Agen Theranostik Generasi Selanjutnya Berdasarkan Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Nanocrystals Semikonduktor:Pengembangan dan Karakterisasi Fungsional
Abstrak
Pembuatan mikrokapsul polielektrolit dan penggunaannya sebagai pembawa obat, label fluoresen, dan nanopartikel logam adalah pendekatan yang menjanjikan untuk merancang agen teranostik. Titik kuantum semikonduktor (QDs) dicirikan oleh kecerahan dan stabilitas foto yang sangat tinggi yang menjadikannya label fluoresen yang menarik untuk visualisasi penetrasi intraseluler dan pengiriman mikrokapsul tersebut. Di sini, kami menjelaskan pendekatan untuk merancang, membuat, dan mengkarakterisasi sifat fisiko-kimia dan fungsional mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan dengan larut-air dan distabilkan dengan tiga-fungsional turunan polietilen glikol inti/kulit QD. Mikrokapsul yang dikembangkan dicirikan oleh hamburan cahaya dinamis, mobilitas elektroforesis, pemindaian mikroskop elektronik, dan pendekatan mikroskop fluoresensi dan confocal, memberikan data yang tepat tentang distribusi ukuran, muatan permukaan, morfologi, dan karakteristik optiknya. Masa hidup fluoresensi dari mikrokapsul yang disandikan QD juga diukur, dan ketergantungannya pada waktu setelah persiapan mikrokapsul dievaluasi. Kandungan optimal QD yang digunakan untuk prosedur pengkodean yang memberikan sifat fluoresensi optimal dari mikrokapsul yang disandikan telah ditentukan. Akhirnya, serapan mikrokapsul intraseluler oleh makrofag murine ditunjukkan, sehingga menegaskan kemungkinan penggunaan yang efisien dari sistem yang dikembangkan untuk pencitraan sel hidup dan visualisasi transportasi mikrokapsul dan pengiriman dalam sel hidup.
Latar Belakang
Penggunaan mikrokapsul polielektrolit sebagai kendaraan untuk pengiriman yang ditargetkan dan pelepasan obat dan agen kontras yang terkontrol dan sebagai probe fluoresen untuk pencitraan in vitro dan in vivo adalah jalur penelitian yang menjanjikan dalam kedokteran translasi dan pendekatan yang dipersonalisasi untuk diagnosis dan pengobatan berbagai penyakit manusia. 1,2,3,4].
Pengembangan agen teranostik yang menggabungkan fungsi obat dan alat untuk pencitraan biomarker yang memungkinkan diagnosis dini berbagai penyakit merupakan tugas penting di bidang perancangan sistem penghantaran obat [5, 6]. Sistem berbasis mikrokapsul polielektrolit merupakan kandidat yang menjanjikan untuk menggabungkan kedua fungsi tersebut. Kondisi fabrikasi mereka memungkinkan penggabungan zat aktif biologis, nanopartikel logam, label fluorescent, dll ke dalam mikrokapsul [7,8,9]. File tambahan 1:Gambar S1 secara skematis menunjukkan agen theranostik tipikal berdasarkan mikrokapsul polielektrolit.
Salah satu metode yang efektif untuk mendapatkan mikrokapsul polielektrolit terdiri dari aplikasi berturut-turut lapisan polimer bermuatan berlawanan ke substrat berbentuk bola atau lainnya, yang dihilangkan setelah itu [10, 11]. Interaksi antara polikation dan polianion yang bermuatan berlawanan pada pH tertentu, kekuatan ionik, dan suhu larutan dan polaritas pelarut menghasilkan kompleks interpolimer berupa membran atau cangkang yang melapisi substrat [12,13,14].
Faktor-faktor yang tercantum di atas juga mempengaruhi morfologi mikrokapsul yang dihasilkan, termasuk porositas dan bentuknya serta integritas dindingnya. Misalnya, peningkatan kekuatan ionik atau pH lingkungan mikrokapsul polielektrolit memfasilitasi perubahan konformasi atau protonasi/deprotonasi polielektrolit yang membentuk dinding kapsul. Ini, pada gilirannya, menyebabkan deformasi dan peningkatan porositas bahkan sampai pada tingkat hilangnya integritas struktural dan transisi ke keadaan "terbuka" diikuti dengan pelepasan isi bagian dalam kapsul dan komponen yang tertanam di dindingnya ke dalam. lingkungan mikro [15, 16]. Sifat-sifat ini membuat mikrokapsul polielektrolit kandidat yang baik untuk peran sistem pengiriman sensitif stimulus dan dasar yang menjanjikan untuk merancang agen teranostik [2, 17, 18].
Titik kuantum (QDs) adalah nanocrystals semikonduktor fluoresen berdiameter 2–10 nm yang dicirikan oleh spektrum penyerapan yang lebar dan spektrum fluoresensi yang sempit dan simetris. Hal ini memungkinkan QDs dengan maxima fluoresensi yang berbeda untuk menjadi bersemangat dari sumber radiasi tunggal, menawarkan kemungkinan penggunaan luas mereka sebagai fluorophores, terutama untuk pencitraan multipleks [19, 20]. Fotostabilitas tinggi dan fluoresensi cerah QD menentukan keunggulannya dibandingkan fluorofor organik standar dalam aplikasi deteksi [21,22,23,24].
Studi yang diterbitkan sebelumnya dikhususkan untuk pengembangan mikrokapsul polielektrolit polielektrolit fluoresen menunjukkan satu pendekatan khas untuk pewarna fluoresen organik klasik atau in situ membentuk titik-titik karbon di bawah karbonisasi hidrotermal dan konversi dekstran menjadi nanopartikel karbon luminescent menjadi jebakan cangkang polielektrolit dalam struktur polimer mikrokapsul polielektrolit yang disiapkan utama . Pendekatan jebakan zat warna organik didasarkan pada difusi fluorescein isothiocyanate atau rhodamin B, zat warna tetramethylrhodamine yang terkonjugasi dengan dekstrane dengan berat molekul rendah atau bovine serum albumin (BSA) ke dalam struktur berpori membran yang dibentuk oleh polielektrolit yang menghasilkan pengisian zat warna fluoresen. dari keseluruhan struktur mikrokapsul polielektrolit seperti pada rongga interior dan seperti pada membran polimer. Perlunya perlakuan termal yang tinggi dalam kasus mikrokapsul berkode titik karbon mengubah fleksibilitas struktur mikrokapsul dan membuatnya lebih kaku yang tidak diinginkan dalam kasus pH dan pengembangan sistem teranostik yang responsif terhadap rangsangan kekuatan ionik [25,26,27, 28,29,30].
Dalam penelitian ini, kami menjelaskan semua aspek teknologi fabrikasi mikrokapsul polimer yang dikodekan dengan QD yang larut dalam air yang sangat berfluoresensi, memiliki stabilitas koloid yang signifikan, menggambarkan sifat fisiko-kimia dan fungsionalnya dan menunjukkan aplikasinya pada pencitraan sel hidup dan visualisasi mikrokapsul transportasi dan pengiriman dalam sel-sel hidup. Data dapat membuka jalan ke langkah berikutnya untuk pengembangan generasi berikutnya dari agen theranostic berdasarkan mikrokapsul fungsional multifungsi.
Eksperimental
Pelarutan dan Karakterisasi Titik Kuantum
QD inti/kulit CdSe/ZnS dengan fluoresensi maksimum maks setara dengan 590 nm disediakan oleh Dr. Pavel Samokhvalov (Laboratorium Nano-Bioengineering, National Research Nuclear University MEPhI (Moscow Engineering Physics Institute), Moskow, Rusia).
QD yang baru disintesis dilapisi dengan trioctylphosphine oxide (TOPO) dan tidak larut dalam air. Transfer mereka ke fase air dilakukan dengan mengganti d,l-sistein untuk TOPO dan kemudian menggantikan d,l-sistein dengan 12- unit turunan PEG yang mengandung gugus akhir tiol dan karboksil HS−(PEG)12 COOH (Thermo Fisher Scientific, USA) seperti yang dijelaskan sebelumnya [22, 31, 32]. Untuk tujuan ini, sampel QD dilarutkan dalam 800 l kloroform, setelah itu 1200 l metanol ditambahkan, dan campuran disentrifugasi selama 5 menit. Prosedur itu diulang tiga kali. Kemudian, pelet QD disuspensikan kembali dalam 800 l kloroform. Larutan d,l-sistein dalam metanol ditambahkan ke suspensi dengan rasio berat QD terhadap d,l-sistein 1:0,13, dan campuran disentrifugasi pada 16,873g selama 10 menit (Centrifuge 5418, Eppendorf, AS). Pelet QD dicuci dari kelebihan d,l-sistein dengan metanol dengan cara sentrifugasi selama 3 menit pada kecepatan yang sama. Pelet QD dikeringkan dalam konsentrator sentrifugal Concentrator Plus (Eppendorf, USA) selama 2 menit. QD kering disuspensikan dalam 650 l natrium hidroksida 0,1 M dan disonikasi selama 10 menit dalam rendaman ultrasound Elma Sonic P30H (Elma Schmidbauer, Jerman). Kemudian, larutan tersebut disentrifugasi pada 5509g selama 10 menit, dan supernatan disaring melalui filter Millipore dengan ukuran pori 0,22 m (Merck, Jerman). Kandungan QD sampel ditentukan secara spektrofotometri pada panjang gelombang puncak serapan eksiton pertama.
Sampel QD larut dalam air yang diperoleh distabilkan dengan menambahkan HS−(PEG)12 COOH pada rasio molar derivatif QD terhadap PEG 1:4,6 dan menginkubasi campuran pada 2–8 °C selama 24-48 jam.
Sintesis Mikropartikel Kalsium Karbonat
Mikropartikel kalsium karbonat diperoleh seperti yang dijelaskan di tempat lain [33, 34]. Lima belas ml 0,33 M Na2 CO3 (Sigma-Aldrich, Jerman) solusi ditambahkan ke 15 ml 0,33 M аСl2 (Sigma-Aldrich, Jerman) larutan sambil diaduk. Campuran reaksi diaduk dengan kecepatan 250, 500, dan 750 rpm pada pengaduk magnet RCT Basic (IKA, Jerman) pada suhu kamar selama 15 hingga 60 detik. аСl2 dan Na2 CO3 larutan sebelumnya disaring melalui filter dengan ukuran pori 0,22 μm.
Setelah itu, pengadukan dihentikan, dan campuran reaksi diinkubasi selama 10 menit. Campuran dicuci dengan air MilliQ dengan cara disuspensikan kembali secara bergantian dan disentrifugasi pada 452g selama 5 menit menggunakan Centrifuge 5810 (Eppendorf, USA). Mikropartikel yang diperoleh dicuci empat kali. Setelah pencucian terakhir, pelet dikeringkan dalam oven pada suhu 60°C selama 90 menit.
Persiapan Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Titik Kuantum
Mikropartikel dikodekan dengan QD menggunakan teknik modifikasi deposisi lapis demi lapis dari polimer bermuatan berlawanan [31, 35] dan QD yang larut dalam air karboksilasi ke mikropartikel kalsium karbonat yang disiapkan, yang berfungsi sebagai matriks. Lapisan polielektrolit terdiri dari pasangan polimer:polikation poli(allylamina hidroklorida) (PAH) dengan Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, USA) dan polianion poli(natrium 4-stirenasulfonat) (PSS) dengan Mw ≈ 70.000 Da ( Sigma-Aldrich, AS).
Lapisan diterapkan dalam urutan berikut:аСО3 /PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/QD-S-(PEG)12 -COOH/PAH/PSS/PAH/PSS/PAH/PSS.
Sampel mikropartikel kering disuspensikan kembali dalam 0,5 ml air MilliQ dan disonikasi dalam penangas ultrasonik selama 10 menit. Alikuot 0,5 ml larutan PAH 2 mg/ml dalam 0,5 M NaCl ditambahkan ke suspensi yang mengandung 3,7 × 10
8
mikropartikel kalsium karbonat dalam air MilliQ. Suspensi disonikasi dalam penangas ultrasonik selama 60 detik dan kemudian diinkubasi selama 20 menit sambil diaduk. Setelah itu, suspensi mikropartikel dicuci dari kelebihan polimer dengan sentrifugasi pada 1054g selama 5 menit diikuti dengan resuspensi dalam air MilliQ. Pencucian mikropartikel kalsium karbonat setelah pelapisan polikation diulang tiga kali. Untuk aplikasi lapisan (polianion) berikutnya, mikropartikel sebelumnya disuspensikan kembali dalam 0,5 ml air MilliQ; suspensi dicampur dengan 0,5 ml larutan PSS 2 mg/ml dalam 0,5 M NaCl, disonikasi dalam penangas ultrasonik selama 60 detik, diinkubasi selama 20 menit sambil diaduk, lalu dicuci dari kelebihan polimer seperti dijelaskan di atas.
Lima lapisan polielektrolit, lapisan luar yang terdiri dari PAH, diaplikasikan ke partikel kalsium karbonat sebelum dikodekan. Dari 0,10 hingga 2,24 mg QD ditambahkan ke suspensi mikropartikel. Campuran diinkubasi selama 80 menit sambil diaduk dan kemudian dicuci tiga kali dengan sentrifugasi seperti dijelaskan di atas. Setelah itu, lapisan berturut-turut dari polimer bermuatan berlawanan diterapkan. Mikropartikel yang disandikan disimpan pada + 4 °C dalam gelap.
Untuk mendapatkan mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD, inti kalsium karbonat dihilangkan dari mikropartikel. Untuk tujuan ini, setelah sentrifugasi, pelet mikropartikel yang disandikan QD disuspensikan kembali dalam 2 ml 0,2 M disodium ethylenediaminetetraacetate (EDTA) (pH 6,5), dan suspensi diinkubasi selama 15 menit. Untuk menjamin pembubaran inti kalsium karbonat, kami mengulangi prosedur ini dua kali lagi, setiap kali mengganti larutan dengan alikuot baru 0,2 M EDTA (pH 6,5) setelah 5 menit sentrifugasi sampel pada 2152g . Kemudian, suspensi mikrokapsul yang disandikan QD dicuci dari kelebihan EDTA empat kali dengan disuspensikan kembali dalam air MilliQ dan disentrifugasi di bawah kondisi yang ditentukan di atas. Mikrokapsul polielektrolit yang dihasilkan disimpan pada + 4 °C dalam gelap.
Saat mempelajari interaksi mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD dengan sel, kami memodifikasi permukaan mikrokapsul dengan BSA (fraksi kejut panas, bebas protease, endotoksin rendah, cocok untuk kultur sel, pH 7, 98%; Sigma-Aldrich, USA) . Secara singkat, mikropartikel yang dikodekan dengan lapisan atas polikation juga dilapisi dengan asam poliakrilat polianion (PAA) dengan Mw ≈ 15.000 Da (Sigma-Aldrich, USA), dan inti dihilangkan seperti dijelaskan di atas. Setelah pencucian terakhir, mikrokapsul didispersikan dalam larutan dapar fosfat 50 mM (pH 7,4) yang mengandung 1% BSA dan diinkubasi pada + 4°C dalam gelap. Sebelum digunakan, mikrokapsul dicuci dari kelebihan BSA dengan larutan buffer fosfat 50 mM (pH 7.4).
Karakterisasi Titik Kuantum, Mikropartikel, dan Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Titik Kuantum
Studi Ukuran dan Biaya
Diameter hidrodinamik dari QD yang dilarutkan, mikropartikel yang dikodekan QD yang dilapisi dengan cangkang polimer, dan mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan QD ditentukan dengan metode hamburan cahaya dinamis; muatan permukaan diperkirakan dari mobilitas elektroforesisnya menggunakan efek Doppler melalui Zetasizer NanoZS (Malvern, UK).
Analisis Fluoresensi
Masa hidup fluoresensi (kinetik peluruhan fluoresen) dari QD yang dilarutkan, mikropartikel yang dikodekan QD yang dilapisi dengan cangkang polimer, dan mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan QD diukur pada panjang gelombang maksimum fluoresensi. Harmonik kedua dari YAG:Nd
3+
laser dengan panjang pulsa 350 ps dan laju pulsa 50 Hz digunakan sebagai sumber eksitasi. Sinyal dideteksi oleh detektor photomultiplier yang terhubung dengan osilografi DPO 3054 (Tektronix, USA) dengan resolusi waktu 2 ns. Suspensi mikropartikel dan mikrokapsul yang dikodekan QD diaduk secara permanen selama pengukuran dengan menggunakan pengaduk magnet eko MIXcontrol (2mag, Jerman) untuk mencegah sedimentasi sampel.
Estimasi Efisiensi Pengkodean
Efisiensi pengkodean diperkirakan dari kandungan QD supernatan setelah aplikasi (adsorpsi) QD ke permukaan mikropartikel. Jumlah QD yang teradsorpsi pada permukaan mikropartikel (\( {Q}_{{\mathrm{QD}}_{\mathrm{abs}}} \)) dihitung sebagai
di mana \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_0} \) adalah jumlah awal QD dalam alikuot yang digunakan untuk encoding, dan \( {Q}_{{\mathrm{QD}}_i} \ ) adalah jumlah QD dalam supernatan i sampel.
Kandungan QD sampel ditentukan secara spektrofotometri menggunakan pembaca pelat multimode 200 PRO Tak Terbatas (Tecan, Swiss).
Memindai Mikroskop Elektron
Mikrofotograf elektron dari mikropartikel kalsium karbonat diperoleh dengan menggunakan mikroskop elektron pemindaian JSM-7001F (JEOL, Jepang) yang dilengkapi dengan katoda Schottky. Serbuk mikropartikel kering diaplikasikan pada pita perekat karbon konduktif dan dipindai pada rata-rata 50, arus pancaran 20 pA, dan tegangan percepatan 15–30 kV.
Untuk mendapatkan mikrofotograf dari mikropartikel yang dilapisi dengan lapisan polielektrolit, setetes suspensi mikropartikel encer yang mengandung ~ 10
6
mikropartikel per 0,5 ml ditempatkan ke substrat silikon yang telah dimurnikan sebelumnya dan dikeringkan pada suhu kamar. Sampel yang dihasilkan dipindai pada rata-rata 50, arus pancaran 20 pA, dan tegangan percepatan 3–30 kV.
Fluoresensi dan Mikroskop Confocal
Morfologi dan distribusi ukuran mikropartikel yang dikodekan QD dianalisis dengan menggunakan mikroskop fluoresensi menggunakan mikroskop Carl Zeiss Axio Scope A1 (Carl Zeiss, Jerman) yang dilengkapi dengan filter emisi fluoresensi Texas Red; 20% larutan gliserol digunakan sebagai media pemasangan slide.
Sampel mikrokapsul yang dikodekan QD juga dipelajari menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Jerman) yang dilengkapi dengan laser untuk eksitasi 405, 458, 476, 488, 496, 514, 561, dan 633 nm dan Leica LAS Perangkat lunak AF versi 2.7.3.9723. Analisis dilakukan pada panjang gelombang eksitasi 488 nm dan kumpulan filter yang mencakup rentang emisi pada 555–620 nm menggunakan objektif Leica HCX PL APO CS 63×/1.20 CORR WATER. Dua puluh persen larutan gliserol dalam buffer PBS pH 7,4 digunakan sebagai media pemasangan slide. Software Image J 1.51 s (AS) digunakan untuk analisis dan pemrosesan gambar.
Penerapan Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Titik Kuantum oleh Sel Hidup in Vitro
Garis sel makrofag alveolar tikus yang diabadikan MH-S (ATCC, USA) dipertahankan dalam media RPMI yang dilengkapi dengan 10% FCS, 0,05 mM 2-mercaptoethanol dan 2,06 mM glutamin dalam atmosfer yang dilembabkan pada 5% CO2 dan 37 °C. Sel MH-S dikultur hingga 3×10
6
sel dalam piringan 35 mm dan 1,2×10
6
mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD yang dilapisi dengan BSA ditambahkan ke setiap -piring. Sel-sel diinkubasi lebih lanjut pada 37 °C dan 5% CO2 masing-masing selama 4 dan 24 jam. Kemudian, inti sel diwarnai menggunakan probe fluoresen DRAQ5 (panjang gelombang ex/em 646/697 nm, ThermoFisher, USA) selama 30 menit dan setelah itu sampel sel dicuci dan dianalisis menggunakan mikroskop pemindaian laser confocal Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Jerman ). Gambar serapan seluler dari mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD diperoleh menggunakan HCX PL APO CS 63.0 × 1.30 GLYC/OIL, HCX PL APO lambda blue 40,0 × 1,25 OIL. Fluoresensi QD tereksitasi pada 488 nm dan emisi dikumpulkan pada 555–620 nm, sedangkan fluoresensi inti sel yang diimbangi dengan DRAQ5 tereksitasi pada 633 nm dan emisi dikumpulkan pada 650–750 nm.
Analisis Statistik
Analisis statistik dilakukan dengan menggunakan software MS Office Excel 2007 dan Origin Pro 2015. Semua data ditampilkan sebagai rata-rata dan simpangan baku menggunakan hasil dari minimal tiga percobaan independen.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi Mikropartikel Kalsium Karbonat
Penggunaan kristal anorganik bulat, khususnya mikrosferolit kalsium karbonat, sebagai substrat ditentukan oleh biokompatibilitasnya, serta kemungkinan penghilangannya selama pembentukan mikrokapsul polielektrolit tanpa menggunakan pelarut yang agresif untuk sistem kehidupan. Mikropartikel kalsium karbonat per se juga dapat digunakan sebagai sistem penghantaran obat dengan pelepasan yang dimodifikasi atau pelepasan yang berkepanjangan, berfungsi sebagai matriks untuk memuat obat dan mengendalikan pelepasannya ke dalam lingkungan mikro, yaitu, mereka memiliki banyak kegunaan potensial dalam sistem penghantaran [36,37 ,38,39,40,41,42,43,44,45,46].
Faktor kunci yang menentukan ukuran dan bentuk mikrokristal adalah kecepatan dan durasi pengadukan serta waktu inkubasi campuran reaksi [33, 41]. Kami telah secara eksperimental menentukan kondisi untuk memperoleh mikrosferolit kalsium karbonat dengan distribusi ukuran yang optimal. CaCO tunggal3 mikropartikel telah ditemukan memiliki bentuk bulat yang hampir teratur. File tambahan 1:Gambar S2 menunjukkan distribusi ukuran mikropartikel kalsium karbonat yang diperoleh pada kecepatan pengadukan yang berbeda. Seperti yang terlihat dari data ini, heterogenitas ukuran partikel meningkat dengan meningkatnya laju pengadukan. Jika kecepatan pengadukan adalah 250 rpm, ukuran partikel yang diperoleh berkisar antara 4,0 hingga 6,0 μm. Dalam hal ini, semua mikropartikel dalam sampel terpisah, dan distribusi ukurannya mendekati normal (File tambahan 1:Gambar S2a). Namun, jika campuran diaduk pada 500 rpm, kami mengamati partikel dengan bentuk tidak beraturan yang merupakan agregasi partikel yang lebih kecil, ukuran rata-rata masing-masing partikel bervariasi dari 2,7 hingga 5,6 m (File tambahan 1:Gambar S2b). Pada kecepatan pengadukan 750 rpm, hamburan ukuran partikel meningkat. Sampel ini juga berisi agregasi berbentuk tidak beraturan, dengan ukuran rata-rata masing-masing mikropartikel berkisar antara 3,8 hingga 5,7 μm (File tambahan 1:Gambar S2c).
Dengan demikian, pengadukan campuran reaksi pada kecepatan 250 rpm memungkinkan untuk memperoleh partikel dengan distribusi ukuran yang optimal dan bentuk yang hampir teratur serta mencegah agregasi partikel. Oleh karena itu, kami memperkirakan pengaruh durasi pengadukan pada distribusi ukuran partikel mikro pada laju pengadukan ini (File tambahan 1:Gambar S3). Pengadukan campuran reaksi selama 15 detik menghasilkan peningkatan jumlah partikel yang lebih besar dibandingkan dengan pengadukan 30 detik. Peningkatan durasi pengadukan hingga 60 detik memiliki efek yang serupa. Artinya, durasi pengadukan tidak mencukupi dalam kasus sebelumnya (File tambahan 1:Gambar S3a) dan berlebihan dalam kasus terakhir (File tambahan 1:Gambar S3c). Oleh karena itu, kami menganggap kecepatan 250 rpm dan durasi 30 dtk sebagai kondisi pengadukan yang optimal.
Menurut data scanning electron microscopy (SEM), permukaan mikropartikel kalsium karbonat adalah heterogen, ditandai dengan porositas (Gbr. 1a). Pada perbesaran × 40.000, dapat dilihat bahwa mikropartikel, pada gilirannya, dibentuk oleh partikel submikrometer yang lebih kecil (Gbr. 1b). Dengan demikian, mikropartikel yang diperoleh memiliki struktur berpori dan mewakili matriks yang tidak hanya cocok sebagai substrat, tetapi juga dapat digunakan sebagai sistem pengiriman dan karena struktur permukaannya yang khusus dapat dengan mudah digunakan sebagai matriks untuk lapisan demi lapisan. deposisi polimer.
Memindai mikrofotograf elektron dari mikropartikel kalsium karbonat (a ) dan permukaannya pada perbesaran yang lebih tinggi (b )
Preparasi dan Karakterisasi Mikrokapsul Polielektrolit yang Dikodekan dengan Titik Kuantum
QD yang larut dalam air yang disiapkan dicirikan oleh spektrum penyerapan yang luas dan spektrum fluoresensi yang sempit dengan emisi maksimum 590 nm (Gbr. 2). Diameter hidrodinamik sampel QD ini berkisar antara 23,96 hingga 28,2 nm. File tambahan 1:Gambar S4 menunjukkan distribusi ukuran QD yang distabilkan dengan HS−(PEG)12 COOH. Modifikasi permukaan QD dengan HS−(PEG)12 COOH memastikan stabilitas QD dalam fase air, serta muatan negatif permukaan yang cukup untuk adsorpsi efektif QD antara lapisan polielektrolit bermuatan positif selama prosedur pengkodean [22, 47].
Karakteristik optik titik kuantum inti/cangkang CdSe/ZnS yang dilarutkan dengan HS−(PEG)12 Ligan COOH
Nilai muatan permukaan terukur dari sampel mikropartikel kalsium karbonat selama setiap langkah pengendapan lapisan polielektrolit dan QD (Tabel 1) menegaskan bahwa muatan permukaan matriks asli, QD terlarut, serta pengisian permukaan setelah setiap deposisi polimer cukup untuk penyerapan efektif setiap lapisan berikutnya.
Muatan permukaan intrinsik dan struktur permukaan berpori dari mikropartikel kalsium karbonat sintetis memungkinkan mereka untuk digunakan sebagai matriks untuk polielektrolit bermuatan berlawanan dan deposisi QD (Gbr. 3). Penerapan polimer PAH dan PSS dalam mikrokapsul polimer polielektrolit yang dikodekan QD ditentukan oleh biokompatibilitas dan non-toksisitasnya dan juga non-biodegradabilitas yang juga membantu mempertahankan QD di dalam cangkang. Biodegradabilitas dari poli-l-arginin, poli-l-lisin, kitosan, garam natrium asam alginat, dan dekstran sulfat yang juga banyak digunakan dalam pembentukan mikrokapsul polielektrolit akan menginduksi difusi QD keluar dari membran polimer yang seharusnya mengakibatkan penurunan dari sifat fluoresen mikropartikel [3, 11, 39, 48,49,50,51,52]. Polikation PAH dan polianion PSS yang digunakan dalam penelitian ini masing-masing mengandung gugus amina dan sulfat yang memastikan interaksi elektrostatik antara lapisan polimer, yang menghasilkan pembentukan kompleks interpolimer [16, 25, 36, 37]. Pilihan lapisan polimer pertama ditentukan oleh nilai muatan permukaan mikropartikel kalsium karbonat yang disintesis.
Prosedur persiapan untuk mikrokapsul yang dikodekan dengan titik-titik kuantum:pembentukan lapisan polikation (1) dan polianion (2), polielektrolit PAH dan PSS, masing-masing, pada permukaan matriks; pengkodean mikropartikel yang dihasilkan dengan titik-titik kuantum dan deposisi polimer lapis demi lapis lebih lanjut (3); penghapusan inti kalsium karbonat (4)
Gambar 4 menunjukkan gambar SEM dari tahapan pembentukan cangkang polimer pada permukaan substrat. Seperti yang terlihat pada mikrofotografi, mikropartikel mengandung inti butir kalsium karbonat dan cangkang, yang menjadi lebih jelas dengan bertambahnya jumlah lapisan polimer yang teradsorpsi. Permukaan mikropartikel yang dilapisi dengan lapisan polielektrolit mengikuti bentuk substrat dengan karakteristik homogenitasnya, yang menunjukkan bahwa ia juga berpori (Gbr. 4a, b) [44]. Saat cangkang polimer menjadi lebih tebal, permukaan mikropartikel menjadi lebih rata dan halus (Gbr. 4c, d).
Memindai gambar mikroskop elektron dari mikropartikel kalsium karbonat setelah aplikasi empat (a , b ) dan sepuluh (c , d ) lapisan polielektrolit
Langkah terakhir dari preparasi mikrokapsul polielektrolit yang disandikan QD meliputi penghilangan inti kalsium karbonat dan pembentukan struktur akhir mikrokapsul. Untuk melarutkan matriks yang terdiri dari butiran kalsium karbonat, mikropartikel dicuci dengan EDTA. EDTA digunakan terutama karena membentuk kompleks yang larut dalam air pada interaksi dengan garam logam divalen, termasuk kalsium, dan berat molekulnya yang rendah memastikan permeabilitas cangkang polielektrolit untuk EDTA dan kompleksasinya dengan Ca
2+
. Hal ini menyebabkan pembubaran inti partikel polielektrolit dan pembentukan struktur berongga [45, 46].
Mikropartikel yang dikodekan QD dan mikrokapsul polielektrolit yang diperoleh dalam penelitian kami memiliki bentuk sferis atau hampir sferis dan ukuran dari 3,8 hingga 6,5 m (Gbr. 5). Analisis morfologi dan struktur mikropartikel dan mikrokapsul dalam mode fluoresen menunjukkan rongga di dalam mikrokapsul polielektrolit, sebagaimana dibuktikan oleh transparansi yang lebih tinggi dibandingkan dengan mikropartikel (Gbr. 5b). Hal ini menunjukkan bahwa prosedur pelarutan inti dengan EDTA efektif. Data mikroskop confocal juga menunjukkan struktur berongga dari mikrokapsul polielektrolit fluoresen yang diperoleh (Gbr. 6). Mikrokapsul ini dapat dibedakan sebagai partikel tunggal (Gbr. 6a, b) yang dapat dicirikan sebagai partikel sferis dengan permukaan kasar karena modifikasi permukaannya dengan pelapisan BSA.
Gambar mikroskop fluoresensi mikropartikel kalsium karbonat dilapisi dengan polielektrolit dan dikodekan dengan titik kuantum (a ) dan mikrokapsul polielektrolit yang diperoleh darinya (b )
Gambar mikroskop confocal dari mikrokapsul polielektrolit yang dikodekan dengan titik-titik kuantum dan dilapisi oleh BSA:penampang mikrokapsul (a ); Proyeksi 3D mikrokapsul polielektrolit tunggal (b )
Estimasi Efisiensi Pengkodean
Efisiensi pengkodean diperkirakan dengan jumlah QD yang teradsorpsi pada permukaan polimer bermuatan positif dari mikropartikel. Estimasi jumlah QDs dalam larutan asli yang digunakan untuk pengkodean mikropartikel dan dalam supernatan sebelum dan sesudah inkubasi mikropartikel dengan larutan QD menunjukkan bahwa jumlah QD yang terikat pada permukaan mikropartikel meningkat secara linier dengan meningkatnya kandungan QD dalam campuran reaksi dari 0,36 hingga 2,241 mg (Gbr. 7a). Peningkatan lebih lanjut dalam jumlah QD dalam larutan menyebabkan penurunan jumlah QD yang teradsorpsi. This may have resulted from an insufficient density of the positive charge determined by amine groups of PAH on the microparticle surface because of an excessive amount of QDs and the resultant saturation of the surface with them. Apparently, the QDs were adsorbed more efficiently if their amount was smaller than 2.241 mg owing to sterically favorable conditions and less interference with one another’s attachment. The pattern of the dependence of the encoding efficiency on the QD content of the solution used for the encoding agrees with our earlier data [22].
Estimation of the efficiency of encoding of microparticles with different amounts of quantum dots (a ) and their fluorescence characteristics (b ). Asterisk indicates significant difference of QD-encoded microbeads from the QD-encoded microcapsules (p < 0.05)
Estimation of the optical characteristics of the obtained polyelectrolyte microcapsules is an essential stage of the assessment of encoding efficiency. Its results show how suitable the given technique is for fabrication of imaging agents based on QD-encoded polyelectrolyte microcapsules.
Figure 7b shows the fluorescence intensities of the microparticles and microcapsules measured as the mean normalized intensity of gray color as dependent on the amount of QDs used for encoding them. As seen from the figure, the fluorescence intensity of the encoded microparticles was higher than that of the microcapsules obtained from them. At the same time, the microcapsules encoded with different amounts of QDs did not differ significantly from one another in fluorescence intensity (p > 0.05). Despite some decrease in the fluorescence intensity of the microcapsules, their encoding with the amount of QDs indicated above ensures a contrast sufficient for effective imaging.
Quantum Dot Fluorescence Lifetime within Encoded Polyelectrolyte Microcapsules
As noted above, the fluorescence intensity of the polyelectrolyte microcapsules was decreased compared to the microparticles used for their fabrication and encoded with the same QDs. Therefore, we have estimated the fluorescence lifetimes of both the original QDs and the same QDs embedded in the microparticles or the polymeric walls of the microcapsules.
The QD fluorescence kinetic curves (Fig. 8) are characterized by monoexponential dependence of fluorescent intensity on time according to the following equation:
$$ I(t)={A}_1\bullet {e}^{-x/{t}_1}, $$
Fluorescence lifetimes of the solubilized CdSe/ZnS quantum dots with a fluorescence peak at 590 nm incorporated in the fabricated microparticles and microcapsules
dimana Aku (t ) is the intensity of QD fluorescence in response to excitation pulses and A1 , х , and t1 are parameters describing the change in the intensity with time.
We determined the fluorescence lifetime for each sample (Table 2). The original solubilized QDs had the longest fluorescence lifetime; it was decreased after the QDs were adsorbed onto the microparticles and incorporated into the structure of the polymer shell. This may have resulted from interaction between the QDs and PAH, as we found earlier [22]. In the case of microcapsules, the QD fluorescence lifetime tended to further decrease compared to the QDs within the microparticles from which the microcapsules were fabricated. A possible cause of this decrease was a technological factor entailed in the fabrication of microcapsules, namely, the dissolution of the core and the related increase in the necessary number of washings.
It should be noted, that the fluorescence lifetime also tended to decrease with time after the microcapsule fabrication. However, since 48 h after the microcapsule fabrication, further changes in the mean fluorescence lifetime were insignificant. The fluorescence decay was apparently caused by a decrease in the fluorescence quantum yield of QD embedded in the shells of the capsules. This effect is likely to have resulted from the change in the distribution of the electron potential and the geometric rearrangement of QDs in the inner layers of the polymer shell after the core removal that increased the probability of nonradiative recombination due to the charge transfer to between neighboring QDs or between QDs and polymer molecules [22].
Interaction of Quantum Dot- Encoded Polyelectrolyte Microcapsules with Phagocytic Cells In Vitro
We used confocal microscopy to analyze the interaction of QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with live phagocytic cells, their uptake by cells, and the possibility of cell labeling. The murine alveolar macrophage (MH-S) cells were used as a model, because of the capability of these cells to phagocytize xenogenic objects.
The MH-S cells were treated with approximately 1.2×10
6
of QD-encoded microcapsules by short-term (4 h) or long-term (24 h) incubations. We observed signs of primary uptake of the microcapsules in both cases:after the short- and (Fig. 9a–d) long-term incubation (Fig. 9e–h). Polyelectrolyte microcapsules or their conglomerates could be seen in green color. The microcapsules could be clearly distinguished both in the external environment of cells and inside the MH-S cells that could be evidenced by the distance between the microcapsules and nuclei of the MH-S cells which were stained by far-red DNA stain DRAQ5 and can be seen as red spherical shaped objects at all the microphotographs. As individual microcapsules and as their conglomerates were detected to undergo the uptake process. The fact that microcapsules were located in internal cell environment or at least attached to the surface of the macrophages is confirmed by clearly distinguished short distances between the nuclei and the polyelectrolyte microcapsules (Fig. 9b, d, g, h). In Fig. 9g, residually stained boundaries of the macrophage cytoplasmic membranes are distinctly seen, which indicates effective uptake, and well-discernible microcapsules are easy to detect to be attached on their surface either within the cells.
Confocal images of the MH-S cells treated with the QD-encoded polyelectrolyte microcapsules coated with BSA. The upper row shows the images of the samples after 4 h of short-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (a –d ). The lower row demonstrates the images of the samples after 24 h of long-term incubation; the microcapsules are shown by white arrows (e –h ). The nuclei of the macrophages were counterstained with far-red DNA stain DRAQ5
During the short-term incubation, single microcapsules were found to be phagocytized by MH-S cells prior to conglomerates of the microparticles. While after long-term incubation (24 h), the amount of the conglomerates of the polyelectrolyte microcapsules undergoing the uptake process and located inside cells or at least attached to the cell surface was more significant than after short-term incubation. Thus, the polyelectrolyte microcapsules obtained in this study used as promising tools for imaging and tracking of live cells.
Conclusions
Our study has demonstrated the feasibility of fabrication of stable QD-encoded polyelectrolyte microcapsules with optimized fluorescence characteristics and a narrow size distribution. The technique for incorporation of water-soluble and stabilized with three-functional polyethylene glycol derivatives core/shell QDs into the polymer wall of the microcapsules and detailed characterization at each stage of experimental procedure ensured efficient fluorescent encoding of microcapsules. The efficient intracellular uptake of developed QD-encoded microcapsules by murine macrophages was demonstrated, thus confirming the possibility of efficient use of developed system for live cell imaging and visualization of microcapsules transportation and delivery within the living cells.
