Nanohydrogel biokompatibel anti-tumor imunostimulan kuat anti tumor yang terbuat dari DNA
Abstrak
Oligodeoksinukleotida CpG yang tidak termetilasi adalah motif imunostimulator kuat dalam mengaktifkan sistem kekebalan bawaan dan didapat dengan menginduksi respons sel T spesifik antigen tipe Th1, tetapi ketidakstabilan mereka dalam serum sangat memengaruhi efisiensi imunostimulan mereka. Di sini, kami membuat nanohidrogel imuno-DNA baru yang terdiri dari urutan pengulangan tandem unit CpG bernama nanohidrogel CpG-MCA melalui amplifikasi rantai multi-prima. Nanohidrogel CpG-MCA terbukti menahan degradasi dan meningkatkan proliferasi dan migrasi sel RAW264.7 seperti makrofag murine. Lebih lanjut, nanohidrogel CpG-MCA secara efektif menginduksi ekspresi tinggi faktor nekrosis tumor-α dan interleukin-6, dan sangat menghambat proliferasi sel U251, menunjukkan bahwa nanohidrogel CpG-MCA diharapkan digunakan sebagai imunostimulan anti-kanker yang kuat.
Pengantar
DNA bakteri yang mengandung motif CpG yang tidak termetilasi adalah adjuvant vaksin, anti-alergen, dan agen imunoprotektif dan antikanker yang sangat menjanjikan [1]; Hal ini dapat dikenali oleh reseptor pada endosom di dalam sel sistem imun, seperti sel dendritik (DC), makrofag, sel T, sel natural killer (NK), dan sel NKT [2]. Sel-sel imun bawaan ini mampu merespons motif CpG yang tidak termetilasi melalui pengenalan pola molekuler terkait patogen (PAMPs) ke molekul spesifik patogen dalam mikroorganisme patogen. Telah dipastikan bahwa oligonukleotida CpG (CpG-ODN) dapat dikenali oleh Toll-like receptor 9 (TLR9) [3] dan menginduksi respon imun tipe Th1 melalui jalur pensinyalan yang bergantung pada Myd88 [4]. Namun, kelemahan CpG-ODN ini menghambat aplikasi klinisnya karena prematuritasnya oleh adsorpsi protein, pencernaan oleh endonuklease dalam serum [5], dan ketidakstabilan in vivo. Masalah-masalah ini diharapkan dapat diselesaikan dengan mengenkapsulasi asam nukleat untai tunggal (ss) ke dalam pembawa pengiriman atau membuatnya merakit sendiri menjadi struktur nano yang meningkatkan stabilitasnya secara in vivo serta rasio internalisasi yang lebih efisien ke sel imun bawaan. Saat ini, berbagai pembawa seperti polietilen kationik polimer (PEI) [6], liposom [7, 8], dan mikropartikel [9] digunakan untuk pengiriman CpG-ODN; masih ada beberapa kekurangan yang masih harus diperbaiki, seperti sitotoksisitasnya, kecepatan pemuatan yang terbatas, dan lain-lain.
Materi DNA yang tersusun dari asam nukleat memiliki potensi besar untuk digunakan sebagai pembawa penghantar CpG-ODN. Dibandingkan dengan ssDNA, bahan DNA dengan struktur dua dimensi atau tiga dimensi menunjukkan sifat yang berbeda, seperti penetrasi membran sel yang mudah dan stimulasi makrofag untuk mensekresi sitokin [10]. DNA berbentuk X digunakan untuk menyampaikan motif CpG dan berhasil meningkatkan aktivitas imunostimulator CpG-ODN dengan meningkatkan serapan seluler, sedangkan peningkatan serapan seluler sebagian disebabkan oleh struktur bentuk-X [11]. Demikian pula, tetrahedral DNA tiga dimensi yang dapat dirakit sendiri menjadi struktur nano dengan ukuran seragam dimasukkan secara non-invasif dan efisien ke dalam sel RAW264.7 untuk berfungsi. Terlebih lagi, tetrahedral tersebut terbukti secara mekanis stabil dan non-sitotoksik menurut penelitian [12]. Baru-baru ini, hidrogel CpG-RCA (gel CpG-RCA) dengan struktur nanoflower yang disiapkan melalui rolling circle amplification (RCA) telah ditunjukkan bahwa ia mampu memberikan sinyal yang merangsang kekebalan, menahan degradasi nuklease, meningkatkan sekresi sitokin kekebalan, dan menghambat proliferasi sel limfosit T leukemia limfositik akut manusia (CCRF-CEM) [13]. Hasil di atas menunjukkan bahwa bentuk dan struktur bahan DNA memainkan peran penting dalam meningkatkan serapan seluler dan meningkatkan efisiensi stimulasi kekebalan. Karena sel CCRF-CEM berasal dari leukemia T limfoblas manusia, sejenis keganasan hematologi, sel ini berbeda dengan tumor ganas hematologi; tumor padat sering mengelilingi dengan lingkungan mikro imunosupresif yang dapat menghambat kekebalan anti-tumor yang valid [14]. Untuk ini, kami membangun imunostimulan DNA yang mengandung lebih banyak salinan CpG-ODN melalui multi-primed chain amplification (MCA) [15] daripada RCA [16]. Mengambil keuntungan dari prinsip pasangan basa komplementer, primer yang melibatkan CpG dan urutan templat yang dirancang khusus dicampur ke ligase dan diperpanjang oleh phi29 polimerase dengan adanya dNTP gratis. RCA (R) atau MCA (M) bereaksi untuk x atau y jam untuk direpresentasikan secara terpisah sebagai Rx atau My (Gbr. 1); produk diidentifikasi dengan elektroforesis gel agarosa (Gbr. 2a). Berdasarkan reaksi MCA, produk yang diperoleh kami sebut hidrogel CpG-MCA (gel CpG-MCA) yang memiliki ratusan atau ribuan CpG tandem karena peningkatan besar salinan motif CpG. Gel CpG-MCA juga merupakan imunostimulan kuat yang secara signifikan meningkatkan sekresi sitokin dari sel RAW264.7 dan secara efektif menghambat proliferasi garis sel glioma U251 manusia. Kami berharap bahwa penelitian ini konduktif terhadap imunostimulan nanohidrogel baru berdasarkan bahan DNA dan mempromosikan aplikasinya untuk imunoterapi tumor [17].
Gambar gel CpG-MCA dan gel CpG-RCA. a Gambar elektroforesis gel agarosa gel CpG-RCA (R12) dan gel CpG-MCA (R4M4 dan R4M8). Jalur 1, penanda standar DNA MW -Hind III digest; jalur 2, R12; jalur 3, R4M4; jalur 4, R4M8, jalur 5, penanda DNA DL5000. Gambar SEM R12 (b ), R4M4 (c ), dan R4M8 (d ). Gambar TEM dari R12 (e ), R4M4 (f ), dan R4M8 (g ). Bilah skala hitam adalah 3 μm; bilah skala merah adalah 1 μm; bilah skala putih adalah 500 nm
Gambar mikroskop confocal dan intensitas fluoresen rata-rata dalam sel RAW 264,7 yang diobati dengan CpG-ODN, gel CpG-RCA (R12), dan gel CpG-MCA (R4M4 dan R4M8) (setara 100 nM CpG). Gel CpG-MCA dan gel CpG-RCA diberi label dengan Cy5 (merah) dengan menambahkan Cy5-dCTP untuk penyerapan selulernya. CpG-ODN berlabel Cy5 digunakan sebagai kelompok kontrol. a Gambar mikroskop confocal gel CpG-RCA dan gel CpG-MCA oleh sel RAW 264,7 setelah diinkubasi selama 2 jam. b Intensitas fluoresen rata-rata Cy5 dalam sel RAW264.7. Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD dari tiga percobaan independen. ****P < 0,0001
Metode/Eksperimental
Materi
Semua oligonukleotida dibeli dari Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. dan dimurnikan dengan kromatografi cair kinerja tinggi. set dNTP (masing-masing 100 mM), phi29 DNA polimerase (10 U/μL), dan buffer reaksi DNA polimerase 10× phi29 (330 mM Tris-acetate (pH 7,9 pada 37 °C), 100 mM Mg asetat, 660 mM K asetat , 1% (v /v ) Tween 20, 10 mM DTT) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). T4 DNA ligase (400 U/μL), 5′-triphosadenine (ATP), dan 10× T4 DNA ligase buffer reaksi (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2 , 1 mM ATP, 10 mM DTT, pH 7,5 pada 25 °C) dibeli dari New England Biolabs, Inc. (Ipswich, MA). Cyanine 5-dCTP dibeli dari PerkinElmer, Inc. (Waltham, MA, USA). Perangkat filter sentrifugal Amicon Ultra-0,5 dibeli dari Merck KGaA (Darmstadt, Jerman). Air yang digunakan dalam makalah ini dimurnikan dengan sistem pemurnian air Millipore Synergy UV Ultrapure. Gibco fetal bovine serum (FBS), medium Eagle modifikasi Dulbecco (DMEM, dengan glukosa tinggi, L-glutamine, phenol red, sodium pyruvate, tanpa HEPES), Trypsin-EDTA (0,25%), dan penisilin (10000 U/mL)- streptomisin (10000 μg/mL) dibeli dari Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Kit ELISA dibeli dari R&D Systems, Inc. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) dibeli dari Dojindo (Kumamoto, Jepang). Garis sel mirip makrofag tikus (sel RAW264.7) diperoleh dari bank sel Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Cina). Garis sel glioma manusia (sel U251) diperoleh dari bank sel Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Cina).
Persiapan Template DNA Edaran
DNA untai tunggal panjang dengan gugus terfosforilasi pada ujung 5 dengan rasio yang sama. Primer CpG-ODN (primer 1) dicampur dalam buffer reaksi 1x phi29 dan dianil pada 95 °C selama 5 menit dan didinginkan perlahan hingga 4 °C pada suhu laju 1 °C/s menggunakan siklus termal (Bio-Rad T100, Jerman). Setelah anil, 20 U/μL T4 DNA ligase dengan buffer reaksi ligase ATP dan T4 DNA ditambahkan dan diinkubasi pada suhu 4 °C semalaman. Enzim tidak aktif pada suhu 75 °C selama 10 menit.
Persiapan CpG-MCA Gel dan CpG-RCA Gel
Sebuah template DNA melingkar (10 μL) dicampur dengan buffer reaksi 1x phi29 DNA polimerase, masing-masing 4 mM dNTP, dan 5 U phi29 DNA polimerase dan DDW steril ditambahkan, total 50 μL. Campuran diinkubasi pada suhu 30°C dengan pengocokan selama 12 jam (R12). Untuk pembentukan gel MCA, setelah reaksi RCA 4 h, 500 pM primer 2 dan primer 3 kemudian ditambahkan ke dalam campuran yang dihasilkan masing-masing untuk diinkubasi selama jam istirahat pada suhu 30°C tanpa menambahkan reagen tambahan (R4M4 dan R4M8). The phi29 polimerase tidak aktif pada 65 °C selama 10 min. Gel CpG-RCA dan gel CpG-MCA dimurnikan dengan ultrafiltrasi.
Konsentrasi Gel CpG-MCA dan Gel CpG-RCA
Konsentrasi gel CpG-MCA dan gel CpG-RCA diukur berdasarkan jumlah salinan CpG yang terlibat dalam semua hidrogel pada kelompok perlakuan. Sejak dNTP ditambahkan ke dalam sistem reaksi adalah 4 mM untuk masing-masing, satu template melingkar berisi 81 nukleotida dan 1 salinan CpG. Jika Abs adalah absorbansi dNTP pada 260 nm dan ε adalah koefisien kepunahan dNTP pada 260 nm, maka dNTP yang dikonsumsi dalam reaksi dapat diukur dan salinan total CpG dihitung dengan persamaan berikut:Salinan CpG = (4 mM × 4 − Abs/ε × 1.000.000)/81 [13]. Perut dan ε dNTP diukur dengan NanoDrop 2000c.
Elektroforesis Gel Agarosa
Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk mengevaluasi pembentukan dan degradasi gel CpG-MCA dan pembentukan cetakan melingkar. Hidrogel dijalankan pada gel agarosa 1% pada 100 V selama 60 menit, dan cetakan melingkar dijalankan pada gel agarosa 3% pada 100 V selama 60 menit.
Karakterisasi Gel CpG-MCA dan Gel CpG-RCA
Mikroskop elektron transmisi (TEM, Hitachi HT7700, Jepang) digunakan untuk mengkarakterisasi struktur dalam gel CpG-MCA dan ukuran perkiraan. Gel CpG-MCA diperiksa dengan ultrasound selama 30 menit sebelum disimpan pada tembaga dan dikeringkan. Pengujian dilakukan di laboratorium pusat Rumah Sakit Renji. Pemindaian mikroskop elektron (SEM, Hitachi SU8020, Jepang) digunakan untuk mendapatkan morfologi gel CpG-MCA. Gel CpG-MCA diperiksa dengan ultrasound selama 30 menit sebelum disimpan pada wafer silikon bersih, dan sampel dilapisi logam dengan Au.
Pencitraan Mikroskopik Confocal
Serapan sel dicitrakan oleh mikroskop confocal Leica. Sel RAW264.7 diunggulkan pada cawan petri confocal dengan kepadatan 2 × 10
5
sel/mL. Setelah dicuci dua kali dengan buffer fosfat (PBS), sel diinkubasi dengan 100 nM Cy5-label CpG-ODN, gel CpG-RCA, dan gel CpG-MCA dalam media DMEM segar selama 2 jam pada 37 °. Sel kemudian dicuci tiga kali dengan PBS dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 30 menit, kemudian sel diwarnai dengan FITC-phalloidin dan Hoechst 33342. Semua gambar diambil menggunakan mikroskop confocal laser Leica. Semikuantitatif intensitas fluoresen rata-rata dihitung oleh Image J, aplikasi berbasis Java untuk menganalisis gambar.
Uji ELISA
Sel RAW264.7 diunggulkan dengan kepadatan 7 × 10
4
sel / mL dalam piring 24-sumur yang dikultur selama 24 jam sebelum digunakan. Sel-sel diinkubasi dengan adanya gel CpG-MCA dan kelompok lain pada 37 °C selama 8 h untuk TNF-α dan 24 h untuk IL-6; supernatan dikumpulkan. Tingkat sitokin dalam supernatan dideteksi dengan enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) mengikuti protokol yang disarankan oleh produsen.
Uji Ekspresi Gen
Tingkat ekspresi gen diuji dengan kuantitatif real-time PCR (Q-PCR). Sel RAW264.7 diunggulkan dengan kepadatan 1 × 10
6
sel / mL dalam piring 6-sumur yang dikultur selama 24 jam sebelum digunakan. Sel diinkubasi dengan adanya gel CpG-MCA dan kelompok lain pada 37 °C selama 2 jam untuk TNF-α dan TLR9 dan 8 h untuk IL-6 dan lainnya. Isolasi dan pemurnian mRNA dilakukan dengan menggunakan Reagen TRIzol (Thermo Fisher Scientific). MRNA yang diekstraksi diukur dengan NanoDrop 2000c. Satu mikrogram RNA total ditranskripsi balik menggunakan Kit reagen PrimeScript RT dengan gDNA Eraser (Takara Bio Inc.); amplifikasi dilakukan dalam volume reaksi total 20 μL, menggunakan TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio Inc) sesuai dengan instruksi pabrik. Primer untuk gen adalah sebagai berikut:GAPDH:F:AGGTCGGTGTGAACGGATTTG; R:TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA; TLR9:F:ATGGTTCTCCGTCGAAGGACT; R:GAGGCTTCAGCTCACAGGG; TNF-α:F:GACGTGGAACTGGCAGAAGAG; R:TTGGTGGTTTGTGAGTGTGAG; IL-6:F:CCAAGAGGTGAGTGCTTCCC; R:CTGTTGTTCAGAACTCTCTCCCT; CD86:F:GAGCTGGTAGTATTTTGGCAGG; R:GGCCCAGGTACTTGGCATT; CD206(MRC1):F:CTCTGTTCAGCTATTGGACGC; R:CGGAATTTCTGGGATTCAGCTTC.
Uji Migrasi Luka Gores
Sel RAW264.7 diunggulkan 70 μL dengan kepadatan 5 × 10
5
sel/mL dalam sisipan kultur selama 24 jam sebelum digunakan. Kemudian, sisipan dikeluarkan dengan hati-hati dan sel dicuci dua kali sebelum diperlakukan dengan masing-masing kelompok dalam media baru. Foto dikumpulkan pada 0 h, 6 h, dan 24h; area luka diukur dengan ImageJ. Setiap kelompok memiliki tiga pengulangan dan percobaan diulang sebanyak tiga kali.
Uji Sitotoksisitas
Sitotoksisitas diuji menggunakan CCK8. Sel RAW264.7 diunggulkan dalam pelat 96-sumur dan diperlakukan dengan masing-masing kelompok selama 24 jam. Kemudian, 10 μL larutan CCK8 ditambahkan ke setiap sumur, diikuti dengan inkubasi 1-2 jam pada suhu 37 °C. Absorbansi diukur pada 450 nm, masing-masing kelompok memiliki tiga ulangan, dan percobaan diulang tiga kali.
Sel U251 Dikultur Bersama dengan Sel RAW264.7
Sel RAW264.7 diunggulkan di ruang atas dan sel U251 diunggulkan di ruang bawah secara terpisah dan diinkubasi selama 24 jam sebelum perawatan. Setelah dicuci dengan PBS tiga kali, gel 1 μM GpC-ODN, CpG-ODN, CpG-RCA, dan CpG-MCA dalam media segar ditambahkan ke dalam ruang atas dan bawah untuk waktu yang ditentukan. Sel U251 di ruang bawah dikumpulkan dan dilakukan eksperimen kloning pelat.
Pengujian Pembentukan Kloning Plat
Efek pada proliferasi sel U251 yang dikultur bersama dengan sel RAW264.7 dianalisis dengan eksperimen kloning pelat. Sel U251 pada ruang bawah dikumpulkan dan diencerkan dengan beberapa proporsi dalam DMEM yang mengandung 15% FBS pada jumlah akhir 200 sel/sumur pada pelat kultur 6-sumur dan terus dikultur selama 2 minggu sampai kelompok klon dapat diamati oleh mata telanjang (lebih dari 50 sel/klon). Setelah dicuci dengan lembut dengan PBS, sel difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 30 menit, kemudian diwarnai dengan kristal violet selama 1 jam. Cluster yang berisi lebih dari 50 sel akan dimasukkan dalam penghitungan sebagai formasi klon yang berhasil. Percobaan diulang tiga kali dan setiap percobaan memiliki tiga sumur ulangi:laju pembentukan klon = (jumlah pembentukan klon/jumlah sel yang diinokulasi) × 100%.
Stabilitas Gel CpG-MCA dan Gel CpG-RCA
Gel CpG-MCA beku-kering atau gel CpG-RCA dimasukkan ke dalam 400 μL DMEM yang masing-masing mengandung 10% serum fetal bovine (10% FBS-DMEM) dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam; konsentrasi DNA dalam supernatan diukur dengan NanoDrop 2000c setelah disentrifugasi pada 1000 rpm selama 10 s. Hidrogel yang tersisa dihitung menurut konsentrasi DNA dalam supernatan. Gel yang tersisa = (mc × V )/m × 100%, di mana m adalah massa gel yang kami tambahkan, c adalah konsentrasi DNA dalam supernatan, dan V adalah volume supernatan. Gel CpG-MCA atau gel CpG-RCA masing-masing dimasukkan ke dalam 10% FBS-DMEM atau PBS dan diinkubasi pada suhu 37 °C selama 12 jam atau 24 jam. Setelah inkubasi, gel dijalankan pada gel agarosa 1% pada 100 V selama 60 min.
CpG-ODN
CpG-ODN untai tunggal disintesis oleh Sangon Company (Beijing, Cina) dan dimurnikan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). CpG-ODN yang digunakan dalam penelitian ini adalah CpG-ODN 1668 [18]:5′-TCCATGTTCCTGATGCT, dan oligonukleotida non-CpG bernama GpC-ODN [18]:5′-TCCATGAGCTTCCTGATGCT.
Analisis Statistik
Semua data dalam penelitian ini direpresentasikan sebagai nilai rata-rata ± standar deviasi (rata-rata ± SD) dari dua atau tiga percobaan independen. Analisis statistik antara kelompok yang berbeda dilakukan melalui t . Siswa tes. Signifikansi statistik ditetapkan pada P < 0,05 (95% tingkat kepercayaan).
Hasil dan Diskusi
Imunostimulan DNA berhasil dibangun melalui reaksi MCA [16]. Dalam reaksi ini, langkah pertama dan penting sebelum amplifikasi isotermal adalah reaksi siklisasi dari template untai tunggal (ss) yang panjang (Skema 1). Kami menggunakan elektroforesis gel agarosa untuk mengkonfirmasi pembentukan DNA sirkular setelah anil dan ligasi dengan primer (File tambahan 1:Gambar S1). Jarak migrasi antara primer dan template ssDNA panjang menjadi lebih pendek karena struktur berubah setelah template menjadi siklus dan diikat dengan primer. Reaksi MCA berisi rangkaian unit berulang secara seri dan dengan mudah menyebabkan munculnya bunga nano karena belitan kontinu (Skema 1). Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa produk reaksi RCA (gel CpG-RCA atau R12) dan reaksi MCA (gel CpG-MCA atau R4M4/R4M8) berhasil diperoleh (Gbr. 1a). Gel CpG-RCA dan gel CpG-MCA sulit untuk bermigrasi melalui gel agarosa dan tetap berada di posisi semula. Kedua gel terlalu lengket sehingga tercabut seperti sutra saat kami memipetnya (File tambahan 1:Gambar S2A–C). Hasil ini menunjukkan bahwa template DNA diamplifikasi secara eksponensial dengan dNTPs bebas untuk membentuk hidrogel [15]. Perlu disebutkan bahwa jarak migrasi tidak ada perbedaan yang signifikan antara gel CpG-RCA dan gel CpG-MCA. Selain itu, hasil SEM dan TEM lebih lanjut menunjukkan bahwa diameter gel CpG-RCA (Gbr. 1b, e) dan gel CpG-MCA (Gbr. 1c, d, f, dan g) berkisar dari skala nano hingga mikrometer, dan menunjukkan morfologi bunga nano. CpG-ODN perlu diinternalisasi ke dalam sel imun positif TLR9 dan berinteraksi dengan TLR9 yang terlokalisasi di endosom di dalam sel imun untuk menjalankan aktivitas imunostimulatornya. Untuk ini, kami menggunakan gel CpG-ODN, CpG-RCA, dan gel CpG-MCA berlabel Cy5 untuk meneliti penyerapannya dalam sel RAW264.7 menggunakan mikroskop confocal. Seperti yang diamati pada Gambar. 2a, gel CpG-MCA berlabel Cy5 efektif diinternalisasi dan didistribusikan dalam sitoplasma sel RAW264.7. Berdasarkan rata-rata intensitas fluoresen yang diukur, efisiensi penyerapan gel CpG-MCA meningkat secara signifikan (P < 0,0001) dibandingkan dengan CpG-ODN (Gbr. 2b), menunjukkan serapan efektif gel CpG-MCA, yang menguntungkan untuk mengerahkan stimulasi kekebalan yang lebih kuat. Dilaporkan bahwa penyerapan DNA oleh sel RAW264.7 makrofag tikus meningkat dengan merancang struktur nano DNA yang berbeda. Seperti DNA berstruktur mirip tetrapoda (tetrapodna), DNA tetrahedral (tetrahedron), dan DNA tetragonal (tetragon) [19]. Demikian pula, hidrogel DNA-berbentuk-X, DNA-berbentuk-Y dan DNA-X juga terbukti meningkatkan serapan DNA oleh sel-sel [20, 21]. Hasil ini menunjukkan bahwa struktur DNA tingkat tinggi adalah bentuk yang lebih efisien untuk mengirimkan fragmen DNA yang difungsikan. Oleh karena itu kami berspekulasi bahwa serapan seluler yang tinggi dari gel CpG-MCA berasal dari perubahan bentuk gel CpG-MCA melalui pembentukan gel. Kami kemudian menguji stabilitas gel CpG-MCA. Gel CpG-MCA diinkubasi pada suhu 37 °C untuk waktu yang berbeda dalam larutan yang berbeda. Hasil elektroforesis gel agarosa menunjukkan bahwa gel CpG-MCA relatif stabil dalam larutan PBS dan terdegradasi sebagian dalam serum yang terlibat medium (File tambahan 1:Gambar S3A). Gel CpG-MCA masih terlihat seperti tangga daripada pita tunggal yang menunjukkan degradasi yang tidak lengkap. Kami kemudian meneliti stabilitas gel dalam 10% FBS-DMEM. Hasil TEM mengkonfirmasi bahwa gel CpG-MCA tercerna sebagian dan tidak lagi terlihat seperti bunga tetapi masih mempertahankan bentuknya (File tambahan 1:Gambar S2D–F). Kurva degradasi gel CpG-MCA diplot dengan mendeteksi konsentrasi DNA dalam supernatan dalam 24 h (File tambahan 1:Gambar S3B). Ditunjukkan bahwa setelah inkubasi selama 24 jam dalam 10% FBS-DMEM, R12 mempertahankan hampir 80%, sementara R4M4 dan R4M8 tetap hampir 85%, yang cocok dengan hasil elektroforesis gel agarosa. Untuk mengkonfirmasi degradasi gel, gel CpG-MCA diinkubasi pada 37 °C hingga 48 jam dalam serum, dan produksi degradasi dijalankan dalam elektroforesis gel agarosa (File tambahan 1:Gambar S4). Gel tidak lagi terlihat seperti tangga karena dicerna menjadi potongan-potongan oleh enzim dalam serum dan kehilangan viskositasnya dan bahkan menjadi potongan nukleotida tunggal, menunjukkan bahwa gel CpG-MCA dapat terurai secara hayati karena dapat dicerna dengan adanya serum janin sapi ( FBS). Dengan demikian, gel CpG-MCA secara efektif menahan pencernaan serum dalam 24 jam dan akhirnya terdegradasi sepenuhnya. Kemampuan tinggi untuk melawan degradasi akan membantu meningkatkan efisiensi perangsangan kekebalannya; tingkat ekspresi TNF-α dan IL-6 dalam supernatan sel RAW264.7 juga dengan jelas menunjukkan bahwa gel CpG-MCA dapat secara efektif merangsang sel untuk memproduksi sitokin imun.
Ilustrasi skema tentang preparasi dan penyerapan seluler gel CpG-MCA dan gel CpG-RCA. DNA untai tunggal panjang dengan gugus terfosforilasi pada ujung 5' dicampur dengan primer yang tersusun dari motif CpG yang pertama dianil dan diikat oleh T4 DNA ligase untuk membentuk templat melingkar. Reaksi RCA dan MCA dilakukan oleh phi29 DNA polimerase untuk menghasilkan sejumlah besar DNA concatemer sekuensial dan berputar seperti banyak bunga nano. Gel kemudian dapat diserap oleh makrofag dan merangsang sekresi sitokin
Kemanjuran stimulasi imun dari gel CpG-MCA dievaluasi lebih lanjut, kami memperlakukan makrofag RAW264.7 dengan GpC-ODN (urutan berubah dari efek GACGTT menjadi GAGCTT) [22], CpG-ODN, gel CpG-RCA, dan CpG- gel MCA dan kemudian mendeteksi ekspresi TNF-α dan IL-6. Konsentrasi TNF-α dalam supernatan sel RAW264.7 yang diinkubasi selama 8 h dengan gel CpG-RCA (R12) dan gel CpG-MCA (R4M4 dan R4M8) menghasilkan kadar TNF-α yang jauh lebih tinggi daripada CpG-ODN di konsentrasi perlakuan yang sama (Gbr. 3a). Untuk gel CpG-MCA, R4M8 daripada R4M4 menginduksi tingkat sekresi TNF-α yang lebih tinggi (P < 0,001), menunjukkan bahwa sekresi TNF-α meningkat seiring dengan meningkatnya salinan. Selain itu, R4M8 menginduksi secara signifikan (P < 0.001) konsentrasi TNF-α yang lebih tinggi dari R12, menunjukkan bahwa gel CpG-MCA adalah stimulator yang lebih kuat daripada gel CpG-RCA ketika total waktu reaksi sama. Tren yang sama juga ditemukan pada deteksi IL-6 (Gbr. 3d). Sekresi IL-6 yang distimulasi oleh gel CpG-MCA dan gel CpG-RCA meningkat secara signifikan. Sekresi IL-6 pada kelompok R12, R4M4, dan R4M8 adalah 2,97 kali (P < 0,0001), 4,39 kali (P < 0,0001), dan 27,81 kali (P < 0,0001) dari kelompok CpG-ODN, masing-masing. Sekresi IL-6 pada kelompok R4M8 adalah 6,33 kali (P < 0,0001) dari yang tercatat dalam kelompok R4M4 dan 9,36 kali (P < 0,001) dari yang dicatat dalam kelompok R12. Perlu disebutkan bahwa sekresi IL-6 tidak memiliki perbedaan yang signifikan antara kelompok CpG-ODN, GpC-ODN, dan kontrol. Hasil ini menegaskan bahwa efisiensi yang lebih tinggi dari pelepasan TNF-α dan IL-6 diamati dari sel RAW264.7 yang diobati dengan gel CpG-MCA daripada dari CpG-ODN. Selanjutnya, efek gel CpG-MCA dengan konsentrasi yang berbeda pada sekresi sitokin juga diselidiki, dan kami menemukan bahwa sekresi TNF-α dan IL-6 meningkat dengan konsentrasi gel (Gbr. 3b, e). Hasil kemampuan stimulasi imun dari gel non-CpG (ditunjukkan sebagai R12-C, R4M4-C, dan R4M8-C pada Gambar. 3c) dan GpC-ODN menunjukkan bahwa mereka hampir tidak menginduksi sekresi TNF-α (Gbr. 3c), menunjukkan bahwa respons imun yang diinduksi oleh gel CpG-MCA dihasilkan dari motif CpG.
Deteksi sitokin yang dilepaskan dari sel RAW264.7 yang distimulasi dengan CpG-ODN, gel CpG-RCA, dan gel CpG-MCA menggunakan ELISA-kit. a Sekresi TNF-α dari sel RAW264.7. b Sekresi TNF-α dari sel RAW264.7 setelah diperlakukan dengan konsentrasi gel CpG-MCA yang berbeda. c Deteksi kemampuan imunostimulan gel CpG dan gel non-CpG (R12-C, R4M4-C, dan R4M8-C). d Sekresi IL-6 dari sel RAW264.7. e Sekresi IL-6 dari sel RAW264.7 setelah diperlakukan dengan konsentrasi gel MCA yang berbeda. Hasil dinyatakan sebagai mean ± SD dari dua percobaan independen. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,0001
Selanjutnya, kami menguji ekspresi mRNA dari sitokin, penanda permukaan sel, dan TLR-9. TNF-α mRNA pada kelompok CpG-ODN adalah 1,25 kali ekspresi yang terdeteksi pada kelompok kontrol, dan perubahan lipatan pada kelompok R12, R4M4, dan R4M8 adalah 3,28 kali (P < 0,01), 2,53 kali (P < 0,05), dan 4,57 kali (P < 0.001) dari yang diuji dalam kelompok CpG-ODN secara terpisah (File tambahan 1:Gambar S5A). Ekspresi mRNA IL-6 pada kelompok CpG-ODN adalah 1,01 kali lebih banyak dari pada kelompok kontrol. Ekspresi mRNA IL-6 pada kelompok R12, R4M4, dan R4M8 adalah 3,87 kali (P < 0,01), 4,63 kali (P < 0,05), dan 23,04 kali (P < 0.0001) sebanyak yang ada di grup CpG-ODN masing-masing (File tambahan 1:Gambar S5B).
Ekspresi mRNA TLR-9, reseptor CpG di dalam sel [4], juga meningkat pada semua kelompok dibandingkan dengan kelompok kontrol, tetapi kelompok gel CpG-MCA sangat meningkatkan ekspresi mRNA TLR-9 dibandingkan dengan CpG. Grup -ODN (File tambahan 1:Gambar S5C). Selain sitokin dan TLR9, kami juga mendeteksi molekul kostimulatori (CD) CD86 dan CD206, yang masing-masing digunakan untuk menandai makrofag pro-inflamasi (M1) dan pemacu pertumbuhan (M2) [23]. Ditemukan bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara kelompok CpG-ODN dan kelompok kontrol baik dalam CD86 maupun CD206 (File tambahan 1:Gambar S5D, E). Dibandingkan dengan kelompok gel CpG-RCA, CD86 dalam kelompok gel CpG-MCA meningkat dalam berbagai derajat, sementara CD206 menurun dalam berbagai derajat, dan kelompok R4M8 meningkat dan menurun paling banyak, menunjukkan bahwa sel RAW264.7 yang diobati dengan gel CpG-MCA rentan untuk berdiferensiasi menjadi populasi M1 dengan penanda permukaan CD86, yang selanjutnya memverifikasi kemampuan stimulasi imun gel CpG-MCA.
Sekresi sitokin dari makrofag sangat penting dalam respon stimulasi imun serta dalam proliferasi dan migrasi makrofag. Stimulasi makrofag dengan CpG-ODN akan meningkatkan produksi sitokin anti inflamasi melalui jalur yang bergantung pada TLR9. Sitokin yang diinduksi oleh CpG-ODN meningkatkan migrasi makrofag dan mendorong proliferasi makrofag dengan menurunkan regulasi ekspresi regulator negatif siklus sel [24]. CpG-ODN juga menginduksi ekspresi plasminogen activator inhibitor tipe-1 (PAI-1) dalam makrofag, yang menghasilkan peningkatan migrasi melalui vitronektin [25]. Kami juga menyelidiki lebih lanjut kemampuan gel CpG-MCA untuk mendorong makrofag bermigrasi dan mengevaluasi sitotoksisitasnya. Migrasi sel RAW264.7 diinduksi oleh gel CpG-MCA di kedua sistem migrasi transwell (Gbr. 4a) dan uji migrasi luka gores (Gbr. 4b). Sel RAW264.7 dikultur dengan ada atau tidak adanya gel CpG-MCA dan dibiarkan bermigrasi selama 24 jam. Jumlah migrasi makrofag pada kelompok gel CpG-MCA jauh lebih banyak daripada kelompok CpG-ODN (Gbr. 4a). Kemudian, kami melanjutkan ke uji migrasi luka gores; sel diizinkan untuk bermigrasi selama 24 jam, dan gambar diambil dalam 0 jam, 6 jam, dan 24 jam. Hasilnya menunjukkan area goresan berkurang saat luka sembuh. Migrasi makrofag pada 6 h menunjukkan bahwa gel CpG-MCA lebih efektif daripada kelompok CpG-ODN karena rasio penyembuhan luka lebih tinggi, tetapi tidak ada perbedaan signifikan antara kelompok R12, R4M4, dan R4M8 (File tambahan 1:Gambar S6A, B). Dan area garukan pada 24 jam menegaskan bahwa tingkat penyembuhan area garukan pada kelompok CpG-ODN adalah 1,70 kali (P < 0,05) pada kelompok kontrol, dan tingkat penyembuhan pada kelompok R12, R4M4, dan R4M8 adalah 1,63 kali (P < 0,001), 1,63 kali (P < 0,0001), dan 2,23 kali (P < 0,0001) yang diukur pada kelompok CpG-ODN secara terpisah. Tingkat penyembuhan pada kelompok R4M8 adalah 1,36 kali (P < 0,01) dari yang ada di grup R12. CpG-MCA gels strongly promoted the migration of RAW264.7 cells compared to that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 4c). In addition, RAW264.7 cells were cultured with a series concentration of gels for 24 h. We found that the CpG-MCA gels exhibited a negligible cytotoxicity to RAW264.7 cells due to the non-toxicity of DNA itself; on the contrary, CpG-MCA gels could stimulate RAW264.7 cell proliferation with a dose-dependent effect, which was a benefit to enhance the production of immune cytokines (Fig. 4d).
The analysises of migration and cell viability of CpG-ODN, CpG-RCA gel (R12), and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) in RAW264.7 cells. a The migration assay of RAW264.7 cells induced with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8. b The migration assay of RAW264.7 cells stimulated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. c The scratch area analysis in the scratch migration experiment. The percentages are calculated as the ratio of the original area. d The cell viability of RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, R12, R4M4, and R4M8 for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0,0001
For further verifying the inhibited efficiency of CpG-MCA gels for the proliferation of solid tumor cells, we estimated the inhibitory effects of CpG-MCA gels as immune stimulators for the U251 human brain glioma cells. The U251 cells was first co-cultured with RAW264.7 macrophages for 24 h, and the clone formation rate was used to check the proliferate ability of the U251 cells. As shown in Fig. 5a–f, the clone formation rate in the CpG-ODN group was 74.1% of that observed in the control group (P < 0.05), and the rates in R12, R4M4, and R4M8 groups were 45.4% (P < 0.01), 15.3% (P < 0.001), and 12.0% (P < 0.001) of that in the CpG-ODN group, respectively. The results demonstrated that the U251 cells treated with CpG-MCA gels presented a significantly lower percentage of clone formation rate compared with that treated with the CpG-ODN or control groups (Fig. 5g). It is notable that the trend of inhibitory results was in accordance with the secretion of TNF-α among groups, CpG-MCA gels exhibited a stronger effect on stimulating RAW264.7 cells to secrete cytokines to inhibit proliferation of U251 cells than CpG-ODN. Our research provided preliminary evidence to demonstrate the CpG-MCA gels have the potential to be used as an immunostimulant.
The assessment on the therapeutic effect of immunostimulatory CpG-RCA gel (R12) and CpG-MCA gels (R4M4 and R4M8) on cancer cells in vitro by plate clone formation assay. U251 cells treated with a none, b RAW264.7 cells, c RAW264.7 cells treated with CpG-ODN, d RAW264.7 cells treated with R12, e RAW264.7 cells treated with R4M4, and f RAW264.7 cells treated with R4M8. g Results of the proliferation percentage of U251 cells after co-cultured with RAW264.7 cells for 24 h. Results are expressed as the mean ± SD of three independent experiments. **P < 0.01, ***P < 0.001
Conclusions
In summary, we have successfully preparedCpG-MCA nanohydrogels that consist of hundreds of immunostimulatory CpG motifs to effectively deliver immune stimulus signal into cells and significantly induce the expression of immune cytokines. CpG-MCA nanohydrogels exhibited powerful anti-tumor immunity against human glioma cells, demonstrating that CpG-MCA nanohydrogels have the potential to be used as an immunostimulant for the therapy of cancer.
Ketersediaan Data dan Materi
Kumpulan data yang digunakan dan/atau dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis terkait atas permintaan yang wajar.
