Penilaian Keamanan Nanokarrier Liposom yang Dikirim Intratimpanik pada Telinga Dalam Tikus
Abstrak
Nanokarrier liposom (LPN) menawarkan muatan obat yang tinggi dan penyerapan yang efisien di telinga dalam setelah pengiriman intratimpanik yang minim invasi. Namun, kompatibilitas biologisnya pada organ sensitif ini belum pernah dievaluasi secara sistematis. Dalam studi ini, LPN—dengan atau tanpa gadolinium-tetra-azasiklo-dodekana-tetra-asetat (Gd-DOTA)—disuntik transtimpanik ke dalam tikus Sprague-Dawley. Resonansi magnetik yang ditingkatkan gadolinium (Gd-MRI) melacak distribusi LPN dan menilai integritas rintangan, sementara respons auditif brainstem (ABR) mengukur fungsi pendengaran. Penanda inflamasi (glikosaminoglikan, asam hialuronik, CD44, TLR2) dan apoptosis (TUNEL) dikuantifikasi pada jaringan koklea. Hasil menunjukkan entri telinga dalam yang efisien LPN tanpa mengganggu rintangan telinga tengah atau telinga dalam, tidak ada penurunan pendengaran, dan tidak ada kenaikan penanda inflamasi atau apoptosis. Oleh karena itu, pengiriman LPN transtimpanik aman untuk koklea tikus dan menjanjikan untuk pengobatan kehilangan pendengaran sensorineural.
Latar Belakang
LPN adalah platform nano terapi tertua di klinik, yang berhasil digunakan untuk kanker, penyakit infeksi, inflamasi, dan nyeri. Kapasitas muatan yang tinggi dan bukti penyerapan di telinga dalam membuatnya menarik untuk terapi otologis. Administrasi intratimpanik adalah pendekatan yang rasional dan terarah yang membatasi paparan sistemik dan sudah digunakan secara klinis untuk penyakit Meniere dan kehilangan pendengaran sensorineural tiba-tiba. Meskipun pekerjaan sebelumnya menunjukkan LPN fungsionalisasi peptid yang mencapai koklea, profil keamanan LPN di telinga dalam—terutama terkait fungsi rintangan, inflamasi, dan kelayakan sel—belum diketahui. Studi ini mengisi celah itu dengan mengevaluasi kompatibilitas biologis LPN di telinga dalam tikus menggunakan Gd-MRI, ABR, dan analisis histology komprehensif.
Ilustrasi telinga mamalia. Telinga mamalia (termasuk manusia dan tikus) terdiri dari telinga luar, tengah, dan dalam. Telinga luar (OE) mencakup auris dan saluran akustik eksternal (EAC). Telinga tengah (ME) menempatkan membrana timpani (TM) dan rantai ossicular (malleus Ma, incus Inc, stapes). Rongga telinga tengah terhubung ke nasofaring melalui saluran Eustachius (ET) dan ke telinga dalam melalui jendela oval (OW) dan membrana jendela bulat (RWM). Telinga dalam berisi koklea dan sistem vestibul. Koklea terdiri dari skala tympani (ST) dan skala vestibuli (SV) yang dipenuhi perilimfa dan skala media (SM) yang dipenuhi endolimfa. Dinding lateral SM berisi stria vascularis (StrV) dan spiral ligament (SLig). Putaran dasar koklea menempatkan organ Corti dengan sel rambut dalam (IHCs) dan sel rambut luar (OHCs), membrana tectorial (TM), dan spiral limbus (Slim). Sel ganglion spiral (SGCs) menyampaikan sinyal pendengaran ke otak. Sistem vestibul termasuk tiga saluran semi-lingkaran (SCC) dan vestibul dengan cupula dan macula. (disesuaikan dari Zou 2014).
Asam hialuronik (HA) adalah komponen utama matriks ekstraseluler yang mengikat CD44 dan TLR2/4, memulai jalur inflamasi. Akumulasi HA telah terkait dengan permeabilitas dan inflamasi yang meningkat pada berbagai jaringan, termasuk koklea, di mana nanopartikel perak (AgNPs) sebelumnya telah menginduksi pembuahan HA. Oleh karena itu, HA, CD44, dan TLR2 diperiksa sebagai penanda inflamasi penting dalam studi ini.
Tujuannya adalah untuk menentukan apakah LPN transtimpanik menyalahgunakan integritas rintangan telinga dalam, menginduksi inflamasi, atau menyebabkan penurunan pendengaran. Gd-MRI menilai fungsi rintangan, ABR mengukur ambang pendengaran, dan imunohistokimia mengkuantifikasi HA, CD44, TLR2, dan fragmentasi DNA apoptosis.
Hasil
LPN tidak menyebabkan perubahan fungsional pada koklea tikus
Gd-MRI menunjukkan bahwa LPN masuk ke dalam koklea secara efisien, dengan sinyal kuat di skala vestibuli dan skala tympani dalam 3 jam setelah suntikan (Fig. 2c–f). Pada 6 jam, distribusi sinyal menjadi homogen di seluruh koklea, menunjukkan keseimbangan lengkap (Fig. 2e–f). Integritas rintangan darah-perilimfa dan darah-endolimfa tetap utuh, seperti yang ditunjukkan oleh intensitas sinyal yang sebanding antara telinga yang diobati dan tidak diobati (Tabel 1). Ambang ABR untuk klik dan ledakan nada (2–32 kHz) tidak menunjukkan pergeseran yang signifikan pada 2, 4, atau 7 hari setelah suntikan, mengonfirmasi fungsi pendengaran yang terlestarikan (Fig. 3).
LPN tidak menginduksi pembuahan glikosaminoglikan pada koklea tikus
Pewarnaan asam periodik–Schiff tidak menunjukkan peningkatan glikosaminoglikan di seluruh struktur koklea (limbus spiral, dinding tulang, stria vascularis) setelah LPN atau perawatan LPN-Gd dibandingkan dengan kontrol air deion (Figs. 5, 6). Kuantifikasi mengonfirmasi tidak ada perbedaan yang berarti secara statistik (p > 0,05).
Dampak kecil pada produksi asam hialuronik oleh LPN
Imunofluoresensi mendeteksi HA terutama di sel ganglion spiral, sel basal strial, sel sulus luar, dan sel endotel kapiler (Fig. 7). Meskipun intensitas HA di fibroosit ligament spiral sedikit berkurang setelah administrasi LPN atau LPN-Gd, perubahan ini tidak menerjemahkan ke dalam permeabilitas rintangan yang berubah atau penurunan pendengaran (Fig. 8).
Ekspresi CD44 tetap tidak berubah setelah paparan LPN
Sel positif CD44 melimpah di lapisan sel basal strial, ligament spinal, sel Deiters, dan endotel kapiler di semua grup, tanpa perbedaan yang signifikan dalam intensitas pewarnaan atau jumlah sel antara telinga yang diobati dan kontrol (Figs. 9, 10).
Ekspresi TLR2 tidak terpengaruh oleh LPN
Reaktivitas imun TLR2 tinggi di sel basal strial, fibroosit ligament spinal, dan endotel tetapi tidak berbeda antara telinga LPN, LPN-Gd, dan air (Figs. 11, 12).
Tidak ada peningkatan apoptosis koklea setelah administrasi LPN
Pewarnaan TUNEL menunjukkan inti apoptosis yang jarang tersebar di seluruh koklea di semua grup, tanpa kenaikan pada kohort LPN atau LPN-Gd dibandingkan kontrol (Fig. 13). Apopitosis sesekali yang diamati pada alas stapes dan niche jendela oval dianggap sebagai siklus seluler normal.
Diskusi
Data kami menunjukkan bahwa LPN intratimpanik mencapai telinga dalam secara efisien, melewati jalur jendela oval dan bulat, dan melakukannya tanpa mengganggu rintangan darah-perilimfa atau darah-endolimfa. Kehilangan ambang pendengaran yang tidak ada dan kehadiran penanda inflamasi atau apoptosis yang tidak ada mengonfirmasi bahwa LPN baik ditoleransi pada koklea tikus. Pengurangan kecil dalam produksi HA dari fibroosit ligament spiral tampak tidak signifikan secara klinis, kemungkinan mencerminkan pergeseran ke arah HA berat molekul tinggi anti-inflamasi tanpa menginduksi perubahan permeabilitas. Temuan ini sepakat dengan laporan sebelumnya bahwa LPN 95 nm paling efisien untuk pengiriman telinga dalam dan bahwa LPN yang lebih besar (110–115 nm) masih mempertahankan keamanan.
Pentingnya, studi ini mengonfirmasi bahwa LPN tidak mengaktifkan sumbu inflamasi TLR2/CD44, jalur kunci yang terlibat dalam cedera koklea oleh spesies reaktif oksigen dan toksin mitokondria. Oleh karena itu, LPN mewakili kendaraan yang aman untuk pengiriman obat terarah ke telinga dalam, mendukung potensi aplikasi klinisnya dalam kehilangan pendengaran sensorineural dan kondisi otologis lainnya.
Kesimpulan
Pengiriman transtimpanik nanokarrier liposom aman untuk telinga dalam tikus, mempertahankan integritas rintangan, fungsi pendengaran, dan homeostasis seluler. LPN menjanjikan sebagai platform pengiriman obat untuk terapi telinga dalam di masa depan.
Metode
Bahan-bahan
Lipid (sphingosine, SOPC, DSPE-PEG-2000), warna floresen (DiI, TRITC-DHPE), Gd-DOTA (DOTAREM), dan nanopartikel perak (AgNPs) diperoleh dari pemasok komersial. Kesucian lipid diverifikasi oleh kromatografi lapis tipis; konsentrasi ditentukan secara gravimetris.
Persiapan dan Karakterisasi LPN
LPN unilamellar (~110 nm) yang mengenkapsulasi 500 mM Gd-DOTA (LPN-Gd) dan LPN kosong (~115 nm) disiapkan dengan metode hidrasi film tipis yang telah dijelaskan sebelumnya (Refs 6, 3). Distribusi ukuran dan potensi zeta diukur oleh pencaran cahaya dinamis.
Administrasi LPN
Di bawah anestesi isoflurane, 50 µl LPN atau LPN-Gd disuntik transtimpanik ke dalam telinga tengah kiri melalui mikroskop operasi. Telinga berseberangan menerima air deion sebagai kontrol negatif. Hewan ditempatkan dengan telinga yang disuntik ke atas selama 15 menit setelah suntikan.
Evaluasi Fungsi Rintangan Biologis Menggunakan Gd-MRI
Gd-MRI dilakukan pada scanner Bruker 4,7 T menggunakan protokol RARE. Kontras diserap secara intravena 2 jam sebelum citra. Titik waktu citra bervariasi dari 5 jam hingga 8 hari setelah suntikan untuk menangkap perubahan akut dan sub-akut.
Respons Auditif Brainstem (ABR)
Ambang ABR untuk klik dan ledakan nada (2–32 kHz) direkam pada baseline, 2, 4, dan 7 hari setelah suntikan menggunakan montase elektroda standar dan kamera pengurang suara.
Analisis Histologi dan Imunofluoresensi
Setelah ABR akhir, koklea dipanen, desifikasi, dan difeksi. Pewarnaan hematoxylin–eosin dan asam periodik–Schiff menilai inflamasi dan kandungan glikosaminoglikan. Imunofluoresensi untuk HA, CD44, dan TLR2 dilakukan pada krioseksi, dan citra konfokal mengkuantifikasi intensitas sinyal. Apoptosis terdeteksi oleh pemberian TUNEL.
Analisis Statistik
Data dianalisis dengan SPSS 20. Uji one-way ANOVA dan Kruskal–Wallis membandingkan pergeseran ABR dan intensitas pewarnaan; uji LSD pasca dilakukan setelah temuan yang signifikan. p < 0,05 dianggap signifikan.
