Evaluasi kuantitatif internalisasi seluler nanopartikel polimer dalam sel kanker laring dan sel imun untuk pengiriman obat yang ditingkatkan

Hasil dan diskusi

Karakterisasi partikel poli(asam laktat-co-glikolat)

Mikrograf fluoresensi partikel PLGA (Gbr. 1a, b, c) menunjukkan intensitas fluoresen yang kuat dan tidak ada penurunan signifikan dalam sinyal fluoresensi selama 14 hari setelah persiapan (File tambahan 1:S1), menunjukkan distribusi ukuran yang relatif homogen dan fluoresensi tinggi stabilitas. Seperti yang ditunjukkan oleh pemasok, partikel PLGA 100, 500, dan 1000 nm menunjukkan ukuran masing-masing sekitar 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± 128,3 nm, dan 951,9 ± 237,5 nm (Gbr. 1d,e,f). Menurut pengukuran potensial zeta, muatan permukaan rata-rata pada partikel adalah − 20.6 ± 5.3,  17 ± 4.6, dan  16.5 ± 3.5 dengan indeks polidispersitas 0,057, 0,056, dan 0,062 untuk 100, 500, dan 1000 partikel nm, masing-masing, yang terakhir menunjukkan standar mereka yang sangat monodispersi. Semua partikel divorteks dan kemudian disonikasi dalam penangas air selama 5 menit untuk sebagian besar menghilangkan agregasi partikel. Namun, puncak kecil yang sesuai dengan partikel 100 dan 1000 nm diamati dengan diameter sekitar 4–6 µm karena agregasi partikel yang tak terhindarkan dalam jumlah yang sangat kecil (sekitar 3-4%).

Karakterisasi partikel PLGA. Mikrograf fluoresensi menunjukkan ukuran yang berbeda (a 100 nm, b 500 nm, dan c 1 µm) partikel PLGA. Partikel-partikel tersebut dapat dideteksi di bawah Olympus Optical Microscopy yang menunjukkan distribusi ukuran partikel yang relatif seragam dalam suspensi air. Pengukuran hamburan cahaya dinamis (DLS) menampilkan distribusi ukuran yang ditimbang berdasarkan volume untuk 100 nm (d ), 500 (e ), 1 µm (f ) partikel PLGA. Meskipun sebagian kecil agregasi partikel (puncak lebih kecil:3-4%) dalam suspensi PLGA 100 nm dan 1 µm, distribusi ukuran partikel keseluruhan cukup homogen karena puncak utama yang sempit

Evaluasi viabilitas sel dan sitotoksisitas

Karena biokompatibilitas dan biodegradabilitasnya yang luar biasa, partikel PLGA telah disetujui oleh FDA dan European Medicine Agency untuk aplikasi biomedis [27, 28]. Partikel PLGA saat ini telah digunakan di klinik dan diterapkan secara luas dalam studi praklinis sebagai pembawa nano yang mengantarkan obat ke daerah atau tumor tertentu yang sakit. Namun, efisiensi penargetan dan kemanjuran terapeutik partikel PLGA terhalang, setidaknya sebagian, oleh sistem kekebalan. Misalnya, fagositosis partikel tinggi oleh sel Kupffer di hati sangat membatasi pembawa obat nano memasuki lokasi tumor [15]. Oleh karena itu, sangat penting untuk membangun model in vitro lanjutan untuk mempelajari interaksi antara sel kanker, sel kekebalan dan partikel untuk lebih meniru situasi in vivo pengiriman obat. UM-SCC-17A adalah garis sel karsinoma skuamosa laring unik yang diisolasi dari spesimen kanker laring primer [29]. Namun, informasi mengenai efisiensi penyerapan seluler in vitro dalam sistem kultur bersama (mis. , co-inkubasi makrofag dan sel kanker) masih belum mencukupi, masalah yang perlu ditangani untuk meningkatkan kemampuan prediksi respons in vivo. Selain itu, telah terbukti bahwa ukuran partikel dan lapisan permukaan memainkan peran penting dalam kemampuan pengiriman ke tumor padat, situs yang sakit, dan sel kanker pada model hewan dan kultur sel [30,31,32,33]. Di sini, kami menerapkan tiga ukuran PLGA ke sel karsinoma UM-SCC-17A untuk menyelidiki efek ukuran partikel pada serapan seluler dan distribusi intraseluler dalam sistem monokultur dan kultur bersama.

Penelitian ini menentukan viabilitas sel menggunakan metode WST-1 (4-[3-(4-iodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzena disulfonat) untuk monokultur THP-1 dan sel UM-SCC-17A, serta kultur bersama kedua jenis sel. Meskipun tidak ada kematian sel yang jelas terjadi pada kelompok yang diobati dengan PLGA 100 dan 500 nm pada semua konsentrasi yang diuji, partikel PLGA 500 nm dan 1 m pada konsentrasi tertinggi (20 g/mL) secara signifikan mengurangi viabilitas sel dalam monokultur UM-SCC-17A sel (Gbr. 2a). Seperti yang diharapkan, viabilitas sel THP-1 tidak terpengaruh secara signifikan setelah inkubasi 24 jam dengan ketiga jenis PLGA pada konsentrasi 5–20 g/mL (viabilitas ≥ 95% dibandingkan dengan sel yang tidak diberi perlakuan, yang viabilitasnya dianggap 100%). , Gbr. 2b). Identik dengan hasil sel UM-SCC-17A monokultur, viabilitas sel dalam sistem kultur bersama tidak berubah dengan adanya partikel PLGA 100 dan 500 nm dalam tiga dosis yang digunakan di sini, sementara itu menurun secara signifikan pada kelompok yang diobati dengan 20 g/mL 1 µm PLGA (Gbr. 2c).

Penentuan viabilitas sel dalam sel monokultur dan kultur bersama menggunakan uji WST. UM-SCC-17A (a ) dan sel THP-1 (b ), dan sel UM-SCC-17A dan THP-1 yang dikultur bersama (c ) diperlakukan dengan berbagai konsentrasi (5—20 µg/mL) partikel PLGA dalam tiga ukuran

Evaluasi sitotoksisitas partikel menggunakan uji LDH adalah untuk mengetahui kebocoran membran sel dengan mengukur jumlah LDH ekstraseluler [9]. Pelepasan enzim sitoplasmik ini ke dalam supernatan kultur sel merupakan karakteristik dari cedera membran sel, yang menyebabkan kematian sel yang ireversibel. Meskipun sedikit peningkatan kadar LDH dengan dosis yang lebih tinggi dalam sel UM-SCC-17A monokultur yang diobati dengan berbagai dosis 1 m PLGA, tidak ada sitotoksisitas yang berbeda pada sel yang diamati bahkan pada konsentrasi tertinggi 20 g/mL (Gbr. 3a) . Tidak mengherankan, ketiga ukuran PLGA yang digunakan di sini pada berbagai dosis tidak dapat menginduksi pelepasan LDH substansial ke dalam supernatan, menunjukkan efek toksik yang tidak signifikan terhadap sel monokultur THP-1, yang juga sangat konsisten dengan hasil viabilitas sel yang dijelaskan di atas (Gbr. . 3b). Dalam percobaan kultur bersama, semua partikel dengan konsentrasi yang berbeda menunjukkan biokompatibilitas yang sangat baik terhadap kedua sel dalam hal tingkat LDH yang dilepaskan (Gbr. 3c). Secara umum, rentang ukuran partikel yang luas, dari 100 nm hingga 1 µm, yang digunakan di sini mencakup ukuran khas nanocarrier (50–200 nm), seperti liposom, misel, dendrimer, polimer, dan sel mini. Rentang ini juga mencakup partikel berukuran sub-mikron (partikel 500 nm masih dapat dianggap sebagai NP, mis., partikel dengan ukuran sekitar 500 nm memiliki jalur pembersihan yang sama di paru-paru seperti NP dalam 10-100 nm [34] dan berukuran mikron 1 µm. Tak satu pun dari partikel PLGA ini menunjukkan sitotoksisitas yang jelas pada sel THP-1 dan/atau UM-SCC-17A dalam sistem monokultur dan kultur bersama, kecuali untuk partikel PLGA 500 nm dan 1 m pada konsentrasi tertinggi terhadap UM-SCC- 17A dan sel kultur bersama (tetapi lebih dari 85% sel bertahan hidup), menunjukkan bahwa mereka cocok untuk aplikasi dalam sistem penghantaran obat.

Penentuan sitotoksisitas untuk sel monokultur dan kultur bersama menggunakan uji LDH. UM-SCC-17A (a ) dan sel THP-1 (b ), dan sel yang dikultur bersama (c ) diperlakukan dengan partikel PLGA. Tidak ada kematian sel yang signifikan yang diamati setelah inkubasi partikel 24 jam (dengan ukuran dan konsentrasi berbeda yang digunakan di sini) dan sel dalam sistem monokultur dan kokultur

Kemampuan penyerapan seluler PLGA dalam sistem monokultur dan ko-kultur

Gambar 4 menunjukkan morfologi sel (Gbr. 4a,d,g), inti sel dan NP 100 nm (Gbr. 4b,e,h), dan menggabungkan gambar yang diperbesar (Gbr. 4c,f,i) dalam monokultur dan ko- sistem budaya. Tidak ada partikel yang diamati pada sel yang tidak diobati dari kelompok kontrol (File tambahan 1:S2). Aglomerat PLGA NP 100 nm berukuran besar besar-besaran diamati dalam sitoplasma sel sel monokultur makrofag (Gbr. 4c). Sementara itu, UM-SCC-17A monokultur menunjukkan kemampuan serapan yang sangat baik dari PLGA 100 nm, dibuktikan dengan sinyal fluoresensi hijau terang yang diamati di dalam membran sel (Gbr. 4f). Untuk lebih menggambarkan akumulasi intraseluler partikel PLGA dalam sel THP-1 atau UM-SCC-17A dan partikel ekstraseluler dalam kultur bersama, hamparan gambar bidang terang dengan gambar fluoresensi diterapkan seperti pada File tambahan 1:S3). Pada sistem kokultur, kedua jenis sel tersebut dibedakan dalam morfologi dan ukuran sel pada citra bidang terang, dimana makrofag menunjukkan bentuk bulat dan ukuran kecil, sedangkan sel kanker menunjukkan ukuran besar dan bentuk memanjang. Namun, sel kanker menunjukkan konsumsi seluler yang tidak mencukupi karena penyerapan PLGA 100 nm yang tinggi oleh makrofag dalam sistem kultur bersama. Hal ini diduga karena makrofag dianggap sebagai jenis sel imun yang efisien dan spesifik untuk melakukan fungsi fagositosis untuk membersihkan mikroorganisme, alergen, dan partikel asing. Demikian pula, Gambar 5 dan Gambar 6 menunjukkan analisis kualitatif kemampuan serapan seluler dari partikel PLGA 500 nm dan 1 m masing-masing dalam kultur sel tunggal atau sel campuran. Patut dicatat bahwa kedua morfologi sel tidak berubah setelah perlakuan dengan ukuran partikel PLGA yang berbeda pada konsentrasi 10 mg/mL yang digunakan di sini (Gbr. 4a,d,g, Gbr.5a,d,g, dan Gbr.6a, d, g). Partikel PLGA 500 nm dan 1 m menunjukkan intensitas fluoresensi yang lebih kuat dalam satu-satunya sel UM-SCC-17A (Gbr. 5e,f, dan Gbr. 6e,f) dibandingkan dengan sel THP-1 tunggal (Gbr. 5b,c, dan Gbr. . 6b,c). Dalam inkubasi kultur bersama (Gbr. 5h,i, dan Gbr. 6h,i), ada penurunan sinyal yang jelas pada sel kanker, di mana intensitas fluoresen partikel ditemukan lebih rendah daripada intensitas makrofag. Makrofag memfagosit semua jenis partikel dengan cepat dan efektif sehingga sel kanker tidak dapat mencerna cukup banyak partikel dalam sistem kultur bersama. Untuk mengukur efek fagositosis pada kapasitas serapan oleh sel kanker untuk ukuran partikel PLGA yang berbeda, analisis optik semi-kuantitatif dilakukan. Secara singkat, intensitas fluoresensi partikel dihitung berdasarkan, misalnya, 50 sel bermuatan partikel individu untuk mencapai nilai rata-rata untuk kedua jenis sel, dan indeks serapan sel kanker ditentukan dengan rata-rata intensitas fluoresen partikel intraseluler per kanker. sel dinormalisasi dengan makrofag (Gbr. 7). Dalam monokultur, indeks serapan sel kanker untuk PLGA 100 nm ditemukan sekitar 1,34 ± 0,19, menunjukkan bahwa sel kanker telah menelan lebih banyak partikel daripada yang dicerna oleh makrofag dalam kultur sel tunggal (Gbr. 7). Hal ini tidak mengherankan karena tingginya tingkat kekentalan partikel PLGA dan ukuran sel kanker laring yang lebih besar. Demikian pula, PLGA 500 nm dan 1 m juga sangat diinternalisasi oleh sel kanker dengan indeks serapan masing-masing sekitar 1,5 ± 0,25 dan 1,4 ± 0,31, dalam monokultur. Indeks serapan untuk partikel besar secara substansial menurun (0,59 ± 0,12 dan 0,47 ± 0,1) dengan adanya makrofag dalam sistem kultur bersama. Sementara itu, kemampuan internalisasi seluler yang identik untuk kedua jenis sel setelah inkubasi 24 jam partikel PLGA 100 nm dalam kultur sel campuran. Overall, the results accumulated here suggested that the ingestion of particles by cancer cells and macrophages might depend on different routes of uptake pathway in single-cell culture and co-culture environment. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , h ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , f , i ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , c ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.