Optimasi Nano-enkapsulasi pada Gugus Sel Mirip Pulau Babi Neonatal Menggunakan Polimersom
Abstrak
Penelitian membuktikan metode untuk nano-enkapsulasi porcine islet-like cell clusters (NPCCs) neonatal menggunakan polimersom (PSomes) yang dibentuk menggunakan polimer polietilen glikol-blok-poli laktida. Di sini, penelitian kami menyajikan prosedur enkapsulasi nano yang efisien dengan kerusakan minimal dan kehilangan NPCC. Kami menggunakan N-hydroxysuccinimide (NHS) pada terminal-N PSomes untuk menginduksi pengikatan gugus amina dalam matriks ekstraseluler yang mengelilingi NPCC. Media kultur F-10 dengan albumin serum sapi digunakan dalam prosedur nano-enkapsulasi untuk meminimalkan kerusakan dan kehilangan NPCC. Akhirnya, kami menginduksi cross-linking antara PSomes bifungsional (NHS-/NH2 -PSom). Media kultur F-10 yang mengandung 0,25% BSA dengan pH 7,3 meminimalkan kerusakan dan kehilangan NPCC setelah nano-enkapsulasi dibandingkan dengan menggunakan buffer HBSS dasar (pH 8,0). Juga, kami menginduksi enkapsulasi nano yang efisien melalui konjugasi PSomes menggunakan PSomes bifungsional (NHS-/NH2 -PSom).
Pengantar
Penggunaan transplantasi allo-islet dalam pengobatan diabetes tipe 1 terbatas karena kurangnya donor yang sesuai. Sebaliknya, ada peningkatan bertahap dalam penggunaan pulau hewan dalam transplantasi pulau xeno, dengan babi muncul sebagai spesies donor yang optimal [1]. Ketika babi digunakan sebagai donor selama transplantasi, pulau terpisah dapat digunakan, berdasarkan usia babi. Seringkali, kluster sel mirip pulau babi neonatal (NPCC) lebih disukai daripada pulau babi dewasa (API) karena keterjangkauan dan kemudahan isolasi. Selain itu, NPCC dapat berkembang biak secara bertahap setelah transplantasi, memperpanjang fungsinya secara in vivo [1, 2]. Namun, ketika NPCC ditransplantasikan ke vena portal manusia atau non-manusia primata (NHP), variasi antarspesies dapat menyebabkan reaksi imun seperti reaksi inflamasi yang dimediasi darah instan (IBMIR) atau penolakan hiperakut, yang menyebabkan hilangnya cangkok dini [3]. Untuk mengatasi masalah ini, diperlukan enkapsulasi NPCC yang dapat menghambat berbagai respon imun. Ada tiga jenis enkapsulasi:enkapsulasi makro, mikro, dan nano. Makro-enkapsulasi menggunakan perangkat yang mengandung pulau, yang kemudian ditanamkan di sekitar pembuluh darah untuk melepaskan insulin melalui membran semipermeabel sebagai respons terhadap kadar glukosa darah. Mikro-enkapsulasi mengemas sejumlah kecil pulau kecil ke dalam kapsul berpori. Meskipun enkapsulasi ini dapat melindungi pulau dari penolakan kekebalan, efek samping seperti runtuhnya membran atau pembentukan trombus telah dilaporkan dalam percobaan in vivo. Pulau-pulau tersebut juga mengganggu aliran hormon, nutrisi, atau oksigen karena peningkatan jarak difusi. Nano-enkapsulasi adalah strategi modifikasi permukaan sel yang menginduksi perlekatan antara sel dan protein eksogen, terutama polietilen glikol (PEG), dalam transfusi darah [4].
Nano-enkapsulasi menggunakan PEG telah banyak digunakan sebagai metode modifikasi untuk meningkatkan efikasi dan sifat fisikokimia protein atau peptida target [5]. Secara khusus, nano-enkapsulasi pulau mungkin memiliki efek penghambatan dalam menanggapi serangan sel imun dan pengenalan antibodi. PEG banyak digunakan untuk pelapisan sel karena sifat biokompatibelnya seperti non-imunogenisitas, antigen masking, dan efek non-fouling [6]. Di antara nanopartikel yang digunakan untuk enkapsulasi nano NPCC, "polimersom" (PSomes) berdasarkan PEG-blok-poli laktida (PEG-b-PLA) adalah yang paling cocok karena stabil dan mudah dimodifikasi; mereka juga dapat menggabungkan reagen hidrofilik dan hidrofobik dalam perakitannya [7, 8]. Modifikasi permukaan pulau menggunakan polimer (mengandung PEG) dilakukan melalui ikatan kovalen atau non-kovalen antara matriks ekstraseluler (ECM) pulau dan polimer terkonjugasi gugus fungsional [9].
Dalam penelitian sebelumnya, larutan garam seimbang Hank's basa (HBSS, pH 8.0) digunakan sebagai buffer reaksi enkapsulasi nano pulau karena kemampuannya untuk memfasilitasi N-hidroksisuksinimida (NHS)-NH2 mengikat [10,11,12]. Namun, untuk meminimalkan kerusakan seluler pada NPCC selama enkapsulasi nano, kami menggunakan media F-10 (media kultur NPCC) dengan pH fisiologis (pH 7,3). Selain itu, karena mempertahankan jumlah NPCC setelah nano-enkapsulasi penting untuk transplantasi jumlah sel yang benar, kami menambahkan bovine serum albumin (BSA), yang melapisi bagian bawah cawan kultur sel dengan polimer rantai panjang, untuk meningkatkan pemulihan menilai [13]. Dalam penelitian kami sebelumnya, enkapsulasi nano NPCC dengan PSomes dilakukan melalui kelompok fungsional tunggal, seperti NHS atau NH2 , yang masing-masing digunakan untuk menginduksi ikatan kovalen atau interaksi elektrostatik dengan ECM dari NPCC. Namun, karena afinitas pengikatan menurun seiring waktu, strategi diperlukan untuk meningkatkan efisiensi pengikatan [14]. Beberapa yang memiliki gugus bifungsional dapat digunakan sebagai kandidat untuk meningkatkan efisiensi pelapisan karena kemampuannya untuk beragregasi. Oleh karena itu, kami menginduksi cross-linking antara PSomes yang mengandung kelompok bifungsional (NHS-/NH2 -PSome) yang dapat mengikat tidak hanya ke ECM dari NPCC, tetapi juga ke setiap PSome melalui interaksi kovalen atau interaksi elektrostatik, sehingga meningkatkan efisiensi nano-enkapsulasi.
Dalam penelitian ini, kami menyelidiki kemungkinan penerapan enkapsulasi nano pada NPCC melalui metode yang dioptimalkan di bidang xeno-transplantasi pulau babi.
Bahan dan Metode
Hewan
Semua eksperimen hewan telah disetujui oleh Institutional Animal Care and Use Committee dari Institute of MGENPLUS co. ltd. (#2019–1), dan semua prosedur dilakukan sesuai dengan pedoman yang ditetapkan oleh panitia. Pembedahan dilakukan dengan anestesi umum, dan upaya dilakukan untuk memastikan hewan mengalami rasa sakit yang minimal. Babi dibunuh sebelum pankreatektomi.
Isolasi Kluster Sel Mirip Pulau Babi Neonatal (NPCC)
NPCC diisolasi dari anak babi berumur 3 sampai 5 hari. Secara singkat, anak babi dibius menggunakan injeksi ketamin (10 mg/kg, Yuhan, Seoul, Korea) dan xylazine hidroklorida (1 mg/kg, Rompun; Bayer Korea, Seoul, Korea) ke otot femoralis dan kemudian dibunuh dengan menyuntikkan kalium klorida ( Sigma-Aldrich, MO, USA) ke dalam jantung. Pankreas dibuka melalui sayatan perut, diambil, dan direndam dalam larutan garam seimbang Hank (HBSS, Biosesang, Gyeonggi-do, Korea) dengan 8,3 mM natrium bikarbonat, 10 mM N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-( 2-ethanesulfonic acid) (HEPES) (Sigma-Aldrich, MO, USA), dan 0,5% antibiotik-antimikotik (Biowest, MO, USA). Pankreas dipotong menjadi 1–2 mm
3
fragmen dan dicerna dalam kolagenase tipe V (1 mg/ml, Sigma- Aldrich, MO, USA) dalam HBSS selama 10 menit. HBSS dingin yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) (Biowest, MO, USA) ditambahkan ke jaringan pankreas yang dicerna untuk menghentikan aktivitas enzim. Jaringan pankreas yang dicerna dicuci dalam HBSS, dan setelah resuspensi, jaringan disaring melalui pluriStrainer 500 m (pluriSelect, Leipzig, Jerman) dan dicuci dalam HBSS. Akhirnya, NPCC diunggulkan dan dibiakkan dalam 5% CO2 pada suhu 37 °C dalam media F-10 (Gibco, CA, USA) ditambah dengan 0,25% bovine serum albumin (BSA) (genDepot, TX, USA), 10 mM nicotinamide, 10 mM D-glucose, 2 mM L-glutamine, 2 mM kalsium klorida dihidrat, 50 μM isobutilmethylxanthine (IBMX), 20 μg/ml ciprofloxacin (Sigma-Aldrich, MO, USA), dan 1% antibiotik-antimikotik. NPCC dikultur selama 5 hari [15], dengan 10 nM exendin-4 (Prospec, Ness-Ziona, Israel) ditambahkan ke media kultur setiap hari.
Penilaian In Vitro NPCC dan NPCC yang Dienkapsulasi Nano
Setelah kultur, jumlah NPCC dihitung sebagai islet equivalen (IEQ) menggunakan reticle lensa mata di mata. Viabilitas dinilai menggunakan acridine orange (AO, 0.67 μM, Sigma-Aldrich, MO, USA) dan pewarnaan propidium iodide (PI, 75 M, Sigma-Aldrich, MO, USA). Untuk melakukan uji glukosa-stimulasi insulin sekresi (GSIS), 20-30 NPCC dipilih dan diinkubasi sebelumnya dengan konsentrasi D-glukosa (2,8 mM) rendah dalam buffer bikarbonat Krebs-Ringer (KRBB) selama 1 jam. NPCC kemudian diinkubasi dengan D-glukosa rendah (2,8 mM) dalam buffer KRBB selama 1 jam diikuti dengan larutan D-glukosa tinggi (28,0 mM) dalam KRBB selama 1 jam. Supernatan dikumpulkan untuk mengukur sekresi insulin di bawah konsentrasi glukosa rendah dan tinggi [11]. Jumlah insulin yang disekresikan dari setiap sampel diukur menggunakan Kit ELISA Insulin Quantikine Manusia/Anjing/Babi (sistem R&D, MN, USA). Indeks stimulasi (SI) dihitung dengan membagi jumlah insulin pada glukosa tinggi (28,0 mM) dengan konsentrasi glukosa rendah (2,8 mM).
Persiapan Polimer (PSome)
Untuk menyiapkan PSomes, baik kopolimer N-hidroksisuksinimida-poli (etilena glikol)-blok-poli (laktida) (10 mg/ml, NHS-PEG-b-PLA) atau amina-poli (etilena glikol)-blok-poli (laktida ) kopolimer (10 mg/ml, NH2 -PEG-b-PLA; Polimer nanosoft, NC, USA) dilarutkan dalam 1 ml dimetil sulfoksida (DMSO, Sigma-Aldrich, MO, USA). Selain menyiapkan PSome bifungsional, setiap kopolimer (NHS atau NH2 -PEG-b-PLA) dilarutkan dalam DMSO dicampur dalam proporsi. Air suling (DH2O) ditambahkan ke larutan polimer untuk membuat konsentrasi akhir 1 mg/ml. Larutan polimer disonikasi dalam ultrasonikator (ultrasonik Sea han, Seoul, Korea) selama 5 menit. 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, garam 4-chlorobenzenesulfonate (DiD; Biotium, CA, USA) ditambahkan ke larutan polimer selama sonikasi untuk memungkinkan visualisasi. Terakhir, campuran didialisis dalam DH2O selama 3 hari.
Enkapsulasi nano
PSome diencerkan dalam buffer reaksi enkapsulasi nano (baik HBSS (pH 7,3 atau pH 8,0) atau media F-10 biasa tanpa suplemen (pH 7,3 atau pH 8,0), dengan atau tanpa BSA 0,25%). Enkapsulasi nano dilakukan dengan menambahkan PSome ke NPCC di media kultur. Untuk melakukan ini, 10.000 IEQ NPCC diunggulkan dalam cawan kultur sel 6-sumur (SPL, Gyeonggi-do, Korea), dan P Beberapa yang diencerkan ditambahkan ke NPCC dan diinkubasi dalam 5% CO2 pada 37 °C selama 1 jam. Kelompok kontrol negatif (NC) (NPCC tanpa lapisan tanpa PSomes) diinkubasi dalam kondisi yang sama dengan kelompok eksperimen. Setelah inkubasi, NPCC yang dienkapsulasi nano dipanen dan dikultur dalam media kultur F-10.
Efisiensi NPCC yang dienkapsulasi Nano
NPCC terkonjugasi PSome nano-enkapsulasi DiD divisualisasikan menggunakan mikroskop fluoresensi (Leica, Wetzlar, Jerman) atau mikroskop pemindaian laser confocal (CLSM; Carl Zeiss, Oberkochen, Jerman). Intensitas NPCC terikat PSome-terkonjugasi DiD dihitung dengan menghitung intensitas fluoresensi rata-rata (MFI) menggunakan perangkat lunak ImageJ (NIH, Bethesda, USA). Nukleus dalam sel diwarnai dengan 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
Uji Permeabilitas Polimersom
NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano dalam F-10 atau F-10 (0,25% BSA) diinkubasi dengan dekstran terkonjugasi fluorescein isothiocyanate (FITC) dengan berbagai berat molekul (10, 20, 70, dan 250 kDa) selama 2 jam . Penetrasi dekstran terkonjugasi FITC ke dalam NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano dikonfirmasi untuk setiap berat molekul melalui mikroskop pemindaian laser confocal.
Uji Viabilitas Sel Polimer
NHS-PSome nano-encapsulated THP-1 (garis sel monositik manusia) di RPMI 1640 (Biowest, MO, USA) diinkubasi selama 1 jam. Kelangsungan hidup NHS-PSome nano-encapsulated THP-1 diukur menurut protokol yang disajikan dalam kit uji proliferasi sel MTT (iNtRon Biotechnology, Seongnamsi, Korea).
Analisis Statistik
Uji-t tidak berpasangan dilakukan pada GraphPad Prism 6.0. Signifikansi statistik dinyatakan sebagai *, ** ***, dan **** yang menunjukkan P nilai 0,05, ≤ 0,01, ≤ 0,001 dan 0,0001.
Hasil
Penilaian Budaya dan Fungsional NPCC
NPCC dikultur selama 5 hari, dan kontrol kualitas, termasuk viabilitas dan GSIS, dilakukan. Jumlah total NPCC adalah 21.014,0 IEQ/g/pankreas. Viabilitas, menggunakan pewarnaan AO/PI, adalah 89,9%. GSIS, yang dilakukan untuk mengkonfirmasi responsivitas NPCC terhadap konsentrasi glukosa, memberikan indeks stimulasi rata-rata (SI) sebesar 2,3 (Tabel 1, File tambahan 1:Gambar. S1).
PBeberapa Konsentrasi Diperlukan untuk Enkapsulasi Nano NPCC yang Efisien
Untuk menentukan konsentrasi PSome yang diperlukan untuk enkapsulasi nano yang efisien, kami menambahkan berbagai konsentrasi NHS-PSome ke NPCC. NHS-PSBeberapa ditebar dengan konsentrasi 1 mg/ml dalam DH2 O dan diencerkan pada 1:5, 1:10, 1:20, dan 1:40 untuk memberikan konsentrasi akhir mulai dari 0,2 hingga 0,025 mg/ml. Efisiensi nano-enkapsulasi diukur dengan MFI dari PSome NPCC yang dienkapsulasi nano DiD-loaded. Konsentrasi akhir 0,1 mg/ml (pengenceran 1:10) menunjukkan intensitas fluoresensi tertinggi pada 2 hari setelah enkapsulasi nano (Gbr. 1a dan b) dan enkapsulasi nano berikutnya dari NPCC dilakukan pada konsentrasi ini.
Optimalisasi konsentrasi PSome untuk enkapsulasi nano yang efektif pada 0 dan 2 hari. Optimalisasi konsentrasi PSome untuk enkapsulasi nano yang efektif. a NHS-PBeberapa yang dimuat DiD dirawat di NPCC pada berbagai konsentrasi (BF; bidang terang). Bilah skala mewakili 200 μm. b MFI dari P Beberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (n = 3) dan kontrol NC (n = 1)
Peningkatan Efisiensi Nano-enkapsulasi dalam Media F-10 dengan pH Fisiologis
Enkapsulasi nano pulau pankreas (mengandung NPCC) sering dilakukan dalam buffer HBSS dasar (pH 8,0 atau lebih) untuk meningkatkan afinitas pengikatan antara NH2 dalam ECM pulau dan NHS terkonjugasi dalam polimer. Namun, enkapsulasi nano dalam buffer HBSS dasar berpotensi merusak NPCC. Dengan demikian, untuk meminimalkan kerusakan NPCC dan menentukan pengaruh pH pada NHS- NH2 mengikat, NPCCs dienkapsulasi secara nano melalui NHS-PSome dalam buffer HBSS atau media kultur F-10 biasa (digunakan dalam penelitian ini untuk mengkultur NPCC) dengan pH 7,3 (fisiologis) atau pH 8,0 (dasar), masing-masing. Ketika NPCC dienkapsulasi nano dalam F-10, morfologi normal NPCC dipertahankan (Gbr. 2a), dan efisiensi enkapsulasi nano berdasarkan MFI meningkat secara signifikan dibandingkan dengan kelompok HBSS terlepas dari pH pada hari ke 0 dan 6 (Gbr. 2b). Meskipun kelompok HBSS menunjukkan perbedaan yang signifikan antara pH 7,3 dan 8,0 pada hari ke-6, intensitas nano-enkapsulasi menurun secara signifikan dibandingkan dengan kelompok F-10. Jadi, kami menggunakan media kultur F-10 fisiologis (pH 7,3) sebagai buffer reaksi enkapsulasi nano dalam eksperimen berikutnya untuk meminimalkan potensi kerusakan NPCC.
Perbandingan efisiensi pelapisan nano-enkapsulasi dalam berbagai buffer reaksi pada hari 1 dan 6. Perbandingan efisiensi pelapisan nano-enkapsulasi di berbagai buffer reaksi. a NPCC yang dienkapsulasi nano dalam HBSS (pH 7,3 dan pH 8,0) atau F-10 (pH 7,3 dan pH 8,0) menggunakan NHS-PSom terkonjugasi DiD (BF; bidang terang). Bilah skala mewakili 200 um; b MFI NPCC yang dienkapsulasi nano dalam HBSS (pH 7,3 dan pH 8,0) atau F-10 (pH 7,3 dan pH 8,0) menggunakan NHS-PSome terkonjugasi DiD (semua kelompok; n = 3). Data mewakili mean ± S.D. *p < 0,05, ***p < 0.001 dan ****p < 0,0001 versus grup lain
Peningkatan Tingkat Pemulihan NPCC Setelah Enkapsulasi Nano
Meskipun kerusakan seluler NPCC diminimalkan di F-10, jumlah NPCC yang dikumpulkan setelah nano-enkapsulasi berkurang secara nyata. Untuk mengatasi masalah ini, kami menambahkan 0,25% BSA ke media F-10 selama kultur dan enkapsulasi nano NPCC menggunakan NHS-PSom. Kami awalnya mengkonfirmasi apakah menambahkan 0,25% BSA ke dalam media F-10 mempengaruhi efisiensi pelapisan dan permeabilitas selektif, memungkinkan lewatnya molekul kecil (10 dan 20 kDa FITC-conjugated dextran) sambil memblokir molekul yang lebih besar (70 dan 250 kDa FITC-conjugated dextran) dekstran), sebagai fungsi penting dari PSome. Akibatnya, lapisan konformal ditunjukkan pada gambar CLSM (Gbr. 3a, Mid) dan permeabilitas selektif dipertahankan secara normal (Gbr. 3b, dekstran terkonjugasi FITC) di NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano dengan F-10 yang mengandung 0,25 % BSA dibandingkan dengan F-10, meskipun MFI sedikit berkurang (Gbr. 3b). Jumlah NPCC yang dikumpulkan setelah nano-enkapsulasi menunjukkan tingkat pemulihan yang jauh lebih tinggi (71,9%) di F-10 dengan 0,25% BSA dibandingkan di F-10 tanpa BSA (42,3%) (Gbr. 3c). Viabilitas (NC:89,5%, NHS-PSom:90,3%) dan sekresi insulin yang distimulasi glukosa (NC:2.1, NHS-PSom:1.6) dari NPCC di F-10 dengan 0,25% BSA juga dipertahankan setelah nano-enkapsulasi (Gbr. . 4a, b, File tambahan 1:Gbr. S2). Hasil kami menunjukkan bahwa penambahan 0,25% BSA dapat secara signifikan meningkatkan tingkat pemulihan NPCC setelah nano-enkapsulasi dan tidak mempengaruhi efisiensi pelapisan atau fungsi PSome.
Perbandingan efisiensi pelapisan setelah penambahan 0,25% BSA dalam buffer reaksi enkapsulasi nano untuk meningkatkan laju pemulihan. Perbandingan efisiensi pelapisan setelah penambahan 0,25% BSA dalam buffer reaksi enkapsulasi nano untuk meningkatkan laju pemulihan. a Efisiensi pelapisan dan permeabilitas selektif dari NPCC yang dienkapsulasi nano dengan NHS-PSBeberapa di F-10 atau F-10 dengan 0,25% BSA (BF; bidang terang, Mid; gambar tengah menggunakan CLSM dari NHS-PSon terkonjugasi DiD Beberapa NPCC yang dienkapsulasi nano, Dekstran terkonjugasi FITC; gambar tengah menggunakan CLSM dari dekstran terkonjugasi FITC di NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano). Biru di Pertengahan mewakili sel melalui pewarnaan DAPI. Bilah skala adalah 200 (BF dan DiD) dan 100 (dekstran terkonjugasi Mid dan FITC) m; b MFI dari NPCC yang dienkapsulasi nano menggunakan NHS-PSom terkonjugasi DiD; c Tingkat pemulihan NPCC setelah enkapsulasi nano di F-10 (n = 12) atau F-10 dengan 0,25% BSA (n = 12). Data mewakili mean ± S.D. *p < 0,05 versus F-10
Viabilitas dan fungsionalitas NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano menggunakan F-10 dengan BSA 0,25%. Viabilitas dan fungsionalitas NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano menggunakan F-10 dengan BSA 0,25%. a Kelangsungan NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (n = 6) dan kontrol NC (n = 6); b SI dari NHS-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (n = 5) dan kontrol NC (n = 5). Data mewakili mean ± S.D
Peningkatan Stabilitas Nano-enkapsulasi Melalui PSomes Penautan Silang
Untuk menginduksi enkapsulasi nano NPCC yang lebih stabil, kami mencoba mengonjugasikan PSomes yang memiliki dua kelompok fungsional yang berbeda. Pertama, kami melakukan enkapsulasi nano NPCC dengan secara bersamaan menambahkan proporsi berbeda dari PSomes yang mengandung NHS dan NH2 kelompok bifungsional (NHS-/ NH2 -PSome) dalam satu PSome (Skema 1). Efisiensi enkapsulasi nano dikonfirmasi oleh MFI dari DiD yang terkonjugasi dalam PSome NPCC yang dienkapsulasi nano. Gambar yang dihasilkan dari mikroskop fluoresensi tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan antara kelompok 9:1, 5:5, dan 1:9 NHS-/NH2-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (9:1, 5:5, 1:9) pada hari ke 0 dan hari (Gbr. 5a). Namun, pada hasil CLSM, kelompok 5:5 tampak overcoated dan 1:9 menunjukkan lapisan yang tidak mencukupi sedangkan kelompok 9:1 membentuk lapisan konformal, pada hari ke-1 (Gbr. 5b). Oleh karena itu, kami menentukan rasio optimal NHS-/NH2 di PSome menjadi 9:1. Ketika uji fungsional dilakukan untuk kelompok 9:1, hasil kami menunjukkan bahwa kelangsungan hidup kelompok 9:1 menurun secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol NC (92,1%), tetapi kelangsungan hidup dipertahankan pada tingkat normal (87,8 %). Fungsi SI kelompok 9:1 adalah normal (3.0) bila dibandingkan dengan fungsi NC kontrol (3.7) (Gbr. 5c,d).
Ilustrasi peningkatan stabilitas enkapsulasi nano dengan menghubungkan silang PSomes
Efisiensi dan fungsionalitas pelapisan NHS-/NH2 -PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano. Efisiensi dan fungsionalitas pelapisan NHS-/NH2 -PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano. a DiD terkonjugasi 9:1, 5:5, 1:9 dari NHS-/NH2 -PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (9:1, 5:5, 1:9) (NC; NPCC yang tidak dilapisi). MFI menunjukkan intensitas P Terkonjugasi DiD Beberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (n = 3) dan kontrol NC (n = 3). Bilah skala mewakili 200 um; b CLSM dari NHS-/NH terkonjugasi DiD2 -PSBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano (Gambar tengah; tengah menggunakan CLSM dari NHS-/NH terkonjugasi DiD2 -PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano). Biru di Pertengahan mewakili sel melalui pewarnaan DAPI. Bilah skala mewakili 100 um; C. Viabilitas 9:1 (n = 9) dan kontrol NC (n = 3). Data mewakili mean ± S.D. **p < 0,01 versus NC; D. SI dari 9:1 (n = 9) dan kontrol NC (n = 3). Data mewakili mean ± S.D
Diskusi
Diabetes melitus atau yang biasa dikenal dengan penyakit kencing manis adalah penyakit metabolik yang ditandai dengan tingginya kadar glukosa darah. Diabetes tipe 1 hasil dari kegagalan sel beta di pankreas untuk memproduksi insulin yang cukup [16]. Transplantasi pulau pankreas yang mengandung sel penghasil insulin baru-baru ini digunakan untuk menyembuhkan diabetes tipe 1. Namun, transplantasi allo-islet terbatas karena kekurangan donor; sebaliknya, xenotransplantasi menggunakan pulau dari hewan non-manusia telah muncul sebagai sumber alternatif jaringan donor. Karena kesamaan fisiologisnya dengan manusia, kemudahan pemuliaan massal, dan ketersediaan perkembangbiakan di fasilitas bebas patogen, babi dianggap sebagai model hewan yang optimal untuk transplantasi pulau xeno [1]. Terutama, NPCC telah digunakan dengan nilai sebaik API. Meskipun kematangan NPCC lebih rendah daripada API, NPCC memiliki beberapa keunggulan dibandingkan API termasuk, memiliki prosedur isolasi pulau yang relatif sederhana dan murah, kemampuan untuk mengembangkan resistensi terhadap lingkungan hipoksia dan proliferasi in vivo setelah transplantasi [1,2,3] . Untuk alasan ini, kami menggunakan babi neonatus berusia 3-5 hari sebagai sumber pulau kecil dalam penelitian ini.
Sayangnya, begitu pulau babi ditanamkan ke dalam pembuluh darah primata manusia atau bukan manusia, reaksi imun yang parah seperti IBMIR atau penolakan hiperakut sering terjadi. IBMIR biasanya terjadi karena beberapa faktor jaringan (TF) yang diekspresikan dalam pulau babi yang memediasi koagulasi dalam pembuluh darah manusia melalui aktivasi jalur ekstrinsik. Antigen alfa-galaktosa atau non-gal yang diekspresikan pada permukaan sel babi juga dapat menjadi target antibodi manusia alami, diikuti oleh aktivasi kaskade pelengkap yang disebut penolakan hiperakut. Akibatnya, cangkok hilang setelah hipoksia oleh pembentukan bekuan dari jalur koagulasi dan kematian sel oleh aktivasi komplemen di host [3]. Untuk mengatasi masalah ini, enkapsulasi, metode pelapisan pulau pankreas dengan bahan biokompatibel untuk melindunginya dari serangan antibodi atau reaksi komplemen, telah dicoba. Pertama, enkapsulasi makro menggunakan perangkat dengan membran semipermeabel yang mengandung pulau dan ditanamkan di sebelah pembuluh darah di mana ia melepaskan insulin ke dalam aliran darah sebagai respons terhadap kadar glukosa darah [4]. Kedua, mikro-enkapsulasi, terutama menggunakan alginat, memiliki permeabilitas selektif dan dapat memungkinkan oksigen dan nutrisi melewati permukaan berpori, sementara memblokir beberapa sitokin dan infiltrasi sel imun. Namun, karena mereka menggunakan ukuran kapsul yang sama terlepas dari ukuran pulau, sulit untuk melapisi pulau secara sesuai. Selain itu, fibrosis dapat terjadi, melampirkan cangkok setelah transplantasi [17]. Terakhir, modifikasi permukaan pulau (nano-enkapsulasi) terutama menggunakan polietilen glikol (PEG) yang memiliki sifat “efek siluman” yang menghalangi interaksi bahan yang dilapisi dengan polimer “siluman” (PEG) dan komponen dalam darah (sel imun) di vivo [11, 18]. Strategi enkapsulasi nano NPCC kami menggunakan kopolimer PEG yang dimodifikasi (PEG-b-PLA, Polymersome, PSome). Juga, Psome memiliki sifat hidrofilik dan hidrofobik dan dapat menggabungkan imunosupresan atau faktor yang terlibat dalam diferensiasi atau pertumbuhan sel [8].
Enkapsulasi nano pulau menggunakan PEG telah dilakukan dalam buffer HBSS dasar (pH 8,0 atau lebih tinggi) untuk meningkatkan afinitas pengikatan antara NHS pada PEG dan NH2 pada ECM pulau [10,11,12]. Namun, karena kondisi ini tidak dapat menyediakan lingkungan kultur sel yang sesuai, kami mencoba enkapsulasi nano dalam lingkungan yang meniru kondisi kultur NPCC. Untuk mengatasi masalah di atas, kami menguji media F-10 biasa, media dasar kultur NPCC, dengan pH fisiologis (tanpa suplemen apa pun) yang digunakan sebagai buffer reaksi enkapsulasi nano. Enkapsulasi nano dalam F-10 dengan pH fisiologis menunjukkan efisiensi pelapisan yang sama dan mempertahankan morfologi normal NPCC bila dibandingkan dengan kondisi kultur menggunakan buffer HBSS dasar (Gbr. 3). Oleh karena itu, kami dapat mengusulkan platform yang meminimalkan kerusakan NPCC selama enkapsulasi nano dalam lingkungan peniruan kultur NPCC.
Meskipun metode enkapsulasi nano untuk meminimalkan kerusakan NPCC telah ditetapkan, jumlah residu NPCC yang dikumpulkan setelah enkapsulasi nano menurun ketika enkapsulasi nano dilakukan dalam cawan petri. Ini berarti Anda memerlukan lebih banyak NPCC untuk enkapsulasi nano untuk transplantasi. Menurut laporan sebelumnya, hasil pulau ditingkatkan pada beberapa strain tikus dengan menggunakan BSA selama isolasi [19]. Juga, BSA digunakan sebagai kultur suspensi dengan melapisi permukaan cawan kultur sel dalam kultur sel hepatoma tikus [13]. Oleh karena itu, untuk meningkatkan jumlah NPCC setelah enkapsulasi nano, 0,25% BSA ditambahkan dalam buffer reaksi enkapsulasi nano F-10, sama dengan konsentrasi BSA yang digunakan untuk membiakkan NPCC. Akibatnya, tingkat pemulihan NPCC meningkat secara signifikan setelah enkapsulasi nano (Gbr. 4). Ini berarti bahwa jumlah pulau yang benar (mengandung NPCC) setelah enkapsulasi nano dapat diprediksi dan ditransplantasikan dengan meminimalkan kehilangan pulau (mengandung NPCC). Singkatnya, penelitian ini menggunakan F-10 dengan 0,25% BSA untuk enkapsulasi nano menunjukkan bahwa (i) morfologi normal NPCC dipertahankan, (ii) pengikatan antara PSome terkonjugasi NHS dan NH2 dalam ECM NPCC tidak terganggu dan (iii) tingkat pemulihan NPCC setelah enkapsulasi nano meningkat.
Akhirnya, kami berusaha untuk meningkatkan stabilitas enkapsulasi nano melalui (i) konjugasi antara PSomes dan (ii) pengikatan antara PSomes dan ECM dari NPCCs. Pertama, polimer NHS- dan NH2-PEG-b-PLA dicampur secara proporsional untuk membentuk PSome bifungsional (NHS-/NH2-PSome) yang dapat mengikat PSome dan ECM dari NPCC. Kami mendalilkan bahwa konjugasi dapat dicapai secara efisien oleh kelompok bifungsional dalam satu PSome daripada mengkonjugasikan dua PSome dengan kelompok mono-fungsional karena gangguan potensial yang disebabkan oleh pengikatan antara PSome dengan kelompok fungsional yang sama (NHS-NHS dan NH2-NH2). Seperti yang terlihat dari hasil, pelapisan konformal NPCC dicapai pada proporsi 9:1 NHS-/NH2-PBeberapa NPCC yang dienkapsulasi nano, dan viabilitas serta fungsionalitas dipertahankan (Gbr. 5). Namun, penelitian lebih lanjut diperlukan untuk mengukur kekuatan ikatan PSome, untuk membuktikan bahwa enkapsulasi nano dengan PSomes bifungsional menghasilkan enkapsulasi yang lebih stabil daripada enkapsulasi dengan PSome monofungsional. Oleh karena itu, kami menyarankan bahwa kondisi enkapsulasi nano efektif kami yang meniru lingkungan kultur NPCC dapat digunakan dalam strategi enkapsulasi nano menggunakan pulau yang mengandung NPCC (File tambahan 1).
Kesimpulan
Penelitian ini dilakukan untuk menentukan metode nano-enkapsulasi pulau pankreas (NPCCs) yang optimal menggunakan polimersom berbasis PEG (PSomes). Pertama, menggunakan media kultur F-10 dengan pH 7,3 dapat mempertahankan morfologi normal NPCC setelah enkapsulasi nano dibandingkan dengan menggunakan buffer HBSS dasar (pH 8,0), sehingga meminimalkan kerusakan pada NPCC selama enkapsulasi. Kedua, menambahkan 0,25% BSA ke media F-10 meningkatkan hasil NPCC sekitar 1,7 kali setelah enkapsulasi nano. Akhirnya, kami menginduksi enkapsulasi nano yang lebih stabil melalui konjugasi PSomes bifungsional (NHS-/NH2-PSomes). Metode enkapsulasi nano yang disajikan dalam makalah ini mungkin dapat diterapkan pada enkapsulasi nano pulau pankreas menggunakan nanopartikel berbasis PEG.
Ketersediaan data dan materi
Tidak berlaku.
Singkatan
DiD:
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindodicarbocyanine, 4-chlorobenzenesulfonate salt
