Pengiriman Mikel Polimerik Asam Oleanolat: Keleresan yang Ditingkatkan dan Efektivitas Anti-Kerut yang Terbukti
Abstrak
Asam oleanolat hanya digunakan sebagai agen pendamping dalam produk kosmetik. Tujuan studi ini adalah untuk menunjukkan efek asam oleanolat sebagai bahan aktif untuk meredakan kerut pada manusia dan mengembangkan formulasi mikel polimerik yang memungkinkan asam oleanolat yang sulit larut digunakan sebagai bahan utama dalam produk kosmetik untuk mengurangi kerut. Keleresan asam oleanolat dievaluasi dalam pelarut, surfaktan, dan polimer. Ukuran dan bentuk mikel polimerik yang mengandung asam oleanolat dievaluasi oleh spektrofotometer pencaharan elektroforetik dan mikroskop elektron kriogenik scanning. Efisiensi kapsulasi dan permeasi kulit diukur oleh HPLC. Stabilitas mikel polimerik yang disimpan pada 40 °C selama 3 bulan dievaluasi oleh pengamatan visual, pengukuran ukuran partikel, dan pengukuran kandungan asam oleanolat. Mikel polimerik dalam bentuk ampul produk akhir diterapkan di sekitar mata 23 subjek wanita selama 8 minggu. Lima parameter kulit dievaluasi oleh profilometri optik setiap 4 minggu selama 8 minggu. Selain itu, profesional melakukan pengamatan visual kulit dan studi iritasi kulit manusia dilakukan. Mikel polimerik asam oleanolat dengan ukuran partikel kurang dari 100 nm disiapkan menggunakan Capryol 90® dan poloxamer. Laju permeasi kulit asam oleanolat dalam mikel polimerik lebih tinggi dari pada solusi lain yang dibuat dari asam oleanolat dispersi dalam 2 surfaktan yang berbeda. Tidak ada perubahan signifikan dalam ukuran partikel, warna, atau kandungan asam oleanolat yang diamati, dan mikel polimerik yang disimpan pada 40 °C selama 3 bulan tidak mengalami pemisahan fasa. Setelah 8 minggu aplikasi, iritasi kulit tidak berkembang dan semua lima parameter yang dievaluasi oleh profilometri optik serta skor evaluasi visual secara signifikan meningkat. Studi ini menunjukkan bahwa mikel polimerik asam oleanolat yang disiapkan dalam studi ini stabil dan efektif untuk meredakan kerut pada manusia sebagai bahan aktif utama. Berdasarkan temuan ini, diharapkan bahwa mikel polimerik asam oleanolat dapat digunakan secara luas dalam aplikasi kosmetik.
Pendahuluan
Penuaan kulit termasuk keredupan (kekenyalan), penipisan, dan kerut. Ini dapat dipercepat oleh infeksi, merokok, cahaya UV, trauma, ketidakseimbangan hormon, stres, dan/atau pro-oksidan seperti hidrolase termasuk elastinase atau kolagenase [1]. Spesies reaktif oksigen atau radikal bebas yang dihasilkan oleh penyebab yang disebut di atas merusak sel-sel tetangga dan mengakibatkan penurunan elastisitas kulit dan penipisan [2, 3]. Khususnya, cahaya UV diketahui memicu generasi spesies reaktif oksigen, yang merusak lipid membran, protein sel, dan DNA, dan oleh karena itu mempercepat perkembangan kerut ekspresi, lentigo, dan melasma [1,2,3,4]. Asam oleanolat adalah komponen efektif asal alami yang diekstraksi dari beberapa spesies tumbuhan dan digunakan sebagai bahan medis dan kosmetik utama. Ini juga ditemukan dalam buah seperti apel atau pir [5]. Sebagai jenis terpena pentasiklik hidroksi, asam oleanolat pertama kali diisolasi dari daun zaitun (Olea europaea) dan ditemukan secara luas dalam tumbuhan termasuk swertia Asia Timur (Eugenia jambos) dan gentian kuning (Gentiana lutea). Ini mempromosikan fungsi anti-penuaan melalui sintesis tidak hanya pro-kolagen, yang penting untuk sintesis kolagen, tetapi juga seramid dan filaggrin, dan juga dengan menghambat aktivitas MMP-1, enzim yang memecah protein seperti kolagen [5, 6]. Berdasarkan temuan ini, dapat diasumsikan bahwa asam oleanolat memiliki efek anti-penuaan ganda dengan tidak hanya mempromosikan produksi kolagen tetapi juga mencegah degradasi kolagen [7]. Akibatnya, asam oleanolat adalah bahan anti-penuaan yang sangat promising untuk produk kosmetik. Namun, penggunaan asam oleanolat dalam produk kosmetik sebagai bahan utama terbatas oleh keleresan air yang buruk; oleh karena itu, hanya jumlah kecil asam oleanolat sebagai bagian dari formulasi emulsi yang digunakan sebagai bahan pendamping dalam produk kosmetik [8]. Sifat fisikokimia terkait dengan serapan kulit termasuk titik lelehnya, bobot molekul, koefisien partisi, dan hidrofilisitas. Titik lelehnya lebih tinggi dari 300 °C, yang menunjukkan bahwa itu adalah bahan kristal yang tinggi. Bahan kristal yang tinggi memerlukan energi lebih besar untuk pelarutan, menunjukkan bioavailabilitas yang buruk karena keleresan yang terbatas dan oleh karena itu tidak mudah terserap [9]. Selain itu, senyawa yang sangat hidrofilik atau lipofilik, atau senyawa dengan bobot molekul tinggi diketahui tidak mudah menembus kulit [10, 11]. Metode yang paling sering digunakan untuk meningkatkan permeasi kulit molekul tersebut adalah sintesis prekursor atau penggunaan pembawa obat koloidal. Dalam hal ini, liposom, emulsi, dan mikel polimerik telah diteliti secara aktif [12].
Mikel polimerik adalah agregat skala nano yang tersusun mandiri membentuk struktur inti-kulit dalam larutan air. Mikel polimerik sering terbuat dari kopolimer di-blok atau tri-blok yang dapat membentuk inti hidrofobik dan kulit hidrofilik [13, 14]. Mikel polimerik dianggap lebih stabil secara fisik dibandingkan mikel surfaktan karena sifat mikel polimerik bervariasi tergantung pada tipe dan rasio monomer polimer dalam kopolimer blok dan memiliki konsentrasi mikel kritis yang relatif rendah [15, 16].
Dalam studi ini, kami menyiapkan mikel polimerik asam oleanolat dan mengevaluasi ukuran dan bentuk partikelnya, serta efisiensi kapsulasi dan laju permeasi kulit asam oleanolat yang dihasilkan. Stabilitas fisik asam oleanolat dalam bentuk ini juga dievaluasi selama 3 bulan. Efek anti-kerut manusia asam oleanolat dalam formulasi produk kosmetik aktual juga diteliti.
Bahan dan Metode
Bahan
Asam oleanolat, Tween 80, Tween 20, dan Tween 60 dibeli dari TCI (Tokyo, Jepang). PEG 400, Pluronic F127, dan Pluronic F68, diperoleh dari BASF (Ludwigshafen, Jerman). Propylene glycol, PEG 300, dan PEG 200 diperoleh dari JUNSEI (Tokyo, Jepang). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90, dan Capryol™ PGMC dibeli dari Gattefossé (Lyon, Prancis). Disodium EDTA (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), allantoin (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA), dipropylene glycol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), propanediol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, USA), carbomer (The Lubrizol Corporation, Ohio, USA) PEG/PPG/polybutylene glycol-8/5/3 glycerin (NOF Corporation, Tokyo, Jepang), sodium hyaluronate (TCI, Tokyo, Jepang), beta-glucan (SK Bioland, Cheonan, Korea), phenoxyethanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), caprylyl glycol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea), dan ethylhexylglycerin (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) digunakan untuk menyiapkan produk kosmetik yang mengandung asam oleanolat. Asetonitril kelas HPLC diperoleh dari Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA). Air triple distilasi digunakan, dan pelarut serta reagen lain adalah kelas EP dan GR. Mencit tanpa rambut Crlori:SKH1-hr betina dibeli dari OrientBio (Seongnam, Korea).
Analisis HPLC
Asam oleanolat dianalisis menggunakan HPLC Shimadzu LC-30 series (Shimadzu Corporation, Kyoto, Jepang). Kolom analitik Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm (Teknokroma, Barcelona, Spanyol) digunakan pada suhu ruang. Fase seluler terdiri dari asetonitril dan air (85:15, v/v), laju aliran 1 mL/min, dan volume injeksi 10 μL. Asam oleanolat dianalisis pada UV λ = 210 nm. Semua pengukuran dilakukan pada suhu ruang [17].
Studi Optimasi Formulasi Keleresan dan Formulasi
Jumlah asam oleanolat yang diukur ditambahkan ke pelarut, diaduk pada 60 °C selama 48 jam, dan di-sonikasi selama 5 menit menggunakan pembersih ultrasonik. Suspensi diasingkan pada 2000 rpm menggunakan sentrifugal Universal 320R (Hettich, Tuttlingen, Jerman), dan supernatant kemudian dikumpulkan. Kemudian supernatant difilter melalui filter membran PVDF 0,45 μm (Whatman, Kent, Inggris). Keleresan asam oleanolat dalam pelarut yang sesuai diestimasi dengan mengurangi berat sisa padat dari jumlah berat awal asam oleanolat dan pelarut (Tabel 1).
Studi optimasi formulasi dilakukan menggunakan poloxamer 188, poloxamer 407, Tween 60, dan Tween 80. Berbagai rasio polimer amfifilik dan surfaktan dicoba seperti yang diringkas dalam Tabel 2. Setiap asam oleanolat dan Capryol® 90 ditimbang, dipanaskan, dan diaduk di atas 60 °C hingga larutan jernih terlihat. Polimer/surfaktan yang ditunjukkan dalam Tabel 2 kemudian ditambahkan ke dalam larutan jernih dan diaduk di atas 60 °C hingga larutan jernih terlihat. Larutan kemudian dispersi dalam air distilasi (Gambar 1). Larutan yang dihasilkan dibiarkan selama sekitar 48 jam, dan kemudian dilakukan pemeriksaan visual untuk memilih formulasi optimal. Hasil pemeriksaan visual setiap formulasi dalam Tabel 2, termasuk pengamatan presipitasi, pemisahan fasa, transparansi, dan gelasi, diringkas dalam Tabel 3.
Persiapan Mikel Polimerik Asam Oleanolat
Mikel polimerik asam oleanolat (PMO) disiapkan menggunakan formulasi G dan H dalam Tabel 2 dengan metode yang ditunjukkan dalam Gambar 1. PMO-G dan PMO-H digunakan untuk eksperimen selanjutnya dan PMO-H dalam produk kosmetik untuk uji klinis.
Uji Warna
Mikelisasi mikel polimerik ketika formulasi G atau formulasi H dispersi dalam air dikonfirmasi oleh pengamatan visual, yaitu, transparansi. Pembentukan PMO (PMO-G atau PMO-H) juga dikonfirmasi oleh uji warna. Metilen biru ditambahkan ke campuran air dan Capryol® 90, air, Capryol® 90, PMO-G, dan PMO-H dan warna larutan diamati secara visual dan difoto.
Pengukuran Ukuran Partikel
Teknik ELS (pencaharan elektroforetik) mengukur fluktuasi intensitas pencaharan dari partikel sebagai fungsi waktu ketika partikel menunjukkan gerakan Brown acak dan gerakan elektroforetik terarah dalam medan listrik yang terdefinisi dengan baik. Mobilitas elektroforetik partikel diukur oleh teknik ELS [18] dan memungkinkan ukuran partikel baik PMO-G maupun PMO-H dievaluasi menggunakan spektrofotometer pencaharan elektroforetik (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Jepang).
Analisis Mikroskop Elektron Kriogenik Scanning (Cryo-SEM)
Mikroskop elektron scanning kriogenik atau mikroskop elektron kriogenik scanning (cryo-SEM) adalah teknik yang kuat untuk memvisualisasikan kondisi mikrostruktur atau nanostruktur suspensi atau dispersi polimer koloidal setelah diimobilisasi dengan pendinginan cepat dan diretakan untuk citra. Retakan dibuat dan diperiksa pada −196 °C, titik didih normal cairan nitrogen dan jauh di bawah suhu transisi kaca partikel bulk dan yang telah terkoalesensi sepenuhnya. Citra Cryo-SEM mengungkapkan berbagai respons partikel terhadap retakan yang menyebar melalui es [19]. Mikroskop elektron kriogenik scanning (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Sample Preparation System) digunakan untuk mengamati bentuk PMO.
Efisiensi Kapsulasi
Efisiensi kapsulasi mikel polimerik asam oleanolat dievaluasi. PMO diasingkan pada 2000 rpm selama 15 menit, dan supernatant dikumpulkan dan dianalisis oleh HPLC. Efisiensi kapsulasi dihitung sebagai jumlah asam oleanolat dalam mikel polimerik dibagi dengan jumlah asam oleanolat yang ditambahkan awalnya (mg) selama persiapan PMO.
$$ \mathrm{Efisiensi}\ \mathrm{Kapsulasi}\ (\%)=\frac{\mathrm{Jumlah}\ \mathrm{asam}\ \mathrm{oleanolat}\ \mathrm{dalam}\ \mathrm{mikel}\ \mathrm{polimerik}\ (\mathrm{mg})}{\mathrm{Jumlah}\ \mathrm{asam}\ \mathrm{oleanolat}\ \mathrm{yang}\ \mathrm{ditambahkan}\ \mathrm{awalnya}\ (\mathrm{mg})}\times 100 $$
Stabilitas PMO-H
Stabilitas fisik PMO-H dievaluasi dengan menyimpannya pada 40 °C selama 3 bulan. Perubahan warna, pemisahan fasa, kehadiran presipitasi, dan perubahan kekaburan diamati secara visual. Sampel PMO-H diambil pada interval waktu teratur dianalisis oleh HPLC untuk menentukan jumlah asam oleanolat yang tersisa dan oleh ELS-Z untuk menentukan ukuran partikel PMO-H. Hasilnya disajikan dalam Gambar 9.
Uji Permeasi Kulit In Vitro
Studi permeasi kulit in vitro dilakukan menggunakan sel difusi Franz untuk menyelidiki peningkatan permeasi kulit asam oleanolat. Uji dilakukan pada PMO-G, PMO-H, campuran asam oleanolat dan Tween 80 dispersi dalam air distilasi, dan campuran asam oleanolat dan propylene glycol dispersi dalam air distilasi. Kulit mencit betina tanpa rambut berusia 6 minggu dipotong menjadi potongan dengan ukuran yang diperlukan. Sel Franz vertikal digunakan, dan kulit dikunci antara dua kamar dengan stratum corneum menghadap ke atas. 330 μl formulasi yang dipilih diterapkan pada kulit dan sel Franz ditutup dengan parafilm. Reseptor diisi dengan larutan PBS (pH 7,4) dan etanol dalam rasio 9:1 (v/v). Larutan reseptor diisi ulang dengan larutan PBS segar pada setiap waktu pengambilan sampel. Sampel diambil pada 2, 4, 6, 8, 10, 20, dan 24 jam dan dianalisis oleh HPLC. Setelah 24 jam, formulasi berlebihan yang tersisa pada kulit dibersihkan dengan Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australia). Kulit yang digunakan dalam studi permeasi dibersihkan dengan larutan PBS dan asam oleanolat yang tersisa dalam kulit diukur oleh HPLC. Semua eksperimen permeasi dilakukan secara triplik.
Statistik Studi
Eksperimen telah dilakukan tiga kali ulang secara independen, dan hasil studi ini dilaporkan sebagai rata-rata ± SD. Analisis statistik diverifikasi oleh uji t independen, dan nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Persiapan Ampul dengan PMO-H
Untuk uji klinis, PMO-H digunakan sebagai produk uji. PMO-H, air tereduksi, disodium EDTA, allantoin, dipropylene glycol, propanediol, carbomer, dan PEG/PPG/polybutylene glycol-8/5/3 glycerin ditambahkan dan diaduk selama 10~15 menit menggunakan pengaduk magnet, dan kemudian kalium hidroksida ditambahkan dan campuran diaduk lebih lanjut selama 5~10 menit. Setelah bahan-bahan tercampur secara homogen, sodium hyaluronate dan beta-glucan ditambahkan dan diaduk selama 2~5 menit lebih lanjut, dan kemudian phenoxyethanol, propanediol, caprylyl glycol, dan ethylhexylglycerin ditambahkan dan diaduk selama 2~5 menit. Formula akhir ditambahkan ke dalam ampul sebagai produk uji. Gelembung udara dalam ampul dihilangkan menggunakan oven kering vakum sebelum digunakan untuk uji. Kontrol disiapkan dengan metode yang sama untuk produk uji kecuali asam oleanolat dikecualikan.
Uji Aplikasi Manusia
Uji Iritasi Kulit Manusia
Uji patch produk kosmetik, yang mengandung PMO-H dalam ampul, dilakukan pada 25 subjek pria dan wanita berusia 22 hingga 56 tahun yang telah menyetuju untuk berpartisipasi dalam uji iritasi kulit manusia. Setiap bahan uji ditetapkan pada lengan atas dan dikunci dengan patch. Patch dilekatkan selama 24 jam dan derajat stimulasi diamati oleh 2 profesional 30 menit, 24 jam, dan 48 jam setelah patch dilepaskan sesuai dengan kriteria International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG).
Uji Klinis untuk Perbaikan Kerut
Mikel polimerik yang mengandung asam oleanolat dalam ampul dalam bentuk produk akhir diterapkan di sekitar mata 23 subjek wanita berusia 30 hingga 65 tahun yang telah menyetuju untuk berpartisipasi dalam uji perbaikan kerut. Subjek memenuhi kriteria inklusi dan tidak ada salah satu kriteria eksklusi dan menyetuju untuk berpartisipasi dalam uji aplikasi manusia. Metode double-blind diikuti oleh baik peneliti maupun subjek uji. Uji dilakukan selama 8 minggu, dan evaluasi dilakukan setiap 4 minggu. Metode double-blind dan alokasi acak digunakan. Produk uji dan kontrol secara terpisah diterapkan secara acak ke sisi kiri atau kanan wajah subjek yang sama. Lima parameter dievaluasi oleh profilometri optik menggunakan Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Cologne, Jerman) setiap 4 minggu selama 8 minggu—kekasaran rata-rata (R3) adalah titik akhir utama, dan empat parameter kekasaran kulit (R1), kekasaran maksimum (R2), kedalaman halus (R4), dan kekasaran aritmatika rata-rata (R5) adalah titik akhir sekunder. Peningkatan atau penurunan lima parameter pada area yang sama dari subjek diukur seiring waktu, dan nilai rata-rata peningkatan atau penurunan lima parameter dihitung dan dibandingkan antara perlakuan kontrol dan produk uji. Selain itu, pengamatan visual kulit dilakukan oleh profesional. Foto kerut mata diambil menggunakan Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Korea). Kriteria yang digunakan untuk menentukan skor evaluasi visual ditunjukkan dalam Gambar S1, dan hasil visual disajikan dalam Gambar 13. Parameter dibandingkan dan dianalisis menggunakan uji t pasangan pada keandalan 95% [20,21,22,23,24,25].
Hasil dan Pembahasan
Penentuan Pelarut, Surfaktan, dan Polimer
Keleresan asam oleanolat dalam pelarut biokompatibel, khususnya surfaktan dan polimer, ditunjukkan dalam Tabel 1. Asam oleanolat cenderung larut dalam minyak hidrofobik dengan nilai HLB rendah. Capryol® 90 memiliki nilai HLB sedikit lebih tinggi dibandingkan minyak umum [26]. Namun, asam oleanolat menunjukkan keleresan yang relatif tinggi dalam Capryol® 90. Selain itu, Capryol® 90 dapat dengan mudah distabilkan sebagai inti dalam mikel [27]. Setelah memilih Capryol® 90, beberapa jenis surfaktan atau poloxamer disaring untuk bagian kulit mikel asam oleanolat [27,28,29,30]. Komposisi mikel asam oleanolat yang ditunjukkan dalam Tabel 2 adalah yang transparan segera setelah dicairkan dengan air distilasi. Namun, beberapa komposisi tidak stabil dan mengalami presipitasi, pemisahan fasa, atau gelasi dalam 24 jam. Citra representatif presipitasi, pemisahan fasa, cairan transparan, dan status gel ditunjukkan dalam Gambar 2. Status akhir setiap formula diringkas dalam Tabel 3. Komposisi G dan H tetap transparan bahkan setelah 24 jam. Meskipun komposisi I tetap jernih, itu adalah gel bukan cairan. Komposisi A hingga D menjadi tidak transparan dengan presipitasi setelah 24 jam. Berdasarkan hasil ini, komposisi G dan H dipilih untuk pengembangan lebih lanjut.
Karakteristik Mikel Polimerik Asam Oleanolat
Struktur mikel polimerik asam oleanolat diteliti dengan uji warna. Gambar 3 menunjukkan citra campuran Capryol® 90 dan air distilasi, Capryol® 90, air distilasi, dan mikel polimerik komposisi G (PMO-G) dan komposisi H (PMO-H), setelah menambahkan metilen biru ke dalam larutan. Pemisahan fasa yang jelas terjadi pada campuran Capryol® 90 dan air distilasi. Presipitasi metilen biru diamati dalam kasus Capryol® 90. Air distilasi berubah biru gelap setelah penambahan metilen biru. PMO-G dan PMO-H juga berubah biru yang menunjukkan bahwa mikel polimerik terdiri dari inti fase minyak dan kulit fase air. Dengan kata lain, polimer amfifilik, poloxamer 407 dalam komposisi G dan H, berfungsi sebagai kulit luar dan membantu untuk berhasil membentuk mikel polimerik asam oleanolat dengan mengkapsulasi inti Capryol® 90 yang mengandung asam oleanolat [31].
Ukuran partikel, distribusi ukuran, dan bentuk dapat menjadi indikator yang baik untuk memprediksi stabilitas fisik formulasi mikel. Ukuran partikel rata-rata PMO-G adalah 80,4 nm, dan PMO-H adalah 57 nm (Gambar 4). Histogram PMO-A, G, dan H ditunjukkan dalam Gambar 5 untuk membandingkan distribusi ukuran yang dipengaruhi oleh status fasa. Seperti yang ditunjukkan dalam Tabel 3, PMO-A tidak transparan karena presipitasi, dan PMO-G dan H transparan. Ukuran partikel PMO-A lebih dari 100 nm, dan PMO-A menunjukkan distribusi ukuran yang lebih lebar dibandingkan PMO-G dan H (Gambar 5). PMO-H menunjukkan distribusi ukuran partikel yang lebih sempit dibandingkan PMO-G dan menunjukkan fluida yang sesuai untuk produk kosmetik.
Efisiensi kapsulasi baik PMO-G maupun PMO-H adalah 99 hingga 100%, yang menunjukkan bahwa hampir 100% asam oleanolat dikapsulasi dalam inti PMO (Gambar 6).
Bentuk PMO-G dan PMO-H diteliti dengan mikroskop elektron kriogenik scanning (Cryo-SEM). Cryo-SEM menunjukkan bahwa baik PMO-G maupun PMO-H adalah mikel polimerik berbentuk bola. Namun, mikel polimerik PMO-H lebih konsisten dalam ukuran dan bentuk dibandingkan mikel polimerik PMO-G (Gambar 7).
Studi Permeasi Kulit In Vitro PMO
Jumlah total asam oleanolat yang tersisa dalam kulit, dan jumlah total asam oleanolat yang menembus kulit sebagai fungsi waktu diukur menggunakan kulit mencit betina tanpa rambut berusia 6 minggu. Empat formulasi berbeda, PMO-G, PMO-H, campuran asam oleanolat dan Tween 80 dispersi dalam air distilasi (OTw), dan campuran asam oleanolat dan propylene glycol dispersi dalam air distilasi (OPG) dibandingkan dalam hal efisiensi permeasi kulit asam oleanolat. Jumlah total asam oleanolat yang menembus kulit setelah 24 jam adalah 29,49 ± 4,00% untuk PMO-H, 21,39 ± 5,91% untuk PMO-G, 13,66 ± 0,81% untuk OTw, dan 5,90 ± 2,47% untuk OPG. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 7, deteksi pertama asam oleanolat dalam kasus baik PMO-G maupun PMO-H mungkin pada 8 jam, sementara deteksi pertama asam oleanolat dalam OTw mungkin pada 10 jam, dan OPG pada 20 jam. Proporsi asam oleanolat yang tersisa dalam kulit adalah 56,22 ± 13,50% untuk PMO-H, 36,74 ± 0,72% untuk PMO-G, 27,44 ± 7,02% untuk OTw, dan 26,28 ± 5,42% untuk OPG. PMO-H menunjukkan jumlah terbesar baik asam oleanolat yang menembus kulit maupun asam oleanolat yang tersisa dalam kulit (Gambar 8). Hasil ini menunjukkan bahwa PMO dapat menembus lebih cepat dan lebih banyak dibandingkan formulasi yang tidak membentuk mikel.
Stabilitas Mikel Polimerik Asam Oleanolat Cair
Berdasarkan studi karakterisasi dan permeasi in vitro, PMO-H akhirnya dipilih untuk persiapan ampul. Sebelum persiapan ampul, stabilitas PMO-H dievaluasi. Untuk studi stabilitas, PMO-H disimpan dalam vial di dalam kondisi studi stabilitas percepatan pada 40 °C/75% RH selama 3 bulan. Presipitasi, pemisahan fasa, perubahan warna, dan transparansi kemudian diamati secara visual. Proporsi asam oleanolat kemudian diukur menggunakan HPLC, dan perubahan ukuran partikel juga diperiksa. Stabilitas diperiksa seiring waktu. PMO-H tetap transparan tanpa presipitasi atau pemisahan fasa, dan warnanya tidak berubah selama 3 bulan di dalam kondisi stabilitas percepatan. Proporsi asam oleanolat yang diukur oleh HPLC dan perubahan ukuran partikel seiring waktu ditunjukkan dalam Gambar 9. Proporsi asam oleanolat tetap di atas 98%, dan ukuran partikel 49,6 ± 5 nm tetap hampir konstan selama periode studi stabilitas 3 bulan. Hasil ini menunjukkan bahwa PMO-H stabil secara fisik dan kimiawi selama 3 bulan di dalam kondisi stabilitas percepatan.
Uji Klinis
Uji Iritasi Manusia
Sebelum uji klinis, uji iritasi manusia dilakukan pada 25 sukarelawan pria dan wanita sehat berusia 22~56 tahun. Produk uji ditempelkan pada lengan atas subjek selama 24 jam, dan indeks iritasi kulit diukur 30 menit, 24 jam, dan 48 jam setelah patch dilepaskan. Iritasi tidak diamati dengan formula ampul kosmetik yang mengandung PMO-H pada 1 jam atau 48 jam setelah patch dilepaskan.
Uji Klinis
Uji klinis dilakukan pada 23 subjek wanita, berusia 30~65 tahun dengan kerut di sekitar mata; dikecualikan 3 dropout, 20 subjek menyelesaikan uji dengan menerapkan baik produk uji, ampul PMO-H, dan kontrol secara terpisah ke sisi kiri atau kanan wajah mereka selama 8 minggu. Perubahan kulit dievaluasi berdasarkan lima parameter—kekasaran rata-rata (R3) sebagai titik akhir utama, dan empat parameter tambahan sebagai titik akhir sekunder, yaitu kekasaran kulit (R1), kekasaran maksimum (R2), kedalaman halus (R4), dan kekasaran aritmatika rata-rata (R5). Skor evaluasi visual menambahkan titik akhir sekunder lebih lanjut. Hasil diringkas dalam Tabel 4.
Titik akhir utama R3 telah menurun sebesar 0,673% setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan secara signifikan secara statistik sebesar 7,835% setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,006). Dengan aplikasi kontrol, R3 telah meningkat sebesar 5,127% setelah 4 minggu penggunaan dan secara signifikan secara statistik sebesar 9,971% setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,010). Perbedaan nilai R3 antara area yang diobati dengan produk uji dan area yang diobati dengan kontrol secara signifikan secara statistik setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,000) tetapi tidak setelah 4 minggu penggunaan, mungkin karena variasi antar subjek (Gambar 10).
Analisis titik akhir sekunder R1 menunjukkan bahwa nilai telah menurun sebesar 4,629% setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan secara signifikan secara statistik sebesar 9,973% setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,017). Dengan aplikasi kontrol, R1 telah meningkat sebesar 8,037% setelah 4 minggu penggunaan dan 4,799% setelah 8 minggu penggunaan. Perbedaan nilai R1 antara area yang menggunakan produk uji dan kontrol tidak signifikan secara statistik setelah 4 minggu penggunaan tetapi signifikan setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,024). Titik akhir sekunder R2 telah menurun sebesar 1,048% setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan 5,803% setelah 8 minggu. Dengan aplikasi kontrol, telah meningkat sebesar 7,261% setelah 4 minggu dan 9,536% setelah 8 minggu. Perbedaan nilai R2 antara area yang diobati dengan produk uji dan area yang diobati dengan kontrol signifikan secara statistik setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,016) tetapi tidak setelah 4 minggu penggunaan. Titik akhir sekunder R4 telah menurun secara signifikan sebesar 8,594% (p = 0,039) setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan sebesar 9,747% setelah 8 minggu penggunaan. Dengan kontrol, R4 telah meningkat sebesar 10,764% setelah 4 minggu penggunaan dan 3,491% setelah 8 minggu penggunaan. Menariknya, perbedaan nilai R4 antara area yang menggunakan produk uji dan kontrol signifikan secara statistik setelah 4 minggu penggunaan (p = 0,008) tetapi tidak setelah 8 minggu. Titik akhir sekunder R5 telah menurun sebesar 6,333% setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan 8,556% setelah 8 minggu penggunaan. Perbedaan nilai R5 antara area yang menggunakan produk uji dan kontrol tidak signifikan secara statistik setelah 4 minggu atau bahkan 8 minggu penggunaan.
Analisis titik akhir sekunder lebih lanjut, evaluasi visual kerut, menunjukkan bahwa skor evaluasi visual telah menurun sebesar 2,917% setelah 4 minggu penggunaan produk uji dan menurun secara signifikan secara statistik sebesar 8,333% setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,034). Dengan aplikasi kontrol, skor evaluasi visual telah meningkat sebesar 1,667% setelah 4 minggu dan 4,167% setelah 8 minggu. Perbedaan skor evaluasi visual antara area yang diobati dengan produk uji dan dengan kontrol signifikan secara statistik setelah 8 minggu penggunaan (p = 0,046) tetapi tidak setelah 4.
Secara ringkasan, analisis area kerut di sekitar mata menunjukkan bahwa perbedaan nilai titik akhir utama R3 antara area yang diobati dengan produk uji dan dengan kontrol signifikan secara statistik setelah 8 minggu penggunaan. Dalam hal titik akhir sekunder, semua nilai telah menurun setelah penggunaan produk uji dan meningkat setelah penggunaan kontrol. Perbedaan nilai R4 antara area yang diobati dengan produk uji dan area yang diobati dengan kontrol signifikan secara statistik setelah 4 minggu penggunaan, tetapi perbedaan nilai R1 dan R2 signifikan secara statistik hanya setelah 8 minggu penggunaan (Gambar 11). Skor evaluasi visual oleh profesional menunjukkan bahwa semua skor evaluasi visual rata-rata untuk kerut telah menurun setelah 4 minggu dan 8 minggu perlakuan produk uji dibandingkan dengan kontrol (Tabel 5). Perbedaan skor evaluasi visual antara area yang diobati dengan produk uji dan dengan kontrol signifikan secara statistik setelah 8 minggu penggunaan (Gambar 12). Secara keseluruhan, berdasarkan semua titik akhir, formula kosmetik yang mengandung PMO-H sebagai bahan utama ditemukan membantu meningkatkan kerut setelah 8 minggu penggunaan (Gambar 13).
