Mikro-lingkungan Asam dalam Liposom Secara Signifikan Meningkatkan Stabilitas Kurkumin dan Efikasi Antikanker

Latar Belakang

Vesikel lipid buatan, atau liposom, meniru sel sel dengan lapisan fosfolipid di sekitar inti air, menawarkan muatan obat tinggi, biodegradabilitas, dan biokompatibilitas [1-5]. Arsitektur amfifiliknya memungkinkan pelarutan obat hidrofobik sambil melindunginya dari lingkungan ekstraselular yang keras [6-9]. Modifikasi permukaan lebih melanjutkan sirkulasi sistemik atau mengarahkan payload ke jaringan tertentu [10-14], dan beberapa formulasi liposom telah mendapat persetujuan klinis [15-18].

Meskipun keuntungan ini, pengiriman obat yang tidak stabil pada pH netral masih masalah. Liposom konvensional biasanya disiapkan dalam PBS pada pH 7,4, sehingga mengekspos porsi yang sensitif pH ke lingkungan yang tidak menguntungkan. Kurkumin, polifenol lipofilik dengan sifat anti-inflamasi dan anti-kanker yang kuat, merupakan contoh masalah ini: ketidakterlarutan air yang rendah dan degradasi yang dimediasi pH membatasi terjemahan klinisnya [19-23]. Oleh karena itu, menciptakan mikro-lingkungan asam dalam inti liposom dapat melindungi integritas obat tersebut.

Dalam studi ini, kami memanfaatkan ruang air dalam liposom untuk menghasilkan gradien keasaman yang dapat disesuaikan dan mengevaluasi dampaknya pada enkapsulasi, stabilitas, dan aktivitas anti-kanker kurkumin.

Metode

Bahan-bahan

Fosfatidilkolin dari lecitin kedelai (grade injeksi) diperoleh dari Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd.; kolesterol dibeli dari Amresco; poloksamer 188 (F68) disumbangkan oleh BASF (China); kurkumin (≥ 98 %) disuplai oleh Sigma; serum fetal sapi (FBS) berasal dari HyClone. Semua reagen adalah kelas analitik.

Persiapan Liposom Termuat Kurkumin

Cur-LPs dihasilkan melalui metode penguapan film tipis [27,28] dengan modifikasi. Fosfolipid (75 mg) dan kolesterol (5 mg) dilarutkan dalam 0,5 mL etanol yang mengandung kurkumin 2 mg/mL. Larutan dicampur dengan 5 mL PBS 0,001 M (pH 2,5, 5,0, atau 7,4) yang mengandung F68 1 % (w/v) untuk menyempitkan distribusi ukuran. Setelah 1 menit pengadukan magnetik pada 35 °C, campuran dihindari di bawah vakum dan dalam kegelapan selama 30 menit untuk menghilangkan etanol. Sentrifugasi kecepatan rendah (3.000 rpm, 5 menit) menghilangkan kurkumin bebas; pelet kemudian difugasi kecepatan tinggi (16.000 rpm, 10 menit) dan disuspendasi kembali dalam PBS (pH 7,4). Formulasi yang dihasilkan disebut Cur-LP-2,5, Cur-LP-5,0, dan Cur-LP-7,4; liposom kosong disiapkan secara identik.

Karakterisasi

Pencaran cahaya dinamis (DLS) mengukur ukuran hidrodinamik dan indeks polidispersi (PDI); potensial zeta diukur dengan pencaran cahaya elektroforetik (ELS) menggunakan Malvern Zetasizer Nano ZS90 pada 25 °C. Efisiensi enkapsulasi (EE) dihitung melalui fluoresens setelah memisahkan kurkumin yang terkapsulasi dari kurkumin bebas dengan sentrifugasi kecepatan tinggi [29].

Mikroskopi Elektron Pemindai

Citra SEM (FEI INSPECT F) diperoleh setelah pencairan 100 kali dalam air destilasi, pengecoran pada kaca, pengeringan udara, dan pelapisan emas.

Stabilitas Fisik

Stabilitas koloidal dievaluasi dengan memantau perubahan ukuran dan transmitansi (550 nm) selama 72 jam pada 37 °C. Agregasi (termodinamik) dan pengendapan (kinetik) dikuantifikasi masing-masing.

Pelepasan In Vitro

Pelepasan kurkumin dari Cur-LPs diukur menggunakan kantong dialisis 10 kDa dalam PBS (pH 7,4, 0,1 % Tween 80) pada 37 °C dengan pengadukan 100 rpm. Sampel dikumpulkan pada interval yang ditentukan, diganti dengan medium segar, dan dianalisis dengan fluoresens (Ex 458 nm, Em 548 nm).

Stabilitas Kimia dalam Serum

Cur-LPs (dipencairkan 10 kali) dicampur dengan 1 mL FBS 50 % dan diinkubasi pada 37 °C, 100 rpm. Pada waktu yang ditentukan, alikot diekstraksi, dicampur dengan etanol, difugasi, dan kurkumin yang tersisa dikuantifikasi dengan fluoresens.

Efikasi Anti-Kanker In Vitro

Sel HepG2 ditanam pada 10.000 sel/lubang dalam plate 96-lubang, dikultur 24 jam dalam PRIM-1640 + 10 % FBS, dicuci dengan PBS, dan kemudian treated dengan kurkumin 4 µg/mL (bebas atau terkapsulasi) dalam medium bebas serum. Keberlangsungan sel diukur setelah 1 dan 3 hari menggunakan uji CCK-8. Keberlangsungan dinyatakan sebagai % relatif terhadap kontrol tidak treated.

Statistik

Data disajikan sebagai rata-rata ± SD (n = 3). Uji t Student dua arah menentukan signifikansi; p < 0,05 dianggap signifikan.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Liposom

Semua Cur-LPs menunjukkan ukuran partikel yang serupa (~300 nm) dan PDI < 0,2 (Gambar 1a). Potensial zeta lebih negatif untuk Cur-LP-5,0 dan Cur-LP-2,5 (~ −18 mV) dibandingkan Cur-LP-7,4 (−9 mV), yang mencerminkan pengaruh keasaman internal terhadap muatan permukaan (Gambar 1b). EE yang lebih tinggi yang diamati untuk Cur-LP-2,5 (74 %) dibandingkan Cur-LP-5,0 (45 %) dan Cur-LP-7,4 (64 %) menunjukkan bahwa inti yang diasamkan meningkatkan pemuatan kurkumin, kemungkinan karena dinamika kelarutan yang berubah pada pH rendah [33].

Citra SEM mengonfirmasi morfologi bolafisik di semua formulasi (Gambar 2). Agregasi minor dicatat untuk Cur-LP-7,4, konsisten dengan potensial zeta yang lebih rendah, dan diameter SEM yang diamati lebih kecil dari nilai DLS karena efek dehidrasi.

Stabilitas Fisik

Selama 72 jam pada 37 °C, tidak ada formulasi yang menunjukkan peningkatan ukuran yang signifikan atau perubahan transmitansi (< 10 %), yang menunjukkan stabilitas termodinamik dan kinetik yang kuat terlepas dari pH internal (Gambar 3).

Pelepasan In Vitro

Kurkumin melepaskan dengan cepat dari larutan bebas (> 80 % dalam 6 jam), mengonfirmasi bahwa membran dialisis tidak menghambat difusi. Cur-LPs menunjukkan pelepasan berkelanjutan, hampir nol-urutan, dengan pelepasan kumulatif ~30 % selama 72 jam (Gambar 4). Regresi linier (R² > 0,99) menggarisbawahi kinetik pelepasan yang konsisten, fitur yang menguntungkan untuk mempertahankan tingkat terapeutik.

Efek pH Internal terhadap Stabilitas Kimia

Insersi serum mengungkapkan ketergantungan pH yang jelas: setelah 6 jam, Cur-LP-2,5 mempertahankan 55 % kurkumin, dibandingkan 43 % (Cur-LP-5,0) dan 34 % (Cur-LP-7,4) (Gambar 5). Tren ini mencerminkan所知nya pH sensitivitas kurkumin bebas [26]. Inti asam mungkin menekan aktivitas enzimatik dan melindungi kurkumin dalam lapisan lipid, yang, tidak seperti harapan, dilintasi oleh volume air kecil yang dapat mempengaruhi stabilitas obat.

Efikasi Anti-Kanker In Vitro

Liposom kosong secara modest mempromosikan proliferasi HepG2 pada 1 hari, yang mengindikasikan efek nutrisi [27]. Kurkumin bebas menunjukkan sitotoksisitas yang terbatas karena ketidakterlarutan yang rendah. Sebaliknya, Cur-LPs secara signifikan menghambat pertumbuhan sel dalam cara yang bergantung pada pH: setelah 1 hari, keberlangsungan adalah 80 % (Cur-LP-2,5 & Cur-LP-5,0) versus 90 % (Cur-LP-7,4); setelah 3 hari, keberlangsungan turun menjadi 24 % (Cur-LP-2,5), 21 % (Cur-LP-5,0), dan 39 % (Cur-LP-7,4) (Gambar 6). Performa superior Cur-LP-2,5 sejalan dengan EE dan stabilitas yang lebih tinggi.

Kesimpulan

Modulasi keasaman internal liposom menawarkan strategi yang sederhana namun kuat untuk meningkatkan stabilitas kimia dan efikasi terapeutik obat sensitif pH, bahkan untuk molekul hidrofobik yang tinggal dalam lapisan lipid. Mikro-lingkungan asam yang diciptakan dalam Cur-LP-2,5 tidak hanya melindungi kurkumin dari degradasi serum tetapi juga meningkatkan aktivitas anti-kankernya pada sel HepG2. Pendekatan ini dapat dengan mudah diperluas ke terapeutik labile lainnya, yang potensialmente dapat meningkatkan performa klinisnya.