Deteksi Peroksida Hidrogen Tingkat Lanjut melalui Nanopor Padat dengan Modifikasi Permukaan

Abstrak

Banyak teknik tersedia untuk deteksi molekul. Namun, deteksi molekul melalui nanopor padat dalam larutan adalah salah satu teknologi yang menjanjikan, dengan throughput tinggi dan biaya rendah yang digunakan saat ini. Dalam penelitian ini, platform nanopor padat dibuat untuk deteksi peroksida hidrogen (H₂O₂), yang tidak hanya merupakan produk bebas label tetapi juga merupakan peserta penting dalam reaksi redoks. Kami berhasil memproduksi nanopor nitride silikon (Si₃N₄) dengan diameter sekitar 50 nm menggunakan sinar ion Ga terfokus, dan permukaan dalam nanopor dimodifikasi dengan peroksidase daun selandia (HRP) menggunakan kimia kopling karbodiimida. Enzim HRP yang diimobilisasi mampu memicu reaksi redoks dalam satu saluran nanopor. Selain itu, translokasi molekul ABTS•⁺ tunggal yang teragregasi secara real-time dipantau dan dikaji. Biosensor nanopor padat yang dirancang dapat dibalik dan dapat digunakan untuk mendeteksi H₂O₂ berkali-kali.

Latar Belakang

Teknologi deteksi nanopor berasal dari counter Coulter [1] dan saluran ion sel [2]. Nanopor mendeteksi molekul bermuatan listrik yang ada dalam larutan saat melewatinya. Munculnya molekul dalam nanopor dapat mengubah konduktivitas pori secara signifikan, sehingga mengakibatkan perubahan pada sinyal arus. Perubahan arus memberikan informasi tentang ukuran dan konsentrasi molekul di dalam pori, untuk mengungkap proses dinamis perilaku translokasi molekul [3]. Beberapa objek skala nano dapat terdeteksi menggunakan nanopor, seperti nanopartikel [4,5,6], virus [7,8,9], molekul protein [10,11,12,13] dan urutan DNA [14,15,16,17]. Nanopor terbagi menjadi dua tipe: nanopor biologis dan nanopor padat. Nanopor biologis memiliki rasio sinis-ke-bisu (SNR) yang lebih rendah dan resolusi yang lebih tinggi. Protein kecil dan yang tidak terlipat dapat terdeteksi menggunakan nanopor biologis [18,19,20,21,22,23]. Nanopor padat dapat disesuaikan ukurannya dan memiliki stabilitas yang lebih tinggi. Biasanya, nanopor padat dibuat pada sebuah tipis, yang membagi sel fluida menjadi dua bagian [24]. Tegangan bias diterapkan di seluruh sel tipis yang mengandung nanopor, resulting dalam arus ionik dari satu sel ke sel lain [25]. Molekul protein, termasuk struktur yang terlipat dan tidak terlipat, terdeteksi dan dianalisis menggunakan nanopor padat [26,27,28,29]. Interaksi protein juga dapat terdeteksi menggunakan nanopor padat [30, 31]. Selain itu, nanopor padat mampu mendeteksi kinetika protein [32, 33]. Untuk mengatasi batasan pada rentang deteksi, nanopor padat yang dimodifikasi kimiawi telah diterapkan secara luas [34,35,36,37,38,39], dan digunakan untuk mendeteksi DNA tunggal [40] dan protein [41].

Banyak metode kuantitatif telah diterapkan untuk deteksi H₂O₂, sebagian besar berdasarkan spektrometri [42,43,44,45], kemiluminesensi [46,47,48,49], amperometri [50,51,52,53] dan elektrokimia [54,55,56,57]. Metode spektrometrik dan kemiluminesensi konvensional biasanya memakan waktu dan mahal. Sensor nanopor padat memiliki konsumsi rendah dan struktur sederhana, dan dapat digunakan untuk mendeteksi molekul kecil.

Di sini, kami menyajikan jenis nanopor padat yang dimodifikasi dengan peroksidase daun selandia (HRP). HRP diimobilisasi pada permukaan dalam nanopor padat, dan HRP yang diimobilisasi tetap aktif dalam reaksi redoks yang terjadi dalam satu saluran nanopor dalam kehadiran H₂O₂ [58]. ABTS•⁺ yang dihasilkan dalam reaksi redoks akan teragregasi, kemudian ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor. Peristiwa translokasi dapat terdeteksi. Untuk deteksi peroksida hidrogen, struktur nanopor padat sederhana, dan dapat mendeteksi ABTS•⁺ yang teragregasi dengan konsumsi reagen rendah. Modifikasi nanopor padat dengan enzim peroksidase daun selandia (HRP) ini dapat mencapai sensasi peroksida hidrogen (H₂O₂) secara tidak langsung, melalui deteksi ABTS•⁺ yang teragregasi. Ini memiliki signifikansi instruksional untuk deteksi molekul tunggal dan pengaturan molekular di dalam nanopor padat.

Metode

Bahan Kimia dan Material

Molekul Peroksidase Daun Selandia (HRP) (1 mg mL⁻¹, Nomor Komisi Enzim 1.11.1.7, 44 kDa) dibeli dari Xiya Reagent (Chengdu, Tiongkok). Sampel (HRP) dilarutkan dalam PBS 0,1 M yang difilter 0,02 μm, disimpan pada 4 °C, dan digunakan dalam waktu dua hari setelah disiapkan. Klorida kalium (KCl), N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilkarbodiimida (EDC), N-hidroxisuksinimida (NHS) dan 2,2’-Azino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic acid) ((ABTS), 98%) dibeli dari DiBo Chemical Technology Co., LTD (Shanghai, Tiongkok). Peroksida hidrogen (H₂O₂, 30%) dibeli dari Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (3-Aminopropil)trietosilana (3-APTES) dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS). Eksperimen dilakukan menggunakan air tidak murni dari sistem pemurnian air Milli-Q (resistivitas 18,2 MΩ/cm, 25 °C, Millipore Corporation, Billerica, MA, AS) yang difilter melalui 0,02 μm dalam sistem FIB FEI Strata 201 (FEI Co., Hillsboro, OR, AS), Zetasizer (Malvern Zetasizer Nano ZS), dan Axopatch 700B (Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, AS). Gambar instrumen yang digunakan kami ditambahkan ke materi tambahan (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S1).

Pembuatan Nanopor Padat dan Pengukuran Listrik

Pertama, tipis Si₃N₄ (ketebalan 100 nm) ditinggalkan pada substrat Si dengan ketebalan 300 μm. Diikuti oleh fotolitografi (ukuran jendela terbuka 500 × 500 μm²). Kemudian, permukaan tipis dibombardir dengan ion Ga+ menggunakan sistem FIB FEI Strata 201 (FEI Co., Hillsboro, OR, AS) pada potensial percepatan 30 kV, sementara arus diukur sebagai 1 pA. Waktu frais adalah 1,5 s dalam mode titik. Akhirnya, chip nanopor padat diperoleh dan dibersihkan dalam larutan piranha segar pada 80 °C selama 30 menit, diikuti dengan pemuculan dengan air ultra murni. Setelah pembersihan, chip dirakit dalam sel Teflon khusus dengan dua cincin o-ring Viton untuk memisahkan kedua sisi chip, dan membentuk dua reservoir untuk memastikan satu jalur tunggal untuk arus ionik melalui nanopor. Gambar perangkat yang digunakan kami ditambahkan ke materi tambahan (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S2). Elektroda (Ag/AgCl) terhubung ke sel fluida dan amplifier patch clamp (Axopatch 700B, Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, AS) yang membuat arus ionik dapat diukur pada tegangan konstan, dengan laju pengambilan sampel 100 kHz untuk sinyal. Filter Bessel delapan tiang internal rendah-pass amplifier diatur pada 10 kHz [3]. Seluruh instrumen ditempatkan dalam pelindung gabung Faraday ganda.

Hasil dan Pembahasan

Imobilisasi Nanopor dengan HRP

Nanopor terpilih dengan diameter sekitar 50 nm direndam dalam larutan piranha pada 80 °C selama 30 menit. Setelah perawatan dengan larutan piranha, permukaan dalam nanopor mampu menerima grup hidroksil silikon. Selanjutnya, seluruh tipis diaktifkan dengan (3-Aminopropil)trietosilana (3-APTES). Akibat perawatan dengan 3-APTES, grup amino (-NH₂) dihasilkan pada permukaan tipis.

Setelah aktivasi dengan (3-Aminopropil)trietosilana (3-APTES), chip nanopor dimasukkan ke dalam larutan PBS 0,1 M N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilkarbodiimida (EDC) (10 mM) dan N-hidroxisuksinimida (NHS) (20 mM). Kemudian, chip nanopor diperkenalkan ke dalam peroksidase daun selandia (HRP) (10 ng/ml). Menurut hasil penelitian kelompok kami sebelumnya [3], dengan konsentrasi garam yang berbeda dari 0,1 hingga 2 M KCl, pH 7,0, HRP tidak teragregasi. Karena nilai pI peroksidase daun selandia adalah 4,3 ± 0,2, kami juga membuktikan bahwa HRP tidak teragregasi dalam 0,1 M KCl pH 6,0 dan pH 7,0. Reagen EDC mengaktifkan grup karboksil (-COOH) HRP menjadi intermediate o-asilisoureia yang sangat reaktif. Selanjutnya, intermediate ini dikonversi lebih lanjut menjadi ester amine-reaktif suksinimidil yang lebih stabil dalam kehadiran NHS [58]. Hasilnya, kopling kovalen intermediate dengan (-NH₂) yang dihasilkan pada permukaan dalam nanopor membentuk ikatan amida stabil (Gambar 1).

Melakukan proses modifikasi dalam satu saluran nanopor padat tunggal. a Representasi skematis dari penempelan kovalen peroksidase daun selandia (HRP) ke satu saluran nanopor tunggal melalui kimia kopling karbodiimida. Grup karboksil (-COOH) HRP diaktifkan oleh larutan EDC, memungkinkan HRP bereaksi dengan (-NH₂) yang dihasilkan pada permukaan chip nanopor. b Skema sensor peroksida hidrogen HRP yang diimobilisasi, permukaan dalam sensor dimodifikasi dengan HRP. Ketika H₂O₂ dan ABTS terjadi, ABTS•⁺ dihasilkan. Struktur kristal HRP digunakan dengan izin dari penulis [3]

Proses-proses ini membawa kami menuju imobilisasi HRP pada permukaan dalam satu nanopor tunggal. Realisasi proses fungsionalisasi dikonfirmasi dengan mengukur karakteristik arus-tegangan (I-V) dari satu nanopor sebelum dan setelah modifikasi (Gambar 2).

Melakukan kurva arus-tegangan (I-V) tipis dari nanopor tidak dimodifikasi (asli) dan yang dimodifikasi dalam 0,1 M KCl, disaring pada pH 7,0 dengan PBS 0,1 M. Garis hitam adalah kurva I-V nanopor tidak dimodifikasi, dan garis merah adalah kurva I-V nanopor yang dimodifikasi dengan HRP. Sisipan adalah mikroskopi elektron pemindai (SEM) dari satu nanopor (diameter sekitar 50 nm cis) dan sensor nanopor. 100 nm adalah skala

Karakterisasi Nanopor Padat yang Dimodifikasi HRP

Di sini, bentuk satu saluran nanopor Si₃N₄ tunggal adalah silinder. Gambar 2 menunjukkan kurva arus-tegangan (I-V) tipis dari nanopor tidak dimodifikasi (asli) dan yang dimodifikasi dalam 0,1 M KCl, disaring pada pH 7,0 dengan PBS 0,1 M. Setelah memodifikasi permukaan dalam nanopor dengan enzim HRP, ukuran pori menjadi lebih kecil.

Menurut Wanunu et al., dengan mempertimbangkan konduktivitas eksternal nanopor, diameter nanopor padat dapat dihitung dengan persamaan berikut:

$$ d=\left(1+\sqrt{1+\frac{16\sigma l}{\pi G}}\right) G/2\sigma $$ (1)

Di mana, d dan l adalah diameter dan panjang pori, G adalah konduktivitas pori terbuka nanopor, σ adalah konduktivitas larutan ion.

Mempertimbangkan efek geometris, setelah modifikasi nanopor padat dengan enzim HRP, ukuran efektif dapat dihitung. Diameter satu nanopor dapat dihitung berdasarkan persamaan (1). Di mana, nilai konduktivitas (G _{tidak dimodifikasi} ) sekitar 15 nS dapat diperoleh dari kurva I-V nanopor padat tidak dimodifikasi. Konduktivitas (σ) larutan ion KCl 0,1 M (25 °C), disaring pada pH 7,0 dengan PBS 0,1 M adalah sekitar 1,28 S/m. Oleh karena itu, diameter nanopor tidak dimodifikasi adalah sekitar 51 nm, yang serupa dengan diameter yang diukur. Menggunakan metode yang sama, nilai yang diperoleh dari konduktivitas (G _dimodifikasi ) adalah sekitar 7,5 nS, dan diameter (~34 nm) nanopor yang dimodifikasi dapat dihitung. Pengurangan diameter mungkin disebabkan oleh dua alasan berikut, pertama adalah perawatan permukaan dalam nanopor dengan (3-aminopropil)trietosilana (3-APTES), yang memungkinkan permukaan nanopor menerima grup amino (-NH₂). Alasan kedua adalah diameter hidrodinamik (D _h ) enzim HRP adalah sekitar 8 nm [3], HRP yang diimobilisasi dapat mengurangi diameter pori. Di sini, nanopor padat yang dimodifikasi HRP dengan diameter sekitar 34 nm digunakan sebagai saluran deteksi peroksida hidrogen.

Prinsip Reaksi Redoks

Reaksi redoks dilakukan di dalam satu nanopor yang dimodifikasi, dan proses reaksi yang disajikan berikutnya sepakat dengan reaksi redoks yang diusulkan [58]. Dalam kehadiran H₂O₂ (0,5 mM), enzim HRP yang diimobilisasi pada permukaan dalam nanopor dikonversi menjadi senyawa 1 segera. Kemudian, senyawa 1 menerima satu elektron dari molekul substrat pengurang ABTS (1,5 mM) untuk menghasilkan senyawa 2. Selanjutnya, senyawa 2 dikembalikan ke enzim istirahat melalui transfer satu elektron dari molekul substrat ABTS lainnya.

Produk kationik (ABTS•⁺) dari reaksi redoks terkumpul dalam satu nanopor. Translokasi molekul yang terkumpul dari saluran nanopor akan mengubah konduktivitas (G), sehingga perubahan arus (ΔI _b ) dapat ditemukan.

$$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{H}}_2{\mathrm{O}}_2\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +}\left(\mathrm{Senyawa}\ 1\right) + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$ $$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right){\mathrm{Porp}}^{\cdotp +} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp}\left(\mathrm{Senyawa}\ 2\right) + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} $$ $$ \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{4+}=\mathrm{O}\right)\mathrm{Porp} + \mathrm{ABTS}\to \mathrm{H}\mathrm{R}\mathrm{P}\left({\mathrm{Fe}}^{3+}\right)\mathrm{Porp} + {\mathrm{ABTS}}^{\cdotp +} + {\mathrm{H}}_2\mathrm{O} $$

Deteksi Peristiwa Translokasi

Eksperimen dilakukan menggunakan nanopor yang dimodifikasi peroksidase daun selandia (HRP) dengan diameter pori yang dimodifikasi (~34 nm) dalam 0,1 M KCl, disaring pada pH 7,0 dengan PBS 0,1 M. 2, 2’-Azinobis-(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonat (ABTS) (1,5 mM) dan peroksida hidrogen (H₂O₂) (0,5 mM) ditambahkan ke kompartimen trans nanopor. Setelah menambahkan ABTS dan H₂O₂, eksperimen menggunakan tegangan bias dari −100 hingga −800 mV dilakukan, dan diambil sampel pada 100 kHz. Tidak ada peristiwa translokasi hingga tegangan meningkat ke −400 mV. Gambar 3 menunjukkan jejak arus ionik representatif dari peristiwa translokasi pada berbagai tegangan dari −400 hingga −800 mV dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Data eksperimen untuk peristiwa translokasi durasi panjang pada berbagai tegangan ditambahkan ke materi tambahan (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S3).

a–e Representasi skematis dari peristiwa translokasi pada berbagai tegangan dari −400 hingga −800 mV. Frekuensi peristiwa translokasi meningkat saat tegangan yang diterapkan meningkat dari −400 mV ke −800 mV. f Amplitudo arus meningkat linier dengan tegangan. h Fungsi eksponensial menurun (t _d ~ e ^−v/v0) digunakan untuk menyesuaikan waktu tinggal yang bergantung pada tegangan yang diterapkan

Peristiwa pemblokiran arus milidetik diamati, dilakukan dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Dengan menambahkan reagen H₂O₂ dan ABTS ke kompartimen trans, enzim HRP yang diimobilisasi pada permukaan dalam satu saluran nanopor tunggal, dan reaksi redoks terjadi. Keberadaan molekul ABTS•⁺ yang berlimpah dihasilkan, satu molekul ABTS•⁺ yang lebih kecil mungkin tidak dapat terdeteksi menggunakan nanopor padat kami, karena resolusi sistem [3]. Namun, molekul-molekul ini akan teragregasi setelah produksi mereka. Oleh karena itu, mungkin untuk mendeteksi molekul ABTS•⁺. Di sini, tegangan negatif dipertahankan, dan molekul ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor. Ada aliran elektroforetik dan elektroosmosis saat tegangan negatif diterapkan. HRP bermuatan negatif dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 [3], akibatnya, lapisan ganda listrik akan dihasilkan, dan elektroosmosis akan menuju arah elektroda negatif. Karena alasan ini, elektroforesis dan elektroosmosis menuju arah yang sama. ABTS•⁺ yang teragregasi dalam saluran nanopor tunggal akan transportasi melalui nanopor padat, alir menuju arah elektroda negatif.

Analisis Statistik Peristiwa Translokasi

Karena tegangan bias memainkan peran kunci dalam translokasi ABTS•⁺ yang teragregasi, pengaruh pemblokiran arus ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor yang dimodifikasi HRP terhadap tegangan yang diterapkan dibahas. Frekuensi kemunculan peristiwa translokasi sangat meningkat dengan peningkatan tegangan (Gambar 3f). Saat tegangan meningkat, amplitudo arus juga meningkat. Namun, peristiwa translokasi secara bertahap menghilang saat tegangan bias dipertahankan di bawah −300 mV, yang mengindikasikan bahwa ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor yang dimodifikasi HRP memerlukan tegangan ambang −300 mV. Gambar 4 menunjukkan histogram amplitudo arus rata-rata dari peristiwa translokasi yang diukur untuk ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan. Berdasarkan kurva pemetaan, nilai puncak pemblokiran arus (ΔI _b ) adalah 308,4 ± 27,795 pA, 419,1 ± 20,354 pA, 478,8 ± 32,857 pA, 528,1 ± 36,98 pA, 606,9 ± 40,916 pA pada −400, −500, −600, −700, dan −800 mV, masing-masing, kemungkinan besar pengurangan arus diinduksikan oleh molekul ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor pada berbagai tegangan. Nilai amplitudo arus dipetakan dengan fungsi polinomial orde pertama, yang menghasilkan kemiringan −0,706 dan tangkapan 49,262. Namun, berdasarkan kurva pemetaan, nilai waktu tinggal adalah 54,5 ± 21,374 ms, 42,8 ± 20,181 ms, 10,3 ± 3,05 ms, 6,0 ± 1,744 ms, 4,0 ± 1,441 ms, pada −400, −500, −600, −700, dan −800 mV. Gambar 3h menunjukkan fungsi eksponensial menurun (t _d ~ e ^−v/v0) digunakan untuk menyesuaikan waktu tinggal yang bergantung pada tegangan yang diterapkan. Histogram waktu tinggal dari peristiwa translokasi ditambahkan ke materi tambahan (lihat Berkas Tambahan 1: Gambar S4).

Histogram amplitudo arus rata-rata dari peristiwa translokasi yang diukur untuk ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan (−400, −500, −600, −700, −800 mV) dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Semua histogram dipetakan dengan distribusi Gaussian

Pemblokiran arus versus waktu tinggal peristiwa untuk setiap ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan dipetakan dalam plot sebar dua dimensi (Gambar 5). Semua ABTS•⁺ yang teragregasi menunjukkan kluster peristiwa dari −400 hingga −800 mV, kluster peristiwa utama disebabkan oleh ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor padat yang dimodifikasi HRP.

Plot sebar dua dimensi pemblokiran arus versus waktu tinggal peristiwa untuk setiap ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan. Histogram yang sesuai ditempatkan di kanan dan di atas. Semua histogram dipetakan dengan distribusi Gaussian

Selain itu, peristiwa translokasi tunggal pada setiap tegangan dianalisis, dan pemblokiran arus diinduksikan oleh substansi dengan ukuran dan muatan yang sama. Jadi, diasumsikan bahwa setiap peristiwa translokasi diinduksikan oleh satu ABTS•⁺ yang teragregasi tunggal. Untuk menganalisis waktu translokasi ABTS•⁺ yang teragregasi dalam eksperimen kami. Durasi pemblokiran arus t _d dianggap sebagai waktu tinggal satu ABTS•⁺ yang teragregasi dari lokasi tempat dihasilkan ke keluar nanopor. Di sini, kondisi lain dipertimbangkan, mungkin ada beberapa enzim HRP yang diimobilisasi pada pintu masuk nanopor, dan mungkin memfasilitasi reaksi redoks. Oleh karena itu, eksperimen lain dilakukan untuk memverifikasi bahwa reaksi redoks terjadi pada permukaan dalam satu nanopor tunggal dan bukan pada pintu masuk. Untuk verifikasi, nanopor yang tidak dimodifikasi oleh HRP diterapkan dan dianalisis. Nanopor ini diaktifkan dengan 3-APTES. Dan konsentrasi HRP yang sama (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) dan H₂O₂ (0,5 mM) ditambahkan ke kompartimen trans nanopor, tegangan bias negatif diterapkan dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, karena gaya elektroforesis, HRP tidak dapat melewati nanopor. Akibat reaksi redoks, ABTS•⁺ yang teragregasi dihasilkan, tetapi tidak ada peristiwa translokasi yang ditemukan. Kemungkinan ABTS•⁺ yang teragregasi menyebabkan efek elektrostatis dengan HRP dan mencegah ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor.

Gambar 6 menunjukkan plot sebar dua dimensi dari perubahan konduktivitas (ΔG) versus waktu tinggal peristiwa untuk setiap ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan. Dapat ditemukan bahwa perubahan konduktivitas (ΔG) terutama terkonsentrasi pada 0,8 nS. Bentuk peristiwa translokasi hampir sama. Nilai rata-rata ΔG adalah ~0,8 nS pada berbagai tegangan. Dapat dipecat bahwa pengecualian volume setiap molekul ABTS•⁺ yang teragregasi hampir sama. Kemungkinan efek elektrostatis dan sterik molekul ABTS•⁺ yang teragregasi dapat mengubah arus ionik. Setelah analisis, dua bentuk typikal jejak arus dengan translokasi ABTS•⁺ yang bermuatan positif diamati (Gambar 7). Peristiwa translokasi pada −700 mV sebagai representasi. Persentase dua jenis peristiwa dianalisis, dan dapat diamati bahwa persentase peristiwa tipe 1 meningkat dengan peningkatan tegangan, di sisi lain, persentase peristiwa tipe 2 menurun. Dipertimbangkan bahwa tegangan lebih tinggi membuat translokasi lebih cepat dari pada tegangan lebih rendah.

Representasi skematik plot sebar dua dimensi ΔG versus waktu tinggal peristiwa untuk setiap ABTS•⁺ yang teragregasi pada berbagai tegangan. Kurva pemetaan yang sesuai ditempatkan di atas. Sisipan adalah peristiwa translokasi pada berbagai tegangan (dari −400 hingga −800 mV)

a Skema dua jenis peristiwa translokasi pada tegangan −700 mV. b Persentase dua jenis peristiwa pada berbagai tegangan (−400, −500, −600, −700, −800 mV)

Sinyal pemblokiran arus mengungkap ukuran, konformasi, dan interaksi ABTS•⁺ yang teragregasi melewati satu saluran nanopor tunggal. Untuk perubahan bentuk arus, proses perubahan dipecat. Untuk peristiwa 1, sinyal arus memiliki bagian fluktuasi typikal dengan intensitas dalam dan waktu tinggal singkat. Kemungkinan ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor dari lokasi tempat dihasilkan. Ketika ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor, arus ionik nanopor pulih ke tingkat asli (Baseline) (I ₀ ). Untuk peristiwa 2, sinyal arus memiliki bagian fluktuasi dengan intensitas dalam dan kemudian memiliki tahap horizontal. Bentuk sinyal ini dapat disebabkan oleh interaksi elektrostatis ABTS•⁺ yang teragregasi dengan HRP pada keluar nanopor, dan arus perlahan pulih ke baseline. Untuk pemahaman yang lebih baik tentang perubahan arus, kita perlu memulai dengan perubahan konduktivitas pori terbuka (G _pore ) pada konsentrasi garam (0,1 M KCl). Seperti yang dibahas dalam studi sebelumnya, persamaan konduktivitas pori terbuka dari nanopor bermuatan negatif dengan diameter d dan panjang l pada konsentrasi garam rendah dapat dijelaskan sebagai

$$ {G}_{p ore}=\frac{\pi {d^2}_{p ore}}{4{l}_{p ore}}\left[\left({\mu}_{K^{+}}+{\mu}_{C{ l}^{-}}\right){n}_{K Cl}\cdot e+{\mu}_K\frac{4{\sigma}_p}{d_{p ore}}\right] $$ (2)

di mana μ _K dan μ _Cl adalah mobilitas elektroforetik K⁺ dan Cl⁻, n _KCl adalah densitas jumlah K⁺ dan Cl⁻, muatan dasar adalah e, σ _p adalah densitas muatan permukaan nanopor. Dalam eksperimen ini, nanopor padat dimodifikasi kimiawi, dan diameter nanopor berubah. Densitas muatan permukaan nanopor (σ _p ) tidak dapat diperoleh secara tepat. Oleh karena itu, konduktivitas pori terbuka (G _pore ) dihitung berdasarkan persamaan (1). Berdasarkan persamaan (1), konduktivitas pori terbuka (G _pore ) adalah ~7,5 nS. Dipecat bahwa perubahan konduktivitas dapat disebabkan oleh dua alasan [15]. Alasan pertama adalah bahwa pengecualian volume ion dalam nanopor ditempati oleh molekul ABTS•⁺ yang teragregasi. Akibatnya, konduktivitas nanopor padat menurun (ΔG ^-). Alasan kedua adalah bahwa beberapa ion dibawa dari nanopor oleh molekul ABTS•⁺ yang teragregasi yang meningkatkan konduktivitas nanopor padat. Dalam eksperimen ini, ABTS•⁺ dihasilkan di dalam nanopor, dan tidak ada ion yang dibawa. Oleh karena itu, perubahan konduktivitas nanopor padat (ΔG) hanya diinduksikan oleh pengecualian volume. Jadi, total perubahan konduktivitas dapat dijelaskan sebagai

$$ \varDelta G=\varDelta {G}^{-} $$ (3)

Penurunan konduktivitas nanopor padat diinduksikan oleh pengecualian volume dan dapat dihitung dengan persamaan berikut

$$ \varDelta {G}^{-}=\sigma \frac{\gamma \varLambda}{{\left( l+0.8 d\right)}^2} $$ (4)

di mana γ adalah faktor bentuk partikel yang merupakan rasio luas permukaan bola dan partikel dengan volume yang sama. Dalam pekerjaan ini, molekul ABTS•⁺ yang teragregasi disederhanakan menjadi objek global, oleh karena itu nilai γ adalah 1 dan Λ adalah pengecualian volume. Konduktivitas larutan massa σ adalah 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Untuk pengecualian volume (Λ), kita dapat menyimpulkan dari peristiwa translokasi beberapa molekul lainnya. Untuk menghubungkan perubahan konduktivitas (ΔG) ke properti fisik molekul, Hukum Ohm dapat diterapkan pada perubahan volume larutan elektrolit berdasarkan nanopor padat [59]. Ketika terjadi peristiwa translokasi molekul dalam nanopor padat silinder, arus turun secara instan. Ketika resistansi nanopor padat adalah resistansi seluruh rangkaian, perubahan konduktivitas (ΔG) dapat dijelaskan dengan persamaan berikut

$$ \varDelta G(t)=-{G}_{p ore}\frac{\varLambda (t)}{H_{eff}{A}_p}\left[1+ f\left({d}_m/{D}_p,{l}_m/{H}_{eff}\right)\right] $$ (5)

Dalam persamaan ini, A _p H _eff = V _p adalah volume nanopor padat, f (d _m /D _p , lm/H _eff ) adalah faktor koreksi (mengabaikan efek muatan permukaan), dalam eksperimen kami, kami menyederhanakan molekul ABTS•⁺ yang teragregasi menjadi objek global; oleh karena itu, faktor koreksi adalah 1. Rasio d _m /D _p adalah rasio diameter molekul dan diameter nanopor, Rasio lm/H _eff adalah rasio panjang efektif molekular dan panjang efektif nanopor. Ungkapan (5) dapat disederhanakan sebagai

$$ \varDelta G/{G}_{p ore}\approx \varLambda /{V}_p $$ (6)

Nilai rata-rata konduktivitas (G _pore ) telah dianalisis dari peristiwa translokasi. Dari persamaan (5), nilai rata-rata pengecualian volume (Λ) pada berbagai tegangan (-400, -500, -600, -700, -800 mV) dapat diperoleh. Sementara itu, ukuran nanopor yang digunakan diketahui, volume nanopor (V _p ) adalah ~90746 nm³. Berdasarkan persamaan (4), nilai perubahan konduktivitas (ΔG ^-) dapat dihitung sebagai ~0,6 nS. Nilai rata-rata perubahan konduktivitas yang diperoleh dari eksperimen peristiwa translokasi pada berbagai tegangan (−400, −500, −600, −700, −800 mV) adalah ~0,784 nS. Dapat ditemukan bahwa nilai yang dihitung mendekati nilai eksperimental.

Dalam beberapa penelitian sebelumnya, molekul peroksida hidrogen telah berhasil terdeteksi dengan berbagai teknologi. Namun, untuk mendeteksi peroksida hidrogen melalui saluran nano adalah langka. Tan et al. [3] membedakan sinyal peristiwa yang berbeda ketika HRP melintasi nanopor, terdapat ABTS dan H₂O₂ dalam larutan KCl. Sinyal tipe berbeda dengan translokasi HRP dianggap sebagai ABTS•⁺ melewati nanopor. Enam peristiwa typikal translokasi produk substrat katalisis enzim dianalisis. Mereka menyimpulkan proses kemungkinan setiap tipe. Namun, tidak cukup bukti untuk mengujinya. Mubarak Ali et al. telah berhasil mendeteksi produk reaksi redoks di dalam saluran nano konus tunggal [58]. Mereka menemukan bahwa radikal kationik ABTS•⁺ mengurangi arus ionik dalam saluran nano HRP secara bergantung pada tegangan, konsisten dengan konsentrasi ion bergantung pada tegangan dalam saluran nano konus. Magnitudo pemblokiran arus berkaitan dengan konsentrasi H₂O₂ dalam larutan.

Kesimpulan

Kesimpulannya, kami berhasil memproduksi nanopor Si₃N₄ menggunakan FIB, sistem nanopor tunggal yang permukaannya dimodifikasi dengan enzim HRP yang terhubung kovalen. Efek enzim HRP yang diimobilisasi dalam satu nanopor padat sebagai sensor peroksida hidrogen (H₂O₂) dikonfirmasi dengan mengkaji produk (ABTS•⁺) dari reaksi redoks yang terjadi dalam kehadiran substrat H₂O₂ dan ABTS. Radikal kationik ABTS•⁺ yang teragregasi dihasilkan di dalam nanopor padat dan mengurangi arus ionik dalam nanopor padat yang dimodifikasi HRP, konsisten dengan ketergantungan tegangan. Tren pemblokiran arus menunjukkan ketergantungan linier untuk tegangan bias yang diterapkan. Hubungan antara waktu tinggal versus tegangan bias yang diterapkan adalah eksponensial menurun (t _d ~ e ^−v/v0). Sementara itu, ABTS•⁺ yang teragregasi melewati nanopor yang dimodifikasi HRP memerlukan tegangan ambang −300 mV. Perubahan konduktivitas (ΔG) telah dihitung secara analitis dan dibandingkan dengan nilai eksperimental yang diukur. Peristiwa translokasi dihasilkan oleh radikal kationik ABTS•⁺ yang teragregasi dengan ukuran tertentu. Kami berharap bahwa penggunaan nanopor padat akan memungkinkan penurunan batas deteksi dan meningkatkan sensitivitas sistem. Untuk sistem nanopor padat kami, struktur sederhana; tidak rentan terhadap kotoran dan dapat digunakan berkali-kali.

Singkatan

3-APTES:

(3-Aminopropil)trietosilana

ABTS:

Asam 3-etilbenzotiazolin-6-sulfonic

EDC:

N-(3-dimetilaminopropil)-N’-etilkarbodiimida

FIB:

Sinar Ion Terfokus

HRP:

Peroksidase Daun Selandia

KCl:

Klorida Kalium

NHS:

N-hidroxisuksinimida

SEM:

Mikroskopi Elektron Pemindai

SNR:

Rasio Sinyal ke Bisu