Deteksi Berbasis Nanopartikel Emas untuk AGE dengan Berat Molekul Rendah dari Sampel Hemoglobin A0 Terglikasi In Vitro
Abstrak
Glikasi protein adalah peristiwa biokimia utama yang terjadi dalam plasma pasien diabetes karena peningkatan kadar gula. Glikasi ekstensif mengarah pada pembentukan produk akhir glikasi lanjut (AGEs) yang dikenal memiliki efek merugikan pada pasien diabetes. Dalam pekerjaan saat ini, kami telah mengglikasi protein penting secara fisiologis Hemoglobin A0 in vitro untuk mempelajari pembentukan dan aktivitas AGE dengan menggunakannya sebagai templat untuk sintesis nanopartikel emas (GNPs). Ditemukan bahwa resonansi plasmon permukaan GNP yang disintesis menunjukkan korelasi tinggi dengan tingkat glikasi. Pada fraksinasi, Hemoglobin A0 yang terglikasi dipisahkan menjadi dua populasi produk yang berbeda, satu terdiri dari fragmen yang lebih besar dari Hemoglobin A0 yang berikatan silang dengan protein dan populasi kedua dari AGE dengan berat molekul rendah non-protein. Hanya AGE dengan berat molekul rendah yang berkontribusi pada sintesis GNP saat menggunakan fraksi sebagai templat, yang memperkuat prinsip pengujian berbasis GNP yang diusulkan. Karena kepentingan fisiologisnya, AGEs dapat digunakan sebagai sarana diagnostik untuk diabetes dan komplikasi terkaitnya. Dalam penelitian ini, kami telah menggunakan reaktivitas AGE yang tinggi untuk pengembangan sensor kolorimetri baru berbasis GNP untuk memungkinkan pendeteksiannya. Penginderaan berbasis GNP yang kami usulkan dapat memiliki signifikansi klinis yang tinggi dalam mendeteksi diabetes dan kompleksitas terkaitnya.
Latar Belakang
Diabetes melitus tipe II (DMT2) merupakan gangguan metabolisme kompleks yang ditandai dengan adanya kadar gula darah yang tinggi. Hiperglikemia yang bertahan dalam tubuh memulai serangkaian reaksi kimia dan biokimia dan reaksi terpenting yang terjadi selama hiperglikemia dikenal sebagai reaksi Maillard yang melibatkan reaksi non-enzimatik antara gula dan protein untuk membentuk aldimin reversibel (basa Schiff) hubungan. Basa Schiff yang relatif tidak stabil tautomerisasi menjadi bentuk keto yang lebih stabil yang dikenal sebagai 'Produk Amadori' [1]. Produk Amadori, juga disebut sebagai produk antara glikasi atau produk glikasi awal, mengalami penataan ulang kelompok, siklisasi, dehidrasi, reaksi degradasi untuk membentuk berbagai senyawa kimia. Senyawa ini dikenal sebagai cross linker yang potensial dari protein dan agen glikosilasi [2]. Mereka rentan terhadap degradasi lebih lanjut yang mengarah pada pembentukan produk akhir glikasi lanjut (AGEs) [3]. Pada konsentrasi endogen yang tinggi, AGEs berkontribusi pada komplikasi diabetes [4] baik dengan menginduksi ikatan silang protein atau melalui transduksi sinyal intraseluler yang dimediasi reseptor (RAGE), yang menyebabkan stres oksidatif dan peradangan [5, 6]. Hal ini juga diketahui terkait dengan penyakit kardiovaskular [7, 8], nefropati [9, 10], retinopati [11, 12], penuaan [13, 14], radang sendi, kanker [15,16,17], penyakit neurodegeneratif seperti Alzheimer [15] dan perkembangan depresi [18]. Selain reaksi Maillard, beberapa jalur lain termasuk oksidasi glukosa, peroksidasi lipid dan jalur poliol juga mengarah pada pembentukan AGEs [19, 20] in vivo. Selain itu, asupan makanan tertentu yang diketahui kaya akan AGEs juga berkontribusi terhadap total AGEs di dalam tubuh [6].
Meskipun sebagian besar produk AGE memiliki elemen struktural yang sama [21], struktur kimia yang tepat dari ratusan AGEs belum dapat diidentifikasi [22]. Terlepas dari heterogenitasnya, pembentukan ikatan silang kovalen dengan protein dan 'efek pencoklatan' adalah tipikal untuk semua AGE yang diketahui [23]. Aduksi yang melibatkan gula dan protein yang terbentuk pada tahap awal glikasi disebut sebagai adisi glikasi awal. Fructosyllysine dan Fructosamine adalah contoh dari struktur tersebut dan mereka adalah cross-linker yang potensial [24,25,26]. Beberapa AGE yang dipelajari secara luas termasuk N -karboksimetil-lisin (CML), N -carboxyethyl-lysine (CEL) [27], pentosidin [28], glucopane [29], pyrraline, Argpyramidine, Crossline dan Vesperlysine C [30].
Studi tentang peran AGE dalam perkembangan diabetes, penuaan dan komplikasi terkait sedang meningkat dan mereka telah dilaporkan menjadi biomarker yang baik untuk studi masing-masing [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][ 31,32,33,34]. Namun, kompleksitas dan heterogenitas dalam struktur AGEs merupakan rintangan utama dalam pengembangan sistem deteksi universal [35]. Analisis kualitatif AGEs umumnya dilakukan melalui teknik spektroskopi dan kolorimetri [36] di mana evolusi produk reaksi Maillard dipantau dengan mengukur peningkatan penyerapan cahaya pada 280 nm yang sesuai dengan produk reaksi Maillard awal [37] atau dengan mengukur emisi fluoresensi pada 450 nm [38,39,40,41,42]. Studi untuk identifikasi produk AGE yang berbeda masih berlangsung; namun, beberapa upaya dilakukan untuk kuantisasi pentosidin [43] dan karboksimetil lisin [44]. Sebagian besar AGE dipelajari pada tingkat jaringan dengan imunohistokimia dan kuantifikasi berbasis ELISA menggunakan berbagai antibodi poli dan monoklonal [21, 45]. Teknik analisis terbaik yang tersedia hingga saat ini untuk deteksi AGE adalah kromatografi cair atau gas diikuti dengan deteksi spektrofotometri atau spektrometri massa [12, 46,47,48,49]. Analisis kuantitatif AGEs masih merupakan tantangan teknis utama dan beberapa teknik yang tersedia untuk hal yang sama mahal dan dengan demikian membatasi penggunaannya dalam aplikasi perawatan. Pengembangan strategi baru untuk evaluasi kualitatif dan kuantitatif AGEs adalah kebutuhan saat ini karena implikasinya terhadap penyakit yang mengancam jiwa.
Upaya besar telah dilakukan untuk pengembangan sensor kolorimetri karena kesederhanaannya dalam deteksi, waktu respons yang cepat dan efektivitas biaya terutama untuk aplikasi biologis [50]. Diantaranya, sensor berbasis resonansi plasmon permukaan (SPR) menjadi perhatian khusus karena sensitivitas deteksinya yang tinggi [51]. Dalam penelitian ini, kami telah mengeksplorasi sifat optik nanopartikel emas (GNPs) untuk identifikasi kualitatif produk AGE. GNP dikenal karena SPRnya yang unik dan dapat disetel dan oleh karena itu berkembang sebagai reporter kolorimetri untuk mendeteksi berbagai biomolekul. Sensor optik berdasarkan GNP termasuk untuk analit kimia kecil [52], gula [53], protein yang berbeda [54], agregat protein [55] dan varian konformasi protein [56]. Sebelumnya, kami menunjukkan bahwa GNP ketika diunggulkan pada template protein terglikasi dapat merespon kemajuan glikasi [57]. Di sini, kami telah memperluas konsep ini untuk deteksi kualitatif produk glikasi yang berbeda secara kolorimetri dengan menggunakan sifat pereduksi yang ditunjukkan oleh AGE. Secara singkat, HbA0 diglikasi secara in vitro, menggunakan fruktosa sebagai gula pereduksi, pembentukan AGE dan perubahan struktural terkait dalam tulang punggung protein dikonfirmasi menggunakan spektroskopi. Hb terglikasi difraksinasi menggunakan kromatografi filtrasi gel untuk memisahkan produk berdasarkan berat molekulnya dan GNP disintesis menggunakan fraksi yang diperoleh. Hanya produk AGE non-protein yang mengarahkan sintesis struktur nano emas sehingga memungkinkan identifikasinya.
Bukti yang berkembang mendukung keterlibatan berbagai produk glikasi pada penyakit termasuk diabetes, penuaan, Alzheimer, penyakit ginjal, aterosklerosis, dan berbagai jenis kanker. Temuan kami menonjolkan penggunaan GNP sebagai platform penginderaan kolorimetri yang sederhana dan sangat sensitif untuk identifikasi berbagai produk AGE yang dapat dikaitkan dengan prognosis komplikasi kesehatan terkait diabetes.
Metode
Materi
Hemoglobin A0 (HbA0) dan Sephadex (G25) diperoleh dari Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Hidrogen tetrakloroaurat (III) trihidrat (HAuCl4 .3H2 O) dibeli dari Loba Chemie. Fruktosa, kalium dihidrogen ortofosfat, dipotassium hidrogen ortofosfat, natrium dihidrogen ortofosfat, dinatrium hidrogen ortofosfat, kalium ferisianida, asam trikloroasetat, besi klorida, asam nitrat (HNO3 ), asam klorida (HCl), akrilamida, bis akrilamida, amonium persulfat, TEMED, natrium dodesil sulfat, Coomassie Brilliant Blue, gliserol, dithiothreitol, basa TRIS dan bahan kimia lain yang digunakan adalah kelas analitik dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut. Air ultra murni MilliQ (>18 MΩ) digunakan untuk semua eksperimen.
Metode
Glikasi HbA0
Larutan stok HbA0 dan fruktosa disiapkan dalam buffer kalium fosfat yang diautoklaf (0,1 M, pH 7,4) dan disaring menggunakan filter spuit 0,2 m sebelum digunakan. Sampel HbA0 diinkubasi dengan konsentrasi fruktosa yang berbeda untuk periode waktu yang berbeda (1 sampai 10 hari) dalam inkubator pada suhu 37 °C. Konsentrasi akhir fruktosa dan HbA0 adalah 0,1 M dan 1 mg mL
−1
masing-masing. Kontrol HbA0 dan fruktosa juga disimpan dengan konsentrasi yang sama. Sampel yang diglikasi selama 10 hari diberi label dengan awalan 'Hari 10' dan sampel kontrol yang tidak diinkubasi diberi label dengan awalan 'Hari 0'. Semua eksperimen dilakukan dalam kondisi steril di dalam tudung aliran udara laminar.
Mengurangi Pengujian Properti
Sifat pereduksi sampel terglikasi ditentukan dengan metode yang dijelaskan oleh Gu. dkk. [37] dengan sedikit modifikasi. Kemudian, 100 L sampel terglikasi dan kontrol protein dan gula masing-masing dicampur dengan 1 mL buffer natrium fosfat 0,2 M dan 1 mL kalium ferisianida 1%. Campuran diinkubasi pada suhu 50 ° C dalam penangas air selama 20 menit. Setelah mendinginkan campuran sampai suhu kamar, 1 mL asam trikloroasetat 10% ditambahkan. Untuk 1 mL campuran ini, 1 mL air MilliQ dan 200 L 0,1% besi klorida ditambahkan. Absorbansi dari campuran yang dihasilkan diukur pada 700 nm. Kontrol negatif disimpan di mana 0,1 M buffer fosfat ditambahkan sebagai pengganti sampel glikosilasi dan ini berfungsi sebagai blanko untuk pengukuran absorbansi. Semakin tinggi absorbansi pada 700 nm, semakin banyak sifat pereduksinya.
Kromatografi Filtrasi Gel Fruc-Hb Hari 0 dan Fruc-Hb Hari 10 Menggunakan Sephadex (G25)
Secara singkat butiran Sephadex (G25) direndam dalam air MilliQ semalaman, kemudian dikemas dalam kolom kaca dengan panjang 15 cm, diameter 1 cm dan volume dalam 15 mL. Mula-mula, kolom dicuci dengan banyak air MilliQ diikuti dengan buffer kalium fosfat (0,1 M, pH 7,4). Sekitar 600 L sampel Fruc-Hb dimasukkan ke dalam kolom setelah diseimbangkan dengan buffer fosfat. Elusi dilakukan dengan buffer yang sama pada laju alir 7,5 mL per jam. Fraksi dikumpulkan setelah sampel yang dimuat melintasi jarak sekitar 10 cm dari kolom. Sekitar 30 fraksi dikumpulkan dari masing-masing sampel dan dikarakterisasi setelahnya. Di sini, Fruc-Hb hari ke-0 dan fraksi turunannya berfungsi sebagai kontrol terhadap sampel Fruc-Hb hari ke-10 dan fraksinya masing-masing.
Sintesis Nanopartikel Emas
Semua peralatan gelas yang digunakan untuk sintesis GNP dicuci dengan Aqua Regia (HCl:HNO3 dalam rasio 3:1 berdasarkan volume) dan dibilas dengan etanol dan air ultra murni sebelum digunakan (Perhatian! Aqua Regia adalah zat pengoksidasi yang sangat korosif yang harus ditangani dengan sangat hati-hati ). Sintesis GNP dilakukan, memanfaatkan sifat pereduksi produk glikasi Hb. Dalam percobaan khas yang dilakukan pada suhu kamar (RT), 32 L larutan berair HAuCl4 (1% dengan /v ) ditambahkan ke 3,868 mL air MilliQ dengan pengadukan konstan. Setelah garam emas larut sempurna, larutan berubah menjadi kuning pucat. Selanjutnya, 50 L sampel Fruc-Hb yang diperlukan atau 100 L fraksi ditambahkan ke dalam larutan garam emas. Setelah semua reaktan tercampur secara menyeluruh, pengadukan dihentikan dan campuran reaksi dibiarkan tidak terganggu untuk memungkinkan pertumbuhan GNP. Pada campuran reaksi akhir, konsentrasi sampel Fruc-Hb adalah 12,5 ng L
−1
(12,5 g mL
−1
) dan pecahannya adalah 1 ng L
−1
(1 g mL
−1
) (Perhitungan rinci diberikan dalam S6). Warna mulai dari merah muda hingga ungu berkembang dalam campuran reaksi tergantung pada sampel yang ditambahkan. Semua sampel dipertahankan sampai warna campuran reaksi stabil dan tidak ada perubahan lebih lanjut yang diamati.
Pengujian Bradford
Fraksi yang dikumpulkan dari sampel Fruc-Hb dianalisis untuk ada tidaknya protein menggunakan uji Bradford. Secara singkat, untuk masing-masing 20 L fraksi murni, sekitar 200 L reagen Bradford ditambahkan, dan absorbansi diukur pada 595 nm dan 450 nm [58]. Rasio OD pada 595 nm hingga 450 nm diplot terhadap jumlah fraksi dan rasio yang lebih tinggi menunjukkan persentase protein yang relatif lebih tinggi.
Spektroskopi
Spektroskopi UV-Visible
Spektrum UV-Visible dari semua sampel Fruc-Hb, kontrol masing-masing dan fraksi kromatografi dari sampel terglikasi dicatat dalam spektrometer UV-Visible Perkin Elmer, Lambda 25. Spektrum diambil dengan menjalankan scan 800-200 nm dengan kecepatan scan 240 nm/menit, dan lebar celah 1 nm. Semua pengukuran dilakukan dengan menggunakan panjang lintasan 1 cm, kuvet kuarsa 1 mL. Spektrum UV-Visible dari GNP juga direkam dengan cara yang sama.
Spektroskopi Fluoresensi
Untuk mengidentifikasi perubahan struktural protein dan pembentukan AGE, profil emisi fluoresensi sampel Fruc-Hb dan fraksi dari hari 0 Fruc-Hb dan hari 10 Fruc-Hb dilakukan menggunakan spektrofotometer fluoresensi Agilent Technologies Cary Eclipse. Lebar celah eksitasi dan emisi ditetapkan sebesar 5 nm dan spektrum diambil menggunakan kuvet kuarsa dengan panjang lintasan 1 cm. Sampel dieksitasi pada 280 nm dan 350 nm masing-masing untuk memeriksa fluoresensi triptofan/protein intrinsik dan fluoresensi AGE [34,35,36,37,38].
Spektroskopi Dikroisme Sirkular
Perubahan struktur sekunder dalam sampel Fruc-Hb diidentifikasi menggunakan spektroskopi dichroism melingkar. Pengukuran dilakukan menggunakan spektrometer dichroism melingkar (CD) dengan Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, UK). Spektrum diambil dalam UV jauh, mulai dari 190 hingga 260 nm.
Untuk semua pengukuran spektroskopi, sampel Fruc-Hb 0,1 mg mL
−1
konsentrasi yang digunakan dan fraksi dari hari 0 Fruc-Hb dan hari 10 Fruc-Hb dianalisis tanpa pengenceran apapun. Buffer kalium fosfat (pH 7,4, 10 mM) berfungsi sebagai blanko di semua percobaan. Semua pembacaan dilakukan dalam rangkap tiga pada suhu kamar.
Mikroskop Transmisi Elektron
Untuk mengidentifikasi ukuran dan struktur GNP yang disintesis dari sampel Fruc-Hb dan kontrolnya masing-masing, analisis mikroskop elektron dilakukan menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM)-JEOL 2100F. GNP dipekatkan dengan sentrifugasi pada 6000 rpm dan diteteskan ke dalam kisi karbon berlapis tembaga dengan ukuran mesh 300. Sampel dibiarkan mengering semalaman pada suhu kamar sebelum analisis.
Profil Intensitas Warna GNP
Untuk menyatakan warna GNP dalam nilai terukur, (RB)/G ((Intensitas merah–Intensitas Biru)/Intensitas hijau) dihitung dengan mengekstrak bidang warna merah, biru dan hijau dari masing-masing koloid emas menggunakan warna digital. meteran.
Elektroforesis Gel Poliakrilamida SDS
Elektroforesis gel natrium dodesil sulfat-poliakrilamida (SDS PAGE) dilakukan untuk melihat perbedaan berat molekul HbA0, pasca glikasi. HbA0 Kontrol hari 0, hari 10 dan Fruc-Hb hari 0 dan hari 10 dicampur dengan 10% SDS yang mengandung buffer pemuatan 6X dan direbus selama 5 menit setelah itu 30 L sampel dimuat ke gel yang dicor (Stacking gel- 5%; Menyelesaikan gel 12%). Sampel dijalankan bersama dengan tangga protein pra-pewarnaan 10-175 kDa PiNK Plus (Kucing No. PM005 0500) pada 100 V menggunakan sistem Mini PROTEAN Tetrad dari Bio-Rad. Gel divisualisasikan di bawah sumber cahaya putih dari iluminator Bio-Rad Trans.
Hasil
Sintesis GNP dari Fruktosa, Hemoglobin A0 dan Hemoglobin A0 Terglikosilasi
Diketahui bahwa gula pereduksi glukosa bereaksi dengan HbA0 in vivo untuk menghasilkan HbA1c, adisi glikasi awal yang terkenal yang merupakan biomarker utama untuk tingkat hiperglikemik yang terkait dengan diabetes [59]. Untuk mencapai kinetika glikasi yang lebih cepat dan akumulasi AGE yang tinggi secara in vitro, fruktosa digunakan sebagai pengganti glukosa yang merupakan agen pengglikasi yang poten dibandingkan dengan yang terakhir [55,56,57,58,59,60]. Dalam penelitian kami, kami melakukan glikasi Hemoglobin A0 menggunakan fruktosa sebagai gula pereduksi dan glikasi dipantau sampai 10 hari yang dilaporkan cukup baik untuk pembentukan AGE substansial [57]. Gambar 1 mengilustrasikan pembentukan AGEs dalam sampel HbA0 setelah 10 hari inkubasi dengan fruktosa in vitro. Pembentukan AGE dievaluasi dengan mengukur emisi fluoresensi secara kualitatif pada 450 nm setelah eksitasi pada 350 nm [38,39,40,41,42]. Lebih dari sepuluh kali lipat peningkatan emisi fluoresensi pada 450 nm dikonfirmasi pembentukan produk AGE di glikosilasi HbA0 (hari 10 Fruc-Hb) dibandingkan dengan non-terglikosilasi HbA0 (hari 0 Fruc-Hb- Campuran fisik HbA0 dan fruktosa tanpa inkubasi). Karakterisasi biofisik rinci dari sampel dibahas dalam file tambahan 1 (S1 &S2).
Pembentukan AGEs diukur dengan generasi fluoresensi pada 450 nm ketika hemoglobin diinkubasi dengan fruktosa selama 10 hari. Perbandingan emisi fluoresensi 450 nm pada hari ke 0 Fruc-Hb dan hari ke 10 Fruc-Hb
Untuk menggunakan GNP sebagai sensor kolorimetri untuk AGEs yang berasal dari glikasi protein, merupakan prasyarat untuk mempelajari kinetika pembentukan GNP dari reaktan gula dan protein. Fruktosa dan Hemoglobin A0 telah dilaporkan mengarahkan sintesis struktur nano emas [53, 61,62,63] bila digunakan sendiri atau dalam kombinasi dengan zat pereduksi kuat. Namun, untuk memahami perbedaan dalam kinetika pembentukan, kami membandingkan GNP yang disintesis dari Fruc-Hb, fruktosa dan HbA0 yang diinkubasi selama 0 dan 10 hari masing-masing tanpa adanya zat pereduksi tambahan. Sifat pereduksi template ini diukur secara biokimia menurut protokol yang dijelaskan di bagian metode. Secara keseluruhan, sampel hari ke-10 menunjukkan sifat pereduksi yang lebih tinggi daripada sampel hari ke-0, dan Fruc-Hb menunjukkan sifat pereduksi maksimum diikuti oleh fruktosa dan HbA0 dalam kedua kasus, yang dapat dikaitkan dengan keberadaan AGEs dalam sampel Fruc-Hb ( Gambar 2a). Dari sampel ini, pada konsentrasi yang khas, hanya hari ke 10 Fruc-Hb yang berkontribusi pada sintesis GNP stabil (Gbr. 2b) pada akhir 4 hari, sedangkan sampel lainnya hanya dapat melakukannya jika diizinkan untuk disimpan untuk waktu yang lama (biasanya lebih dari 10 hari) dan hasilnya sesuai dengan sifat pereduksi yang diperoleh dari sampel (data tidak ditampilkan). Spektrum penyerapan cahaya tampak hari 10 Fruc-Hb_GNPs menghasilkan puncak sekitar 530 nm (Gbr. 2c) dan partikel juga ditandai dengan mikroskop elektron transmisi (TEM), untuk mempelajari ukuran dan morfologi (Gbr. 2d). Mikrograf elektron menunjukkan adanya partikel berbentuk bola dengan diameter rata-rata 21,930 ± 2,4 nm (Gbr. 2e). Juga, partikel adalah polikristalin di alam dengan titik kisi sesuai dengan 111, 200, 220, 311 bidang kisi fcc (Gbr. 2f). Sebuah analisis kinetik rinci pembentukan GNP dari sampel terglikasi diferensial diberikan dalam S3.
Karakterisasi pembentukan AGE dan sintesis GNP dari sampel HbA0, fruktosa dan Fruc-Hb. a Sifat pereduksi HbA0, fruktosa, Fruc-Hb dari inkubasi 0 dan 10 hari berturut-turut diukur dengan uji reduksi ion besi. b Foto-foto GNP disintesis dari sampel masing-masing. c Spektrum penyerapan UV-Visible untuk hari10 Fruc-Hb_GNPs. d Mikrograf elektron transmisi hari ini10 Fruc-Hb_GNPs (bilah skala:20 nm). e Distribusi ukuran partikel dan f SAED untuk partikel
Di sini, Fruc-Hb bertindak baik sebagai templat maupun penstabil untuk mengarahkan sintesis struktur nano emas berbentuk bola. Karena hanya hari ke 10 Fruc-Hb memungkinkan sintesis partikel dalam waktu yang ditentukan dibandingkan dengan rekan gula dan protein, mekanisme ini dapat digunakan untuk membedakan antara template protein terglikasi dan non-terglikasi.
Fraksionasi Fruc-Hb Menyelesaikan Dua Kelas Produk Glikosilasi yang Berbeda
Sangat menarik untuk melihat apakah AGE atau perubahan pada tulang punggung protein bertanggung jawab atas respons SPR diferensial yang diamati dalam GNP yang diunggulkan pada templat Fruc-Hb hari ke-10. Untuk menyelidiki lebih lanjut, kami memfraksinasi Fruc-Hb hari ke 10 dan Fruc-Hb hari ke 0 menggunakan kromatografi filtrasi gel seperti yang dijelaskan pada bagian metode. Fraksi yang berasal dari hari ke 0 Fruc-Hb berfungsi sebagai kontrol terhadap fraksi dari hari ke 10 Fruc-Hb. Gambar 3 merangkum karakterisasi spektroskopi fraksi. Gambar 3a menunjukkan profil elusi fraksi yang dikumpulkan dari hari 0 Fruc-Hb (merah) dan hari 10 Fruc-Hb (hitam). Profil elusi karakteristik yang diperoleh untuk fraksinasi Fruc-Hb konsisten dengan laporan sebelumnya [37].
Profil elusi fraksi Fruc-Hb (merah) hari ke-10 dan fraksi Fruc-Hb (hitam) hari ke-10. Profil absorbansi UV diukur pada 280 nm (a ) dan uji Bradford untuk keberadaan protein (b ) pecahan dari hari ke 0 Fruc-Hb dan hari ke 10 Fruc-Hb
Kehadiran protein dalam fraksi dari hari 0 dan hari 10 dikonfirmasi oleh penyerapan sinar UV pada 280 nm oleh asam amino aromatik yang ada dalam protein. Profil elusi Fruc-Hb hari ke-10 yang diukur dengan penyerapan cahaya pada 280 nm menunjukkan adanya dua populasi produk bertanda I dan II. Populasi I, yang terdiri dari produk dengan berat molekul tinggi, berkisar dari fraksi no. 5 sampai 12 dan pecahan no. 15 dan seterusnya sesuai dengan produk dengan berat molekul rendah termasuk dalam populasi II. Rentang kecil yang mencakup 2-3 fraksi diamati di antara I dan II, di mana tidak ada penyerapan UV yang diamati. Di sisi lain, populasi tunggal fraksi dari hari ke 0 Fruc-Hb menunjukkan penyerapan sinar UV (populasi I), menegaskan bahwa penyerapan pada wilayah II pada hari ke 10 fraksi adalah dengan produk yang dihasilkan pada hari ke 10 Fruc-Hb sebagai hasilnya. dari glikasi. Telah dilaporkan bahwa zat antara reaksi Maillard menyerap cahaya dalam kisaran UV dekat [64] yang mendukung pengamatan. Peningkatan penyerapan sinar UV pada 280 nm pada fraksi hari 10 dibandingkan dengan fraksi hari ke 0 dapat disebabkan oleh pembukaan protein yang ekstensif sebagai akibat dari glikasi, yang menghasilkan paparan asam amino aromatik (Gbr. 3a).
Glikasi sangat mengubah struktur sekunder dan kuaterner protein seperti yang dibahas dalam S1. Untuk mengkonfirmasi status struktural protein dalam fraksi, kami melakukan elektroforesis gel poliakrilamida SDS dari fraksi dan menemukan bahwa sebagai pengganti pita monomer dan dimer, pita menyatu diamati untuk mengkonfirmasi ikatan silang protein pada hari ke 10 sampel Fruc-Hb (File tambahan 1:Gambar S4).
Saat membandingkan profil elusi Fruc-Hb hari 0 dan Fruc-Hb hari 10, kami melihat bahwa fraksi yang termasuk dalam populasi I bersifat protein dan populasi kedua yang sama sekali tidak ada pada fraksi hari 0 (non-glikasi) terdiri dari produk glikasi non-protein. Temuan ini didukung oleh estimasi protein dengan uji Bradford di mana sifat protein dari fraksi dalam populasi I dari hari ke 0 dan hari ke 10 Fruc-Hb dikonfirmasi (Gbr. 3b). Secara ringkas, fraksinasi Fruc-Hb hari ke-10 dengan kromatografi filtrasi gel menghasilkan dua populasi fraksi yang berbeda, keduanya menyerap cahaya pada 280 nm, yang satu bersifat protein dan yang lainnya non-protein.
Produk Glikasi Berprotein dan Produk Glikasi Non-Protein Bersifat Neon
Setelah memahami elusi produk glikasi dari protein dan non-protein di alam, emisi fluoresensi dari fraksi ini diukur pada 450 nm untuk mengkarakterisasi keberadaan produk AGE. Mirip dengan profil elusi UV, dua populasi emisi fluoresensi diamati untuk fraksi hari 10, tetapi tidak ada fraksi hari 0 yang menunjukkan emisi fluoresensi pada 450 nm karena tidak ada pembentukan AGE yang terjadi pada hari 0 Fruc-Hb (Gbr. 4). Intensitas fluoresensi bervariasi secara signifikan di antara fraksi hari ke 10 yang menunjukkan sifat kimia diferensial dari produk glikasi. Dalam profil elusi fluoresensi, elusi awal milik populasi I terdiri dari produk glikasi dengan intensitas fluoresensi tinggi. Ini bersama dengan estimasi protein yang ditunjukkan pada Gambar. 3 menunjukkan elusi produk glikasi berfluoresensi tinggi yang terdiri dari struktur protein dalam fraksi ini. Populasi kedua menunjukkan emisi fluoresensi dengan intensitas yang lebih rendah dibandingkan dengan fraksi awal. Mereka ditemukan non-protein di alam (Gbr. 3b) tetapi mampu menyerap sinar UV pada 280 nm (Gbr. 3a).
Perbandingan fluoresensi AGE pada hari ke 0 Fruc-Hb dan hari ke 10 fraksi Fruc-Hb dinyatakan sebagai intensitas pancaran fluoresensi pada 450 nm
Mempertimbangkan penyerapan UV (Gbr. 3) dan emisi fluoresensi dari fraksi hari ke 10 (Gbr. 4), terbukti bahwa fraksinasi membedakan dua kelas produk glikasi HbA0 yang berbeda. Populasi fraksi yang dielusi dari kolom G25 awalnya memiliki berat molekul tinggi, bersifat protein dan memancarkan fluoresensi kuat pada 450 nm. Kelas produk kedua adalah struktur non-protein dengan berat molekul rendah, memancarkan fluoresensi pada 450 nm tetapi dengan intensitas yang relatif lebih rendah. Karena kedua produk menunjukkan fluoresensi 'AGE', struktur protein dapat menjadi produk AGE yang terkait silang dengan tulang punggung protein yang awalnya terbentuk selama reaksi Maillard dan fraksi populasi kedua dapat menjadi produk akhir glikasi yang terbentuk sebagai hasilnya. dari degradasi ikatan silang protein AGE.
GNP yang Diunggulkan pada Pecahan dari Sampel Fruc-Hb Memungkinkan Diferensiasi Di Antara Produk Glikasi
Jelaslah bahwa sintesis GNP dapat digunakan untuk membedakan antara template terglikasi dan non-terglikasi (Gbr. 2). Sekarang, untuk menyelidiki apakah GNP dapat membedakan antara elusi protein dan non-protein dari hari ke 10 Fruc-Hb, kami mensintesis GNP menggunakan fraksi yang diperoleh dari hari ke 10 Fruc-Hb seperti yang dijelaskan dalam metode. Warna GNP yang terbentuk dipantau sampai semua sampel menjadi stabil.
Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5, tidak ada fraksi yang terdiri dari struktur protein (populasi I) yang menunjukkan pembentukan GNP yang menonjol, sedangkan fraksi yang mengandung produk AGE non-protein (populasi II) menghasilkan GNP stabil yang menunjukkan rentang warna dalam larutan koloid. Pembentukan GNP dikarakterisasi dengan menggunakan spektroskopi UV-Visible dan absorbansi maxima diplot terhadap bilangan fraksi. Data spektroskopi sangat mendukung profil warna GNP yang divisualisasikan. Data ini menyimpulkan bahwa diferensiasi template protein terglikasi dari template protein non-terglikasi berdasarkan mekanisme penginderaan berbasis GNP dimediasi oleh produk AGE dengan berat molekul rendah dan mekanisme yang sama dapat digunakan untuk membedakan antara protein dan non-berat molekul rendah. -produk glikasi protein.
Sintesis GNP dari hari ke 10 fraksi Fruc-Hb. Profil kolorimetri GNP yang disintesis dari fraksi hari ke-10 dan maksima penyerapannya diplot terhadap jumlah fraksi
Kinetika penginderaan kolorimetri berbasis GNP dapat ditingkatkan ke perluasan yang lebih besar hanya dengan meningkatkan konsentrasi Fruc-Hb dan garam emas, sehingga mempersempit waktu respons. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).
The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.
Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL
Discussion
The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.
Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.
Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).
Conclusions
Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.
