memiliki efek pada progresi siklus sel, uji siklus sel kompleks ChrGO/adriamycin sendirian atau dalam kombinasi perawatan dengan trastuzumab dilakukan pada sel BT474. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 8a, analisis sitometri aliran mengungkapkan bahwa trastuzumab sendirian meningkatkan populasi sel dalam fase G0/G1. Perawatan dengan ChrGO/adriamycin sendirian menyebabkan penurunan signifikan dalam jumlah sel G0/G1 dan akumulasi dalam fase S dan G2/M dibandingkan sel kontrol. Selain itu, ChrGO/adriamycin yang dikombinasikan dengan trastuzumab menyebabkan penahanan fase S, disertai penurunan signifikan dalam jumlah sel dalam fase G0/G1. Sementara ChrGO/adriamycin paling aktif dalam fase S siklus sel, perawatan ChrGO/adriamycin dengan trastuzumab dapat menyebabkan peningkatan fase G0/G1 dibandingkan ChrGO/adriamycin sendirian. Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa trastuzumab dapat menyebabkan penahanan sel dalam fase G1 [53]. Adriamycin menghambat proliferasi sel dan replikasi DNA, yang pada akhirnya mengarah pada penahanan siklus sel [54].
a Analisis siklus sel setelah perawatan dengan ChrGO/adriamycin sendirian atau dalam kombinasi dengan trastuzumab pada sel BT-474, b efek ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) pada induksi apoptosis pada sel BT-474. Adria: adriamycin. **p < 0,01, ***p < 0,001
Untuk menilai efek ChrGO/adriamycin pada molekul apoptosis, sel BT-474 diobati selama 48 jam dengan ChrGO/adriamycin, trastuzumab, atau kombinasi keduanya. Untuk visualisasi apoptosis, aktivitas caspase 3/7 telah digunakan secara luas sebagai markernya spesifik apoptosis karena aktivitasnya terkait dengan proses apoptosis [55]. Seperti yang diamati dari Gambar 8b, dibandingkan dengan kontrol negatif, perawatan dengan ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) sendirian secara signifikan meningkatkan aktivitas caspase 3/7. Namun, trastuzumab (5 μg/mL) sendirian tidak secara signifikan meningkatkan ekspresi caspase 3/7, yang mengindikasikan bahwa trastuzumab tidak menginduksi apoptosis. Sebaliknya, perawatan dengan ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) secara signifikan meningkatkan aktivitas caspase 3/7 dibandingkan dengan setiap obat sendirian. Terapi target dual menunjukkan apoptosis yang lebih tinggi, yang mengindikasikan efektivitas terapeutik yang unggul karena adanya mekanisme tindakan yang berbeda. Mirip dengan studi lainnya, adriamycin memperkuat respons apoptosis pada sel kanker yang overexpressi HER2 [56]. Kesimpulannya, ChrGO/adriamycin yang dikombinasikan dengan trastuzumab menginduksi penahanan siklus sel dan apoptosis, yang pada akhirnya mengarah pada kematian sel yang ditingkatkan.
Kesimpulan
Dalam karya ini, nanosheet grafit oksida terkait chitosan disusun dengan reduksi yang dibantu mikrogelap, yang menunjukkan kompatibilitas biologik dan stabilitas dispersi yang baik. Nanokomposit yang disiapkan menunjukkan efisiensi enkapsulasi dan pengiriman obat yang tinggi. Nanosheet ChrGO/adriamycin menampilkan inhibi pertumbuhan yang signifikan pada BT-474 dengan cara yang bergantung pada dosis. Perawatan kombinasi ChrGO/adriamycin dan trastuzumab menghasilkan efektivitas terapeutik yang unggul pada sel BT-474 dibandingkan dengan setiap agen sendirian. Hasilnya menguntungkan untuk pengembangan nanokarrier intracelular untuk mengirimi obat dengan cara yang terkontrol, yang diharapkan dapat meningkatkan efek terapi pada kanker yang overexpressi HER2.
Ketersediaan Data dan Bahan
Data yang mendukung kesimpulan studi ini tersedia dari penulis yang sesuai atas permintaan yang wajar.
