Peningkatan Khasiat Antitumor dan Farmakokinetik Bufalin melalui Liposom PEGylated

Metode

Bahan Kimia dan Reagen

Bufalin (kemurnian ≥ 98%) dibeli dari BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Baoji, Shaanxi, China). L-α-phosphatidylcholine, kolesterol, dan 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (garam amonium; DSPE-PEG₂₀₀₀ ) dibeli dari Sigma Chemical Co., Ltd.(St. Louis, MO, USA) (rumus molekul zat ini ditunjukkan dalam File tambahan 1:Gambar S1). Asetonitril yang digunakan adalah kelas spektroskopi dan dibeli dari Honeywell (Amerika). Kloroform dan alkohol (kelas analitik) dibeli dari Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Cina). Semua bahan kimia adalah kelas analitik atau kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Dan air dideionisasi menggunakan sistem pemurnian air Millipore (Milford, MA, USA) dan disaring dengan membran 0,22 m.

Hewan dan Sel

Penelitian ini dilakukan sesuai dengan rekomendasi dalam Panduan Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium dari National Institutes of Health. Protokol ini disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee dari Universitas Kedokteran Militer Keempat (Shaanxi, China) (persetujuan 2015-1013-R). Semua operasi dilakukan di bawah anestesi natrium pentobarbital, dan semua upaya dilakukan untuk meminimalkan penderitaan. Tikus jantan Sprague-Dawley, awalnya dengan berat 250 ± 20 g, diperoleh dari Universitas Kedokteran Militer Keempat (Xi'an, Cina). SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87, dan garis sel HepG2 masing-masing dibeli dari Bank Sel Shanghai atau Pusat Hewan Eksperimental dari Universitas Kedokteran Militer Keempat, dibiakkan dalam RPMI 1640 ditambah dengan 10% ( v /v ) serum janin sapi (FBS) dan 1% antibiotik (100 U/mL penisilin G dan 0,1 mg/mL streptomisin). Sel-sel dipertahankan dalam fase pertumbuhan eksponensial mereka dalam atmosfer 5% CO₂ dan 90% kelembaban relatif pada 37 °C.

Sintesis Liposom yang Mengandung Bufalin

Liposom disiapkan sebagai ukuran batch 10 mL menggunakan homogenisasi tekanan tinggi. Jumlah bufalin yang digunakan sama pada semua liposom. Secara singkat, liposom umum yang mengandung bufalin dibuat dengan komposisi bufalin, kolesterol, dan L-α-fosfatidilkolin dalam rasio molar 10:30:60; Liposom PEGylated bufalin-loaded disintesis dengan komposisi bufalin, kolesterol, L-α-phosphatidylcholine, dan DSPE-PEG₂₀₀₀ dalam rasio molar masing-masing 10:30:55:5.

Campuran fosfolipid di atas didispersikan seluruhnya dalam 3 mL kloroform, dan kemudian kloroform diuapkan seluruhnya dengan rotary evaporator pada suhu 50 °C dalam kondisi dekompresi. Selanjutnya, pelarut sisa (jika ada) dikeringkan dengan menempatkan dalam desikator vakum semalaman, dan kemudian film tipis kering yang telah disiapkan direhidrasi menggunakan vortex dalam 10 mL 50 ° C air deionisasi yang dipanaskan pada 10 mmol/mL fosfolipid selama 15 menit. Campuran yang terbentuk selanjutnya diproses dengan homogenisasi tekanan tinggi. Tekanan dan waktu homogenisasi dioptimalkan yang ternyata 500 bar pada 35 °C, dan prosesnya telah didaur ulang 10 kali. Suspensi liposom yang dihasilkan segera diekstrusi dengan ekstruder Lipex (ATS, Kanada) dua kali menggunakan membran polikarbonat (ukuran pori 0,2-μm, Whatman, Maidstone, UK) untuk membentuk liposom unilamellar. Suspensi liposomal blanko juga dibuat dengan metode yang sama seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan menghilangkan langkah penambahan bufalin.

Karakterisasi Liposom yang Mengandung Bufalin

Ukuran Partikel dan Potensi Zeta

Ukuran partikel dan zeta potensi liposom ditentukan dengan teknik hamburan cahaya dinamis menggunakan zeta penganalisis potensial (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, California, AS). Semua liposom bufalin diencerkan dengan phosphate-buffered saline (PBS) ke konsentrasi yang sesuai sebelum menentukan distribusi ukuran dan zeta potensi. Pengukuran dilakukan dalam mode otomatis penuh.

Mikroskopi Elektron Transmisi Resolusi Tinggi

Liposom bufalin selanjutnya dikarakterisasi dengan studi mikroskop elektron transmisi resolusi tinggi (HR-TEM). Suspensi liposom bufalin yang didukung pada kisi tembaga 300 mesh diwarnai secara negatif dengan 1% (w /v ) asam fosfotungstat. Pencitraan morfologi langsung dilakukan pada tegangan akselerasi 200 kV menggunakan TEM (Hitachi H-7650, Tokyo, Jepang).

Efisiensi Jebakan

Kandungan bufalin dianalisis dengan metode HPLC. Sistem HPLC Shimadzu (Kyoto, Jepang) dilengkapi dengan pompa LC-20AT, detektor susunan dioda SPO-M20A, oven kolom VP CTO-10AS, dan autosampler SIL-10AF. Semua pemisahan dilakukan pada kolom SinoChrom ODS-BP C18 (250 mm × 4.6 mm, 5 μm, Yillite) (Yillite, Dalian, China). Volume injeksi adalah 20 L, dan efluen kolom dipantau pada 296 nm. Data diperoleh dan diproses menggunakan perangkat lunak ClassVP. Fase gerak terdiri dari campuran asetonitril:0,1% kalium dihidrogen fosfat (dengan asam fosfat untuk mengatur nilai pH 3,8) dengan elusi gradien (50:50, v /v ). Kromatografi dilakukan pada laju alir 1,0 mL/menit. Untuk menentukan efisiensi penjeratan, 1,0 mL suspensi liposom bufalin ditambahkan ke kolom Sephadex G50 dan dielusi dengan PBS. Bagian kebiruan dari efluen dikumpulkan dan dibuat hingga 10,0 mL (volume akhir) dengan menambahkan PBS. Jumlahnya (A ₁ ) bufalin dalam suspensi liposom ditentukan dengan metode HPLC. PBS ditambahkan ke dalam bagian lain dari 1,0 mL suspensi liposom bufalin, sehingga mencapai volume akhir hingga 10,0 mL, dan jumlahnya (W ₂ ) bufalin yang terkandung ditentukan dengan cara yang sama. Persentase bufalin yang terperangkap dalam liposom bufalin dihitung dengan rumus:

Uji Coba Stabilitas In vitro

Efisiensi jebakan diuji dengan metode kromatografi Sephadex dan ukuran partikel ditentukan oleh zeta penganalisis potensial diterapkan untuk menilai profil stabilitas setelah penyimpanan pada 4 °C pada hari 0, 7, 15, 30, dan 90. Pada lima titik waktu, 200 L suspensi liposom diaspirasi untuk menentukan rasio kebocoran liposom. Bufalin bebas 200 L suspensi liposom segera dipisahkan menggunakan kromatografi kolom Sephadex G50, dan jumlah bufalin bebas ditentukan dengan metode HPLC. Rasio kebocoran liposom dihitung dengan rumus:

Pelepasan Bufalin In vitro

Perilaku pelepasan bufalin secara in vitro dari liposom dilakukan menggunakan teknik kantong dialisis pada suhu 37 °C seperti yang dijelaskan sebelumnya dengan beberapa modifikasi. PBS (pH = 7.4) yang mengandung 10% serum janin sapi digunakan sebagai media pelepasan. Obat bebas dikeluarkan dari liposom bufalin dengan dialisis lengkap selama 4 jam terhadap buffer PBS pada 4°C. Secara singkat, 1,0 mL suspensi liposom bufalin dipipet ke dalam tabung dialisis (Spectrumlabs, USA; MWCO 30 kDa) dengan pengocokan horizontal yang lembut (120 rpm/menit) pada suhu kamar. Tabung dialisis disimpan dalam 50 mL PBS (pH =7,4) yang mengandung 10% serum janin anak sapi dan suhu dipertahankan pada 37 °C. Dialisat ditarik dari media dan diganti dengan volume yang sama dari PBS segar pada jangka waktu yang berbeda, yaitu. jam 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24, dan 48. Konsentrasi bufalin yang dilepaskan diukur dengan HPLC seperti yang dijelaskan sebelumnya.

Sitotoksisitas

Studi sitotoksisitas in vitro dilakukan dengan menggunakan uji MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) pada beberapa jenis garis sel tumor termasuk SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87, dan HepG2. Selain itu, sel U87 dan U251 dipilih untuk mengukur efek sitotoksik liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEG yang mengandung bufalin pada sel tumor glioma. Sel U87 dan U251 masing-masing diunggulkan ke dalam pelat mikrotiter 96-sumur pada 1,0 × 10 ⁵ sel/sumur dan dibiarkan menempel (37 °C, 5% CO₂ ) selama 24 jam, setelah itu media diaspirasi dan diganti dengan 0,1 mL media segar. Entitas bufalin, liposom kosong, liposom PEGylated kosong, liposom bermuatan bufalin, dan liposom PEGylasi bermuatan bufalin diencerkan ke dalam medium lengkap dan ditambahkan ke sel dalam volume total 0,1 mL untuk mencapai konsentrasi akhir yang diinginkan; untuk kontrol, tidak ada larutan uji yang ditambahkan. Liposom kosong dan liposom PEGylated kosong dievaluasi untuk menguji toksisitas eksipien yang digunakan dalam pembuatan liposom bufalin. Setelah 24 jam, viabilitas sel dinilai dengan menginkubasi dalam media pertumbuhan yang mengandung 5 mg/mL MTT selama 4 jam pada 37°C. Setelah mengaspirasi media kultur, kristal formazan yang terbentuk dilarutkan dengan 200 L pelarut organik. Absorbansi telah diukur pada pembaca pelat mikro pada panjang gelombang 570 nm.

Studi Farmakokinetik In vivo Liposom Bufalin Menggunakan Metode HPLC

Studi farmakokinetik dilakukan untuk mengevaluasi penyerapan, distribusi, metabolisme, dan ekskresi bufalin dari liposom umum atau liposom bersirkulasi panjang dan untuk mencari perbedaan bioavailabilitas bufalin, menggunakan teknik HPLC.

Dalam percobaan ini, tikus Sprague-Dawley jantan dewasa muda yang sehat, dengan berat 250 ± 20 g, dibeli dari Universitas Kedokteran Militer Keempat (Xi'an, Cina). Tikus ditempatkan di kandang yang berventilasi baik pada suhu kamar (24 ± 2 °C) dan kelembaban relatif 40–60% pada siklus terang-gelap 12 jam reguler. Hewan diaklimatisasi minimal 3 hari sebelum percobaan. Prosedur hewan dilakukan sesuai dengan Pedoman Komite Etik Hewan Universitas Kedokteran Militer Keempat.

Liposom yang mengandung bufalin, liposom PEGylated yang mengandung bufalin, dan bufalin dalam pelarutan yang dibantu suspensi berair dengan etanol disiapkan seperti yang dijelaskan sebelumnya dan kemudian diberikan secara intravena dengan dosis setara masing-masing 0,5 mg/kg. Sampel darah dikumpulkan dari fossa orbitalis wein tikus di bawah anestesi eter ringan ke dalam tabung mikro-fuge yang mengandung heparin sebagai antikoagulan pada 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 menit pasca- dosis dan kemudian disentrifugasi pada 3500 r/menit selama 15 menit pada 4 °C. Plasma yang dipisahkan disimpan beku pada 20 °C sebelum pengujian.

Perlakuan Awal Sampel

Sebuah metode ekstraksi cair-cair sederhana diikuti untuk ekstraksi bufalin dan standar internal dari darah tikus. Ke dalam 200 L, larutan standar internal (20 L 100 μg/mL stok kerja cinobufagin) setara dengan 10,0 g ditambahkan dan dicampur selama 10 detik pada siklomikser, diikuti dengan ekstraksi dengan 3,0 mL etil asetat:petroleum eter, 1:1(v /v ), dan campuran. Campuran divortex selama 5 menit, diikuti dengan sentrifugasi selama 15 menit pada 4000 r/menit pada Sigma 3-16k (Frankfurt, Jerman). Sebuah alikuot dari 3,0 mL lapisan organik dipisahkan dan diuapkan sampai kering di bawah nitrogen, dan kemudian residu dilarutkan kembali dalam 200 L asetonitril. Dua puluh mikroliter cairan supernatan disuntikkan ke kolom analitik untuk analisis setelah sentrifugasi 15 menit pada 12.000 r/menit.

Analisis Farmakokinetik

Konsentrasi darah maksimum yang diamati (C _maks ) dan waktu paruh (T _1/2 ) diperoleh dengan inspeksi visual dari data eksperimen. Data menjadi sasaran analisis farmakokinetik non-kompartemen menggunakan Obat dan Statistik (DAS 2.1.1) yang diedit oleh komite profesional farmakologi matematika Masyarakat Farmakologi Cina untuk evaluasi klinis obat. Data dianalisis menurut model terbuka dua kompartemen.

Analisis Statistik

Semua hasil dinyatakan sebagai mean ± SD (n = 3), dan perbedaan antara formulasi dibandingkan dengan analisis varians satu arah (ANOVA), menggunakan perangkat lunak GraphPad Prism 5. P < 0,05 menunjukkan signifikansi dalam semua kasus.

Hasil

Sifat Fisikokimia

Rehidrasi film yang dikombinasikan dengan teknologi homogenisasi tekanan tinggi digunakan untuk preparasi liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEG yang mengandung bufalin. Rehidrasi film merupakan salah satu metode konvensional untuk mensintesis liposom dengan proses yang matang dan terkendali untuk menjebak obat lipofilik. Selain itu, jumlah siklus homogenisasi memainkan peran kunci untuk mencapai suspensi liposom yang seragam dan stabil.

Morfologi liposom bufalin-loaded dan liposom PEGylated bufalin-loaded hampir bulat atau oval seperti yang diamati oleh TEM seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1 Menurut gambar TEM, ukuran partikel rata-rata liposom bufalin-loaded dan PEGylated bufalin-loaded liposom keduanya di bawah 200 nm. Ukuran partikel rata-rata liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin adalah masing-masing 127,6 ± 3.64 nm dan 155.0 ± 8.46 nm (Gbr. 1c), diukur dengan zeta penganalisis potensial (Delsa™ Nano, Beckman Coulter, California, AS). Dibandingkan dengan liposom yang mengandung bufalin, liposom PEGylated yang mengandung bufalin menunjukkan muatan permukaan negatif, menunjukkan stabilitas yang sangat baik (liposom yang mengandung bufalin 2.24 mV; liposom PEGylated yang mengandung bufalin −18.05 mV, File tambahan 2:Tabel S1). Selain itu, distribusi zeta potensial dapat dilihat pada Gambar 1b. Namun, efisiensi penjebakan bufalin dalam liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin yang ditentukan oleh HPLC masing-masing adalah 76,31 ± 3,40% dan 78,40 ± 1,62%.

Sifat fisikokimia liposom bufalin-loaded dan liposom PEGylated bufalin-loaded. a Gambar TEM dari liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin dengan bentuk hampir bulat atau oval. b Ukuran partikel yang khas dan distribusi liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin yang diukur dengan hamburan cahaya dinamis. c Permukaan khas zeta potensi liposom bufalin-loaded dan liposom PEGylated bufalin-loaded

Uji Coba Stabilitas In vitro

Profil stabilitas liposom bufalin-loaded dan liposom PEGylated bufalin-loaded ditunjukkan pada Tabel 1. Selain itu, rasio kebocoran liposom juga telah dihitung. Untuk liposom bufalin-loaded, hasilnya masing-masing 0,0, 16,7, 25,2, 27,9, dan 30,6% pada 4 °C pada hari ke 0, 7, 15, 30, dan 90. Untuk liposom PEGylated bufalin, hasilnya masing-masing 0,0 , 5.0, 8.8, 14.5, dan 18,0% pada 4 °C pada hari ke 0, 7, 15, 30, dan 90.

Profil Rilis In vitro

Profil pelepasan bufalin dari liposom yang mengandung bufalin atau liposom PEG yang mengandung bufalin dirangkum dalam Gambar 2. Dari data eksperimen, dalam media disolusi yang sama, bufalin dapat berdifusi ke PBS yang mengandung 10% serum janin sapi dengan cepat tanpa batasan, diikuti dengan bufalin - liposom dan terakhir liposom PEGylated yang mengandung bufalin.

Pelepasan bufalin in vitro dari liposom umum yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin dalam buffer fosfat media disolusi, pH 7,4. Data adalah sarana ± SD, n = 3

Sitotoksisitas

Viabilitas sel dari beberapa jenis garis sel tumor yang dipengaruhi oleh entitas bufalin ditunjukkan pada Gambar. 3a ketika diuji dengan uji MTT, dan konsentrasi penghambatan setengah maksimalnya (IC₅₀ ) juga dihitung dalam File tambahan 2:Tabel S2. Bufalin menyebabkan penghambatan pertumbuhan beberapa sel tumor dengan cara yang tergantung dosis, sedangkan hasil IC₅₀ mengungkapkan bahwa bufalin lebih sensitif terhadap sel kanker glioma U251 dan U87 daripada sel kanker lain yang diuji. Ketika diterapkan dengan entitas bufalin, liposom yang mengandung bufalin, dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin, viabilitas sel U251 yang dilakukan oleh uji MTT ditunjukkan pada Gambar. 3b. Ketika dikultur selama 12 jam, viabilitas sel dari entitas bufalin, liposom yang mengandung bufalin, dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin menunjukkan secara berbeda, sedangkan liposom kosong dan liposom PEGylated kosong tidak berubah. Seperti yang dijelaskan, pada tingkat konsentrasi yang sama, viabilitas sel U251 dalam kelompok liposom PEGylated yang mengandung bufalin selalu lebih rendah daripada yang ada dalam kelompok liposom yang mengandung bufalin; sementara itu, dampak entitas bufalin pada viabilitas sel minimal.

Sitotoksisitas in vitro dari liposom kosong, liposom PEGylated kosong, entitas bufalin, liposom yang mengandung bufalin, dan liposom PEGylated yang memuat bufalin terhadap sel tumor. a Viabilitas sel dari beberapa jenis garis sel tumor pada berbagai konsentrasi entitas bufalin. b Viabilitas sel sel U251 pada berbagai konsentrasi liposom kosong, liposom kosong PEGylated, entitas bufalin, liposom bermuatan bufalin, dan liposom PEGylasi bermuatan bufalin

Studi Farmakokinetik In vivo

Validasi Metode

Kurva kalibrasi diplot berdasarkan analisis regresi linier keberatan terhadap rasio area puncak standar internal (y ) versus konsentrasi (x , g/mL) bufalin dalam larutan standar pada tujuh konsentrasi yang berbeda. Persamaan regresi adalah y = 0.4238 x + 0,2429 (kisaran linier 0,05–10,0 μg/mL), dan koefisien korelasi (R ² ) adalah 0,9965. Nilai batas deteksi (LOD) adalah 0,01 μg/mL, yang dihitung sebagai jumlah sampel yang disuntikkan yang memberikan rasio signal-to-noise 3 (S/N = 3).

Kekhususan, Presisi, dan Pemulihan

Tingkat interferensi oleh zat endogen dinilai dengan pemeriksaan kromatogram yang berasal dari sampel plasma kosong yang diproses. File tambahan 3:Gambar S2 menyajikan kromatogram khas plasma kosong, plasma kosong yang dibubuhi bufalin, plasma kosong yang dibubuhi bufalin dan resibufogenin (sebagai standar internal), sampel plasma yang dibubuhi resibufogenin 30 menit setelah pemberian entitas bufalin secara intravena, sampel plasma dibubuhi dengan resibufogenin 30 menit setelah pemberian intravena liposom yang mengandung bufalin, dan sampel plasma dibubuhi resibufogenin 30 menit setelah pemberian intravena liposom PEGylated yang mengandung bufalin. Bufalin dan resibufogenin dielusi masing-masing sekitar 7,191 dan 10,131 menit. Tidak ada puncak interferensi dan bahan membran liposom yang ditemukan pada waktu retensi bufalin atau standar internal. Hasil uji presisi dan pemulihan diilustrasikan pada Tabel 2.

Farmakokinetik

Profil waktu konsentrasi darah dari liposom yang mengandung bufalin, liposom PEGylated yang mengandung bufalin, dan perbandingannya dengan entitas bufalin dalam suspensi berair ditunjukkan pada Gambar 4. Parameter farmakokinetik rata-rata disajikan pada Tabel 3. Hasil menunjukkan bahwa ada perbedaan yang signifikan di sebagian besar parameter ini di antara mereka, dan C _maks liposom bufalin-loaded kurang dari entitas bufalin, sedangkan liposom PEGylated bufalin-loading paling sedikit. Selain itu, T _1/2z rasio liposom PEGylated bermuatan bufalin terhadap entitas bufalin dan liposom bermuatan bufalin terhadap entitas bufalin adalah sekitar 2,15 kali lipat (87,84 min/40,52 mnt) (P < 0,01) dan 1,34 kali lipat (54,40 mnt/40,52 mnt) (P < 0,05), masing-masing. AUC_{(0–t )} rasio liposom PEGylated yang mengandung bufalin terhadap entitas bufalin dan liposom yang mengandung bufalin terhadap entitas bufalin adalah sekitar 5,49 kali lipat (139.157.83 ng/(mL min)/25.334.27 ng/(mL min)) (P < 0,01) dan 2,28 kali lipat (57.751,88 ng/(mL mnt)/25.334,27 ng/(mL mnt)) (P < 0.01), masing-masing. Ini mengungkapkan bahwa entitas bufalin dengan cepat dibersihkan dalam aliran darah dan persiapan liposom meningkatkan konsentrasi obat dalam plasma dan menahan pembersihan. Selanjutnya, modifikasi PEG dapat memfasilitasi efek ini.

Kurva waktu konsentrasi bufalin dalam plasma pada tikus

Diskusi

Penelitian ini berhasil menyiapkan liposom bufalin-loaded dan liposom PEGylated bufalin-loaded dengan metode homogenisasi-film rehidrasi, keduanya memiliki kisaran ukuran optimal dan polidispersitas rendah dan dapat dengan mudah direproduksi dalam ukuran batch yang besar. Studi ini menemukan bahwa formulasi liposomal sangat meningkatkan kelarutan bufalin.

Liposom PEGylated yang dimuat bufalin menunjukkan muatan permukaan negatif dengan nilai absolut yang lebih besar daripada liposom yang dimuat bufalin dengan muatan permukaan positif. zeta potensial terutama ditentukan oleh sifat permukaan. Liposom bermuatan bufalin yang tidak dimodifikasi bersifat netral, dan potensinya umumnya dalam ± 5 mV. Namun, DSPE tidak bermuatan dalam kondisi netral, tetapi proses persiapan tidak dapat sepenuhnya netral, sehingga DSPE bermuatan negatif. Sementara itu, zeta potensi makromolekul PEG adalah sekitar negatif untuk beberapa milivolt, mendekati potensial negatif netral. Oleh karena itu, setelah modifikasi permukaan DSPE-PEG₂₀₀₀ pada liposom yang mengandung bufalin, zeta potensi liposom PEGylated bufalin-loaded negatif. Temuan ini menunjukkan bahwa modifikasi permukaan DSPE-PEG₂₀₀₀ mengubah potensial listrik permukaan liposom, yang meningkatkan stabilitasnya. Hal ini telah dikonfirmasi dengan uji stabilitas in vitro. Li dkk. [12] menggunakan sistem pengiriman bersama liposom yang menggabungkan anti-CD40 mAbs ke permukaan liposom PEGylated yang dibungkus dengan bufalin. Liposom disintesis dengan komposisi bufalin, kolesterol, EPC, DSPE-PEG₂₀₀₀ , dan DSPE-PEG₂₀₀₀ -Mal dalam rasio molar masing-masing 20:55:5:5:15. Kemudian antibodi monoklonal anti-CD40 dikonjugasikan ke liposom melalui reaksi maleimida-tiol untuk pembuatan anti-CD40 berlabuh liposom bufalin. Berkenaan dengan profil stabilitas, hanya disebutkan bahwa muatan permukaan negatif menunjukkan stabilitas yang sangat baik tanpa deskripsi data yang jelas dan pasti.

Li dkk. [13] membuat liposom bufadienolide-loaded (BU-lipo) yang terdiri dari Lipoid E-80® 1,25% dan kolesterol 0,06%. Efisiensi penjeratan bufalin, cinobufagin, dan resibufogenin berturut-turut adalah 86,5, 90,0, dan 92,1%. Mempertimbangkan stabilitas fosfolipid, pH 6,5 dipilih untuk formulasi BU-lipo. Sifat-sifat BU-lipo, seperti pH, PSD, zeta potensi, dan efisiensi jebakan, tidak berubah setidaknya selama 3 bulan pada 2–8°C. Namun, kondisi penyimpanan perlu dikontrol secara ketat. Sediaan yang lebih stabil pada pH netral perlu dipelajari untuk mengurangi biaya transportasi dan penyimpanan, yang harus dipertimbangkan untuk aplikasi klinis di masa mendatang.

Menurut formulasi persiapan dari penelitian sebelumnya, kami mereplikasi percobaan tentang liposom yang mengandung bufalin. Namun, stabilitas liposom tidak dapat memenuhi kebutuhan produksi.

Dalam penelitian ini, liposom PEGylated bufalin-loaded disintesis dengan komposisi bufalin, kolesterol, L-α-phosphatidylcholine, dan DSPE-PEG₂₀₀₀ dalam rasio molar 10:30:55:5, masing-masing. Khusus sebelum diekstrusi dengan ekstruder Lipex menggunakan membran polikarbonat, campuran yang terbentuk diproses lebih lanjut dengan homogenisasi tekanan tinggi.

Ketika disimpan dalam pH netral pada 4 °C selama 3 bulan, ukuran partikel kedua liposom meningkat sedikit dan efisiensi penjeratan menurun secara keseluruhan, yang akan nyaman digunakan dalam aplikasi klinis. Foto TEM menunjukkan bahwa struktur tebal seperti awan tiga dimensi menutupi permukaan liposom yang mengandung bufalin, yang menunjukkan bahwa DSPE-PEG₂₀₀₀ berperan dalam stabilisasi sterik karena fitur struktur polimer linier amfifiliknya.

Sebuah studi pelepasan in vitro mengungkapkan bahwa pelepasan bufalin dari liposom yang mengandung bufalin dan liposom PEGylated yang mengandung bufalin ditunda dalam media disolusi yang sama, sementara entitas bufalin berdifusi ke PBS dengan cepat tanpa batasan. Modifikasi permukaan DSPE-PEG₂₀₀₀ mengubah sifat penghalang dari lapisan batas berair dan permeabilitas membran, menghasilkan kecepatan pelepasan bufalin dari liposom yang rendah.

Mengenai studi sitotoksisitas, bufalin menyebabkan penghambatan pertumbuhan yang jelas pada beberapa sel tumor dengan cara yang bergantung pada dosis, sedangkan hasil IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.

Efek Kopling Polariton Plasmon Permukaan dan Resonansi Dipol Magnet pada Metamaterial Persiapan Palladium(II) Ion-Imprinted Polymeric Nanospheres dan Penghapusan Palladium(II) dari Larutan Berair