Pencitraan Biologis Multiplexing Hyperspectral dari Nanoprobe yang Memancar di Wilayah Inframerah Gelombang Pendek

Metode

Persiapan dan Karakterisasi Nanoformulasi

Sintesis Nanopartikel Cangkang Inti Polimer yang Diisi dengan Pewarna NIR-SWIR Neon Organik

Polistirena (PS)-poli-N -isopropilakrilamida (PNIPAM) inti-shell nanopartikel disintesis oleh polimerisasi mikroemulsi, dengan modifikasi metode yang dijelaskan sebelumnya [44, 45]. Pertama, nanopartikel inti PS-co-PNIPAM (10 wt.% dari PNIPAM) disiapkan sebagai berikut. NIPAM (0,1 g), natrium dodesil sulfat SDS (0,1 g), dan 0,005 g NaH₂ PO₄ × H₂ O dilarutkan dalam 45 ml H₂ O. Styrene (1 g) ditambahkan setetes demi setetes dengan pengadukan kuat ketika suhu dinaikkan menjadi 60 °C. Sebagai langkah berikutnya Ar digelembungkan ke dalam campuran selama 30 menit, suhu dinaikkan menjadi 70 °C, dan 0,08 g K₂ S₂ O₈ dilarutkan dalam 1 ml H₂ O disuntikkan untuk memulai polimerisasi. Kedua, shell PNIPAM dilapisi ke inti PS-co-PNIPAM. Untuk tujuan ini, reaktor ditambahkan larutan monomer NIPAM (1,8 g) dan pengikat silang N ,T -methylenebisacrylamide (BIS) (0,18 g) dalam 4 ml H₂ O menggunakan jarum suntik. Reaksi dibiarkan berlanjut selama 4  jam pada 70 °C. Campuran didinginkan sampai suhu kamar dan didialisis selama 74 h menggunakan membran selulosa dengan MWCO 3500 Da. Akibatnya, suspensi nanopartikel PS-PNIPAM dibuat; struktur kulit-inti nanopartikel terlihat jelas oleh gambar mikroskop elektron transmisi (TEM) (Gbr. 3a). Untuk mendapatkan PNP fluoresen NIR-SWIR, 2-butil-6-[5-(2-butil-1,3-dimetilsiklo-hepta[c]pirol-6(2H)-ilidena)penta-1,3-dien -1-yl]-1,3-dimethylcyclohepta[c]pyrrolium tetra-fluoroborate (diberi label sebagai JB9-08) pewarna fluoresen [46] telah dimuatkan [47] ke nanopartikel PS-PNIPAM. Delapan mikroliter larutan pewarna 1 mM JB9-08 dalam DMF ditambahkan ke 2 mL suspensi air PNPs 0,25 wt% dan disimpan selama 24 jam sebelum digunakan.

Sintesis RENP Core-Shell

RENP disintesis mengikuti protokol yang dimodifikasi yang dilaporkan di tempat lain [48]. Pertama, -NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% T ³⁺ nanopartikel inti disiapkan melalui dekomposisi trifluoroasetat logam pada suhu tinggi. Dalam prosedur umum, 0,05 mmol Yb₂ O₃ , 0,15 mmol Nd₂ O_3, dan 0,25 mmol Y₂ O₃ dimasukkan ke dalam labu 250 ml yang berisi 5 ml air deionisasi dan 5 ml TFA dan dipanaskan hingga 90 °C selama 1 jam untuk menghasilkan larutan yang jernih. Larutan bening yang dihasilkan diuapkan pada suhu ini di bawah pembersihan argon untuk mendapatkan RE(TFA) bubuk berlumpur₃ . Selanjutnya, 8 ml OA, 8 ml OM, 12 ml ODE, dan 2 mmol NaTFA ditambahkan ke dalam labu. Larutan dipanaskan hingga 120 °C dan disimpan pada suhu tersebut selama 30 menit, diikuti dengan pemanasan hingga 300 °C selama 30 menit sebelum didinginkan secara alami hingga mencapai suhu kamar. Lingkungan argon diterapkan selama seluruh proses sintesis. Nanopartikel yang dihasilkan diendapkan dengan menambahkan 20 mL etanol ke dalam labu reaksi yang didinginkan. Setelah pencucian sentrifugal dengan etanol selama tiga kali, serbuk putih yang terkumpul akhirnya didispersikan dalam 10 ml heksana untuk penggunaan lebih lanjut.

Kedua, -NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% T ³⁺ @CaF₂ RENP cangkang inti disiapkan melalui proses pertumbuhan epitaksial yang dimediasi benih, yang melibatkan penggunaan -NaYF₄ :10% Yb ³⁺ , x% Td ³⁺ inti sebagai benih dan pertumbuhan yang sesuai dalam larutan prekursor cangkang. Untuk menyiapkan prekursor cangkang, pertama, 2 mmol CaO dengan 5 ml air deionisasi dan 5 ml TFA ditambahkan ke dalam labu 250-ml dan dipanaskan pada 90 °C selama 1 jam untuk menghasilkan larutan yang jernih. Larutan ini kemudian diuapkan pada suhu ini untuk menghasilkan prekursor cangkang kalsium trifluoroasetat (Ca(TFA)₂ ). Selanjutnya, 0,5 mmol NaYF₄ :10% Yb ³⁺ , 30% T ³⁺ nanopartikel inti, 7 ml OA, dan 7 ml ODE semuanya ditambahkan ke labu. Larutan kemudian dipanaskan hingga 120 °C selama 30 menit, diikuti dengan pemanasan hingga 300 °C selama 60 menit sebelum didinginkan secara alami. Seluruh proses dilakukan di bawah lingkungan argon. Nanopartikel cangkang inti yang dihasilkan diendapkan dengan menambahkan 20 mL etanol ke labu reaksi yang didinginkan. Setelah pencucian sentrifugal dengan etanol selama tiga kali, NP cangkang inti yang dikumpulkan akhirnya didispersikan dalam 10 ml heksana untuk penggunaan lebih lanjut. Untuk persiapan dispersi berair, disiapkan -NaYF₄ :10%Yb ³⁺ , 30% T ³⁺ @CaF₂ RENP cangkang inti (dispersi heksana 5 mL) pertama-tama dicampur dengan 5 mL N ,T -Dimetilformamida (DMF) larutan nitrosonium tetra-fluoroborat (NOBF₄ ) (0,1 M) pada suhu kamar. Sebuah gemetar lembut diterapkan pada campuran sampai pengamatan presipitasi RENP. Selanjutnya, toluena dan heksana (1:1, volume) ditambahkan ke dalam campuran, yang kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 min. Endapan dikumpulkan dan didispersikan dalam 5 mL DMF. Kedua, 250 mg poli(asam akrilat) (PAA, MW = 18,000) ditambahkan ke larutan DMF 5 mL NOBF₄ -diperlakukan RENPs, yang dipanaskan sampai 80 °C dan disimpan pada suhu ini selama 30 min di bawah pengadukan yang kuat. Setelah itu, NP diendapkan dengan menambahkan aseton, dicuci dengan etanol, dan terakhir didispersikan dalam akuades.

Mikroskop Transmisi Elektron

Morfologi PNP dan RENP dinilai menggunakan mikroskop elektron transmisi (TEM). Untuk dicitrakan dengan TEM, 10 μL suspensi nanopartikel dijatuhkan ke film pendukung karbon yang distabilkan dengan formvar. Untuk memvisualisasikan struktur cangkang inti PNP, mereka diwarnai secara negatif dengan larutan air asam fosfotungstat 1% sebelum dijatuhkan ke film pendukung. Film pendukung karbon dikeringkan dengan udara dan dicuci dengan 5 μL air murni. Gambar diperoleh dengan beroperasi pada tegangan akselerasi 100 kV pada TEM (JEM-1230, JEOL).

Spektroskopi Photoluminescence

Spektrum PL untuk kedua jenis nanopartikel diukur dalam rentang NIR dan SWIR menggunakan spektrofluorometer Fluorolog-3 yang dilengkapi dengan spektrometer iHR320 untuk rentang NIR-SWIR (Horiba); dioda laser gabungan serat yang memancarkan pada 808 nm (QSP-808-4, QPhotonics) digunakan untuk membangkitkan PL dari PNP dan RENP.

Sistem Pencitraan Hiperspektral

Sistem SWIR HSI buatan sendiri memanfaatkan metode akuisisi sekuensial pita (Gbr. 2) dan mencakup kamera NIR (Xeva-1.7-320, Xenics, Belgia), optik pemfokusan (TEC-M55MPW, Computar, USA), dan filter kristal cair yang dapat disetel (Varispec LNIR 20-HC-20, PerkinElmer, USA) sebagai elemen dispersi. Sistem ini memiliki resolusi 340 × 258 piksel dan beroperasi dalam rentang spektral 900-1700 nm. Sumber penerangan dalam sistem termasuk lampu pijar (untuk penyelarasan gambar, pemfokusan, dan pencitraan bidang terang) dan dioda laser yang digabungkan dengan serat 808-nm (QSP-808-4, QPhotonics, USA), ditenagai dengan sumber daya laser (Sumber Laser 4308 , Arroyo Instruments, USA), untuk eksitasi PL dalam pencitraan PL. Akuisisi kubus data spektral dilakukan dengan penyetelan sekuensial transmisi LCTF dengan lebar spektral 20-nm dalam kisaran dari 900 hingga 1200 nm dengan langkah 10-nm dan menangkap gambar yang sesuai. Waktu pemaparan kamera NIR selama akuisisi HSI diatur ke 200 ms. Kepadatan daya laser pada sampel ditetapkan pada ~ 100 mW/cm ² . Untuk akuisisi gambar PL di seluruh rentang NIR-SWIR, LCTF digantikan oleh filter lolos sepanjang 850 nm (Edmund Optics, USA).

Diagram skema sistem pencitraan hiperspektral NIR-SWIR

Perangkat Lunak Pemisah Spektral

Untuk analisis kubus data spektral yang diperoleh, kami mengembangkan algoritma unmixing spektral menggunakan lingkungan MATLAB. Spektrum setiap piksel dianggap sebagai campuran linier dari anggota akhir yang diketahui:\( F\left(\lambda \right)=\sum \limits_i{a}_i{G}_i\left(\lambda \right) \), dimana F (λ )—spektrum piksel, G _i — spektrum anggota akhir, dan a _i adalah kelimpahan anggota akhir. Tujuan dari perangkat lunak unmixing adalah untuk memperkirakan kelimpahan anggota akhir yang diketahui dengan memecahkan masalah analisis campuran spektral linier (LSMA) di setiap piksel kubus data spektral yang diperoleh. Misalkan, L adalah jumlah pita spektral, dan p adalah jumlah anggota akhir yang ada dalam campuran. Kemudian, masalah LSMA dapat dinyatakan sebagai F = Ga + n , di mana F adalah L × 1 vektor intensitas piksel, G adalah L × p matriks yang berisi semua vektor anggota akhir, a adalah p × 1 vektor kelimpahan yang tidak diketahui, dan n adalah L × 1 vektor kesalahan. Metode berbasis kesalahan kuadrat terkecil (LSE) untuk menyelesaikan masalah LSMA dapat dibentuk sebagai tugas optimasi berikut:min_a {(B Ga ) ^T (B Ga )}, dan solusi klasiknya adalah a (r ) = (G ^T G ) ⁻¹ G ^T B . Namun, solusi tersebut mungkin mengandung nilai negatif untuk kelimpahan, yang tidak memiliki arti fisik. Untuk mengatasi kendala ini, tugas pengoptimalan LSE harus dimodifikasi:min_a {(B Ga ) ^T (B Ga )}, tunduk pada a 0. Untuk menyelesaikan tugas ini, kami menggunakan algoritma iteratif, berdasarkan analisis campuran spektral linier terkendala non-negatif (NC-LSMA) yang dijelaskan secara rinci dalam [49, 50]. Setelah perhitungan kelimpahan untuk setiap komponen, mereka dipetakan sebagai grafik colormap 2D. Terakhir, perangkat lunak unmixing menghasilkan gambar intensitas komponen yang sesuai, berdasarkan kelimpahan yang diperoleh:\( {I}_i\left(x,y\right)={a}_i\left(x,y\right)\sum \limits_ {\lambda }{G}_i\left(\lambda \right) \), di mana Saya _i (x , y )—intensitas integral i -anggota akhir dalam piksel, dan a _i (x , y )—i -kelimpahan.

Eksperimen Hewan

Tikus telanjang BALB/c (Sumber:The Jackson Laboratory, USA) dibiakkan dalam kondisi gelap dan aseptik di fasilitas hewan kecil. Semua percobaan hewan dilakukan sesuai dengan kriteria Peraturan Nasional China untuk Perawatan dan Penggunaan Hewan Laboratorium. Sebelum pencitraan, tikus telanjang jantan (berusia 6 minggu, 20 ± 2 g) dibius dengan 5% kloral hidrat (0,06 ml per gram berat tikus) dengan injeksi intraperitoneal. Untuk pencitraan SWIR PL in vivo, nanopartikel disuspensikan dalam 10x phosphate buffered saline (PBS) dan 100 μL setiap suspensi PBS dari PNP, RENP, atau campurannya disuntikkan secara subkutan ke tikus.

Hasil dan diskusi

Dua jenis NP-fotoluminesen SWIR disiapkan untuk digunakan dalam HSI:(1) PNP yang dimuat dengan pewarna JB9-08, yang hampir tidak berpendar dalam larutan berair [46] tetapi, seperti yang ditunjukkan oleh kami [51], memulihkan fluoresensinya dalam air melalui post-loading ke dalam matriks polimer PNP (Gbr. 3a dan b) dan (2) NaYF berlapis PAA₄ :10%Yb ³⁺ ,30%Td ³⁺ @CaF₂ inti-cangkang nanopartikel yang didoping ion tanah jarang (RENPs, Gambar. 3c dan d). T ³⁺ ion di inti RENP dapat dieksitasi dengan ~ 808 nm cahaya ( ⁴ Saya_9/2 →  ⁴ F_5/2 transisi) dan mentransfer energi ke Yb ³⁺ ion, yang memancarkan dalam kisaran 950-1100 nm dengan puncak pada ~ 975 nm ( ² F_5/2 →  ² F_7/2 transisi). Inti RENP dilapisi dengan CaF inert₂ shell untuk mengurangi kerugian nonradiative melalui cacat permukaan dan interaksi dengan lingkungan sekitarnya [48]. Kedua nanoformulations menunjukkan photoluminescence dalam kisaran 900-1200 di bawah eksitasi 808 nm (Gbr. 3e).

Karakterisasi PNP dan RENP. Gambar TEM (a ) dan struktur skema (b ) dari PNP yang diisi dengan pewarna JB9-08. Gambar TEM (c ) dan struktur skema (d ) dari RENP. e Spektrum emisi PL yang dinormalisasi dari suspensi PNPs-JB9-08 dan RENPs di bawah eksitasi 808 nm. Bilah skala, 100 nm

Perlu dicatat bahwa spektrum emisi PL dari nanopartikel yang diperoleh dengan spektrofluorometer tidak dapat digunakan sebagai anggota akhir dalam perangkat lunak unmixing spektral karena dua alasan. Pertama, sensitivitas sistem HSI tidak terkoreksi secara spektral, tidak seperti pada spektrofluorometer konvensional, sehingga profil spektral emisi yang diperoleh berbeda untuk dua metode akuisisi. Kedua, frame HSI dikumpulkan dengan langkah 10 nm, meskipun bandwidth spektral LCTF adalah 20 nm. Itu menghasilkan sinyal yang tumpang tindih di bingkai tetangga, menyebabkan distorsi profil spektral yang diperoleh dibandingkan dengan yang diukur dengan spektrofluorometer. Untuk mengatasi kendala ini, anggota akhir (profil spektral sampel PNP dan RENP) diakuisisi dengan sistem HSI. Dengan tujuan ini, kedua jenis nanoprobe disuspensikan dalam PBS dan suspensi PBS-nya ditempatkan dalam tabung mikrosentrifugasi (Gbr. 4a). Hampir tidak mungkin untuk membedakan dua sampel dengan pencitraan PL konvensional, karena spektrum emisi PL mereka tumpang tindih (Gbr. 4b dan 3e). Menggunakan sistem HSI, 31 gambar PL dikumpulkan dalam rentang spektral dari 900 hingga 1200 nm dengan langkah 10-nm (Gbr.4c). Profil spektral PNP, RENP, dan latar belakang (BG) dihitung melalui dimensi spektral kubus data spektral dengan rata-rata sinyal di area yang ditandai dengan kotak merah, biru, dan hijau, secara bersamaan (Gbr.4b). Profil spektral yang diperoleh untuk PNP dan RENP (Gbr. 4d) ditemukan serupa dengan yang diukur dengan spektrofluorometer dan kemudian digunakan sebagai anggota akhir untuk unmixing spektral. Setelah itu, dengan profil spektral PNP, RENP, dan BG sebagai anggota akhir, kelimpahan komponen yang sesuai dihitung dan dipetakan sebagai plot peta warna 2D (Gbr. 4e). Kelimpahan dihitung untuk setiap piksel spasial hypercube dan direpresentasikan sebagai nilai dari 0 hingga 1, dengan 0 dan 1 menunjukkan ketidakhadiran penuh dan kelimpahan penuh komponen, masing-masing. Jumlah kelimpahan semua komponen di setiap piksel sama dengan 1. Perlu dicatat bahwa perangkat lunak unmixing menggunakan ambang batas berdasarkan intensitas sinyal untuk menghilangkan kesalahan yang disebabkan oleh piksel berintensitas rendah. Jika intensitas maksimum piksel sepanjang dimensi spektral kurang dari 5% dari maksimum keseluruhan hypercube, piksel tersebut dianggap sepenuhnya berlimpah dengan komponen noise. Selanjutnya, gambar intensitas integral dari PNP dan RENP dihitung dengan mempertimbangkan kelimpahan yang sesuai dan menghilangkan komponen latar belakang (Gbr. 4f). Seperti yang diharapkan, baik pemetaan kelimpahan dan gambar intensitas integral menunjukkan kelimpahan penuh PNP di tabung kanan dan RENP di tabung kiri, dengan sedikit kesalahan yang disebabkan oleh hamburan emisi PL dan ketidaksempurnaan algoritme unmixing.

HSI tabung microcentrifuge yang mengandung RENP dan PNP. a Gambar bidang terang tabung microcentrifuge dengan PNP dan RENP ditangguhkan di PBS. b Gambar PL dari sampel PNP dan RENP yang dieksitasi dengan 808 nm (filter pass sepanjang 850 nm digunakan untuk akuisisi gambar). c Skema yang menggambarkan hypercube terdiri dari frame HSI. d Profil spektral PNP, RENP, dan latar belakang (BG) dirata-ratakan dari ROI yang ditunjukkan pada b sebagai kotak merah, biru, dan hijau, sesuai. e Peta warna kelimpahan komponen. f Gambar intensitas yang direkonstruksi dari komponen PL dan gambar gabungan PL/bidang terang

Spectral unmixing juga mampu membedakan campuran PNPs, RENPs. Untuk mendemonstrasikan ini, tiga tabung mikrosentrifugasi diisi dengan larutan PNP, RENP, dan campurannya. Setelah akuisisi hypercube dan prosedur unmixing spektral, pemetaan kelimpahan menunjukkan keberadaan penuh PNP di tabung mikrosentrifugasi pertama, RENP di tabung kedua, dan campuran keduanya di tabung ketiga (Gbr. 5a). Rekonstruksi gambar intensitas lebih lanjut dilakukan untuk mengungkapkan distribusi intensitas sinyal PNP dan RENP PL dalam spesimen (Gbr. 5b).

HSI tabung microcentrifuge yang berisi (kiri ke kanan) RENP, PNP, dan campuran keduanya. a Kelimpahan PNP, RENP, dan background (BG). b Gambar intensitas PL yang direkonstruksi dan gambar gabungan PL/bidang terang

Kami selanjutnya telah menunjukkan penerapan metode HIS kami untuk melipatgandakan nanoprobe yang tumpang tindih secara spektral dalam pencitraan PL SWIR in vivo. Tikus telanjang dibius dan disuntik secara subkutan dengan PNP, RENP, dan campuran keduanya. Pencitraan NIR dengan filter lintasan sepanjang 850 nm menunjukkan tiga titik photoluminescent yang tidak dapat dibedakan (Gbr. 6a). Setelah melakukan HSI dan analisis, pemetaan kelimpahan menunjukkan kelimpahan penuh PNP dan RENP di tempat injeksi atas dan bawah, masing-masing, sementara campuran keduanya diidentifikasi di tempat injeksi kiri (Gbr. 6b). Selain itu, untuk memperoleh distribusi intensitas PL, dilakukan rekonstruksi intensitas (Gbr. 6c). Dengan menyesuaikan nilai ambang batas dalam perangkat lunak unmixing hingga 15% (diperkirakan secara empiris), menjadi mungkin untuk menghilangkan kebisingan di area yang berdekatan dengan titik emisi (Gbr. 6d). Hasil tersebut menunjukkan bahwa tidak seperti modalitas pencitraan PL konvensional, yang menggunakan filter optik panjang atau bandpass, HSI tidak hanya mampu memetakan distribusi intensitas dalam spesimen, tetapi juga dapat menggandakan komponen yang ada dalam campuran dengan mengidentifikasi profil spektral intensitas dalam setiap piksel gambar.

HSI tikus yang disuntik secara subkutan dengan PNP (tempat injeksi kanan atas), RENP (kanan bawah), dan campuran RENP/PNP (kiri). a Bidang terang (SWIR), SWIR PL, dan gambar gabungan yang diperoleh dengan filter emisi lintasan sepanjang 850 nm. b Kelimpahan PNP, RENP, dan background (BG). c Gambar intensitas yang direkonstruksi yang sesuai. d Gambar intensitas PL direkonstruksi dari kelimpahan dengan tingkat ambang batas 15% dan gambar gabungan bidang PL/bright.

Dengan demikian, kombinasi akuisisi HSI dan pemrosesan unmixing spektral diterapkan dalam pekerjaan ini untuk mendapatkan pencitraan multipleks dari nanoprobe SWIR PL yang tumpang tindih secara spektral. Namun, beberapa masalah harus dipertimbangkan sehubungan dengan penerapan modalitas HSI. First, due to the spectrally narrow acquisition, every HSI frame deals with relatively low signal intensity (especially in the case of the spectrally broad PL emission form the organic moieties). In addition, an increase in the PL exciting laser power in biological imaging is limited by danger of tissue damage (or phototoxicity). This results in higher requirements for the brightness of the PL probes and their photostability, as HSI can require order of magnitude longer acquisition time in comparison with conventional PL imaging. It should also be noted that the linear mixture analysis and spectral unmixing algorithm can work satisfactorily for multiplexed PL imaging of biological tissues in the spectral range where tissue transmittance does not change much. In contrast, if tissue transmittance has distinctive features in the spectral range of HSI, linear spectral mixture model may be hardly applicable (especially in case of deeper tissues) and nonlinear models can be considered.

Kesimpulan

In conclusion, we developed a hyperspectral SWIR bioimaging technique and applied it for multiplexing of nanoparticles emitting in SWIR spectral range. Two types of nanoparticles with overlapping PL spectra, which are undistinguishable in conventional imaging, were successfully multiplexed by their PL spectral profiles using hyperspectral acquisition along with the linear spectral mixture analysis algorithm. The developed method was successfully employed for multiplexed imaging of SWIR PL nanoparticles both in sample suspensions and injected in small animals. With SWIR bioimaging having superior resolution at higher imaging depth, SWIR HSI approach holds a great potential for use in various applications requiring multiplexed imaging with NIR-SWIR PL nanoprobes. Furthermore, as SWIR bioimaging is at a very early stage, there is plenty of room for the development of biomedical applications of PL probes in a combination with HSI.

Ketersediaan Data dan Materi

Semua data yang dihasilkan atau dianalisis selama penelitian ini disertakan dalam artikel yang dipublikasikan ini.

Singkatan

BG:

Background

HSI:

Hyperspectral imaging

LCTF:

Liquid crystal tunable filter

NIR:

Inframerah dekat

NP:

Nanopartikel

PL:

Fotoluminesensi

PNIPAM:

Poly-N -isopropylacrylamide

PNPs:

Polymeric nanoparticles

PS:

Polistirena

RENPs:

Rare-earth doped fluoride nanoparticles

SWIR:

Short-wave infrared

TEM:

Mikroskop elektron transmisi

Struktur mikro terkontrol dan sifat mekanik komposit nanokarbon berbasis Al2O3 yang dibuat dengan metode perakitan elektrostatik Studi Time-Resolved dari Korosi Spesifik Situs dalam Nanopartikel Perak Kristal Tunggal