ELISA dan Elektroda Interdigitated yang Ditingkatkan Nanopartikel Emas untuk Deteksi Ultra-Sensitif Defisiensi Faktor IX Manusia

Abstrak

Deteksi awal dan akurat biomarker berabad rendah sangat penting untuk pengobatan pencegahan gangguan pembekuan darah. Kami menyajikan strategi fungsionalisasi permukaan yang kuat yang menggabungkan aktivasi polistiren pre-alkaline, modifikasi amina (APTES), dan konjugasi nanopartikel emas (GNP) untuk mengimobilisasi faktor IX manusia (FIX) dengan sensitivitas yang tidak pernah sebelumnya. Kondisi yang dioptimalkan—2,5 % APTES dan 25 % GNP 15 nm—menghasilkan batas deteksi (LOD) 100 pM dalam ELISA, peningkatan 60 kali lipat dibandingkan protokol konvensional. Dalam platform elektrokimia elektroda interdigitated (IDE), kimia permukaan yang sama mencapai LOD 25 pM, yang memungkinkan deteksi FIX dalam serum manusia yang dicairkan 1:640 (≈125 pM). Temuan ini menunjukkan keberagaman permukaan yang dibantu GNP di seluruh modalitas sensori yang berbeda dan menetapkan standar baru untuk diagnosis defisiensi koagulasi.

Pendahuluan

Diagnostik akurat dan cepat mendasari kapasitas medis modern untuk bertindak sebelum komplikasi penyakit timbul. Uji imunosorben terkait enzim (ELISA) tetap menjadi standar emas untuk biomarker virus, bakteri, dan protein, namun sensitivitasnya terbatas oleh kimia imobilisasi probe. Orientasi antibodi yang salah, cakupan yang tidak merata, dan adsorpsi tidak spesifik dapat meningkatkan batas deteksi (LOD) dengan beberapa orde magnitudo. Kemajuan terbaru memanfaatkan properti plasmonik nanopartikel emas (GNP) untuk meningkatkan transduksi sinyal dan densitas probe. Di sini, kami mengintegrasikan GNP ke dalam permukaan ELISA yang dimodifikasi kimia untuk meningkatkan deteksi FIX—faktor pembekuan krusial yang defisiennya mengarah pada gangguan perdarahan yang parah. Eksperimen komplementer pada elektroda interdigitated (IDE) memvalidasi pendekatan ini di seluruh bacaan optik dan elektrokimia.

Bahan dan Metode

Reagen dan Biomolekul

APTES dan serum manusia dari Sigma-Aldrich. Protein FIX dan antibodi anti-FIX (Abcam, Malaysia); anti-mouse-IgG-HRP (Thermo-Scientific). Plate ELISA (Becton Dickinson). GNP 10, 15, dan 80 nm (Nanocs) digunakan untuk optimasi.

Persiapan Permukaan

Plate polistiren (PS) dihidroksilasi dengan 1 % KOH selama 1 jam, kemudian diinkubasi dengan 2,5 % APTES dalam etanol selama 5 jam pada suhu kamar. 25 % GNP 15 nm diterapkan (atau dicampur terlebih dahulu dengan FIX) dan diinkubasi selama malam hari pada 4 °C.

Optimasi Konsentrasi APTES dan GNP

Kami menguji 1,25, 2,5, dan 5 % APTES yang digabungkan dengan pengenceran GNP 25, 50, dan 100 %. 250 nM FIX diperkenalkan, diikuti oleh pemblokiran (2 % BSA), antibodi primer (1:1000) dan sekunder (1:1000), serta substrat HRP. Kepadatan optik (OD) pada 405 nm mengukur sinyal. Kondisi 2,5 % APTES/25 % GNP memberikan rasio sinyal-ke-bisu terbaik.

Penentuan Ukuran GNP

Menggunakan kimia permukaan optimal, GNP 10, 15, dan 80 nm dievaluasi. GNP 15 nm memberikan OD yang sebanding dengan GNP 80 nm tetapi dengan stabilitas koloid yang lebih baik, sehingga dipilih untuk eksperimen selanjutnya.

Kontrol Spesifikitas

Empat konfigurasi kontrol dirancang: (C1) FIX-BSA-anti-mouse-IgG-substrat; (C2) FIX-BSA-antibodi FIX-substrat; (C3) BSA-antibodi FIX-anti-mouse-IgG-substrat; (S) FIX-BSA-antibodi FIX-anti-mouse-IgG-substrat. Kehilangan sinyal dalam kontrol mengonfirmasi interaksi antigen-antibodi yang spesifik.

Perbandingan Sensitivitas ELISA

Tiga format ELISA dibandingkan: (1) konvensional; (2) APTES-GNP-FIX (FIX diimobilisasi setelah pemasangan GNP); (3) APTES-GNP premixed FIX (FIX dan GNP dicampur sebelum binding permukaan). Setiap yang diuji di seluruh 0–200 nM FIX. Metode premixed mencapai LOD 100 pM; metode GNP-FIX langsung 200 pM; ELISA konvensional 6 nM.

Deteksi Serum Manusia

Sampel serum (20–1280 × pengenceran) dicampur terlebih dahulu dengan GNP dan diterapkan pada permukaan yang dimodifikasi. FIX terdeteksi pada pengenceran 1:640 (≈125 pM). Eksperimen spiking dengan 0,125–8 nM FIX ke dalam serum 1:640 mengonfirmasi respons linier.

Pembuatan dan Modifikasi Permukaan IDE

Proses litografi cahaya standar menghasilkan IDE Al 240 nm pada SiO₂ 310 nm. Permukaan dibersihkan dengan 1 M KOH, kemudian difungsikan dengan 2,5 % APTES, diikuti oleh campuran GNP-FIX. Pemblokiran menggunakan etanolamin; antibodi anti-FIX mendeteksi analit. Respons arus direkam untuk menentukan LOD.

Hasil dan Pembahasan

Efektivitas Pra-perlakuan

Aktivasi 1 % KOH memperkenalkan grup hidroksil, meningkatkan penambalan APTES dan penangkapan GNP selanjutnya. Tanpa langkah ini, densitas amina—dan consequently pemuatan GNP—tidak cukup.

Karakterisasi GNP

Spektroskopi UV-Vis menunjukkan satu puncak plasmon pada 550 nm, mengonfirmasi monodispersi. TEM mengonfirmasi diameter ~15 nm. FTIR menunjukkan tanda amina, dan potensial zeta –6,9 mV mengindikasikan koloid yang stabil.

Optimasi Permukaan

2,5 % APTES/25 % GNP menyediakan densitas probe optimal sambil meminimalkan adsorpsi tidak spesifik. Konsentrasi APTES atau GNP yang lebih tinggi mengakibatkan kerumunan permukaan dan positif palsu.

Seleksi Ukuran

GNP 15 nm menawarkan keseimbangan terbaik antara luas permukaan dan stabilitas koloid, mencapai OD yang sebanding dengan partikel 80 nm tetapi dengan agregasi yang lebih sedikit.

Verifikasi Spesifikitas

Kontrol C1–C3 menghasilkan OD yang dapat diabaikan, sedangkan uji spesifik (S) menghasilkan perubahan warna yang kuat, mengonfirmasi bahwa sinyal timbul dari binding FIX–antibodi yang benar.

Sensitivitas yang Ditingkatkan

Gambar 5 menunjukkan peningkatan LOD yang dramatis. Metode GNP-FIX yang dicampur memungkinkan deteksi visual hingga 200 pM, sedangkan ELISA konvensional membutuhkan >3 nM. Densitas antigen yang ditingkatkan dan amplifikasi plasmonik mendasari peningkatan performa ini.

Aplikasi Serum

Deteksi FIX dalam serum 1:640 (125 pM) tercapai tanpa gangguan dari protein serum yang berlimpah, menekankan relevansi praktis metode ini untuk diagnostik klinis.

Komplementasi IDE

Deteksi elektrokimia menggunakan kimia permukaan yang sama menghasilkan LOD 25 pM, melebihi ELISA empat kali lipat. Pengenceran serum 1:1280 menghasilkan perpindahan arus yang dapat diukur, memvalidasi platform IDE untuk pengujian di titik perawatan.

Kesimpulan

Kimia permukaan yang dibantu GNP secara signifikan meningkatkan batas deteksi FIX di seluruh uji optik dan elektrokimia. Pengurangan LOD 60 kali lipat dibandingkan ELISA konvensional, bersama dengan deteksi serum yang berhasil, memosisi pendekatan ini sebagai alat serbaguna untuk diagnosis gangguan pembekuan darah dan potensialnya untuk biomarker konsentrasi rendah lainnya.

Ketersediaan Data dan Bahan

Semua data eksperimental tersedia tanpa keterbatasan.

Singkatan

APTES

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

BSA

Albumin serum sapi

ELISA

Uji imunosorben terkait enzim

GNP

Nanopartikel emas

HRP

Peroksidase perakaran

IDE

Elektroda interdigitated

FIX

Faktor IX