Nanodot Karbon sebagai Nanosensor Mode Ganda untuk Deteksi Selektif Hidrogen Peroksida

Hasil dan Diskusi

Karakterisasi CD

Morfologi CD yang disiapkan diukur dengan mikroskop elektron transmisi (TEM). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a, CD tersebar dengan baik dengan kisaran ukuran seragam 2,5–6,5 nm dan diameter rata-rata sekitar 5 nm (File tambahan 1:Gambar S1b). Selain itu, gambar HRTEM (sisipan dari Gambar 1a) menunjukkan pinggiran difraksi sekitar 0,21 nm yang sesuai dengan (100) grafit. Pola XRD dari CD yang ditunjukkan pada Gambar 1b menunjukkan puncak yang lebar di sekitar 23,4°, yang sesuai dengan atom karbon yang sangat tidak teratur dengan struktur karbon seperti grafit. Spektrum Raman dari CD (Gbr. 1c) mengungkapkan dua pita:pita D (sekitar 1347 cm ⁻¹ , yang disebabkan oleh getaran sp ³ -karbon hibridisasi dengan ketidaksempurnaan dan ketidakteraturan) dan pita G (sekitar 1577 cm ⁻¹ , yang dikaitkan dengan E_2g mode getaran sp ² -karbon hibridisasi dalam struktur kristal heksagonal dua dimensi). Spektrum FTIR CD (Gbr. 1d) menunjukkan pita serapan getaran O–H/N–H yang luas pada 3100–3600 cm ⁻¹ , getaran regangan C=O/C=C pada sekitar 1690–1610 cm ⁻¹ dan vibrasi regangan N–O pada sekitar 1350–1390 cm ⁻¹ . Data di atas menunjukkan bahwa mungkin ada beberapa gugus fungsi pada permukaan CD, dan gugus fungsi ini mungkin memainkan peran penting dalam hidrofilisitas dan stabilitas tinggi CD dalam larutan berair.

a Gambar TEM dari CD. Inset menunjukkan gambar HRTEM dari CD. b Pola XRD dari CD. c Spektroskopi Raman dari CD. d Spektroskopi FTIR dari CD. e Variasi fluoresensi CD setelah menambahkan 0,5 M H₂ O₂ . Inset tunjukkan foto CD sebelumnya (kiri ) dan setelahnya (kanan ) menambahkan H₂ O₂ di bawah sinar UV. f Variasi kolorimetri CD setelah menambahkan 0,5 M H₂ O₂ . Inset tunjukkan foto CD sebelumnya (kiri ) dan setelahnya (kanan ) menambahkan H₂ O₂ di bawah siang hari

Perilaku fluoresen nanosensor berbasis CD terhadap H₂ O₂ diukur dalam larutan berair CD yang ditunjukkan pada Gambar. 1e. Di bawah eksitasi panjang gelombang tunggal pada 365 nm, larutan CD menggambarkan spektrum emisi asimetris, yang dapat dipasang oleh pita fluoresen emisi ganda yang berpusat pada 450 dan 500 nm, masing-masing sesuai dengan pita fluoresen biru dan hijau. Ketika larutan CD dicampur dengan H₂ O₂ , intensitas pita biru menunjukkan penurunan yang lebih besar daripada yang hijau. Dengan demikian, emisi CD terkuat bergeser dari 450 ke 500 nm dari hasil matriks eksitasi-emisi CD setelah penambahan H₂ O₂ (Berkas tambahan 1:Gambar S2). Akibatnya, warna fluoresensi larutan CD berubah dari biru menjadi hijau di bawah penerangan lampu UV 365 nm (sisipan Gambar 1e). Selain itu, larutan CD secara bersamaan mengalami perubahan kolorimetri dari merah tua menjadi hijau setelah menambahkan H₂ O₂ (sisipan dari Gambar. 1f). Perubahan warna ini dapat dikaitkan dengan evolusi intensitas pita serapan pada sekitar 555 dan 595 nm yang disebabkan oleh penambahan H₂ O₂ dalam larutan CD (Gbr. 1f). Secara keseluruhan, hasil ini mengonfirmasi bahwa CD dapat digunakan sebagai nanosensor mode ganda untuk mendeteksi H₂ O₂ .

Mekanisme Penginderaan

Untuk menyelidiki mekanisme penginderaan, morfologi dan sifat fluoresensi CD setelah menambahkan H₂ O₂ juga dicirikan. Seperti diilustrasikan pada File tambahan 1:Gambar S1a dan S1c, penambahan H₂ O₂ ke dalam solusi CD dapat menyebabkan agregasi CD, yang ukurannya berkisar antara 30 hingga 60 nm. H₂ O₂ -agregasi CD yang diinduksi juga terungkap dalam spektrum penyerapan yang dinormalisasi (File tambahan 1:Gambar S3); yaitu, pita serapan CD bergeser merah dari 555 ke 595 nm di wilayah yang terlihat [15]. Sejalan dengan itu, warna larutan CD bervariasi dari merah tua ke hijau, bersama dengan keadaan dispersi CD yang berubah menjadi keadaan agregasi. Spektrum XRD (Gbr. 1b dan File tambahan 1:Gambar S4) dari CD sebelum dan sesudah menambahkan H₂ O₂ sedikit berubah, menunjukkan tidak ada perubahan dalam struktur kristal CD.

Evolusi fluoresensi dari CD yang disiapkan dengan penambahan H₂ O₂ diselidiki oleh spektrum fluoresensi. Matriks eksitasi-emisi menunjukkan bahwa penambahan H₂ O₂ membuat pusat emisi CD berubah dari 450 menjadi 500 nm (File tambahan 1:Gambar S2). Kurva peluruhan fluoresensi yang ditunjukkan pada Gambar. 2a untuk CD dengan emisi pada 450 dan 500 nm dapat dilengkapi dengan baik oleh fungsi peluruhan mono-eksponensial dengan masa pakai rata-rata masing-masing 7,96 dan 7,12 nm (di bawah eksitasi 365 nm). Sebaliknya, masa peluruhan fluoresensi CD setelah H₂ O₂ perlakuan berubah menjadi 4,53 dan 4,83 ns (Gbr. 2b dan Tabel 1). Sementara itu, hasil kuantum PL (η _int ) CD berubah dari 5,5 menjadi 4,6% saat H₂ O₂ ditambahkan ke dalam larutan CD. Mempertimbangkan perubahan masa pakai fluoresensi dan hasil kuantum PL, dapat disimpulkan bahwa transfer muatan (CT) dapat terjadi antara CD dan H₂ O₂ , yang dapat menjadi pemicu untuk melakukan perubahan spektrum PL CD.

a , b Peluruhan fluoresensi CD sebelumnya (a ) dan setelah (b ) menambahkan 0,5 Jt J₂ O₂ . c , d XPS (N1s) dari CD sebelumnya (c ) dan setelah (d ) menambahkan 0,5 Jt J₂ O₂

Spektrum FTIR dan XPS dari CD diukur untuk memberikan wawasan tentang komposisi kimia dan perubahan lingkungan yang disebabkan oleh H₂ O₂ . Spektrum FTIR CD sebelum dan sesudah penambahan H₂ O₂ ditunjukkan pada File tambahan 1:Gambar S7 mengilustrasikan bahwa vibrasi regangan N–O pada sekitar 1350–1390 cm ⁻¹ meningkat dengan penambahan H₂ O₂ , yang juga dikonfirmasi oleh hasil spektrum XPS. Hal ini diamati dari survei penuh spektrum XPS (File tambahan 1:Gambar S8) bahwa rasio O ke N dari CD sebelum dan sesudah H₂ O₂ perlakuan adalah 1,57 dan 3,85, masing-masing. Peningkatan rasio O/N menunjukkan bahwa keadaan ikatan N dalam CD dapat berubah dengan penambahan H₂ O₂ , yang sejalan dengan spektrum resolusi tinggi N1s ​​XPS yang ditunjukkan pada Gambar. 2c, d. Dari hasil spektra N1s XPS, kandungan grafit N dalam CD mengalami peningkatan dengan penambahan H₂ O₂ . Selanjutnya, ada puncak tambahan status N–O pada 407,3 eV dalam spektrum N1s setelah penambahan H₂ O₂ , yang dengan jelas menunjukkan bahwa pengimporan H₂ O₂ membawa variasi keadaan permukaan dalam CD. Semua survei menunjukkan bahwa bingkai N permukaan dapat diubah dengan penambahan H₂ O_2.

Laporan sebelumnya menunjukkan bahwa pita emisi CD terkait dengan keadaan permukaan seperti radikal N-doped dan kelompok urea [5, 9, 12, 23,24,25]. Sementara itu, keadaan permukaan ini sensitif terhadap rangsangan fisik atau kimia eksternal. Berdasarkan fotofisika dan analisis lingkungan permukaan, kami mengusulkan mekanisme evolusi fluoresensi dengan pengenalan H₂ O₂ (Gbr. 3). Keadaan tepi dari CD yang disiapkan terdiri dari gugus N pirolat terkonjugasi. Jenis keadaan N ini mungkin sebagian besar terlokalisasi pada tingkat energi tinggi. Dengan demikian, elektron yang tereksitasi dapat berelaksasi secara nonradiatif ke tingkat N permukaan tingkat tinggi dan kemudian secara radiasi berpindah ke keadaan dasar disertai dengan pita emisi fluoresensi sekitar 450 nm. Sebaliknya, intensitas fluoresensi larutan CD sedikit menurun karena pendinginan dinamis antara H₂ O₂ dan CD, di mana CT muncul antara CD dan H₂ O₂ mirip dengan laporan sebelumnya [26,27,28,29]. Jika tidak, dapat disimpulkan bahwa radikal fluoresensi energi tinggi (keadaan N terkait) diubah menjadi keadaan N–O energi rendah berdasarkan dampak radikal hidroksil dari H₂ O₂ . Jadi, elektron yang tereksitasi sebagian besar dapat bersantai dengan transisi radiasi dari keadaan N–O berenergi rendah ke keadaan dasar dengan pita emisi hijau pada 500 nm, yang juga menghasilkan pendinginan statis fluoresensi 450 nm. Oleh karena itu, pita emisi utama CD dapat menunjukkan perubahan dari emisi biru ke emisi hijau.

Mekanisme penginderaan yang mungkin untuk CD sebelumnya (kiri ) dan setelahnya (kanan ) menambahkan H₂ O₂

Evaluasi Nanosensor CD

Berdasarkan perilaku fluoresen dan kolorimetri CD di atas, kami telah mengembangkan nanosensor untuk mendeteksi H₂ O₂ oleh CD. Sistem penginderaan yang diusulkan terdiri dari CD dengan konsentrasi yang tepat dalam larutan berair (3,75 μg mL ⁻¹ , File tambahan 1:Gambar S9), di mana CD berfungsi ganda sebagai reporter kolorimetri dan fluorometrik dalam sistem ini.

Sistem nanosensing yang diusulkan berdasarkan larutan CD diilustrasikan pada Gambar. 4. Perubahan fluorometrik dan kolorimetri yang disebabkan oleh H₂ O₂ dapat dengan jelas divisualisasikan dengan mata telanjang (Gbr. 4c, f), di mana serangkaian perubahan warna yang mencolok dari biru menjadi hijau dan dari merah tua menjadi hijau dapat diamati di bawah sinar UV dan penerangan siang hari. Selain itu, penambahan H₂ O₂ ke dalam larutan CD juga dapat diekspresikan secara kuantitatif dengan spektrum fluoresensi dan penyerapan (Gbr. 4a, d). Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, pita fluoresensi yang berpusat pada 450 dan 500 nm menurun secara bertahap dengan peningkatan H₂ O₂ konsentrasi dari 0 hingga 2 M. Namun, peningkatan H₂ O₂ konsentrasi menyebabkan penurunan intensitas fluoresensi yang berbeda pada 450 nm (I ₄₅₀ ) dan 500 nm (Saya ₅₀₀ ), yang sesuai dengan perubahan warna fluoresensi dalam larutan CD (Gbr. 4c). Oleh karena itu, rasio intensitas fluoresensi pada 500 nm dengan 450 nm dipilih untuk memantau H₂ O₂ konsentrasi (Gbr. 4a, b). Rasio yang lebih rendah terkait dengan emisi biru, sedangkan fluoresensi hijau dapat diamati dengan mata telanjang pada rasio I yang lebih tinggi. ₅₀₀ untuk Aku ₄₅₀ . Rentang deteksi linier dengan cara ini berkisar dari 0,05 hingga 0,5 M dengan korelasi linier R ² = 0,987. Demikian pula, perubahan kolorimetri terjadi dalam larutan CD karena penurunan pita serapan yang tidak homogen pada 555 dan 595 nm. Seperti yang ditampilkan pada Gambar. 4d, intensitas penyerapan menurun di wilayah yang terlihat, tetapi peningkatan H₂ O₂ konsentrasi menghasilkan penyerapan sekitar 595 nm menurun lebih lambat dari sekitar 555 nm. Oleh karena itu, rasio penyerapan pada 595 nm (A ₅₉₅ ) hingga 555 nm (A ₅₅₅ ) dapat juga digunakan untuk mengukur H₂ O₂ konsentrasi. Rasio A ₅₉₅ untuk A ₅₅₅ meningkat secara eksponensial dari 0,05 menjadi 2 M dengan korelasi eksponensial R ² = 0,999, dan perubahan kolorimetri berkorelasi baik dengan H₂ O₂ rentang konsentrasi dari 0,05 hingga 0,25 M dengan batas deteksi linier (LOD) 14 mM (File tambahan 1:Gambar S11 dan Tabel S1). Nanosensor dual-mode memiliki sensitivitas yang tepat dari metode ini yang memenuhi persyaratan klinis dan medis karena konsentrasi H₂ O₂ melalui reaksi GOD berkisar sekitar milimolar (~10 mM) dalam plasma [20]. Selain itu, nanosensor mode ganda memiliki referensi kalibrasi internal bawaan, sehingga fluktuasi intensitas dan faktor eksternal lainnya dapat dihilangkan, yang berkontribusi pada peningkatan akurasi pengujian.

a Spektrum fluoresensi CD dengan adanya H₂ . yang berbeda O₂ konsentrasi. b Kurva kalibrasi I ₅₀₀ /Aku ₄₅₀ dari CD vs. H₂ O₂ konsentrasi. Inset menunjukkan jangkauan deteksi linier I ₅₀₀ /Aku ₄₅₀ dari CD vs. H₂ O₂ konsentrasi. c Gambar fotografi larutan CD fluoresensi di bawah konsentrasi H₂ . yang berbeda O₂ . d Spektrum UV-Vis CD dengan adanya H₂ . yang berbeda O₂ konsentrasi. e Kurva kalibrasi A ₅₉₅ /A ₅₅₅ dari CD vs. H₂ O₂ konsentrasi. f Gambar fotografi larutan CD di bawah konsentrasi H₂ . yang berbeda O₂

Untuk mengevaluasi selektivitas nanosensor terhadap H₂ O₂ , uji interferensi dilakukan dalam kondisi yang sama menggunakan beberapa kation umum, seperti Na ⁺ , K ⁺ , NH ⁴⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , dan Fe ²⁺ . Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5a, b, perubahan fluorometrik dan kolorimetri dari CD telah disurvei dengan adanya kation yang berbeda. Di hadapan Na ⁺ , K ⁺ , NH₄ ⁺ , Ca ²⁺ , Zn ²⁺ , dan Fe ²⁺ , rasio fluoresensi I ₅₀₀ untuk Aku ₄₅₀ dan rasio penyerapan A ₅₉₅ untuk A ₅₅₅ hanya muncul sebagai sedikit variasi dibandingkan dengan sampel kosong, yang berarti kation ini memiliki sedikit gangguan pada deteksi H₂ O₂ . Selain itu, kami juga membandingkan dampak pada CD dengan oksidan lain, seperti HNO₃ , KClO₃ , FeCl₃ , NaClO, K₂ Cr₂ O₇ , dan KMnO₄ (Gbr. 5c, d dan File tambahan 1:Gambar S12 dan S13), dan kami menemukan bahwa warna fluoresensi berubah dari biru menjadi hijau dengan penambahan oksidan ini kecuali K₂ Cr₂ O₇ dan KMnO₄ . Jadi, kita dapat mengesampingkan gangguan dari K₂ Cr₂ O₇ dan KMnO₄ melalui perubahan fluoresensi. Selain itu, kita dapat dengan mudah mengecualikan dampak dari oksidan lain seperti HNO₃ , KClO₃ , FeCl₃ , dan NaClO dari hasil rasio penyerapan A ₅₉₅ untuk A ₅₅₅ . Oleh karena itu, nanosensor dual-mode yang ditunjukkan dalam makalah ini mungkin sangat menjanjikan dalam selektivitas penentuan yang tinggi karena efek sinergis dari dua metode deteksi independen [30,31,32,33]. Selanjutnya, kami telah mengukur waktu respons dari perubahan fluorometrik pada penambahan H₂ O₂ dan menemukan bahwa fluoresensi berkurang setelah menyuntikkan H₂ O₂ dan tetap stabil sekitar 3,3 s (File tambahan 1:Gambar S14).

a , c Rasio fluoresensi I ₅₀₀ /Aku ₄₅₀ larutan yang mengandung CD dan berbagai kation interferensi (a ) dan oksidan (c ). b , d Rasio penyerapan A ₅₉₅ /A ₅₅₅ larutan yang mengandung CD dan berbagai kation interferensi (b ) dan oksidan (d )

Kelangsungan hidup sel A549 diperiksa menggunakan uji CCK-8 standar untuk menilai sitotoksisitas CD. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, kami menemukan bahwa hampir 80% viabilitas diperoleh dengan menginkubasi sel A549 dengan CD selama 48 jam bahkan pada CD konsentrasi tinggi seperti 500 μg mL ⁻¹ . Dihitung bahwa 50% konsentrasi penghambat (IC50) CD adalah sekitar 1106 μg mL ⁻¹ oleh GraphPad Prism 5.0, yang menyimpulkan bahwa CD memiliki biokompatibilitas yang baik dan sitotoksisitas yang sangat rendah pada konsentrasi tinggi. Selain itu, kami telah membandingkan kinerja analitik dari nanosensor yang dilaporkan sebelumnya untuk H₂ O₂ penentuan ditunjukkan dalam file tambahan 1:Tabel S2. Biokompatibilitas, kesederhanaan, dan visualisasi deteksi sebanding dengan atau bahkan lebih baik daripada sebagian besar H₂ yang dilaporkan ini O₂ tes. Mempertimbangkan bahwa nanosensor mode ganda berbasis CD memiliki selektivitas yang baik terhadap H₂ O₂ deteksi, batas deteksi yang tepat (LOD = 14 mM) pada urutan yang sama dengan glukosa darah, dan sitotoksisitas yang sangat rendah pada konsentrasi CD yang tinggi, nanosensor menjanjikan untuk digunakan dalam pengujian glukosa darah dan persyaratan klinis lainnya.

Viabilitas sel sel A549 setelah inkubasi 48 jam dalam konsentrasi CD yang berbeda