Penginderaan Hidrogen Peroksida Berdasarkan Modifikasi Permukaan Bagian Dalam dari Nanopori Padat

Hasil dan Diskusi

Imobilisasi Nanopore dengan HRP

Nanopori terpilih dengan diameter ~50nm direndam dalam larutan piranha pada suhu 80 °C selama 30 menit. Setelah diolah dengan larutan piranha, permukaan bagian dalam nanopori mampu mengambil gugus hidroksil silikon. Selanjutnya, seluruh film tipis diaktifkan dengan (3-Aminopropil)triethoxysilane (3-APTES). Sebagai hasil pengobatan dengan 3-APTES, amino (-NH₂ ) kelompok dihasilkan di permukaan film.

Setelah aktivasi dengan (3-Aminopropyl)triethoxysilane (3-APTES), chip nanopore dimasukkan ke dalam larutan PBS 0,1 M N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide (EDC) (10 mM) dan N-hydroxysuccinimide ( NHS) (20 mM). Setelah itu, chip nanopore dimasukkan ke horseradish peroxidase (HRP) (10 ng/ml). Menurut hasil penelitian sebelumnya dari kelompok kami [3], dengan konsentrasi garam yang berbeda dari 0,1 sampai 2 M KCl, pH 7,0, HRP tidak beragregasi. Karena pI nilai horseradish peroksidase menjadi 4,3 ± 0,2, kami juga membuktikan bahwa HRP tidak beragregasi dalam 0,1 M KCl pH 6,0 dan pH 7,0. Reagen EDC mengaktifkan gugus karboksil (-COOH) dari HRP menjadi zat antara o-acylisourea yang sangat reaktif. Selanjutnya, intermediet selanjutnya diubah menjadi ester suksinimida yang lebih stabil dengan adanya NHS [58]. Menghasilkan, dalam kopling kovalen zat antara dengan (-NH₂ ) yang dihasilkan pada permukaan bagian dalam nanopori untuk membentuk ikatan amida yang stabil (Gbr. 1).

Melakukan proses modifikasi dalam satu saluran nanopori solid-state. a Representasi skema dari perlekatan kovalen horseradish peroxidase (HRP) ke saluran nanopori tunggal melalui kimia kopling karbodiimida. Gugus karboksil (-COOH) dari HRP diaktifkan oleh larutan EDC, memungkinkan HRP untuk bereaksi dengan (-NH₂ ) yang dihasilkan pada permukaan chip nanopore. b Skema sensor hidrogen peroksida HRP amobil, permukaan bagian dalam sensor dimodifikasi dengan HRP. Saat H₂ O₂ dan ABTS terjadi, ABTS ^•+ diproduksi. Struktur kristal HRP digunakan dengan izin dari penulis [3]

Proses-proses ini membawa kita menuju imobilisasi HRPs pada permukaan bagian dalam nanopori tunggal. Realisasi proses fungsionalisasi dikonfirmasi dengan mengukur tegangan arus (I-V ) dari nanopori tunggal sebelum dan sesudah modifikasi (Gbr. 2).

Melakukan tegangan arus tipikal (I-V ) kurva nanopori yang tidak dimodifikasi (asli) dan yang dimodifikasi dalam 0,1 M KCl, buffer pada pH 7,0 dengan 0,1 M PBS. garis hitam adalah I-V kurva nanopore yang tidak dimodifikasi, dan garis merah adalah I-V kurva nanopore dimodifikasi dengan HRPs. sisipan adalah mikroskop elektron pemindaian (SEM) dari nanopori tunggal (diameter ~50 nm cis) dan sensor nanopori. 100 nm adalah skala

Karakterisasi Nanopore Padat-State Modifikasi HRP

Di sini, bentuk satu Si₃ N₄ saluran nanopore berbentuk silinder. Gambar 2 menunjukkan tegangan arus tipikal (I-V ) kurva nanopori yang tidak dimodifikasi (asli) dan yang dimodifikasi dalam 0,1 M KCl, buffer pada pH 7,0 dengan 0,1 M PBS. Setelah memodifikasi permukaan bagian dalam nanopore dengan enzim HRP, ukuran pori menjadi lebih kecil.

Menurut Wanunu et al, dengan memperhitungkan konduktansi eksternal nanopori, diameter solid-state nanopore dapat dihitung dengan persamaan berikut,

Dimana, d dan l adalah diameter dan panjang pori,G adalah konduktansi pori terbuka nanopore, σ adalah konduktivitas larutan ion.

Mempertimbangkan efek geometris, setelah modifikasi nanopori solid-state dengan enzim HRP, ukuran efektif dapat dihitung. Diameter nanopori tunggal dapat dihitung berdasarkan persamaan (1). Dimana, nilai konduktansi (G _{tidak dimodifikasi} ) adalah ~15 nS dapat diperoleh dari I-V kurva nanopore solid-state yang tidak dimodifikasi. Konduktivitas (σ ) larutan ion 0,1 M KCl (25 °C), buffer pada pH 7,0 dengan 0,1 M PBS adalah ~1,28 S/m. Oleh karena itu, diameter nanopori yang tidak dimodifikasi adalah ~51 nm, mirip dengan diameter yang diukur. Dengan menggunakan metode yang sama, diperoleh nilai konduktansi (G _diubah ) adalah ~7,5 nS, dan diameter (~34 nm) nanopori yang dimodifikasi dapat dihitung. Pengurangan diameter dimungkinkan karena dua alasan berikut, pertama adalah memperlakukan permukaan bagian dalam nanopori dengan (3-aminopropil)triethoxysilane (3-APTES), memungkinkan permukaan nanopori untuk mengambil (-NH₂ ) gugus amino. Alasan kedua adalah bahwa diameter hidrodinamik (D _h ) dari enzim HRP adalah ~8 nm [3], HRP yang tidak bergerak dapat mengurangi diameter pori. Di sini, nanopore solid-state yang dimodifikasi HRP dengan diameter ~34 nm digunakan sebagai saluran deteksi hidrogen peroksida.

Prinsip Reaksi Redoks

Reaksi redoks dilakukan di dalam nanopori termodifikasi tunggal, dan proses reaksi yang disajikan berikut ini sesuai dengan reaksi redoks yang diusulkan [58]. Di hadapan H₂ O₂ (0,5 mM), enzim HRP yang diimobilisasi pada permukaan bagian dalam nanopori segera diubah menjadi senyawa 1. Kemudian, senyawa 1 menerima satu elektron dari molekul substrat pereduksi ABTS (1,5 mM) untuk menghasilkan senyawa 2. Selanjutnya, senyawa 2 direduksi kembali ke enzim istirahat melalui transfer satu elektron dari molekul substrat lain ABTS.

Produk kationik (ABTS ^•+ ) dari reaksi redoks terakumulasi dalam nanopori tunggal. Translokasi akumulasi molekul dari saluran nanopore akan mengubah konduktansi (G ), dan dengan demikian perubahan arus (ΔI _b ) dapat ditemukan.

Deteksi Peristiwa Translokasi

Eksperimen dilakukan menggunakan horseradish peroxidase (HRP) yang dimodifikasi nanopori dengan diameter pori yang dimodifikasi (~34 nm) dalam 0,1 M KCl, buffer pada pH 7,0 dengan 0,1 M PBS. 2, 2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate (ABTS) (1,5 mM) dan hidrogen peroksida (H₂ O₂ ) (0,5 mM) ditambahkan ke kompartemen trans nanopori. Setelah menambahkan ABTS dan H₂ O₂ , percobaan menggunakan tegangan bias dari 100 hingga 800 mV dilakukan, dan mereka diambil sampelnya pada 100 kHz. Tidak ada peristiwa translokasi sampai tegangan meningkat menjadi 400 mV. Gambar 3 menunjukkan jejak arus ionik representatif dari peristiwa translokasi pada tegangan berbeda dari 400 hingga 800 mV dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Data eksperimen dari peristiwa translokasi durasi panjang dari tegangan yang berbeda ditambahkan ke bahan tambahan (lihat File tambahan 1:Gambar S3).

a –e Representasi skematis dari peristiwa translokasi pada tegangan yang berbeda dari 400 hingga 800 mV. Frekuensi peristiwa translokasi meningkat ketika tegangan yang diterapkan meningkat dari 400 mV menjadi 800 mV. f Amplitudo arus meningkat secara linier dengan tegangan. h Fungsi yang meluruh secara eksponensial (t _d ~ e ^−v/v0 ) digunakan agar sesuai dengan waktu tinggal yang bergantung pada tegangan yang diberikan

Peristiwa blokade arus milidetik diamati, dilakukan dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Dengan menambahkan reagen H₂ O₂ dan ABTS ke dalam transkompartemen, enzim HRP diimobilisasi pada permukaan bagian dalam saluran nanopori tunggal, dan terjadi reaksi redoks. Kelimpahan ABTS ^•+ molekul yang dihasilkan, satu molekul ABTS yang lebih kecil ^•+ mungkin tidak terdeteksi menggunakan nanopori solid-state kami, karena resolusi sistem [3]. Namun, molekul-molekul ini akan berkumpul setelah produksinya. Oleh karena itu, dimungkinkan untuk mendeteksi ABTS ^•+ molekul. Di sini, tegangan negatif ditahan, dan ABTS agregat ^•+ molekul melewati nanopori. Ada aliran elektroforesis dan eletroosmotik ketika tegangan negatif diterapkan. HRP bermuatan negatif pada 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0 [3], akibatnya akan dihasilkan lapisan listrik ganda, dan eletroosmosis akan menuju arah elektroda negatif. Karena alasan ini, elektroforesis dan eletroosmosis menuju ke arah yang sama. ABTS gabungan ^•+ di saluran nanopori tunggal akan diangkut melalui nanopori solid-state, mengalir ke arah elektroda negatif.

Analisis Statistik Peristiwa Translokasi

Karena tegangan bias memainkan peran kunci dalam translokasi agregat ABTS ^•+ , pengaruh blokade saat ini dari ABTS gabungan ^•+ melewati nanopore yang dimodifikasi HRP versus tegangan yang diterapkan telah dibahas. Frekuensi terjadinya peristiwa translokasi sangat meningkat dengan peningkatan tegangan (Gbr. 3f). Ketika tegangan meningkat, begitu juga amplitudo arus. Namun, peristiwa translokasi secara bertahap menghilang ketika tegangan bias dijaga di bawah 300 mV, yang menunjukkan bahwa ABTS gabungan ^•+ melintasi nanopori yang dimodifikasi HRP membutuhkan tegangan ambang batas 300 mV. Gambar 4 menunjukkan histogram amplitudo rata-rata saat ini dari peristiwa translokasi yang diukur untuk ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda. Berdasarkan kurva pas, nilai puncak penyumbatan saat ini (ΔI _b ) masing-masing adalah 308.4 ± 27.795 pA, 419.1 ± 20.354 pA, 478.8 ± 32.857 pA, 528.1 ± 36.98 pA, 606.9 ± 40.916 pA pada 400, 500, -600, 700, dan 800 mV. pengurangan arus diinduksi oleh ABTS agregat ^•+ molekul melewati nanopore pada tegangan yang berbeda. Nilai amplitudo arus dilengkapi dengan fungsi polinomial orde pertama, yang menghasilkan kemiringan 0,706 dan intersep 49,262. Namun berdasarkan kurva fitting, nilai dwell time adalah 54,5 ± 21.374 ms, 42.8 ± 20.181 ms, 10.3 ± 3.05 ms, 6.0 ± 1.744 ms, 4.0 ± 1.441 ms, pada −400, 500, 600, 700, dan 800 mV. Gambar 3h menunjukkan fungsi peluruhan eksponensial (t _d ~ e ^−v/v0 ) digunakan untuk menyesuaikan waktu tinggal yang bergantung pada tegangan yang diberikan. Histogram dari waktu tinggal peristiwa translokasi ditambahkan ke bahan tambahan (lihat File tambahan 1:Gambar S4).

Histogram amplitudo rata-rata saat ini dari peristiwa translokasi yang diukur untuk ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda (−400, 500, 600, 700, 800 mV) dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0. Semua histogram dilengkapi dengan distribusi Gaussian

Blokade saat ini versus waktu tunggu peristiwa untuk setiap ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda dipasang dalam plot pencar dua dimensi (Gbr. 5). Semua ABTS gabungan ^•+ menunjukkan sekelompok peristiwa dari 400 hingga 800 mV, kelompok peristiwa utama disebabkan oleh ABTS gabungan ^•+ melewati nanopore solid-state yang dimodifikasi HRP.

Plot sebar dua dimensi dari penyumbatan saat ini versus waktu tunggu peristiwa untuk setiap ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda. Histogram yang sesuai diletakkan di kanan dan di atas. Semua histogram dilengkapi dengan distribusi Gaussian

Selain itu, peristiwa translokasi tunggal pada setiap tegangan dianalisis, dan blokade arus diinduksi oleh ukuran dan zat bermuatan yang sama. Jadi, dianggap bahwa setiap peristiwa translokasi diinduksi oleh ABTS agregat tunggal ^•+ . Untuk menganalisis waktu translokasi ABTS gabungan ^•+ dalam percobaan kami. Durasi blokade saat ini t _d dianggap sebagai waktu tinggal ABTS gabungan tunggal ^•+ dari lokasi di mana ia diproduksi hingga keluarnya nanopore. Di sini, kondisi lain dipertimbangkan, mungkin ada beberapa enzim HRP yang tidak bergerak di pintu masuk nanopore, dan mungkin mengkatalisis reaksi redoks. Oleh karena itu, percobaan lain dilakukan untuk memverifikasi bahwa reaksi redoks terjadi di permukaan bagian dalam nanopori tunggal daripada di pintu masuk. Untuk verifikasi, HRP yang tidak dimodifikasi diterapkan dan dianalisis. Nanopori ini diaktifkan dengan 3-APTES. Dan HRP dengan konsentrasi yang sama (10 ng/ml), ABTS (1,5 mM) dan H₂ O₂ (0,5 mM) ditambahkan ke kompartemen trans nanopori, tegangan bias negatif diterapkan dalam 0,1 M KCl, 0,1 M PBS, pH 7,0, karena gaya elektroforesis, HRP tidak dapat melewati nanopori. Karena reaksi redoks, ABTS gabungan ^•+ diproduksi, tetapi tidak ada peristiwa translokasi yang ditemukan. Ada kemungkinan bahwa ABTS gabungan ^•+ menyebabkan efek elektrostatik dengan HRPs dan mencegah ABTS teragregasi ^•+ melewati nanopore.

Gambar 6 menunjukkan plot sebar dua dimensi dari perubahan konduktansi (ΔG ) versus waktu tunggu peristiwa untuk setiap ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda. Dapat ditemukan bahwa perubahan konduktansi (ΔG ) terutama terkonsentrasi di 0,8 nS. Bentuk peristiwa translokasi hampir sama. Nilai rata-rata ΔG adalah ~0,8 nS pada tegangan yang berbeda. Dapat dispekulasikan bahwa pengecualian volume dari setiap ABTS gabungan ^•+ molekulnya hampir sama. Ada kemungkinan bahwa efek elektrostatik dan sterik dari agregat ABTS ^•+ molekul dapat mengubah arus ionik. Setelah analisis, dua bentuk khas jejak arus dengan ABTS agregat bermuatan positif ^•+ translokasi diamati (Gbr. 7). Peristiwa translokasi pada 700 mV sebagai perwakilan. Persentase peristiwa dua jenis dianalisis, dan dapat diamati bahwa persentase peristiwa tipe 1 meningkat dengan peningkatan tegangan, di sisi lain, persentase peristiwa tipe 2 menurun. Dianggap bahwa tegangan yang lebih tinggi membuat translokasi lebih cepat daripada tegangan yang lebih rendah.

Representasi skema dari plot sebar dua dimensi ΔG versus waktu tunggu peristiwa untuk setiap ABTS gabungan ^•+ pada tegangan yang berbeda. Kurva fit yang sesuai ditempatkan di atas. sisipan adalah peristiwa translokasi tegangan yang berbeda (dari 400 hingga 800 mV)

a Skema dua jenis peristiwa translokasi pada tegangan 700 mV. b Persentase dua jenis kejadian pada tegangan yang berbeda (−400, 500, 600, 700, 800 mV)

Sinyal blokade saat ini mengungkapkan ukuran, konformasi, dan interaksi agregat ABTS ^•+ melewati saluran nanopori tunggal. Untuk perubahan bentuk saat ini, proses perubahan itu berspekulasi. Untuk peristiwa 1, sinyal arus memiliki bagian fluktuasi yang khas dengan intensitas yang dalam dan waktu tinggal yang singkat. Ada kemungkinan bahwa ABTS gabungan ^•+ melewati nanopore dari tempat di mana ia diproduksi. Saat ABTS gabungan ^•+ melewati nanopore, arus ion nanopore dikembalikan ke tingkat aslinya (Baseline) (I ₀ ). Untuk peristiwa 2, sinyal arus memiliki bagian fluktuasi dengan intensitas yang dalam dan kemudian memiliki tahap horizontal. Bentuk sinyal ini dapat dikaitkan dengan interaksi elektrostatik ABTS gabungan ^•+ dengan HRP di pintu keluar nanopore, dan arus perlahan pulih ke garis dasar. Untuk pemahaman yang lebih baik tentang perubahan saat ini, kita harus mulai dengan perubahan konduktansi pori terbuka (G _pori ) pada konsentrasi garam (0,1 M KCl). Seperti yang telah dibahas pada penelitian sebelumnya, persamaan konduktansi pori terbuka dari nanopori bermuatan negatif dengan diameter d dan panjang l pada konsentrasi garam rendah dapat digambarkan sebagai

dimana μ _K dan μ _Cl adalah motilitas elektroforesis dari K ⁺ dan Kl ⁻ , n _KCl adalah kerapatan bilangan K ⁺ dan Kl ⁻ , muatan dasar adalah e, _p adalah kerapatan muatan permukaan dari permukaan nanopori. Dalam percobaan ini, nanopore solid-state dimodifikasi secara kimia, dan diameter nanopore diubah. Kerapatan muatan permukaan dari permukaan nanopori (σ _p ) tidak dapat diperoleh dengan tepat. Oleh karena itu, konduktansi pori terbuka (G _pori ) dihitung berdasarkan persamaan (1). Karena persamaan (1), konduktansi pori terbuka (G _pori ) adalah ~7,5 nS. Hal ini berspekulasi bahwa perubahan konduktansi dapat dikaitkan dengan dua alasan [15]. Alasan pertama adalah bahwa, pengecualian volume ion dalam nanopore ditempati oleh ABTS agregat ^•+ molekul. Akibatnya, konduktansi nanopori solid-state menurun (ΔG ^- ). Alasan kedua adalah, beberapa ion dibawa dari nanopori oleh ABTS yang dikumpulkan ^•+ molekul yang meningkatkan konduktansi nanopori solid-state. Dalam eksperimen ini, ABTS ^•+ diproduksi di dalam nanopore, dan tidak ada ion yang dibawa. Oleh karena itu, perubahan konduktansi nanopori solid-state (ΔG ) hanya disebabkan oleh pengecualian volume. Jadi, perubahan total konduktansi dapat digambarkan sebagai

Penurunan konduktansi nanopori solid-state disebabkan oleh pengecualian volume dan dapat dihitung dengan persamaan berikut

dimana γ adalah faktor bentuk partikel yang merupakan rasio luas permukaan bola volume yang sama dan partikel. Dalam karya ini, ABTS gabungan ^•+ molekul disederhanakan menjadi objek global, oleh karena itu nilai γ adalah 1 dan Λ adalah pengecualian volume. Konduktivitas larutan curah σ adalah 1,28 S/m, 0,1 M KCl (25 °C).

Untuk pengecualian volume (Λ ), kita dapat menyimpulkan dari peristiwa translokasi beberapa molekul lain. Untuk menghubungkan perubahan konduktansi (ΔG ) untuk sifat fisik molekul, Hukum Ohm dapat diterapkan pada perubahan volume larutan elektrolit berdasarkan nanopori solid-state [59]. Ketika peristiwa translokasi molekul dalam nanopori solid-state silindris, arus menurun secara instan. Ketika resistansi nanopori solid-state adalah resistansi seluruh rangkaian, perubahan konduktansi (ΔG ) dapat dijelaskan dengan persamaan berikut

Dalam persamaan ini, A _p H _eff = V _p adalah volume nanopori solid-state, f (d _m /D _p , lm/H _eff ) adalah faktor koreksi (mengabaikan efek muatan permukaan), dalam percobaan kami, kami menyederhanakan agregat ABTS ^•+ molekul ke objek global; oleh karena itu, faktor koreksinya adalah 1. d _m /D _p adalah rasio diameter molekul dan diameter nanopori, lm/H _eff adalah rasio panjang efektif molekul dan panjang efektif naopore. Ekspresi (5) dapat disederhanakan menjadi

Nilai rata-rata konduktansi (G _pori ) telah dianalisis peristiwa translokasi. Dari persamaan (5), nilai rata-rata pengecualian volume (Λ ) pada tegangan yang berbeda (-400, -500, -600, -700, -800 mV) dapat diperoleh. Sedangkan ukuran nanopori yang digunakan diketahui volume nanopore (V _p ) adalah ~90746 nm ³ . Karena persamaan (4), nilai konduktansi berubah (ΔG ^- ) dapat dihitung sebagai ~0,6 nS. Nilai rata-rata perubahan konduktansi yang diperoleh dari percobaan peristiwa translokasi pada tegangan yang berbeda (−400, 500, 600, 700, 800 mV) adalah ~0,784 nS. Dapat ditemukan bahwa nilai yang dihitung mendekati nilai eksperimen.

Dalam beberapa penyelidikan sebelumnya, molekul hidrogen peroksida telah dicapai untuk dideteksi dengan teknologi yang berbeda. Tapi, untuk mendeteksi hidrogen peroksida dengan nanochannel jarang terjadi. Tan dkk. [3] membedakan sinyal peristiwa yang berbeda ketika HRP diulir ke nanopore, ada ABTS dan H₂ O₂ dalam larutan KCl. Jenis sinyal yang berbeda dengan translokasi HRP dianggap sebagai ABTS ^•+ melewati nanopori. Enam peristiwa khas dari translokasi produk substrat katalisis enzim dianalisis. Mereka berspekulasi kemungkinan proses dari setiap jenis. Namun, tidak ada cukup bukti untuk bersaksi. Mubarak Ali dkk. telah dicapai untuk mendeteksi produk reaksi redoks dalam saluran nano kerucut tunggal [58]. They found that the cationic radical ABTS ^•+ reduced the ion current in the HRP-nanochannel in a voltage-dependent fashion, consistent with voltage-dependent concentrations of ions in conical nanochannels. The magnitude of the current blockage was correlated with the H₂ O₂ concentration in the solution.