Liposome PEGilasi Meningkatkan Kelebihan Larutan, Farmakokinetik, dan SitoToksis Glioma Bufalin

Abstrak

Bufalin, glikosida jantung yang diekstrak dari Venenum Bufonis, menunjukkan aktivitas jantung, antiviral, imunomodulasi, dan antitumor yang signifikan. Namun, sifat hidrofobiknya membatasi pengiriman sistemik. Dalam studi ini kami memformulasikan bufalin ke dalam liposome PEGilasi menggunakan eksipien yang disetujui FDA dan membandingkan properti fisikokimia, in vitro efikasi, dan farmakokinetik in vivo dengan liposome non-PEGilasi dan obat bebas. Kedua sistem liposome menunjukkan ukuran partikel homogen (127,6 ± 3,6 nm untuk non-PEGilasi, 155,0 ± 8,5 nm untuk PEGilasi), efisiensi penangkap tinggi (>76 %), dan muatan permukaan yang berbeda (2,2 mV vs. –18,0 mV). Formulasi PEGilasi merilis bufalin lebih lambat in vitro dan, pada tikus Sprague-Dawley, memanjang setengah hayat plasma (87,8 min vs. 40,5 min untuk obat bebas) dan meningkatkan AUC sebesar 5,5 kali lipat. Uji sitotoksis pada sel glioma U251 mengungkapkan potensi yang lebih baik dari liposome PEGilasi dibandingkan bufalin bebas. Hasil ini menunjukkan bahwa liposome PEGilasi secara signifikan meningkatkan kelebihan larutan, biodistribusi, dan efikasi antitumor bufalin, mendukung potensinya sebagai platform pengiriman obat glioma.

Latar Belakang

Secara global, insidensi kanker meningkat, dengan glioma yang menjadi tantangan yang sangat mematikan karena penghalang otak-darah (BBB) dan resistensi multidroga [1,2]. Bufalin, yang diisolasi dari kulit dan sekresi parotid katak seperti Bufo bufo gargarizans dan Bufo melanostictus, dilaporkan memiliki properti jantung, antiviral, imunoregulasi, dan antitumor [3–7]. Terjemahan klinisnya terhalang oleh kelebihan larutan air yang buruk dan klarifikasi cepat [8]. Enkapsulasi liposome dapat meningkatkan kelebihan larutan, melindungi obat dari degradasi, dan memfasilitasi penetrasi BBB [9–10]. Namun, konvensional liposome dengan cepat diopsonasi dan dibersihkan oleh sistem fagosit mononukleer. PEGilasi permukaan memberikan perlindungan steril, memanjang waktu sirkulasi dan meningkatkan farmakokinetik [11]. Belum ada studi komprehensif yang membandingkan farmakokinetik bufalin bebas, liposome non-PEGilasi, dan formulasi liposome PEGilasi setelah pengiriman intravena. Karya ini mengatasi kesenjangan itu dengan mengembangkan liposome PEGilasi untuk bufalin dan mengevaluasi karakteristik fisikokimia, peluncuran in vitro, sitotoksis, dan farmakokinetik in vivo pada tikus.

Metode

Bahan dan Reagen

Bufalin (≥ 98 % kemurnian) diperoleh dari BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. Komponen lipid—L-α-fosfatidilkolin, kolesterol, dan DSPE-PEG2000—dibeli dari Sigma-Aldrich. Semua pelarut kelas HPLC, dan air MilliQ digunakan sepanjang waktu.

Hewan dan Sel

Tikus Sprague-Dawley jantan (250 ± 20 g) dirawat dalam kondisi standar. Baris sel tumor manusia (SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87, HepG2) dikultur dalam RPMI-1640 yang dilengkapi dengan 10 % FBS dan antibiotik pada 37 °C, 5 % CO₂.

Persiapan Liposome

Bufalin diimbuhkan ke dalam liposome melalui rehidrasi film tipis diikuti oleh homogenisasi tekanan tinggi (500 bar, 35 °C, 10 siklus). Liposome non-PEGilasi berisi bufalin, kolesterol, dan L-α-fosfatidilkolin (10:30:60 mol %) sedangkan liposome PEGilasi menambahkan DSPE-PEG2000 (5 mol %) untuk menghasilkan rasio 10:30:55:5. Suspensi yang dihasilkan diekstrusi dua kali melalui membran policarbonat 0,2 µm untuk menghasilkan vesikel unilamelar.

Karakterisasi

Ukuran, Potensi Zeta, dan Morfologi

Pencaran cahaya dinamis (DLS) mengukur diameter hidrodinamik dan potensi zeta (Delsa™ Nano, Beckman Coulter). TEM (Hitachi H-7650, 200 kV) mengonfirmasi morfologi bola.

Efisiensi Penangkap

Enkapsulasi diukur dengan HPLC pada kolom SinoChrom ODS-BP C18 (250 × 4,6 mm, 5 µm). Gradien asetonitril dan 0,1 % KH₂PO₄ (pH 3,8) pada 1,0 mL min⁻¹ digunakan. Efisiensi penangkap (%) = (W₁/W₂) × 100, di mana W₁ adalah bufalin yang dipulihkan dari inti liposome dan W₂ adalah total dosis yang ditambahkan.

Penilaian Stabilitas

Sampel disimpan pada 4 °C dievaluasi pada hari 0, 7, 15, 30, dan 90 untuk ukuran partikel, potensi zeta, dan kebocoran (W₀ – Wₓ)/W₀ × 100 %.

Peluncuran In Vitro

Kapsul dialisis (MWCO 30 kDa) yang berisi 1 mL suspensi liposome direndam dalam 50 mL PBS (pH 7,4) dengan 10 % FCS pada 37 °C. Sampel dikumpulkan pada titik waktu yang ditentukan dan dianalisis dengan HPLC.

Sitotoksis

Uji MTT dilakukan pada sel glioma U251 dan U87 yang terpapar liposome kosong, PEGilasi, atau liposome termuat bufalin. Kepadahan sel dibaca pada 570 nm setelah inkubasi 24 jam.

Farmakokinetik In Vivo

Tikus menerima dosis IV 0,5 mg kg⁻¹ bufalin bebas, liposome non-PEGilasi, atau liposome PEGilasi. Sampel darah dikumpulkan hingga 10 jam setelah dosis, difusgasir, dan plasma disimpan pada –20 °C. Konsentrasi bufalin diukur dengan ekstraksi cair-cair diikuti oleh HPLC, dan analisis non-kompartemen menghasilkan C_max, T½, dan AUC.

Analisis Statistik

Data adalah rata-rata ± SD (n = 3). ANOVA satu arah (GraphPad Prism) menentukan signifikansi pada p < 0,05.

Hasil

Properti Fisikokimia

Kedua persiapan liposome menunjukkan distribusi ukuran seragam (<200 nm) dan enkapsulasi tinggi (76–78 %). Vesikel PEGilasi memiliki muatan permukaan yang lebih negatif (–18 mV vs. +2 mV), yang menunjukkan stabilitas koloid yang ditingkatkan (Gambar 1).

Stabilitas

Selama 90 hari pada 4 °C, liposome PEGilasi menunjukkan peningkatan ukuran minimal (≤ 8 %) dan kebocoran (< 18 %) dibandingkan liposome non-PEGilasi (kebocoran hingga 31 %).

Profil Peluncuran

Bufalin bebas larut dengan cepat dalam PBS/FCS, sementara liposome PEGilasi merilis obat dengan laju yang lebih lambat dan sosten (Gambar 2). Keterlambatan dalam peluncuran berkaitan dengan penghalang sterik yang dihasilkan oleh DSPE-PEG2000.

Sitotoksis

Di seluruh baris tumor, bufalin menghambat pertumbuhan secara tergantung pada dosis, dengan nilai IC₅₀ terendah untuk sel glioma U251 dan U87 (Tabel S2). Liposome PEGilasi mengurangi vitalitas U251 secara lebih efektif daripada bufalin bebas atau liposome non-PEGilasi, sementara formulasi kosong tidak menunjukkan sitotoksis (Gambar 3).

Farmakokinetik

Pada tikus, liposome PEGilasi memanjang setengah hayat plasma (87,8 min) dan AUC (139 µg min mL⁻¹) relatif terhadap bufalin bebas (40,5 min, 25 µg min mL⁻¹). Liposome non-PEGilasi juga meningkatkan farmakokinetik (54,4 min, 58 µg min mL⁻¹) tetapi dalam tingkat yang lebih rendah (Gambar 4).

Pembahasan

Formulasi PEGilasi kami mencapai ukuran partikel dalam jendela optimal 100–200 nm untuk penetrasi tumor, sementara muatan permukaan negatif memberikan stabilitas jangka panjang. Profil peluncuran sosten selaras dengan efek penghalang PEG yang diketahui, yang melindungi isi liposome dari kebocoran prematur. Uji sitotoksis mengonfirmasi bahwa enkapsulasi tidak mengorbankan, dan bahkan dapat meningkatkan, potensi antitumor bufalin terhadap sel glioma—kemungkinan karena pengambilan sel yang ditingkatkan dan pengintasan seluler yang terkontrol.

Data farmakokinetik menggarisbawahi relevansi klinis: PEGilasi melipatgandakan waktu tinggal plasma dan lebih dari melipatkalima paparan sistemik, yang dapat diterjemahkan menjadi akumulasi tumor yang lebih tinggi melalui efek penetrasi dan retensi yang ditingkatkan (EPR). Temuan ini konsisten dengan laporan sebelumnya tentang obat liposome yang dimodifikasi PEG yang mencapai sirkulasi yang panjang dan klarifikasi yang diminu [12–14].

Sementara studi ini menunjukkan keuntungan yang jelas dari liposome PEGilasi, investigasi lebih lanjut diperlukan untuk memetakan distribusi jaringan, menilai translokasi BBB, dan mengevaluasi efikasi terapeutik dalam model glioma ortotopik. Namun, data mendukung liposome PEGilasi sebagai platform pengiriman yang menjanjikan untuk bufalin dalam terapi kanker.

Kesimpulan

Liposome PEGilasi secara signifikan meningkatkan kelebihan larutan bufalin, memanjang setengah hayat plasma, dan meningkatkan sitotoksis sel glioma. Sistem nanokarrier ini menawarkan strategi yang feasible untuk pengiriman bufalin ke otak dan memerlukan pengembangan preclinical lebih lanjut.