Sensor Kimiawarna Nanopartikel Emas untuk AGEs Berat Molekul Rendah dalam Hemoglobin Glisilasi A0
Abstrak
Glikasi protein dalam plasma diabetik menghasilkan produk akhir glikasi lanjutan (AGE) yang mendorong perkembangan penyakit. Kami glisilasi hemoglobin A0 (HbA0) in vitro menggunakan fruktosa, lalu menggunakan protein glisilasi yang dihasilkan sebagai template untuk sintesis nanopartikel emas (GNP). Resonansi plasmon permukaan (SPR) dari GNP berkaitan kuat dengan tingkat glikasi. Fraksinasi saringan gel mengungkapkan dua populasi produk: fragmen protein bersilang berat molekuler tinggi dan AGE non-protein berat molekul rendah. Hanya yang terakhir yang menginduksi pembentukan GNP, memvalidasi ujian yang diusulkan. Karena AGE berfungsi sebagai biomarker yang andal untuk diabetes dan komplikasi tersebut, sensor kimiawarna berbasis GNP ini menawarkan alat diagnostik cepat, murah, dengan dampak klinis yang berpotensi.
Latar Belakang
Diabetes mellitus tipe II (T2DM) ditandai dengan hiperglikemia kronis yang memicu reaksi Maillard—glikasi non-enzimatik protein dan gula. Basis Schiff awal dengan cepat berubah menjadi produk Amadori, yang melalui transformasi lebih lanjut untuk membentuk AGE. AGE bersilang protein, mengaktifkan reseptor RAGE, dan menginduksi stres oksidatif dan peradangan, yang berkontribusi pada penyakit kardiovaskular, nefropati, retinopati, dan neurodegenerasi [4–18]. Jalur lain, seperti oksidasi glukosa, peroksidasi lipid, dan jalur poliol, juga menghasilkan AGE [19–20], dan asupan diet menambahkan ke tingkat sistemik [6]. Meskipun heterogen, AGE berbagi bersilang kovalen dan efek pengayaan coklat yang membuatnya menarik sebagai biomarker untuk diabetes, penuaan, dan gangguan terkait [23].
Deteksi AGE saat ini bergantung pada kromatografi-mas spektrometri atau ELISA yang mahal, yang membatasi penggunaan di titik perawatan. Oleh karena itu, sensor kimiawarna yang sederhana, cepat, dan hemat biaya sangat diinginkan. Nanopartikel emas (GNP) menawarkan SPR yang dapat dituning dan telah berhasil digunakan sebagai pelapor kimiawarna untuk gula, protein, dan agregat protein [52–56]. Kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa protein yang glisilasi dapat menanamkan sintesis GNP, dengan tingkat glikasi terpantau dalam respons optik [57]. Membangun pada ini, kami menyelidiki apakah AGE berat molekul rendah dapat mendorong pembentukan GNP dan berfungsi sebagai dasar untuk sensor kualitatif.
Metode
Bahan
Hemoglobin A0 dan Sephadex G25 (Sigma Aldrich) digunakan sebagaimana adanya. Klorida emas(III) trihidrat (HAuCl₄·3H₂O, Loba Chemie) adalah sumber Au⁺. Fruktosa, buffer fosfat, dan reagen kelas analitik diperoleh dari pemasok standar. Air MilliQ (>18 MΩ) digunakan selama proses.
Metode
Glikasi HbA0
HbA0 (1 mg mL⁻¹) diinkubasi dengan fruktosa (0,1 M) dalam buffer fosfat 0,1 M, pH 7,4, pada 37 °C selama 1–10 hari. Sampel dipecah pada hari 0 (kontrol) dan hari 10 (sepenuhnya glisilasi) dan disimpan dalam kondisi steril.
Uji Sifat Reduksi
Aktivitas reduksi diukur melalui uji reduksi ferosianida. Setelah inkubasi dengan kalium ferosianida, campuran reaksi diasingkan, dan absorpsi pada 700 nm diukur; absorpsi yang lebih tinggi menunjukkan daya reduksi yang lebih kuat.
Kromatografi Saringan Gel
Frak Sampel hari 0 dan hari 10 Fruc-Hb difraksikan pada kolom Sephadex G25 (15 cm × 1 cm) pada 7,5 mL h⁻¹. Tiga puluh fraksi dikumpulkan dan dianalisis dengan serapan UV (280 nm) dan uji Bradford protein.
Sintesis Nanopartikel Emas
Garam emas (1% w/v HAuCl₄) dicampur dengan air dan diaduk hingga kuning pucat. Fruc-Hb (12,5 ng μL⁻¹) atau fraksi individu (1 ng μL⁻¹) ditambahkan, lalu campuran dibiarkan diam untuk pertumbuhan GNP. Warna akhir berkisar dari merah muda hingga ungu, yang menunjukkan pembentukan nanopartikel yang berhasil.
Uji Bradford
Kandungan protein dalam setiap fraksi diukur dengan mengukur absorpsi pada 595 nm dan 450 nm; rasio (OD₅₉₅/OD₄₅₀) mencerminkan pengayaan protein.
Spektroskopi
Spektroskopi UV-Visible
Spektra direkam pada Perkin Elmer Lambda 25 dari 200–800 nm dengan panjang jalur 1 cm.
Spektroskopi Fluoresensi
Fluoresensi intrinsik protein (eksitasi 280 nm) dan fluoresensi AGE (eksitasi 350 nm) diukur pada Agilent Cary Eclipse.
Spektroskopi Sirkuit Diferensial
CD jauh-UV (190–260 nm) menilai perubahan struktur sekunder menggunakan spektrometer Chirascan.
Mikroskop Elektron Transmisi
GNP diimage pada JEOL 2100F TEM setelah sentrifugasi dan pengeringan pada grid karbon.
Profil Intensitas Warna GNP
Warna dikwantifikasi dengan menghitung (R–B)/G dari gambar digital.
SDS-PAGE
Sampel HbA0 yang glisilasi dan kontrol diselesaikan pada gel resolving 12%, divisualisasikan di bawah cahaya putih.
Hasil
Sintesis GNP dari Fruktosa, HbA0, dan HbA0 yang Glisilasi
Fluoresensi pada 450 nm (eksitasi 350 nm) naik >10× setelah 10 hari inkubasi fruktosa, mengonfirmasi pembentukan AGE (Gambar 1). Uji daya reduksi menunjukkan hari 10 Fruc-Hb > hari 0 Fruc-Hb > fruktosa > HbA0 (Gambar 2a). Hanya hari 10 Fruc-Hb yang menghasilkan GNP stabil dalam 4 hari (Gambar 2b), menampilkan puncak SPR pada 530 nm (Gambar 2c) dan partikel bolong 22 ± 2,4 nm (Gambar 2d). Data mengonfirmasi bahwa AGE, bukan sekadar perubahan protein, mendorong sintesis GNP.
Fraksinasi Fruc-Hb Memecah Dua Kelas Produk Glikasi yang Berbeda
Saringan gel menghasilkan dua populasi dalam hari 10 Fruc-Hb: fragmen protein berat molekul tinggi (fraksi 5–12, 15+) dan AGE non-protein berat molekul rendah (populasi II). Hari 0 Fruc-Hb hanya menghasilkan fraksi protein (populasi I) (Gambar 3). Serapan UV pada 280 nm dan analisis Bradford mengonfirmasi sifat protein dari populasi I, sementara populasi II menunjukkan serapan UV tetapi kandungan protein yang bisa diabaikan.
Fluoresensi Produk Glikasi Protein dan Non-Protein
Hanya fraksi hari 10 yang menunjukkan fluoresensi AGE pada 450 nm. Fraksi populasi I memiliki intensitas fluoresensi yang lebih tinggi, yang menunjukkan AGE yang terikat protein, sedangkan fraksi populasi II memancarkan fluoresensi yang lebih lemah tetapi mempertahankan serapan UV, mengonfirmasi sifat non-protein dan berat molekul rendahnya (Gambar 4).
GNP yang Ditumbuhi pada Fraksi Fruc-Hb Membedakan Produk Glikasi
Ketika sintesis GNP dilakukan dengan fraksi individu, hanya populasi II (AGE non-protein) yang menghasilkan GNP stabil dan berwarna, sementara populasi I tidak (Gambar 5). Ini menunjukkan bahwa AGE berat molekul rendah adalah yang bertanggung jawab atas pembentukan nanopartikel dan dapat berfungsi sebagai sensor selektif. Peningkatan konsentrasi Fruc-Hb dan garam emas mempercepat reaksi hingga 1 hari, yang menunjukkan kesesuaian untuk pengaturan titik perawatan (Gambar S5). Linearitas intensitas warna terhadap konsentrasi Fruc-Hb dari 8–40 ng μL⁻¹ mengonfirmasi potensi kuantitatif (Gambar 6).
Pembahasan
Studi kami membuktikan bahwa AGE berat molekul rendah adalah spesies aktif yang mendorong sintesis GNP. Fraksinasi menunjukkan bahwa hanya AGE non-protein yang memicu pembentukan nanopartikel, yang memberikan dasar mekanisme yang jelas untuk sensor. GNP menawarkan sensitivitas tinggi dan dapat mendeteksi AGE pada tingkat nanogram, dengan batas deteksi 1 ng μL⁻¹. Metode ini sederhana, hemat biaya, dan kompatibel dengan volume sampel kecil, menjadikannya ideal untuk pemantauan diabetes cepat di titik perawatan. Pekerjaan masa depan dapat memperluas pendekatan ini untuk membedakan spesies AGE tertentu dan untuk mendeteksi produk akhir peroksidasi lipid lanjutan, yang memperluas manfaat klinis lebih lanjut.
Kesimpulan
Kami menyajikan uji kimiawarna yang tangguh yang mendeteksi AGE berat molekul rendah dalam hemoglobin yang glisilasi dengan sensitivitas nanogram. Dengan memanfaatkan daya reduksi AGE untuk menanamkan pembentukan GNP, sensor membedakan antara sampel yang glisilasi dan tidak glisilasi, dan antara AGE yang terikat protein dan bebas. Dibandingkan dengan LC-MS/MS, uji ini menawarkan alternatif yang cepat dan murah untuk memantau perkembangan diabetes dan komplikasi terkait. Spesifisitas untuk AGE, digabungkan dengan kesederhanaannya, memosisikannya sebagai alat yang menjanjikan untuk diagnostik klinis dan manajemen glikemia dipersonalisasi.
