Pengiriman Kanker Terarah: Dekorasi Nanovesikel dengan pHLIP untuk Pengenalan Lingkungan Tumor Asam
Abstrak
Kekasaran pada permukaan sel kanker adalah ciri khas lingkungan tumor, yang tidak bergantung pada perfusi tumor, sehingga dapat berfungsi sebagai biomarkernya umum untuk menargetkan sel kanker. Kami menggunakan peptid pH rendah penyisipan (pHLIP) untuk menghiasi liposom dan niosom. pHLIP merasakan pH pada permukaan sel kanker dan menyisipkan ke dalam membran sel yang ditargetkan, serta membawa nanomaterial ke kedekatan membran sel. Liposom DMPC dan niosom Tween 20 atau Span 20 dengan dan tanpa pHLIP dalam lapisannya sepenuhnya dikarakterisir untuk mendapatkan pemahaman dasar tentang fitur nanokarier dan memfasilitasi desain rasional vektor nano yang sensitif keasaman. Stabilitas sampel seiring waktu dan dalam kehadiran serum telah divalidasi. Ukuran, potensi zeta, dan morfologi vektor nano, serta kemampuan mereka untuk menangkap sondah hidrofil dan mengatur rilisnya, telah diselidiki. Vsesikel yang dihiasi pHLIP dapat berguna untuk mendapatkan rilis (dimodifikasi) yang panjang dari zat biologis aktif untuk menargetkan tumor dan jaringan penyakit asam lainnya.
Pendahuluan
Lebih dari satu abad yang lalu, Paul Ehrlich mengemukakan ide untuk mewujudkan "peluru ajaib" untuk pengiriman obat yang lebih spesifik dan efektif [1]. "Peluru ajaib" harus dapat melindungi obat yang dikirim dari lingkungan yang keras, mengurangi efek samping dengan menargetkan obat ke jaringan yang sakit, meningkatkan farmakokinetik dan farmakodinamik obat, dan mengatur rilis obat [2].
Pada tahun 1965, Bangham mengamati vesikel berbasis fosfolipid untuk pertama kalinya [3] dan, dalam tahun-tahun berikutnya, Gregory Gregoriadis mendirikan konsep bahwa liposom dapat mengenkapsulasi obat dan kemudian digunakan sebagai sistem pengiriman obat. Secara khusus, mereka terdiri dari lapisan fosfolipid tertutup (lamellae), di mana rantai lipid hidrofobik tertutup di antara dua lapisan kepala hidrofilik. Lapisan tertutup ini mengelilingi inti air, sehingga memungkinkan pelokalan obat hidrofobik atau hidrofilik masing-masing [4, 5].
Ukuran liposom adalah parameter kritikal dalam mempengaruhi nasib karier setelah administrasi, dalam hal penyerapan protein plasma, pengenalan oleh sistem endotel retikuloendotel (RES), waktu sirkulasi sirkulasi, dan traffik seluler. Karier berukuran nano dapat mendukung internalisasi sel dan target tumor, sehingga banyak peneliti telah berfokus pada "nanoisasi" [6,7,8,9].
Untuk mendapatkan nanokarier yang lebih serbaguna dan lebih hemat biaya, tensioaktiv sintesis telah digunakan untuk mendapatkan sistem pengiriman obat seperti liposom. Tensioaktiv non-ionik banyak digunakan untuk tujuan ini, dan mampu menyusun diri sendiri menjadi vesikel unilamelar atau multilamelar (non-ionic liposomes, niosom, atau vesikel tensioaktiv non-ionik). Ester sorbitan (Span®) adalah bahan lipofilik yang banyak digunakan dalam pembuatan niosom. Untuk memperpanjang waktu sirkulasi vesikel dan mendapatkan nanokarier "stealth", integrasi polietilena glikol (PEG) adalah pendekatan standar emas: melalui konjugasi ini, ester sorbitan etoksietilasi (Tweens®) diperoleh. Baik Span maupun Tween ditandai dengan nilai keseimbangan hidrofilik/lipofilik (HLB) yang berbeda dan pilihan tensioaktiv memungkinkan pembuatan niosom dengan properti yang diinginkan [10]. Selain itu, penambahan kolesterol digunakan untuk meningkatkan stabilitas lapisan dengan meregangkan ekor tensioaktiv, mempengaruhi suhu transisi fase gel ke cair tensioaktiv, dan memberikan kekakuan pada lapisan lipofilik [11, 12]. Nanokarier yang "dioptimalkan" dirancang untuk meningkatkan formulasi dan/atau meningkatkan target [10].
Saat ini, kanker adalah salah satu penyebab kematian utama di dunia. Pendekatan terapeutik saat ini memiliki sejumlah keterbatasan termasuk pengiriman obat yang tidak efisien ke tumor dan kurangnya target tumor yang terkait dengan efek samping yang tidak diinginkan dan berbahaya, yang pendekatan nanoteknologi mungkin membantu untuk mengatasi [13].
Saat ini, berbagai pendekatan targeting sedang dikembangkan. Sebagian besar berdasarkan pada targeting biomarker tertentu yang overexpressed pada permukaan sel kanker. Namun, karena fakta bahwa tumor manusia sangat heterogen, pendekatan targeting tumor yang lebih umum akan jauh lebih menguntungkan. Kekasaran pada permukaan sel kanker adalah ciri khas lingkungan tumor, dan tidak bergantung pada perfusi tumor, sehingga dapat berfungsi sebagai biomarker umum untuk menargetkan sel kanker [14]. Teknologi peptid pH rendah penyisipan (pHLIP) sedang berkembang pesat untuk targeting imaging dan molekul kecil terapeutik, serta nanomaterial ke tumor. pHLIP merasakan pH pada permukaan sel kanker dan menyisipkan ke dalam membran sel yang ditargetkan [15, 16]. Mekanisme penyisipan pHLIP dipicu oleh protonasi residu bermuatan negatif peptid pada pH rendah (pH < 7,0). Ini menghasilkan peningkatan hidrofobisitas peptid sehingga menggeser kesetaraan terhadap partisi peptid ke dalam lapisan [17]. Nanokarier yang dihiasi pHLIP kompatibel biologis, dapat menargetkan tumor, dan menunjukkan penyerapan seluler yang ditingkatkan oleh sel kanker. Di antara nanopartikel yang dilapisi pHLIP yang telah diselidiki adalah nanomaterial berbasis lipid, polimer, dan logam [18,19,20,21].
Tujuan dari penelitian saat ini adalah untuk sepenuhnya mengkarakterisir nanokarier vesikular baru yang dihiasi pHLIP untuk mendapatkan pemahaman dasar tentang fitur nanokarier dan memfasilitasi desain rasional vektor nano yang sensitif keasaman.
Bahan dan Metode
Bahan
Polioksietilenasorbitan monolaurat (Tween 20), sorbitan monolaurat (Span 20), kolesterol (Chol), garam Hepes {N-(2-idroxyethyl) piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid)}, serum manusia, Sephadex G-75, kalsin, dan difenilheksatrien (DPH) dibeli dari Sigma-Aldrich. 1,2-Dimiroistol-sn-gliserol-3-fosfokolin (DMPC) dan 1,2-dioleoyl-sn-gliserol-3-fosfoetanolamina-N-[4-(p-maleimidofenil)butiramida] garam natrium (DSPE-maleimide) dibeli dari Avanti Polar Lipids dan piren diperoleh dari Fluka. Peptid pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) disintesis dan difurnirkan oleh CS Bio. Semua produk dan reagen lainnya adalah kelas analitik.
Sintesis DSPE-pHLIP
pHLIP dikonjugasikan dengan lipid DSPE dalam metanol melalui konjugasi kovalen DSPE-maleimide dengan residu sistein tunggal di N-terminus pHLIP, seperti yang telah dijelaskan sebelumnya [18, 21, 22]. Secara singkat, 5 mg peptid dilarutkan dalam 250 μL metanol (ditiumkan dengan argon) dan DSPE-maleimide (dari larutan stok 9,9 mM) dilarutkan dalam kloroform dicampur pada ras mol 1:1. Campuran reaksi disimpan pada suhu ruangan selama sekitar 2–6 jam hingga konjugasi selesai. Kemajuan reaksi dalam konjugasi DSPE-malemide dengan pHLIP dipantau oleh RP-HPLC menggunakan gradien dari 25 hingga 80% asetonitril dalam air yang mengandung 0,05% TFA dengan memantau penurunan puncak yang sesuai dengan pHLIP tanpa label dalam campuran reaksi. Konstruksi yang disintesis dikarakterisir dengan spektrometri massa SELDI-TOF. Konsentrasi konjugat DSPE-pHLIP ditentukan oleh absorptansi menggunakan koefisien absorpsi moler untuk pHLIP: ε280 = 13,940 M−1 cm−1.
Persiapan dan Pemurnian Vesikel
Metode penguapan lapisan tipis digunakan untuk memproduksi vesikel tensioaktiv non-ionik (dari Tween 20 atau Span 20) dan fosfolipid (dari DMPC), dengan dan tanpa pHLIP. Dalam setiap formulasi vesikel, kolesterol ditambahkan dalam ras mol yang berbeda (Tabel 1) [23].
Komposisi sampel telah dioptimalkan dengan memilih struktur yang telah baik dikarakterisir sebelumnya [24, 25] di mana jumlah pHLIP yang sama telah ditambahkan.
Komponen lipofilik pertama kali dilarutkan dalam campuran CHCl3:CH3OH (3:1); pelarut organik kemudian dihilangkan dalam vakum pada suhu yang berbeda tergantung pada sampel. Film yang dihasilkan dihidrasi dengan 5 mL buffer Hepes (0,01 M pH 7,4) atau larutan kalsin natrium 10−2 M. Suspensi diaduk dengan vortex selama sekitar 5 menit, diikuti dengan sonikasi (lihat File Tambahan 1: Tabel S1, informasi pendukung) menggunakan mikroson yang beroperasi pada 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). Sonikasi LipoDMPC dilakukan dalam atmosfer inersia untuk mencegah oksidasi.
Suspensi vesikel kemudian dipurnikan dengan kromatografi gel permeasi menggunakan Sephadex G-75 (kolom kaca 50 × 1,2 cm) dan buffer Hepes sebagai eluen. Setelah itu, suspensi vesikel yang dipurnikan difilter dengan menggunakan filter selulosa dengan diameter pori yang sesuai.
Metode persiapan yang sama digunakan untuk memproduksi niosom dan liposom yang dilapisi pHLIP.
Pengukuran Pencaharan Cahaya Dinamis
Rata-rata ukuran dan distribusi ukuran vesikel diukur pada T = 25 °C oleh pencaharan cahaya dinamis (DLS), menggunakan Malvern NanoZetaSizer ZS90, dilengkapi dengan laser HeNe 5 mW (panjang gelombang λ = 632,8 nm) dan korelator digital. Fungsi autokorelasi ternormalisasi dari intensitas berserakan pada sudut 90° dianalisis dengan algoritma Contin untuk mendapatkan distribusi koefisien difusi partikel D, sehingga distribusi radius hidrodinamik efektif RH dari vesikel melalui hubungan Stokes-Einstein RH = KBT/6πηD, di mana KBT adalah energi termal dan η adalah viskositas pelarut. Lebar distribusi ukuran niosom/liposom cukup kecil tetapi tidak dapat diabaikan. Nilai yang dilaporkan dalam Tabel 2 sesuai dengan diameter hidrodinamik rata-rata yang diukur dengan intensitas partikel [26].
Pengukuran Potensi Zeta
Pengukuran mobilitas elektroforetik dilakukan dengan teknik elektroforesis Doppler laser, menggunakan aparatur Malvern NanoZetaSizer ZS90. Mobilitas u dikonversi menjadi potensi ζ menggunakan hubungan Smoluchowski ζ = uη/є, di mana η dan є adalah viskositas dan permitivitas fase pelarut, masing-masing [27].
Pencaharan Sinar X Sudut Kecil
Eksperimen pencaharan sinar X sudut kecil (SAXS) dilakukan di fasilitas radiasi sinkrotron Eropa (ESRF, Grenoble, Prancis). Penggunaan jalur cahaya ID02 cemerlang memungkinkan pengukuran pada larutan cair dalam daerah transfer momentum 0,1 nm−1 ≤ q ≤ 6 nm−1, q = (4π/λ)sin(θ/2), di mana θ adalah sudut pencaharan dan λ = 0,1 nm panjang gelombang sinar X. Skala panjang yang diteliti berada antara 1 dan 60 nm, cocok untuk mengakses struktur internal vesikel niosomal dan liposomal. Semua eksperimen dilakukan pada T = 25 °C dengan waktu iradiasi pendek, 0,1 s, untuk mencegah kerusakan radiasi. Untuk setiap sampel, intensitas berserakan pada sudut pencaharan yang berbeda ditangkap pada detektor 2D, kemudian dikelompokkan secara sudut, dikurangi untuk latar belakang dan kontribusi pelarut, dan dianalisis untuk mendapatkan informasi tentang bentuk dan struktur internal vesikel dalam larutan.
Dalam kasus vesikel unilamelar, lapisan bilar tertutup dimodelkan dengan tiga cangkang konsentrik yang sesuai dengan kepala eksternal, rantai hidrofobik, dan kepala internal. Distribusi Schulz untuk ukuran vesikel diasumsikan.
Cryo-TEM
Tetesan larutan vesikel (5 μL) disebarkan pada grid mikroskop elektron Lacey formar/carbon dan dipertahankan dalam kondisi hidrasi beku dengan pembekuan cepat dalam etana cair. Proses vitrifikasi dilakukan menggunakan sistem FEI Vitrobot dengan pengaturan satu blot 3 s, offset 1, dan waktu drain dan tunggu 1 s. Mikroskop elektron transmisi (TEM) (JEOL 2100) dengan tegangan percepatan 200 kV pada pembesaran dalam rentang × 10.000 hingga × 150.000 digunakan untuk mengambil gambar vesikel.
Stabilitas Studi
Studi stabilitas fisik niosom dan liposom, yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP, dilakukan pada dua suhu penyimpanan yang berbeda (25 °C dan 4 °C). Tujuannya untuk mengevaluasi apakah terjadi perubahan signifikan dalam ukuran dan potensi zeta dari dispersi vesikel selama periode 90 hari. Sampel dari setiap batch diambil pada interval waktu tertentu (1, 30, 60, dan 90 hari) dan ukuran serta potensi zeta vesikel ditentukan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya.
Demikian pula, stabilitas vesikel juga diselidiki dalam kehadiran cairan biologis, seperti serum manusia. Suspensi dihubungkan dengan 45% serum manusia pada 37 °C. Pada interval waktu tertentu (0, 30 menit, 1 jam, 2 jam, dan 3 jam), variasi ukuran dan potensi zeta vesikel ditentukan seperti yang telah dijelaskan.
Karakterisasi Bilayer
Fluida dan mikroviskositas-polaritas bilayer niosomal dan liposomal diakses dengan pengukuran fluoresensi dua sondah fluoresen, difenilheksatrien (DPH) dan piren, masing-masing, yang terletak di wilayah hidrofobik bilayer membran. Baik DPH (2 mM) dan piren (4 mM), 220 μL dan 2,5 mg masing-masing, ditambahkan ke dalam campuran tensioaktiv atau fosfolipid/kolesterol sebelum pembuatan vesikel [28]. Selanjutnya, vesikel yang dimuat piren dipurnikan seperti yang telah dijelaskan sebelumnya, sedangkan vesikel yang dimuat DPH difilter melalui ukuran pori yang progresif lebih kecil (dari 5,0 hingga 0,22 μm).
Pengukuran anizotrofi fluoresensi dilakukan pada suhu ruangan menggunakan spektrofluorometer LS55 (PerkinElmer, MA, USA) pada λexc = 400 nm dan λem = 425 nm dan anizotrofi fluoresensi (A) dari sampel dihitung menurut persamaan berikut [29]: $$ A=\frac{I_{vv}-{I}_{vh\kern0.5em }x\ G}{I_{vv}+2{I}_{vh}\ x\ G} $$
di mana Ivv dan Ivh adalah intensitas fluoresensi yang dihasilkan (satuan arbitrer), masing-masing, sejajar dan tegak lurus terhadap arah cahaya eksitasi terpolarisasi vertikal. Faktor koreksi G = Ihv/Ihh adalah rasio antara komponen emisi terpolarisasi vertikal dan horizontal ketika cahaya eksitasi terpolarisasi horizontal. Nilai anizotrofi fluoresensi berbanding terbalik dengan fluida membran. Oleh karena itu, nilai anizotrofi fluoresensi yang tinggi sesuai dengan urutan struktural yang tinggi dan/atau fluida membran rendah [30].
Untuk mengevaluasi mikroviskositas dan mikropolaritas bilayer vesikel, eksperimen fluoresensi dengan piren dilakukan dengan spektrofluorometer Perkin-Elmer LS55 pada λexc = 330 nm, mencatat spektrum emisi dalam rentang 350 < λem < 550 nm [28]. Struktur halus fluoresensi piren menyajikan lima puncak. Rasio antara intensitas puncak pertama (372 nm) dan ketiga (382 nm) puncak getaran spektrum fluoresensi piren, I1/I3, berkaitan dengan polaritas lingkungan piren [31]. Memang, nilai rendah dari rasio I1/I3 sesuai dengan lingkungan nonpolar. Selanjutnya, molekul piren yang disisipkan ke dalam bilayer vesikel dapat membentuk eksimer intramolekuler dan proses ini sensitif terhadap viskositas mikroenvirontemen sondah [32]. Oleh karena itu, rasio intensitas fluoresensi eksimer/monomer, IE/IM, berkaitan dengan mikroviskositas.
Studi ini dilakukan pada vesikel yang disiapkan baik dengan maupun tanpa pHLIP dan hasil yang diperoleh kemudian dibandingkan.
Studi Rilis Kalsin
Vesikel tensioaktiv non-ionik atau fosfolipid dimuat dengan kalsin pada konsentrasi 10−2 M. Pada konsentrasi ini, fluoresensi kalsin sendiri-diperlambat [33]. Pengukuran dekuenching kemudian digunakan untuk menentukan rilis kalsin dari inti air vesikel. Sondah fluoresen dimuat ke dalam vesikel selama hidrasi film tipis dengan penambahan 5 mL larutan air kalsin. Suspensi vesikel dipurnikan dengan kromatografi gel permeasi, dihubungkan dengan 45% serum manusia atau Hepes, dan kemudian dimuat dalam kantong dialisis selulosa (bobot molekuler potong 8.000 Da dari Spectra/Por®). Eksperimen rilis dilakukan pada 37 °C, di bawah pengadukan magnetik dalam buffer Hepes (10 mM, pH 7,4) sebagai medium eksternal. Aliquot medium eksternal ditarik pada waktu yang berbeda selama 0–24 jam. Dari waktu ke waktu, aliquot yang ditarik dimasukkan kembali ke dalam sistem [34].
Rilis kalsin dipantau dengan pengukuran fluoresensi medium menggunakan spektrofluorometer Perkin-Elmer LS50B dengan λex = 492 dan λem = 520 nm. Nilai referensi F∞ (satuan arbitrer), yang berkaitan dengan jumlah kalsin total yang terkandung dalam vesikel [35], ditentukan setelah kegagalan vesikel menggunakan alkohol isopropil (1:1 v/v). Persentase rilis (F%) pada setiap titik waktu diperoleh menggunakan persamaan berikut:
$$ F\%={F}_t/{F}_{\infty }x\ 100 $$
di mana Ft (satuan arbitrer) adalah fluoresensi yang dibaca pada titik waktu tertentu t.
Analisis Statistik
Satu jalur ANOVA digunakan untuk analisis statistik. Uji t Bonferroni a posteriori dilakukan untuk mengevaluasi signifikansi statistik uji ANOVA. Nilai p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Hasil adalah rata-rata dari tiga eksperimen ± deviasi standar.
Hasil dan Pembahasan
Vesikel Tween20-, Span20-, dan DMPC-, disiapkan dengan dan tanpa DSPE-pHLIP, dikarakterisir untuk ukuran dan potensi zeta (Tabel 2).
Menurut hasil yang ditampilkan dalam Tabel 2, sampel yang dianalisis tidak menunjukkan variasi signifikan baik dalam ukuran maupun potensi zeta, terlepas dari kehadiran pHLIP.
Rentang ukuran yang telah dilaporkan di atas dikonfirmasi dengan teknik analisis yang berbeda, seperti cryo-TEM (Fig. 1).
Gambar cryo-TEM representatif dari niosom dan liposom yang dilapisi pHLIP. Gambar niosom NioSpan20-pHLIP (a) dan liposom LipoDMPC-pHLIP (b) yang diperoleh pada pembesaran × 10.000 dan liposom LipoDMPC-pHLIP (c) yang diperoleh pada pembesaran × 40.000
Struktur internal niosom/vesikel dengan dan tanpa DSPE-pHLIP ditentukan oleh eksperimen SAXS. Spektra intensitas SAXS, yang ditampilkan dalam Fig. 2, berbeda, yang menunjukkan bahwa setiap sistem memiliki fitur khas.
Spektra SAXS. Spektra intensitas niosom/vesikel tanpa (simbol terbuka hitam) dan dengan DSPE-pHLIP (simbol berwarna)
Niosom berbasis Tween20 adalah unilamelar, sementara vesikel DMPC menampilkan tingkat multi-lamelaritas tertentu (seperti liposom), seperti yang ditunjukkan oleh kehadiran puncak khas pada q ≅ 1 nm−1, yang sesuai dengan jarak antar-lapis 6 nm (sekitar 5 nm lapisan lipid dan 1 nm air). Vesikel berbasis Span20 pasti multi-lamelar, dengan puncak khas pada q = 1,6 nm−1 yang sesuai dengan jarak antar-lapis 3,8 nm, yang cocok dengan dua kali panjang molekul Span20. Hasil menunjukkan bahwa lapisan multi-lapisan dari vesikel Span20 terdiri dari lapisan bersebelahan dengan hampir tidak ada air antar-lapis.
Kehadiran DSPE-pHLIP (kurang dari 1% fraksi mol) tidak secara dramatis mempengaruhi sistem. Intensitas berserakan di semua rentang q yang diteliti cukup serupa, yang menunjukkan fraksi materi terstruktur yang serupa dan ukuran keseluruhan partikel vesikular yang serupa.
Vesikel berbasis DMPC menunjukkan peningkatan ringan dalam jumlah lapisan dalam liposom, seperti yang dapat disimpulkan dari peningkatan intensitas puncak Bragg pada q = 1 nm−1. Penyisipan fraksi rendah rantai C18 DSPE, yang terhubung dengan setiap molekul peptid, tidak mengubah ketebalan lapisan lipid, dan terutama ditentukan oleh fraksi besar kolesterol dibandingkan DMPC (sekitar 40–50%). Pada konsentrasi kolesterol ini, rantai lipid terorganisir dalam fase cair terurut (Lo), dan ditandai dengan pemisahan urutan posisi lateral lemah dari rantai terhadap urutan orientasi tinggi sepanjang rantai dan mampu menampung beberapa rantai C18 tanpa perubahan struktural [36]. Juga vesikel multi-lapisan berbasis Span20 tidak menunjukkan perubahan dalam struktur internalnya.
Dalam sistem Tween20 + pHLIP, terdapat sejumlah kristalit kolesterol, seperti yang ditunjukkan oleh puncak tajam khas pada q = 1,84 nm−1 (jarak khas 3,41 nm), dan struktur vesikel tidak terpengaruh. Kehadiran beberapa mikro-kristalit sering kali ditemukan terkait dengan niosom berbasis Tween [37] dalam jumlah yang bergantung pada komposisi, prosedur persiapan, dan pemurnian. Dalam Gambar 2, dua spektral eksperimental dari vesikel Tween20 dan Tween20 + pHLIP ditampilkan bersama dengan kurva pemasangan yang diperoleh dengan memodelkan lapisan bilar tertutup sféris dengan tiga cangkang konsentrik: kepala eksternal, rantai, dan kepala internal. Rata-rata ukuran vesikel yang dipasang adalah sekitar 168 nm dalam kedua sistem, sesuai dengan hasil DLS. Parameter struktural sama untuk kedua lapisan bilar tertutup (lihat File Tambahan 1: Gambar S1 dan Tabel S2) kecuali untuk cangkang eksternal: dalam kehadiran DSPE-pHLIP, penurunan ringan (5%) densitas elektron kepala diamati (dari 0,42 menjadi 0,40 e/Å3), bersama dengan peningkatan kekasaran lapisan. Hasil ini menunjukkan bahwa penambahan DSPE-pHLIP terutama mempengaruhi cangkang eksternal vesikel. Ini konsisten dengan gambar di mana rantai C18 DSPE menyisipkan ke dalam lapisan bilar dan menambatkan peptid ke permukaan vesikel, di antara kelompok glikol etilena yang diperluas dan bertambah. Kami mencatat bahwa kemampuan peptid pHLIP itu sendiri (yang tidak terhubung dengan molekul lipid) untuk berinteraksi dengan permukaan eksternal vesikel pada pH tinggi dan menyisipkan ke dalam lapisan bilar pada pH rendah telah baru saja diamati oleh SAXS dalam kasus lapisan fosfolipid tidak jenuh [38]. Dalam penelitian saat ini, fraksi mol peptid jauh lebih rendah dan peptid terhubung dengan lipid, karena tujuannya adalah merancang vektor nano obat pHLIP yang dilapisi dan sensitif pH. Asosiasi pHLIP didorong oleh interaksi hidrofobik rantai C18 DSPE yang dikonjugasi menyisipkan ke dalam wilayah hidrofobik vektor nano. Peptid pHLIP ditambatkan dan berada di wilayah kepala eksternal, cenderung berinteraksi dengan membran target pada pH asam dan/atau melepaskan isi vektor nano setelah susunan ulang lapisan bilar dalam lingkungan pH rendah.
Untuk menyelidiki apakah kehadiran pHLIP dapat mempengaruhi properti mikrorheologi lapisan bilar (fluida, mikroviskositas, dan polaritas), dilakukan karakterisasi lapisan lipofilik. Studi karakterisasi dilakukan dengan menggunakan sondah fluoresen lipofilik, piren, yang ditambahkan ke dalam sampel pada awal proses persiapan. Karena sifat lipofiliknya, piren menyisipkan ke dalam lapisan bilar vesikel dan memberikan informasi tentang polaritas dan mikroviskositas lingkungan membran.
Seperti yang ditampilkan dalam Tabel 3, dalam semua tiga himpunan sampel, nilai polaritas hanya sedikit menurun dalam kehadiran pHLIP dibandingkan vesikel tanpa pHLIP, sementara nilai mikroviskositas menunjukkan peningkatan tiga kali lipat, untuk semua vesikel.
Lapisan bilar lebih dikarakterisir dengan pengukuran anizotrofi fluoresensi dari sondah fluoresen lipofilik lain, DPH, yang disisipkan ke dalam lipid. Pengukuran ini mencerminkan gerakan dan orientasi sondah dalam lapisan bilar yang memberikan informasi tentang fluida lapisan bilar yang dapat mempengaruhi kemampuan vesikel untuk melepaskan isinya [29]. Nilai anizotrofi fluoresensi berbanding terbalik dengan fluida membran. Oleh karena itu, nilai anizotrofi fluoresensi yang tinggi sesuai dengan urutan struktural yang tinggi dan/atau fluida membran rendah, seperti dalam fase cair-terurut [30].
Nilai anizotrofi untuk setiap sampel ditampilkan dalam Tabel 3. Data menunjukkan bahwa kehadiran DSPE-pHLIP dalam vesikel meningkatkan fluida membran, karena anizotrofi fluoresensi menurun. Diketahui bahwa fluida lapisan bilar tidak hanya dipengaruhi oleh urutan dan organisasi lateral rantai apolar tetapi juga oleh kelompok polar [31]. Hasil SAXS pada tiga sistem yang berbeda menunjukkan bahwa molekul DSPE-pHLIP mempengaruhi terutama wilayah kepala, yang pada akhirnya menyebabkan pengemasan yang berbeda dari kepala polar. Hasil struktural tampaknya cocok dengan properti mikrorheologi lapisan bilar dalam kehadiran DSPE-pHLIP yang terasosiasi seperti yang diungkapkan oleh penyisipan dua sondah yang berbeda. Hasil menunjukkan peningkatan mikroviskositas seperti yang diungkapkan oleh piren, sondah yang dapat menyisipkan di dekat wilayah luar (log P piren adalah 4,88). Di sisi lain, DPH diasumsikan tersemat di inti lapisan bilar, berorientasi sejajar dengan sumbu rantai asil lipid atau dibatasi di pusat lapisan bilar, sejajar dengan permukaan. DPH sangat sensitif terhadap reorientasi sudut rantai asil amfifil [39]. Peningkatan fluida, seperti yang diungkapkan oleh DPH, dapat terkait dengan efek penyisipan rantai DSPE di antara rantai asil lainnya dan dengan efek partisi pHLIP di wilayah kelompok polar, mengubah properti pengemasan tensioaktiv. (Fig. 3).
Representasi interaksi pHLIP dengan membran vesikel
Studi karakterisasi lebih lanjut dilakukan pada persiapan yang diteliti. Semua sampel, yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP, disimpan selama 90 hari pada suhu 4 °C untuk mengevaluasi stabilitas vesikel seiring waktu, dengan mengukur variasi ukuran dan potensi zeta (File Tambahan 1: Gambar S2). Tidak ada variasi signifikan dalam ukuran dan potensi zeta yang diamati selama eksperimen; oleh karena itu, semua persiapan yang diteliti dianggap stabil jika disimpan pada suhu 4 °C.
Selain itu, stabilitas sampel diselidiki dalam kehadiran 90% (v/v) serum manusia dan disimpan pada 37 °C selama 3 jam (File Tambahan 1: Gambar S3).
Dalam kontak dengan serum manusia, vesikel Tween20 menunjukkan peningkatan ukuran, meskipun tetap di bawah 300 nm. Nilai ukuran dan PDI diukur konstan selama eksperimen 3 jam, yang menunjukkan bahwa vesikel dalam suspensi tetap utuh selama seluruh eksperimen.
Kedua sampel Span20 dalam kontak dengan serum manusia menunjukkan peningkatan ukuran, terutama dalam persiapan dengan pHLIP, sementara nilai PDI menunjukkan distribusi ukuran yang homogen (data tidak ditampilkan). Kejadian ini dapat disebabkan oleh penyerapan protein plasma pada permukaan niosom, sebagai hasil interaksi elektrostatis, namun tanpa menyebabkan kerusakan vesikel. Hipotesa ini didukung oleh penurunan potensi zeta setelah kontak vesikel dengan serum manusia. Fenomena ini terjadi ketika potensi zeta mencapai nilai sedikit negatif, sekitar area netral, yang membuat sistem tidak stabil, dan vesikel mulai mengagregasi.
Seperti Tween20, vesikel DMPC menunjukkan peningkatan ukuran dibandingkan sampel sebelum kontak. Namun, variasi ini ternyata tidak signifikan dan nilai ukuran tetap di bawah 280 nm (DMPC) atau di bawah 240 nm (DMPC + pHLIP).
Kemampuan rilis dievaluasi untuk sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP dengan mengikuti jumlah kalsin (sondah hidrofil) yang dilepaskan dari vesikel seiring waktu.
Studi dilakukan pada suhu 37 °C selama periode waktu 24 jam, dengan mengekspos sampel yang telah difurnirkan dengan buffer HEPES atau serum manusia. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, profil rilis kalsin sangat serupa baik untuk Tween20 maupun Tween20-pHLIP dalam buffer HEPES atau serum manusia.
Profil rilis kalsin. NioTween20 dan NioTween20-pHLIP yang dihubungkan dengan buffer HEPES (a) atau serum manusia (b)
Jumlah kalsin yang dilepaskan berada antara 30 dan 50% yang menunjukkan tidak ada perbedaan dalam kemampuan rilis antara sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP.
Hasil yang sama telah diperoleh untuk sampel Span dan DMPC (data tidak ditampilkan).
Profil rilis yang serupa telah dilaporkan untuk berbagai nanokarier respons rangsangan, seperti kubosom sensitif suhu [40] atau nanokarier polimer yang menyusun diri sendiri (SANs) [41, 42].
Dalam kesimpulan, perbedaan fisiko-kimia yang diamati dalam hal mikroviskositas dan fluida untuk sampel yang disiapkan dengan dan tanpa pHLIP (Tabel 3) tidak mempengaruhi kemampuan rilisnya (Gambar 4), sesuai dengan bukti bahwa penyisipan molekul DSPE-pHLIP terutama mempengaruhi wilayah kelompok. Data ini sesuai dengan hasil yang telah dilaporkan sebelumnya yang menunjukkan bahwa pada pH netral dan tinggi, pHLIP terikat pada permukaan liposom yang dibuat dari 1-Palmitoil-2-oleoil-sn-gliserol-3-fosfokolin (POPC) dan tidak menginduksi fuesi atau kebocoran membran.
Kesimpulan
Studi ini mengonfirmasi kemungkinan pembuatan vesikel yang dihiasi pHLIP. Sampel stabil jika disimpan pada suhu 4 °C selama setidaknya 3 bulan dan dalam kehadiran serum. Selain itu, vektor nano yang diusulkan mampu menangkap sondah hidrofil dan mengatur rilisnya.
Vesikel pHLIP sepenuhnya dikarakterisir untuk mendapatkan pemahaman dasar tentang fitur nanokarier dan memfasilitasi desain rasional vektor nano yang sensitif keasaman.
Asosiasi pHLIP didorong oleh interaksi hidrofobik rantai C18 DSPE yang dikonjugasi menyisipkan ke dalam wilayah hidrofobik vektor nano. Peptid pHLIP ditambatkan dan berada di wilayah kelompok eksternal, cenderung berinteraksi dengan membran target pada pH asam dan/atau melepaskan isi vektor nano setelah susunan ulang lapisan bilar dalam lingkungan pH rendah.
Menurut temuan ini, vesikel pHLIP yang diusulkan dapat berguna untuk mendapatkan rilis (dimodifikasi) yang panjang dari zat biologis aktif untuk menargetkan tumor dan jaringan penyakit asam lainnya.
