Biokompatibilitas Liposom Nanocarriers di Telinga Bagian Dalam Tikus Setelah Pemberian Intratimpani
Abstrak
Liposom nanocarriers (LPNs) berpotensi menjadi terapi telinga bagian dalam masa depan karena kapasitas pemuatan obat yang tinggi dan penyerapan yang efisien di telinga bagian dalam setelah pemberian intratimpani invasif minimal. Namun, informasi tentang biokompatibilitas LPN di telinga bagian dalam masih kurang. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendokumentasikan biokompatibilitas LPN di telinga bagian dalam setelah persalinan intratimpani. LPN dengan atau tanpa asam gadolinium-tetra-azacyclo-dodecane-tetra-acetic (Gd-DOTA) dikirim ke tikus melalui injeksi transtympanic. Distribusi LPN yang mengandung Gd-DOTA di telinga tengah dan dalam dilacak secara in vivo menggunakan MRI. Fungsi penghalang telinga tengah dan dalam dievaluasi menggunakan MRI yang ditingkatkan gadolinium. Fungsi pendengaran diukur dengan menggunakan auditory brainstem response (ABR). Respon inflamasi potensial diselidiki dengan menganalisis glikosaminoglikan dan sekresi asam hialuronat dan ekspresi CD44 dan TLR2 di telinga bagian dalam. Apoptosis potensial dianalisis menggunakan terminal transferase (TdT) untuk memberi label pada 3′OH bebas pada untaian DNA sel apoptosis dengan TMR-dUTP (pewarnaan TUNEL). Akibatnya, LPN memasuki telinga bagian dalam secara efisien setelah injeksi transtimpani. Injeksi LPN transtimpani dengan atau tanpa Gd-DOTA tidak mengganggu fungsi penghalang telinga tengah dan dalam atau menyebabkan gangguan pendengaran pada tikus. Penanda biologis inflamasi kritis di telinga bagian dalam, termasuk sekresi glikosaminoglikan dan asam hialuronat dan ekspresi CD44 dan TLR2, tidak dipengaruhi oleh pemberian LPN. Tidak ada kematian sel yang signifikan terkait dengan pemberian LPN. Injeksi transtimpani LPN aman untuk telinga bagian dalam, dan LPN dapat diterapkan sebagai matriks penghantaran obat dalam terapi klinis gangguan pendengaran sensorineural.
Latar Belakang
Liposom nanocarriers (LPNs) berpotensi menjadi terapi telinga bagian dalam masa depan karena kapasitas pemuatan obat yang tinggi dan penyerapan yang efisien di telinga bagian dalam setelah pemberian intratimpani invasif minimal [1,2,3,4]. Pendekatan intratimpani diterima dengan baik oleh ahli otologi sebagai pendekatan penghantaran obat yang ditargetkan secara rasional karena menghindari akumulasi agen terapeutik yang tidak perlu di daerah yang tidak ditargetkan, yang telah menjadi strategi sebelumnya di klinik untuk pengobatan penyakit Meniere dan gangguan pendengaran sensorineural mendadak. menggunakan gentamisin dan kortikosteroid. Penargetan molekuler dari model terapi di koklea ditunjukkan oleh pemberian intratimpani dari LPN yang difungsikan peptida spesifik [5]. Selanjutnya, pengiriman berkelanjutan LPNs otomatis ke telinga bagian dalam melalui telinga tengah dicapai dengan menggunakan perangkat baru yang terdiri dari pompa osmotik dan tabung polimida kinerja tinggi [6]. Sebagai platform nanoterapi tertua di klinik, LPN aman dalam mengobati kanker, penyakit menular, peradangan, nyeri, dll. [7,8,9]. Namun, biokompatibilitas LPN di telinga tengah dan dalam masih belum diketahui dan perlu diklarifikasi sebelum dapat diterapkan secara klinis di otologi.
Telinga terdiri dari telinga luar, tengah, dan dalam (Gbr. 1) yang mungkin terkena LPN setelah pelahiran intratimpani. Telinga tengah adalah situs utama yang terpapar LPN pada konsentrasi tertingginya, telinga bagian dalam adalah situs terapeutik dan organ yang paling sensitif terhadap agen berbahaya, dan saluran telinga luar berpotensi teriritasi oleh agen yang keluar dari telinga. rongga telinga tengah. Penghalang biologis adalah sistem pertahanan pertama, membatasi bioavailabilitas agen, dan ada di kulit, mukosa, dan struktur perineural. Sistem penghalang di telinga bagian dalam memainkan peran penting dalam mempertahankan homeostasis ionik yang penting untuk aktivitas fisiologis telinga bagian dalam. Perubahan fungsional penghalang ini dapat dievaluasi secara akurat menggunakan pencitraan resonansi magnetik yang ditingkatkan gadolinium (Gd-MRI). Penurunan fungsi pendengaran dapat diukur secara tepat melalui auditory brainstem response (ABR). Oleh karena itu, telinga (termasuk telinga luar, tengah, dan dalam) itu sendiri berfungsi sebagai model yang sangat baik untuk nanotoksikologi [10, 11].
Ilustrasi telinga mamalia. Telinga mamalia (termasuk manusia dan tikus) terdiri dari telinga luar, tengah, dan dalam. Telinga luar (OE ) terdiri dari daun telinga dan saluran pendengaran eksternal (EAC ). Telinga tengah (AKU ) terdiri dari membran timpani (TM ) dan rongga yang menampung rantai tulang pendengaran, termasuk maleus (Ma ), termasuk (Inc ), dan stapes. Rongga telinga tengah merupakan perpanjangan dari nasofaring melalui tuba Eustachius (ET ) dan berkomunikasi dengan telinga bagian dalam melalui jendela oval (OW ) dan membran jendela bundar (RWM ). Telinga bagian dalam terdiri dari koklea dan sistem vestibular. Koklea adalah organ sensorik untuk pendengaran dan memiliki tiga ruang, yaitu kompartemen perilimfatik skala timpani (ST ) dan skala vestibuli (SV ), dan kompartemen endolimfatik skala media (SM ). Pada dinding lateral SM, terdapat stria vaskularis (StrV ) dan ligamen spiral (SLig ). Di bagian bawah SM, ada organ Cortis yang berisi sel-sel rambut bagian dalam (IHCs ) dan sel rambut luar (OHCs ), membran tektorial (TM ), dan limbus spiral (Ramping ). Sel ganglion spiral (SGC ) memicu potensial aksi yang sesuai dengan transduksi mekanik-listrik sel-sel rambut dan memasok semua input pendengaran otak. Sistem vestibular bertanggung jawab atas keseimbangan dan terdiri dari tiga kanalis semisirkularis (SCC ) dan ruang depan. Kupula ampulla di dalam SCC mendeteksi percepatan rotasi dan makula di dalam sakulus dan utrikulus vestibulum mendeteksi percepatan linier. CN saraf koklea, SP menonjol spiral, VN saraf vestibular, VS vas spiralis. (diadaptasi dari Zou J. Pengiriman Obat Fokal dalam Terapi Telinga Bagian Dalam:dalam Pengiriman Obat Terkontrol Fokal. Editor:Domb AJ dan Khan W. Springer, London, Inggris. ISBN:978-1-4614-9433-1, 2014; p215- 224)
Asam hialuronat (hyaluronan) adalah biopolimer polianionik alami dan merupakan komponen utama matriks ekstraseluler di membran dasar. Asam hialuronat terdiri dari asam D-glukuronat dan N-asetil-D-glukosamin, yang dihubungkan melalui ikatan -1, 4 dan -1, 3 secara bergantian. Akumulasi asam hialuronat mungkin berkontribusi pada peningkatan permeabilitas dan peradangan mikrosirkulasi pada cedera reperfusi iskemik ginjal [12]. Efek ototoksik nanopartikel perak terbukti berkorelasi dengan akumulasi asam hialuronat di koklea tikus dalam laporan kami sebelumnya [11]. Asam hialuronat mengikat CD44 dan reseptor seperti tol 2/4 (TLR2/4) di jaringan dan memicu reaksi biologis [13, 14]. Aktivitas biologis yang dimediasi oleh CD44 saat mengikat asam hialuronat terutama melalui interaksi dengan molekul pengatur dan adaptor, seperti SRC kinase, Rho GTPase, VAV2, protein terikat reseptor faktor pertumbuhan 2 protein pengikat terkait 1 (GAB1), ankyrin, dan ezrin [15,16,17]. CD44 juga memediasi metabolisme asam hialuronat melalui pendekatan serapan dan degradasi seluler selain merekrut sel T ke tempat inflamasi dan mengatur cedera endotel yang dimediasi sel T [18]. Dilaporkan bahwa sitotoksisitas sel endotel telinga bagian dalam oleh antibodi sel anti-endotel mungkin berperan dalam menyebabkan kerusakan stria vaskularis pada tuli sensorineural mendadak yang dimediasi imun [19]. Aktivasi faktor-kB nuklir yang bergantung pada TLR2 dilaporkan terlibat dalam peningkatan regulasi protein kemotaktik monosit yang diinduksi Haemophilus influenzae non-typeable 1 dalam fibrosit ligamen spiral telinga bagian dalam, yang mungkin menjadi langkah kunci dalam disfungsi telinga bagian dalam akibat otitis media kronis. 20]. Jika LPN menginduksi gangguan telinga bagian dalam setelah pemberian telinga tengah, jalur pensinyalan yang dimediasi TLR2 harus menjadi mekanisme yang penting.
Kami bertujuan untuk mengevaluasi biokompatibilitas LPN di telinga bagian dalam setelah injeksi transtimpani. Fungsi penghalang biologis di kulit (saluran telinga luar), mukosa (rongga telinga tengah), dan kompartemen telinga bagian dalam diukur menggunakan Gd-MRI pada berbagai titik waktu. Fungsi pendengaran dievaluasi menggunakan pengukuran ABR. Terakhir, potensi perubahan histopatologi dianalisis dengan mengukur akumulasi glikosaminoglikan dan asam hialuronat, ekspresi CD44 dan TLR2, dan fragmentasi DNA di koklea.
Hasil
LPN tidak Menyebabkan Perubahan Fungsional pada Koklea Tikus
Pada kelompok kontrol positif, sinyal terang di perilimfe koklea (Coch) dan vestibular (Rompi) di kedua sisi (L, R) (Gbr. 2a, b) menunjukkan serapan Gd-DOTA. Setelah injeksi transtimpani nanopartikel perak (AgNPs), intensitas sinyal di kompartemen perilimfatik meningkat secara signifikan sementara sinyal yang sangat intens juga terdeteksi di kulit saluran telinga eksternal, mukosa telinga tengah, menunjukkan peningkatan penyerapan Gd-DOTA terkait dengan administrasi AgNP ( L pada Gambar. 2a, b) (Tabel 1). Oleh karena itu, sistem evaluasi divalidasi. Pada hewan yang menerima injeksi transtimpani LPN + Gd-DOTA, sinyal terang terdeteksi pada permukaan rantai tulang pendengaran, skala vestibuli, skala timpani, dan ruang depan pada 3 jam pasca injeksi yang menunjukkan distribusi LPN yang jelas di wilayah ini (Gbr. 2c). , D). Intensitas sinyal dalam skala vestibuli pada putaran basal tampak lebih kuat daripada skala timpani yang menunjukkan masuknya LPN yang efisien melalui jendela oval pada hewan saat ini [21]. Pada 6 jam pasca injeksi, intensitas sinyal antara skala vestibuli dan skala timpani pada putaran basal menjadi serupa dan seluruh koklea menunjukkan sinyal yang hampir homogen, tetapi ada perubahan yang tidak signifikan di ruang depan (Gbr. 2e, f). Pada hewan yang menerima injeksi Gd-DOTA intravena setelah injeksi transtimpani dari LPN kosong, kedua sisi menunjukkan intensitas sinyal yang sama kecuali bahwa ada sinyal kuat di telinga tengah yang menerima injeksi transtimpani dari LPN kosong yang mencurigai akumulasi LPN pada permukaan rantai tulang pendengaran (Gbr. . 2g, j). Lubang hitam pada rantai tulang pendengaran yang menunjukkan area berongga pada stapes (Gbr. 2h). Intensitas sinyal yang sama di kedua sisi menunjukkan bahwa properti transportasi untuk Gd-DOTA dari penghalang darah-perilimfe di kedua telinga tidak berubah setelah injeksi LPN transtimpani (Gbr. 2g, h) (Tabel 1).
MRI telinga bagian dalam tikus yang disempurnakan dengan gadolinium setelah pemberian liposom nanocarrier (LPN). Pada semua hewan, bahan nano disuntikkan ke dinding medial rongga telinga tengah kiri. Kontrol positif dicitrakan pada tikus pada 2 jam pasca injeksi Gd-DOTA intravena sekunder untuk injeksi transtimpani nanopartikel perak (AgNPs) 5 jam sebelumnya (a , b ). Distribusi dinamis LPN di telinga tengah dan dalam ditunjukkan pada c , d , e , f dengan injeksi transtimpani LPN yang mengandung Gd-DOTA tanpa pemberian intravena Gd-DOTA. Dampak LPN kosong pada penghalang biologis ditunjukkan oleh MRI pada 2 jam pasca injeksi Gd-DOTA (i.v. Gd-DOTA) secara intravena pada tikus yang menerima injeksi LPN transtimpani 5 jam sebelumnya (g , h ). Aku ampula kanalis semisirkularis posterior, Coch koklea, EES kulit telinga luar, L telinga kiri, LPN-Mu LPN di mukosa telinga tengah, LPN-OC LPN pada rantai tulang pendengaran (OC ), ME-Mu , mukosa telinga tengah, R telinga kanan, media skala SM , ST skala timpani, SV skala vestibuli, Rompi vestibulum, 1H putaran basal koklea yang lebih tinggi, 1L belokan bawah koklea basal, 2H giliran koklea kedua yang lebih tinggi, 2L belokan bawah kedua koklea. Bilah skala = 5 mm
Baik LPN + Gd-DOTA maupun LPN tidak menyebabkan gangguan pendengaran yang signifikan, disajikan sebagai pergeseran ambang ABR yang diukur menggunakan rangsangan klik dan ledakan nada pada frekuensi 2, 4, 8, 16, dan 32 kHz pada 2, 4, dan 7 hari setelah pemberian, dibandingkan dengan telinga yang menerima injeksi air deionisasi transtimpani (dH2 O) (Gbr. 3).
Dampak injeksi transtimpani nanocarriers liposom pada fungsi pendengaran pada tikus diukur dengan respon batang otak pendengaran. Gangguan pendengaran dinyatakan sebagai pergeseran ambang batas. Ada perbedaan yang tidak signifikan antar kelompok (p> 0,05, ANOVA satu arah). n =6 di setiap kelompok. H2O injeksi transtimpani air deionisasi pada kelompok kontrol negatif, LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd-DOTA LPN yang mengandung Gd-DOTA, 2d , 4d , dan 7d 2, 4, dan 7 hari setelah injeksi
LPN tidak Menginduksi Akumulasi Glikosaminoglikan di Koklea Tikus
Pewarnaan hematoxylin dan eosin tidak menunjukkan adanya infiltrasi inflamasi dari leukosit dan fibrin di koklea semua hewan yang dianalisis termasuk stapes dan jendela oval tempat LPN melewatinya (Gbr. 4). Pewarnaan Schiff asam periodik menunjukkan adanya glikosaminoglikan di dinding tulang, limbus spiral, ligamen spiral, membran tektorial, membran Reissner, lamina spiral tulang, dan stria vaskularis di koklea hewan yang menerima injeksi transtimpani dH2 O. Ada peningkatan gradien intensitas sinyal dari belokan basal ke puncak, dan perbedaannya signifikan pada stria vaskularis (Gbr. 5 dan 6). Gradien sinyal di koklea tidak berubah pada hewan yang menerima injeksi transtimpani LPN dan LPN + Gd-DOTA (Gbr. 5 dan 6).
Pewarnaan hematoxylin-eosin cochleae tikus terkena nanocarriers liposom. Tidak ada infiltrasi inflamasi di koklea yang menerima administrasi LPN (a ), LPN+Gd (b ), dan H2O (c ). Area yang dilingkari menunjukkan pemilihan wilayah yang diminati untuk pengukuran intensitas (a ). LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd LPN yang mengandung Gd-DOTA. Sa saku, SFP pijakan kaki stapes, SVJ sendi stapediovestibular, SM skala media, ST skala timpani, SV skala vestibuli, Ut utrikulus. Bilah skala = 1 mm
Sekresi glikosaminoglikan di koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom dideteksi menggunakan mikroskop cahaya pewarnaan Schiff asam periodik. Libus spiral (SLim ) dan dinding tulang (BW ) koklea menunjukkan pewarnaan paling intensif pada kelompok kontrol negatif (H2O ) (a –c ), nanocarrier liposom kosong (LPN) (d –f ), dan LPN yang mengandung Gd-DOTA (LPN + Gd ) (g –i ). Area pewarnaan dengan intensitas yang tampak lebih tinggi ditunjukkan oleh * dalam c , f , dan h dibandingkan dengan kolom kiri. RM Membran Reissner, SGC sel ganglion spiral, SLig ligamen spiral, StrV stria vaskularis, 1 belokan dasar, ke-2 giliran kedua. Bilah skala = 50 μm
Kuantifikasi sekresi glikosaminoglikan pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom terdeteksi menggunakan pewarnaan Schiff asam periodik. n = 3 di setiap kelompok. AU unit sewenang-wenang, H2O kontrol negatif, LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd LPN yang mengandung Gd-DOTA, SLig ligamen spiral, Ramping limbus spiral, StrV stria vaskularis, 1 belokan dasar, ke-2 giliran kedua. *p < 0,05, **p < 0.01 (ANOVA satu arah dengan uji LSD digunakan sebagai analisis post hoc)
Ada Dampak Kecil pada Sekresi Asam Hyaluronic di Koklea Tikus oleh LPN
Dalam koklea tikus yang menerima suntikan transtimpani dH2O, pewarnaan positif untuk asam hialuronat terdeteksi terutama di sel ganglion spiral, sel basal strial, sel sulkus luar, dan sel endotel kapiler, di antara sel-sel lainnya (Gbr. 7). Intensitas sinyal dalam fibrosit ligamen spiral dari putaran basal dan kedua secara signifikan lebih tinggi daripada di puncak. Perbedaan ini menjadi tidak signifikan pada koklea tikus dengan penerapan LPN dan LPN + Gd-DOTA, yang menunjukkan bahwa sekresi asam hialuronat oleh fibrosit ligamen spiral dipengaruhi oleh pemberian LPN (Gbr. 8). LPN + Gd-DOTA juga mengurangi pewarnaan pada fibrosit ligamen spiral pada putaran basal. Namun, tidak ada dampak pada sekresi asam hialuronat di sebagian besar sel koklea dengan injeksi transtimpani LPN dan LPN + Gd-DOTA (Gbr. 7 dan 8).
Sekresi asam hialuronat pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom dideteksi dengan mikroskop confocal imunofluoresen. Pewarnaan positif ditemukan pada sel basal stria (SBC ), sel sulkus luar (OSC ), sel ganglion spiral (SGC ), dan sel endotel kapiler (KTK ) dari modiolus kelompok kontrol negatif (H2O ) (a –c , j ), nanocarrier liposom kosong (LPN ) (d –f , k ), dan LPN yang mengandung Gd-DOTA (LPN + Gd ) (g –i , l ). Tidak ada pewarnaan pada kontrol negatif antibodi yang dihilangkan (AbNC ) (m ). KPK sel endotel kapiler, ISC sel sulkus bagian dalam, SBC sel basal stria, SL-I fibrosit ligamen spiral tipe I, SLSF fibrosit satelit limbus spiral, SMC sel marginal stria vaskularis. Bilah skala = 16 μm
Kuantifikasi sekresi asam hialuronat pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom terdeteksi menggunakan mikroskop confocal imunofluoresen. n = 3 di setiap kelompok. AU unit sewenang-wenang, H2O kontrol negatif, LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd LPN yang mengandung Gd-DOTA, SBC sel basal stria, SGC sel ganglion spiral, SLig , ligamen spiral, Ramping limbus spiral, 1 belokan dasar, ke-2 giliran kedua. **p < 0.01 (dibandingkan dengan puncak), ##p < 0.01 (dibandingkan dengan kelompok LPN dan H2O pada putaran basal) (ANOVA satu arah dengan uji LSD digunakan sebagai analisis post hoc)
LPN tidak Mengubah Populasi Sel CD44 di Koklea Tikus
Di koklea terkena dH2 O, sel antara strial, sel basal strial, fibrosit ligamen spiral, sel ganglion spiral, sel Deiters di organ Corti, dan sel endotel kapiler di modiolus dan ligamen spiral menunjukkan pewarnaan intensif untuk CD44. Ada perbedaan yang tidak signifikan dalam intensitas sinyal di antara belokan koklea. Populasi dan intensitas ekspresi CD44-positif tidak terpengaruh oleh injeksi transtimpani baik LPN + Gd-DOTA atau LPN (Gbr. 9 dan 10).
Distribusi sel CD44-positif dalam koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom ditunjukkan menggunakan mikroskop confocal imunofluoresen. Sel CD44-positif terutama terdeteksi di sel basal stria (SBC ), ligamen spiral (SL ), sel Dieter (DC ), sel ganglion spiral (SGC ), dan sel endotel kapiler (KTK ) pada kelompok kontrol negatif (H2O ) (a –e ), nanocarrier liposom kosong (LPN ) (f –j ), dan LPN yang mengandung Gd-DOTA (LPN + Gd ) (k –n ). Tidak ada pewarnaan pada kontrol negatif antibodi yang dihilangkan (AbNC ) (o ). IHC sel rambut dalam, M-CEC sel endotel kapiler dalam modiolus, SL-CEC sel endotel kapiler di ligamen spiral:sel ganglion spiral, SL-III fibrosit ligamen spiral tipe III, SL-IV fibrosit ligamen spiral tipe IV, TM membran tektorial, OHC sel rambut luar. Bilah skala = 16 μm
Kuantifikasi tingkat protein CD44 pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom terdeteksi menggunakan mikroskop confocal imunofluoresen. Ada perbedaan yang tidak signifikan antar kelompok (p> 0,05, ANOVA satu arah). n = 3 di setiap kelompok. n = 3 di setiap kelompok. AU unit sewenang-wenang, H2O kontrol negatif, LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd LPN yang mengandung Gd-DOTA, SBC sel basal stria, SGC sel ganglion spiral, SLig ligamen spiral, 1 belokan dasar, ke-2 giliran kedua
LPN tidak Mengubah Ekspresi TLR2 di Koklea Tikus
Pada koklea yang terpapar dH2O, sel basal strial, fibrosit ligamen spiral, sel akar, sel ganglion spiral, sel pilar organ Corti, dan sel endotel kapiler di modiolus menunjukkan pewarnaan intensif untuk TLR2. Ada perbedaan yang tidak signifikan dalam intensitas sinyal di antara belokan koklea. Populasi dan intensitas ekspresi TLR2-positif tidak terpengaruh oleh injeksi transtimpani baik LPN + Gd-DOTA atau LPN (Gbr. 11 dan 12).
Distribusi sel TLR2-positif dalam koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom ditunjukkan menggunakan mikroskop confocal imunofluoresen. Sel TLR2-positif terutama terdeteksi di sel basal stria (SBC ), ligamen spiral (SL ), sel akar (RC ), sel pilar (PC ), sel ganglion spiral (SGC ), dan sel endotel kapiler (KTK ) pada kelompok kontrol negatif (H2O ) (a –e ), nanocarrier liposom kosong (LPN ) (k –n ), dan LPN yang mengandung Gd-DOTA (LPN + Gd ) (f –j ). Tidak ada pewarnaan pada kontrol negatif yang dihilangkan antibodi (AbNC ) (o ). IHC sel rambut bagian dalam, SL-III fibrosit ligamen spiral tipe III, OHC sel rambut luar. Bilah skala = 16 μm
Kuantifikasi tingkat protein TLR2 pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom terdeteksi menggunakan mikroskop confocal imunofluoresen. Ada perbedaan yang tidak signifikan antar kelompok (p> 0,05, ANOVA satu arah). n = 3 di setiap kelompok. AU unit sewenang-wenang, H2O kontrol negatif, LPN nanocarrier liposom kosong, LPN + Gd LPN yang mengandung Gd-DOTA, SBC sel basal stria, SGC sel ganglion spiral, SLig ligamen spiral, 1 belokan dasar, ke-2 giliran kedua
LPN tidak Menyebabkan Kematian Sel di Koklea Tikus
Ada sel-sel apoptosis jarang yang didistribusikan secara acak di koklea tikus yang tidak diobati. Anehnya, ada sel-sel apoptosis yang melimpah di pelat kaki stapes dan ceruk jendela oval. Tidak ada dampak pada jumlah dan pola distribusi sel apoptosis dengan pemberian LPN dan LPN + Gd-DOTA (Gbr. 13).
Apoptosis pada koklea tikus yang terpapar nanocarrier liposom ditunjukkan menggunakan mikroskop confocal pewarnaan TUNEL. Sel-sel apoptosis jarang terdeteksi pada sel koklea tikus dalam kelompok kontrol negatif (H2O ) (a –c ), nanocarrier liposom kosong (LPN ) (f –i ), dan LPN yang mengandung Gd-DOTA (LPN + Gd ) (j –l ). Ada sel-sel apoptosis yang melimpah di footplate stapes (FP ) dan ceruk jendela oval (SENDIRI ) dari kedua grup (d , e ). Dalam kontrol positif (PC), pewarnaan TUNEL yang melimpah terdeteksi pada fibrosit ligamen spiral (SL ), sel basal stria (SBC ), dan sel stria margina (SMC ). PP proses perifer sel ganglion spiral (SGC ), OC osteosit, OSC sel sulkus luar, SL-IV tipe IV fibrosit ligamen spiral, SLim limbus spiral, StrV stria vaskularis. Bilah skalaa –l = 32 μm, m = 16 μm
Diskusi
LPN memasuki telinga bagian dalam secara efisien setelah injeksi transtimpani yang ditunjukkan oleh MRI menggunakan Gd-DOTA sebagai mimetik obat yang dienkapsulasi di dalam LPN (Gbr. 2c-f). Meskipun penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa jendela bundar adalah jalur utama LPN untuk masuk ke bagian dalam [6], pengamatan saat ini menunjukkan bahwa jalur jendela bundar lebih efisien daripada jendela bundar untuk mengangkut LPN dari telinga tengah ke telinga bagian dalam. telinga. Hasil ini menunjukkan bahwa kedua jalur penting dalam pemuatan LPN di telinga bagian dalam setelah pemberian dinding medial telinga tengah yang ditargetkan. Menggunakan metode in vivo yang paling efisien dari MRI telinga bagian dalam yang ditingkatkan gadolinium untuk mengevaluasi penghalang biologis dan ABR spesifik frekuensi untuk menilai fungsi pendengaran, penelitian ini menunjukkan bahwa injeksi transtimpani LPN dan LPN + Gd-DOTA tidak mengganggu fungsi pendengaran. penghalang telinga bagian dalam atau menyebabkan gangguan pendengaran pada tikus. Dengan menganalisis penanda biologis inflamasi kritis yang ditunjukkan sebelumnya [11, 22], LPNs dan LPN + Gd-DOTA tidak menginduksi respon inflamasi di koklea. Meskipun membran jendela bundar tidak dievaluasi, tidak adanya peradangan pada stapes dan jendela oval mengesampingkan reaksi inflamasi yang jelas pada membran jendela bundar karena penelitian ini menunjukkan bahwa jalur jendela oval lebih unggul daripada pendekatan jendela bundar untuk LPN. /P>
MRI telinga bagian dalam setelah injeksi gadolinium chelate secara intravena mampu mendeteksi gangguan oksidatif yang dimediasi stres pada penghalang darah-perilimfe dan darah-endolimfe yang disebabkan oleh racun mitokondria [23]. AgNPs dilaporkan menyebabkan kerusakan seluler melalui generasi spesies oksigen reaktif (ROS) dan aktivasi Jun amino-terminal kinase (JNK), yang menyebabkan pelepasan sitokrom C ke dalam sitosol dan translokasi Bax ke mitokondria [24] ]. Dalam injeksi transtimpani, AgNPs memasuki telinga bagian dalam dan menginduksi perubahan permeabilitas pada penghalang biologis telinga bagian dalam tikus [11, 25]. LPN juga memasuki telinga bagian dalam tikus setelah injeksi transtimpani dalam pola yang bergantung pada ukuran, dan LPN berdiameter 95 nm menunjukkan kemanjuran tertinggi dalam melewati penghalang telinga bagian dalam [3]. Dalam penelitian ini, ukuran rata-rata LPN adalah 100 hingga 115 nm, yang sedikit lebih besar dari ukuran yang paling efisien. LPN + Gd-DOTA menunjukkan bahwa ukuran LPN ini masuk ke telinga bagian dalam, yang sesuai dengan laporan sebelumnya [3]. Namun, masuknya LPN ke telinga bagian dalam tidak menyebabkan perubahan permeabilitas pada blood-perilymph dan blood-endolymph barrier. Hasil ini menunjukkan bahwa LPN aman untuk telinga bagian dalam. Hasil ABR yang menunjukkan fungsi pendengaran normal mendukung hasil MRI.
Ada hubungan antara sekresi asam hialuronat dan perubahan permeabilitas dan inflamasi mikrosirkulasi pada cedera reperfusi iskemik ginjal [12]. The previous study also showed that AgNPs caused the accumulation of hyaluronic acid in the rat cochlea [11]. CD44 and toll-like receptor 2/4 (TLR2/4) work as receptors of hyaluronic acid and trigger biological reactions [13, 14]. CD44 also mediates the metabolism of hyaluronic acid through cellular uptake and degradation in addition to recruiting T cells to inflammatory sites and regulating T cell-mediated endothelial injury [18]. In the present study, hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were detected in the rat cochlea. LPN + Gd-DOTA reduced the secretion of hyaluronic acid in the spiral ligament fibrocytes. The expressions of CD44 and TLR2 were not changed after the transtympanic injection of either LPNs or LPN + Gd-DOTA. The total glycosaminoglycan, which contains hyaluronic acid in the cochlea was not affected by the administrations of LPNs and LPN + Gd-DOTA. The impact of LPNs on the hyaluronic acid distribution in rat cochlea did not cause either permeability change or hearing loss, indicating that the modification is unharmful. It was reported that macrophages undergo phenotypic changes dependent on molecular weight of hyaluronan that correspond to either pro-inflammatory response for low molecular weight hyaluronic acid or anti-inflammatory response for high molecular weight hyaluronic acid [26]. The observed minor changes of hyaluronic acid distribution in the cochlea might have high molecular weight and anti-inflammatory function. Therefore, there was no hint of an inflammatory reaction in the rat cochlea.
The observed apoptosis in the stapes footplate cells might be normal biological activity. A balance between survival and apoptosis in the stapes footplate cells was reportedly as necessary to inactivate the otosclerosis [27]. Administration of LPN + Gd-DOTA did not affect apoptosis in the rat stapes.
Conclusions
The present study demonstrated that the transtympanic injection of liposome nanocarriers neither impaired the biological barriers of the inner ear nor caused hearing loss in the rats. The critical inflammatory mechanism was not activated by the administration of liposome nanocarriers, either. The results suggested that transtympanic injection of liposome nanocarrier is safe for the cochlea of rat.
Methods
Materials
Sphingosine (Sph), 1-stearoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (SOPC), and 1, 2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethyleneglycol)-2000] (ammonium salt) [DSPE-PEG-2000] were purchased from Avanti polar lipids (Alabaster, USA). DiI (Vybrant DiI cell-labeling solution, 1 mM in solvent) and N-(6-tetramethylrhodaminethiocarbamoyl)-1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-hosphoethanolamine, triethylammonium salt (TRITC-DHPE) were purchased from Thermo Fisher Scientific (Waltham, USA). Gd-DOTA (DOTAREM) was from Guerbet, Cedex, France. Hepes and EDTA were from Sigma. The purity of the lipids was evaluated using thin-layer chromatography on silicic acid-coated plates (Merck, Darmstadt, Germany) developed with a chloroform/methanol/water mixture (65:25:4, v/v/v). An examination of the plates after iodine staining and, when appropriate, upon UV illumination revealed no impurities. The lipid concentrations were determined gravimetrically with SuperG (Kibron, Espoo, Finland); a high-precision microbalance. The polyvinylpyrrolidone-stabilized AgNPs were supplied by Colorobbia (Firenze, Italy). The AgNPs were dispersed in deionized water (370.7 mM), and scanning electron microscopy showed that the AgNPs are spheroids with a particle size of around 100 nm. Dynamic light scattering (DLS) showed a mean hydrodynamic size of 117 ± 24 nm and a mean zeta potential of −20 ± 9 mV.
In the visualization of nanocarrier uptake in the inner ear and the evaluation of biological barrier function, 5 male Sprague Dawley rats, weighing between 334 and 348 g, were provided by the Biomedicum Helsinki, Laboratory Animal Centre, University of Helsinki, Finland (this is the defined animal center that provides animals for MRI experiments in Biomedicum); in the ABR and histological studies, 18 Sprague Dawley rats, weighing between 300 and 400 g, were provided by the Experimental Animal Unit of the University of Tampere School of Medicine in Finland. Animal assignments in each study were shown in Table 2. All animal experiments were approved by the Ethical Committee of University of Tampere (permission number:ESAVI/3033/04.10.03/2011). Animal care and experimental procedures were conducted in accordance with European legislation. Animals in the Gd-MRI study were anesthetized with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min) for induction and 3% for maintenance via a facemask. Animals for the ABR and histological studies were anesthetized with a mixture of 0.5 mg/kg medetomidine hydrochloride (Domitor
®
, Orion, Espoo, Finland) and 75 mg/kg ketamine hydrochloride (Ketalar
®
, Pfizer, Helsinki, Finland) via intraperitoneal injection followed by an intramuscular injection of enrofloxacin (Baytril
®
vet, Orion, Turku, Finland) at a dose of 10 mg/kg to prevent potential infection. The animal’s eyes were protected by Viscotears® (Novartis Healthcare A/S, Copenhagen, Denmark).
Preparation and Characterization of LPNs with and without Gd
Preparation of Gd-containing LPNs
LPNs of unilamellar vesicles with an apparent hydrodynamic particle diameter (Zav ) of 110 ± 15 nm that contain Gd-DOTA were prepared according to the previously published method [6]. A concentration of 1 mM Gd-DOTA-containing LPN (LPN + Gd-DOTA) refers to 1 mM liposomes encapsulating 500 mmol/L of Gd-DOTA.
Preparation of Blank LPNs
Blank LPNs of unilamellar vesicles with Zav of 115 ± 10 nm were prepared according to a previous publication [6].
Administration of LPNs
Under general anesthesia with isoflurane with 5% isoflurane–oxygen mixture (flow-rate 1.0 L/min), 50 μl of either LPNs or LPN + Gd-DOTA were injected into the left middle ear cavity through the tympanic membrane penetration under an operating microscope (OPMI1-F, Carl Zeiss, Jena, Germany). The same amount of deionized water (H2 O) was injected transtympanically in rats that were assigned to the negative group. After the injection, the animals were kept in the lateral position with the injected ear oriented upward for 15 min before further measurements.
Evaluation on Biological Barrier Function Using Gd-MRI
One animal receiving transtympanic injection of LPN + Gd-DOTA was selected to demonstrate distributions of LPN in the inner ear using MRI without contrast agent. Two animals receiving transtympanic injection of blank LPNs were engaged in MRI study for evaluation of the biological barrier function. Two animals receiving transtympanic injection of AgNPs (370.7 mM, 40 μl) were used as positive control. The contralateral ear without any injection was used as negative control in all studies. A 4.7T MR scanner with a bore diameter of 155 mm (PharmaScan, Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany) was utilized. The maximum gradient strength was 300 mT/m with an 80-μs rise time. A gadolinium-tetraazacyclododecane-tetraacetic acid (Gd-DOTA, 500 mM, DOTAREM, Guerbet, Cedex, France) solution was injected into the tail vein (0.725 mM/kg) 2 h before the MRI measurements. The imaging protocol and rapid acquisition with relaxation enhancement (RARE) sequences were applied according to a previous publication [10]. MRI scanning commenced at several time points after the transtympanic injection. The first MRI time of around 5 h was determined by taking the penetration time of liposome nanoparticles from the middle ear to the inner ear as a reference [1, 3, 6]. The final imaging time of 8 d was selected according to the course of potential acute inflammation and the availability of the scanner. ParaVision PV 4.0 (Bruker, MA, USA) software was used for the post-processing and quantification of MR images.
ABR Measurement
The auditory function of animals receiving injections of both blank and Gd-containing LPNs were evaluated using ABR measurements using BioSig32 (Tucker Davis Technologies, FL, USA) in a custom made, soundproof chamber. The ABR thresholds upon click and tone burst stimuli were recorded before and at a certain time point post-administration of LPNs. The first ABR measurement was followed on 2 days post-administration of AgNPs, allowing the animals to recover from the general anesthesia during the injection and to ensure the injected solution to be entirely cleared from the middle ear cavity. The second follow-up time of 4 days post-injection was chosen because it is close to the peak time of potential mitochondrial impairment-induced cell death in the cochlea [22]. The third follow-up time of 7 days is the time point when temporary threshold shifts remained significantly approved in an animal model of mitochondrial toxin-induced hearing loss [28]. The ABR recording procedure followed the previous report [11].
Glycosaminoglycan Staining in Rat Cochlea After Administration of LPNs
Hematoxylin-eosin staining to assess potential inflammatory infiltration and periodic acid Schiff’s staining to evaluate potential glycosaminoglycan accumulation in the cochlea after administration of LPNs were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11] The slices were observed and digital images were acquired under a light microscope (Leica DM2000 microscope equipped with an Olympus DP25 camera) for further analysis.
Immunofluorescence Staining for Hyaluronic Acid and Receptors
Immunofluorescence staining for hyaluronic acid, CD44, and TLR2 were performed according to a previous publication after ABR measurements over 7 days [11, 21].
Cell Death Detection
Potential nuclear DNA fragmentation in the cochlea was investigated using terminal transferase (TdT) to label the free 3′OH breaks in the DNA strands of apoptotic cells with TMR-dUTP (TUNEL staining) following the reported procedure [11]. Slices exposed to recombinant DNase I (Fermentas, Vantaa, Finland, 100 U/ml in 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mg/ml bovine serum albumin) at 37 °C for 10 min, which induced DNA strand breaks prior to the labeling procedures, were utilized as positive controls. The samples were observed under a confocal microscope.
Confocal Microscopy
The samples were observed under a Nikon inverted microscope (ECLIPSE Ti) combined with an Andor confocal system installed with Andor iQ 2.8 software (Andor Technology, Belfast, UK). The excitation lasers were 488 nm (green excitation) and 568 nm (red excitation) from an Andor laser combiner system, and the corresponding emission filters were 525/50 (Alexa Fluor-488) and 607/45 nm (Cy
TM
3 and TMR Red). DAPI was excited with light at 405 nm generated from a light-emitting diode and was detected using a 450–465 nm filter.
Analysis and Statistics
ImageJ (1.45S, National Institutes of Health, Bethesda, USA) software was used for signal intensity measurements. For light microscopy of periodic acid Schiff’s staining, the region of interests (ROIs) including spiral ligament, spiral limbus, and stria vascularis were selected using freehand selections button. The “measure” function was used to obtain the mean gray scale value of the ROI, which was inversely correlated with the staining intensity. For confocal microscopy of immunofluorescence staining, the ROIs including stria basal cells, spiral ganglion cells, spiral ligament, and spiral limbus were extracted using photoshop CS6 (version 13.0, Adobe Systems Software Ireland Ltd, Dublin, Ireland) program and were imported into ImageJ program. The images were split into individual channel, and the green (corresponded to CD44 and TLR2) and red (corresponded to hyaluronic acid) channels were selected for further quantifications. The “Threshold” was adjusted using the “set” button in the “Image” menu, and “Limit to Threshold” option should be selected and “Direct to” should be defined to the corresponding channel in the “Analyze” menu. Then the gray scale value, which was inversely correlated with the staining intensity, was obtained using the “Measure” function in the same menu.
Statistical analyses were performed using the IBM
®
SPSS
®
Statistics Version 20 software package (SPSS Inc., Chicago, USA). A one-way ANOVA and Kruskal-Wallis test were used to compare ABR threshold shifts and signal intensities (grayscale) of staining for glycosaminoglycan and hyaluronic acid secretions, and TLR2 and CD44 staining between the LPN injected-ear and saline injected-ear groups in the different cochlear structures among various turns. Least significant difference (LSD) test was used as post hoc analysis. Higher numbers in the grayscale analysis correlate with lower signal intensities of the staining. p < 0.05 was accepted as statistically significant.
Singkatan
ABR:
Auditory brainstem response
AgNPs:
Silver nanoparticles
dH2 O:
Deionized water
GAB1:
Growth factor receptor-bound protein 2-associated-binding protein 1
