Penggunaan Kembali Obat
Menghambat Protease Utama SARS-CoV-2
Pengembangan obat baru adalah proses yang mahal dan panjang. Saat ini dunia sedang menghadapi pandemi, ada kebutuhan mendesak untuk mengidentifikasi dengan cepat obat yang menghentikan proliferasi virus. Penggunaan kembali obat menawarkan alternatif yang menarik untuk proses yang panjang ini dengan mencoba mengidentifikasi apakah obat yang diketahui aman pada manusia dapat digunakan untuk mengobati penyakit baru.
Sementara penggunaan obat yang diubah posisinya secara individual mungkin pada akhirnya tidak menghasilkan manfaat klinis yang signifikan, kombinasi obat yang hati-hati dengan target beberapa protein penting untuk replikasi dan proliferasi virus bisa sangat efektif, seperti halnya dengan HIV pada 1990-an. Pertanyaan mendesaknya adalah kombinasi mana yang lebih efektif?
Di sini kami mencoba memahami struktur situs aktif protease SARS-CoV-2, membandingkannya dengan struktur kompleks protease SARS-CoV yang ada dengan inhibitor mikro-molar, sehingga kami dapat lebih memahami interaksi kunci yang diperlukan untuk membuat inhibitor yang baik. untuk protease SARS-CoV-2.
Kami kemudian melakukan percobaan penyaringan virtual menggunakan perpustakaan obat yang disetujui FDA untuk melihat apakah beberapa di antaranya diprediksi akan berikatan dengan protease. Kami memeriksa bagaimana mereka diprediksi mengikat protease SARS-CoV-2 dan dengan demikian dapat digunakan dalam terapi kombinasi.
Protein SARS-CoV–2
Genom SARS-CoV-2 dari pasien yang sakit dengan cepat diisolasi dan diurutkan, memberikan urutan kemungkinan target protein. Protein ini memiliki kesamaan urutan tinggi dengan protein SARS-CoV dan pada awalnya kelompok penelitian mulai membangun model homologi. Sekarang kita melihat semakin banyak struktur yang diturunkan secara eksperimental ini (X-ray dan Cryo-EM) yang tersedia.
Salah satu target obat dengan karakterisasi terbaik di antara virus corona adalah protease utama:Mpro, juga disebut 3CL Protease.
1
Bersama dengan protease mirip papain, enzim ini penting untuk memproses poliprotein yang diterjemahkan dari RNA virus.
2
Ini memotong tulang punggung asam amino di 11 situs pembelahan pada poliprotein besar 1ab (Gbr. 1).
Menghambat aktivitas enzim ini akan memblokir replikasi virus. Karena tidak ada protease manusia dengan spesifisitas pembelahan yang sama yang diketahui, penghambat target ini jauh lebih kecil kemungkinannya untuk menjadi toksik dan menyebabkan efek samping.
Desain Obat Berbasis Struktur untuk Penggunaan Ulang Obat:Protease Utama
Protease utama ini adalah homodimer (Gbr. 2) dan setiap subunit berisi diad katalitik His41/Cys145.
SARS-CoV-2 memiliki identitas 96,1% dan kemiripan 99% dengan protease SARS-CoV. (Gbr. 3) Hanya ada satu perbedaan asam amino di situs aktif:residu 46 pada SARS-CoV-2 adalah Serine, bukan Alanine pada SARS-CoV.
Ada banyak struktur kompleks SARS-CoV Mpro dengan ligan yang tersedia di PDB dan ligan yang memiliki afinitas pengikatan molar mikro semuanya adalah ligan kovalen.
Situs aktif dari protease utama sangat terkonservasi di antara coronavirus dan biasanya terdiri dari empat situs (S1′, S1, S2 dan S4)
3
(Gbr. 4).
Dalam kasus struktur PDB 2ZU4 dan 2GX4 dimana ligan masing-masing memiliki nilai Ki 0,038 M dan 0,053 M, tiol sistein 145 di situs S1′ menghubungi inhibitor dengan ikatan kovalen. Jika dibandingkan dengan inhibitor lain dengan afinitas lebih rendah, ini tampaknya penting untuk afinitas yang lebih tinggi.
Pemeriksaan yang cermat tentang bagaimana semua ligan ini berinteraksi dengan protease ini dapat memberikan informasi tentang interaksi utama untuk dipantau saat menganalisis hasil docking.
Pemutaran Virtual
Memanfaatkan struktur kristal resolusi tinggi dari dimer protease SARS-COV-2 dalam kompleks dengan penghambat seperti peptida N3 yang terikat secara kovalen yang dirilis pada bulan Februari (6LU7)
4
, kami menggunakan struktur ini untuk melakukan percobaan penyaringan virtual. Inhibitor N3 yang terkristalisasi bersama mengikat di kantong pengikat substrat dalam konformasi yang diperpanjang. (Gbr. 5)
Kami mulai dengan perpustakaan yang berisi obat yang disetujui FDA dengan 2.684 senyawa. Kami mempertahankan senyawa dengan Berat Molekul lebih rendah dari 800 kDa dan melakukan docking dengan EMAS dari CCDC. Kemudian, kami menghitung Energi Bebas Pengikatan dengan pelarut implisit CHARMM dan GBMV. Untuk setiap pose, pertama-tama kami melakukan minimalisasi Ligan In Situ dengan diameter bola 14 untuk fleksibilitas residu, dan memperkirakan Entropi Ligan saat menghitung Energi Bebas Pengikatan. Sebagian besar senyawa yang ditambatkan dikenal sebagai obat protease HCV dan HIV. (Gbr. 6)
Banyak senyawa membuat kontak di 4 subsitus:S1, S’1, S2, S4 dan beberapa dengan HIS 41 dan CYS 145, terutama PI.
Senyawa dengan skor terbaik adalah Troxerutin, yang merupakan flavonoid.
- Flavonoid telah terbukti menghambat beberapa protease
5
dan baru-baru ini IC50 nilai dihitung dari kurva penghambatan tergantung dosis herbacetin, rhoifolin dan pektolinarin pada SARS-CoV. Nilai yang diukur masing-masing adalah 33,17, 27,45, dan 37,78 μM.
Dipyridamole (Gbr. 7), yang merupakan senyawa peringkat kelima, telah disebutkan baru-baru ini dalam pracetak Efek terapeutik dipyridamole pada pasien COVID-19 dengan disfungsi koagulasi, dan terbukti menekan replikasi HCoV-19 pada EC50 100 nM secara in vitro.
Gambar 7 :Render 3D dan peta interaksi 2D Dipyridamole dalam protease utama. Terdapat interaksi dengan residu Katalitik, dan dengan beberapa residu yang disebutkan sebelumnya untuk inhibitor SARS-CoV.
Sebuah pracetak baru-baru ini melaporkan pengujian seluler dari beberapa PI:“Nelfinavir menghambat replikasi coronavirus 2 in vitro .”
Kami melaporkan tabel dari pracetak (Tabel 1). Ini bukan IC50, tapi EC50, jadi tidak memberitahu seberapa baik molekul ini mengikat protease. Namun, ini menunjukkan bahwa semua senyawa tersebut menghambat replikasi SARS-CoV-2 dan beberapa lebih aktif daripada yang lain.
Ritonavir dan Lopinavir berinteraksi dengan banyak residu yang sebelumnya terlihat pada senyawa lain yang menargetkan protease SARS-CoV (Gbr. 8 dan 9). Meskipun beberapa uji klinis sedang berlangsung dengan kombinasi kedua molekul tersebut, sayangnya tidak ada data IC50 yang tersedia untuk Ritonavir atau Lopinavir pada SARS-CoV-2.
Gambar 8 :Pose dengan skor terbaik untuk Ritonavir:dan diagram interaksi 2D yang menunjukkan bahwa Ritonavir berinteraksi dengan dua residu katalitik:CYS145 dan HIS41, tetapi juga GLU166, PRO168 dan GLN189 seperti yang terlihat dengan penghambat SARS-CoV lainnya yang diketahui.
Gambar 9 :Pose dengan skor terbaik untuk Lopinavir:dan diagram interaksi 2D yang menunjukkan bahwa Lopinavir berinteraksi dengan dua residu katalitik:CYS145 dan HIS41, tetapi juga GLU166, PRO168 dan GLN189 seperti yang terlihat dengan penghambat SARS-CoV lainnya yang diketahui.
Nelfinavir (Gbr. 10) memiliki afinitas pengikatan yang diprediksi tinggi dalam perhitungan kami dan juga telah dicirikan terhadap COVID19 dalam pracetak baru-baru ini:“Nelfinavir aktif melawan SARS-CoV-2 dalam sel Vero E6.“
Cetakan kedua menunjukkan bahwa Atazanavir aktif pada sel yang terinfeksi SARS-CoV-2:“Atazanavir menghambat replikasi SARS-CoV-2 dan produksi sitokin pro-inflamasi.”
Struktur PDB 6W63 yang berisi inhibitor baru untuk SARS-CoV-2 diterbitkan setelah kami memulai pekerjaan ini (Gbr. 11). Tidak ada informasi yang dipublikasikan tentang afinitas pengikatan senyawa ini ke Mpro SARS-CoV-2. Rantai samping di situs pengikatan hampir dalam orientasi yang sama seperti untuk 6LU7. Kami memasang kembali senyawa kami dan mencetak ulang dengan pendekatan MMGBSA seperti sebelumnya dan menemukan hasil yang sangat mirip.
Gambar 11 :struktur PDB 6W63:protease utama SARS-CoV-2 dalam kompleks dengan inhibitor X77.
Perspektif
Situs pengikatan protease SARS-CoV-2 sangat besar, mengandung empat subsitus, dan dapat menampung banyak ligan berbeda dengan afinitas pengikatan sedang. Seperti yang dijelaskan di sini, penyaringan virtual adalah alat yang berguna untuk mengidentifikasi kemungkinan penghambat dan mampu memberi kita beberapa penjelasan struktural tentang bagaimana kemungkinan penghambat berinteraksi dengan protease.
Namun, semua hipotesis ini memerlukan konfirmasi dengan bukti eksperimental, seperti pengukuran IC50, untuk membangun model yang lebih kuat.
Di sini kami belum melakukan docking kovalen, tetapi karena senyawa paling aktif terhadap protease SARS-CoV adalah kovalen, ini mungkin merupakan persyaratan inhibitor kuat. Inhibitor kovalen juga menunjukkan keunggulan dibandingkan inhibitor reversibel seperti memiliki afinitas target yang kuat dan masa kerja yang lebih lama pada pasien.
Agar obat aktif pada pasien, kita perlu mempertimbangkan aspek farmakologis lainnya seperti farmakokinetik. Penting untuk mengevaluasi kemampuan obat ini untuk mencapai target plasma dan konsentrasi paru-paru setelah dosis yang disetujui pada manusia.
Itu tidak dalam lingkup pekerjaan ini untuk mengomentari penelitian desain berbasis struktur lainnya, karena ini tidak akan tepat waktu untuk epidemi saat ini. Tujuan kami adalah untuk menilai terapi yang siap digunakan untuk calon obat potensial melawan COVID19.
Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Pusat Data Kristalografi Cambridge (CCDC) atas izin menggunakan GOLD untuk penyaringan virtual dalam pekerjaan ini. GOLD telah terbukti sukses dalam penyaringan virtual, pengoptimalan timbal, dan mengidentifikasi mode pengikatan molekul aktif yang benar. Antarmuka ke GOLD tersedia dalam Discovery Studio.
