Sistem Perakitan Reversibel yang Diinduksi pH dengan Pemuatan dan Pelepasan yang Dapat Dikontrol Resveratrol untuk Kemoterapi Penargetan Tumor yang Ditingkatkan
Abstrak
Dalam laporan ini, kami menyajikan sistem perakitan reversibel yang diinduksi pH (PIRAS) berdasarkan feritin (Ft) untuk terapi tumor yang ditargetkan. Ini telah dikembangkan untuk dengan mudah memuat dan melepaskan resveratrol obat antikanker (RV), berdasarkan sensitivitas pH alami dan rongga berongga unik Ft. Peptida target spesifik tumor Arg-Gly-Asp (RGD) dikonjugasikan ke permukaan Ft (RV@Ft) yang dimuat RV, untuk membentuk nanopartikel biokompatibel (RV@Ft-RGD). Sensitivitas pH Ft memungkinkannya untuk didenaturasi menjadi nanosfer berpori berongga dalam kondisi asam dan diubah menjadi nanosfer berongga tertutup dalam kondisi netral. Menggunakan manipulasi pH, RV@Ft-RGD, dengan diameter ~ 21 nm, menunjukkan rasio pemuatan RV yang tinggi sebesar 79,6%. Pelepasan RV yang dipicu pH kemudian diukur pada rasio 50,3% pada pH5,0 selama 24 jam. Dalam kondisi netral, RV@Ft-RGD menunjukkan stabilitas yang sangat baik selama 20 hari. Pencitraan fluoresensi confocal menunjukkan bahwa RV@Ft-RGD memiliki rasio serapan sel yang tinggi dan lokalisasi bersama dengan lisosom, terutama karena efek target yang dimediasi RGD. Berdasarkan pemuatan obat yang tinggi, pelepasan yang dipicu oleh pH, dan efek penargetan sel tumor, RV@Ft-RGD menunjukkan kemampuan membunuh sel yang hebat secara in vitro dan in vivo. Biokompatibilitas in vitro dan in vivo juga terbukti sangat baik, tanpa toksisitas sistematis. Konsep desain PIRAS berdasarkan Ft secara signifikan menghambat pertumbuhan tumor dan secara bersamaan semakin memperluas penerapan Ft dalam pengobatan nano.
Pengantar
Kanker paru-paru adalah salah satu keganasan padat paling mematikan pada manusia. Dengan meningkatnya kerusakan lingkungan dan faktor lain, kejadian kanker paru-paru meningkat dari tahun ke tahun, dan tingkat kelangsungan hidup 5 tahun hanya 17,4% [1, 2]. Saat ini, meskipun pengobatan klinis tradisional seperti reseksi bedah, terapi radiasi, dan kemoterapi lini pertama standar tersedia, rata-rata tingkat kelangsungan hidup pasien kanker paru secara keseluruhan masih perlu ditingkatkan [3, 4]. Oleh karena itu, perlu segera dikembangkan pengobatan yang lebih efektif dan aman untuk menyembuhkan penyakit mematikan ini. Saat ini, meskipun efek target rendah dan efek samping yang tinggi dari banyak obat kemoterapi telah membatasi kegunaannya dalam kemoterapi [5, 6], agen kemoterapi baru terus dikembangkan, terutama di bidang obat nano yang muncul [7,8, 9,10]. Resveratrol (RV) adalah ekstrak tumbuhan alami seperti anggur dan kedelai, yang telah banyak digunakan dalam pengaturan klinis untuk mempromosikan agregasi trombosit, penghambatan vasodilatasi, pengurangan viskositas darah, dan sejenisnya [11,12,13,14,15] ]. Dalam beberapa tahun terakhir, juga ditemukan memiliki efek antikanker yang kuat [16,17,18]. Namun, sebagai obat molekul kecil yang potensial, RV juga memiliki beberapa kelemahan seperti obat kemoterapi lini pertama lainnya—seperti kelarutan yang buruk, waktu paruh sirkulasi darah yang pendek, dan kurangnya selektivitas tumor [19, 20]. Obat nano berbasis RV telah dikembangkan dalam beberapa tahun terakhir untuk mengatasi kekurangan ini dan untuk meningkatkan efek terapeutiknya [21]. Berbagai jenis nanocarrier telah digunakan untuk memuat RV, termasuk liposom, albumin serum, bahan karbon, dichalcogenides logam transisi dua dimensi (2D-TMDs), dan lain-lain [21,22,23,24,25]. Meskipun nanocarrier ini telah dilaporkan secara efisien meningkatkan efek terapeutik RV, mereka masih menunjukkan beberapa kekurangan — seperti kapasitas pelepasan pemicu aktif efisiensi tinggi untuk liposom dan albumin serum, dan potensi toksisitas sistemik jangka panjang untuk bahan karbon dan 2D- TMD [26, 27]. Oleh karena itu, masih ada permintaan untuk nanocarrier yang lebih berkualitas.
Feritin adalah protein nanocage alami dengan lumen sekitar 8 nm, dibentuk melalui interaksi dan perakitan 24 subunit rantai berat dan ringan [28, 29]. Karena merupakan protein endogen, feritin memiliki biokompatibilitas dan keamanan yang sangat baik. Selain itu, ada laporan bahwa feritin adalah protein alami yang sensitif terhadap pH yang dapat didenaturasi secara reversibel dan dipasang kembali saat lingkungannya berubah dari kondisi asam menjadi basa [30]. Ketika pH asam, oligomer seperti batang yang dibongkar pulih hanya ke struktur berbentuk headset, dan zat antara berbentuk headset yang dibongkar pulih hanya ke struktur bola berongga [28,29,30]. Perilaku perakitan dan pembongkaran unik yang dipicu pH ini menjadikan feritin sebagai sistem penghantaran obat yang ideal. Baru-baru ini, Zhang dkk. melaporkan bahwa molekul doxorubicin (DOX) dapat dienkapsulasi dalam feritin dan berhasil dilepaskan oleh regulasi pH untuk terapi tumor [28].
Dalam penelitian ini, kami bertujuan untuk mengembangkan sistem perakitan reversibel yang diinduksi pH (PIRAS) berbasis feritin untuk mengontrol pemuatan dan pelepasan RV untuk kemoterapi penargetan tumor yang ditingkatkan. Permukaan bola feritin dikaitkan dengan RGD peptida penargetan tumor. Obat nano yang dihasilkan RV@Ft-RGD terbukti stabil di lingkungan netral dan basa (pH> 7,4), dan hanya melepaskan RV di lingkungan asam (pH <7,4). Ketika dikarakterisasi lebih lanjut, RV@Ft-RGD menunjukkan manfaat berikut in vitro dan in vivo:(1) RV@Ft-RGD menargetkan sel tumor dan terakumulasi dalam lisosom (lingkungan asam), di mana memfasilitasi pelepasan lebih banyak RV ke dalam sitoplasma; (2) pembawa feritin secara signifikan meningkatkan waktu paruh RV bebas, meningkatkan retensi obat dalam sirkulasi sistemik untuk memfasilitasi akumulasi obat di lokasi tumor; (3) stabilitas arsitektur feritin mencegah kebocoran ledakan RV selama proses pengiriman; (4) RV@Ft-RGD menunjukkan biokompatibilitas in vitro dan in vivo yang hebat. Oleh karena itu, karena kelebihan ini, RV@Ft-RGD menampilkan sifat terapeutik antitumor yang luar biasa, yang menunjukkan potensi besar untuk terjemahan klinik di masa depan.
Bahan dan Metode
Materi
Feritin, resveratrol (RV, 99%) berasal dari Sigma-Aldrich. 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) karbodiimida (EDC), N-hidroksisuksinimida (NHS), dan fluorescein isothiocyanate (FITC) dibeli dari Aladdin Bio-Chem Technology Co., LTD (Shanghai, Cina). NH2 -PEG2000 -RGD dibeli dari Hunan Huateng Pharmaceutical Co., Ltd (Hunan, Cina). Media sel DMEM, serum janin sapi (FBS), dan saline buffer fosfat (PBS) diperoleh dari Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kit penghitung sel-8 (CCK-8) dipasok oleh Dojindo Laboratories (Jepang).
Sintesis RV@Ft-RGD
Pemuatan RV disiapkan seperti yang dijelaskan menurut laporan sebelumnya [21, 28] dengan modifikasi. Pertama, NH2 -PEG2000 -RGD (10 mg) didispersikan ke dalam larutan Ft (1,5 mg/mL) dengan adanya 20 L EDC (5 mg/mL) dan 20 L NHS (20 mg/mL). Campuran direaksikan selama 2 jam pada suhu 4 °С dengan sedikit pengadukan, dan dimurnikan dengan dialisis terhadap air suling (MW cut off =5 kDa) semalaman, menghasilkan nanopartikel Ft-RGD. Kemudian RV yang tidak larut dalam air dilarutkan dalam DMSO menjadi 2 mg/mL dan ditambahkan ke dalam larutan Ft-RGD dengan konsentrasi akhir 1,5 mg/mL. PH campuran diatur menjadi pH =5 untuk membongkar subunit polipeptida. Setelah itu, pH campuran diatur secara perlahan menjadi 7,4 dengan natrium hidroksida (1 M) agar menyerupai subunit polipeptida. Solusi yang dihasilkan didialisis dalam air suling semalaman untuk menghilangkan molekul RV bebas menjadi produk akhir (RV@Ft-RGD). Jumlah RV yang dimuat dideteksi oleh spektrofotometer UV-vis (UV3100, Shimadzu, Jepang) dengan memantau puncak serapan pada 306 nm. Rasio pemuatan RV adalah (AaAb )/Ac , di mana Aa , Ab , dan Ac mewakili bobot RV dan Ft-RGD awal yang dibongkar.
Karakterisasi
Metode Dynamic Light Scattering (DLS) (BI-9000AT, Brookhaven, USA) digunakan untuk mendeteksi ukuran dan potensi zeta nanopartikel. Morfologi nanopartikel diamati dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, JEM-100S, JEOL, Jepang). Spektrum fluoresensi dideteksi oleh spektrofotometer luminesensi Perkin-Elmer LS50B. Sinyal fluoresensi seluler direkam oleh mikroskop pemindaian laser komersial (LSM 510, Zeiss, Jerman) dan Flow cytometry (FCM, EPICS XL, Beckman, USA).
Studi Rilis RV
Lima ratus mikroliter larutan RV@Ft-RGD ditempatkan dalam tabung-D (MWCO 6-8 kDa, Novagen), dan larutan disesuaikan dengan nilai pH yang berbeda melalui buffer yang berbeda. Solusinya kemudian didialisis pada 37
o
C. Setelah waktu inkubasi yang berbeda, 1 mL alikuot dialisat dihilangkan dan diganti dengan 1 mL media segar. RV dilepaskan pada waktu inkubasi yang berbeda ditentukan oleh spektrofotometer UV-vis. Selain itu, RV@Ft-RGD dilarutkan dalam larutan pembilas yang memiliki kondisi pH berbeda, termasuk pH 5, 6,5, 7,4, dan 8,5. Setelah diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam, ukuran nanopartikel dikarakterisasi dengan DLS.
Budaya Sel
Sel kanker paru-paru manusia A549 dan NCI-H358 diperoleh dari Cell Collection of Chinese Academy of Sciences (Shanghai, China), dan dikultur dalam media DMEM yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS) dan 1% penisilin streptomisin (PS) dalam atmosfer lembab yang mengandung 5% CO2 di 37
o
C.
Serapan Seluler dan Lokalisasi RV@Ft-RGD
Sebagai metode yang umum digunakan, FITC diterapkan untuk memberi label pada nanopartikel. FITC dilarutkan dalam larutan etanol (2,0 mg/mL) dan dicampur dengan larutan berair RV@Ft dan RV@Ft-RGD (1,0 mg/mL) di bawah pengadukan 4 jam dalam lingkungan gelap pada suhu kamar. Campuran didialisis dalam air suling semalaman untuk menghilangkan FITC dan etanol yang berlebihan, menghasilkan larutan RV@Ft dan RV@Ft-RGD berlabel FITC. Untuk mengkonfirmasi lokalisasi organel nanopartikel in vitro, sel-sel diperlakukan dengan RV@Ft berlabel FITC dan RV@Ft-RGD selama 5 jam dan diwarnai dengan pewarna khusus lisosom Lyso Tracker Red (Invitrogen). Setelah itu, internalisasi seluler RV@Ft dan RV@Ft-RGD diamati menggunakan CLSM. Singkatnya, sel A549 diinkubasi dengan RV@Ft berlabel FITC dan RV@Ft-RGD (dengan konsentrasi FITC yang sama) selama 5 jam. Dan kemudian, sel diperlakukan dengan larutan Lyso Tracker Red (100 nM) pada 37 ° C selama 30 menit. Setelah dicuci dengan PBS selama tiga kali, sel-sel diamati dengan mikroskop pemindaian laser komersial. Perangkat lunak ImageJ digunakan untuk menganalisis intensitas fluoresensi sel.
Studi Kemoterapi dan Apoptosis Tumor In Vitro
Pertama-tama, sitotoksisitas pembawa Ft-RGD dievaluasi dengan uji CCK-8 standar (Bestbio, Cina). Sel A549 dan NCI-H358 (1 × 10
5
sel / mL, 0,5 mL) diunggulkan di piring 96-sumur dan dikultur selama 24 jam. Setelah media lama dibuang, media baru yang mengandung 0, 0,01, 0,1, 0,5, dan 1 mg/mL Ft-RGD diinkubasi dengan sel A549 dan NCI-H358 selama 24 jam. Sel-sel dicuci dengan lembut tiga kali dengan PBS. Seratus mikroliter larutan kerja CCK-8 (10% CCK-8 + 90% DMEM) kemudian ditambahkan ke setiap sumur dan diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37 °C. Nilai absorbansi pada 450 nm diukur menggunakan spektrofotometer lempeng mikro (Multiskan FC, Thermo Scientific). Foto setiap kelompok sel diamati dengan mikroskop optik (Olympus).
Berbagai konsentrasi RV bebas, RV@Ft, RV@Ft-RGD, dan RV@Ft-RGD + RGD (0, 10, 20, 30, dan 40 g/mL RV setara) diperlakukan dengan sel A549. Setelah inkubasi 24 jam, viabilitas sel yang dirawat dianalisis dengan uji CCK-8. Sementara itu, sel-sel yang dirawat ini diwarnai ganda dengan kit deteksi apoptosis (Annexin VFITC/PI) dan dianalisis oleh FCM.
Waktu Sirkulasi RV@Ft-RGD dalam Darah
RV atau RV@Ft-RGD gratis (setara 6 mg/kg RV) disuntikkan secara intravena ke tikus telanjang Balb/c yang sehat (n =5 per kelompok). Setelah injeksi, darah vena mencit dikumpulkan pada titik waktu yang berbeda dan ditempatkan dalam tabung pengumpul darah yang berisi heparin, kemudian plasma dipisahkan. Konsentrasi RV dalam plasma diekstraksi dengan reagen isopropanol yang diasamkan, dan kemudian absorbansinya pada eksitasi 306 nm diukur untuk menentukan konsentrasi RV.
Model Hewan dan Di Vivo Kemoterapi Tumor
Tikus Balb/c (4–6 minggu) yang digunakan dalam penelitian ini dibeli dari Charles River Laboratories (Beijing, China). Semua operasi yang melibatkan hewan percobaan benar-benar sesuai dengan pedoman perawatan dan penggunaan hewan laboratorium. Pedoman ini telah disetujui oleh Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Universitas Zhengzhou. Untuk membuat model tumor subkutan A549, 2 × 10
6
Sel A549 disuntikkan secara subkutan ke bagian belakang tikus. Mereka kemudian ditempatkan di kandang hewan selama 7 sampai 9 hari. Rumus perhitungan volume tumor adalah panjang × lebar
2
/2.
Tumor A459 yang mengandung tikus dibagi secara acak menjadi lima kelompok. Setiap kelompok terdiri dari lima ekor mencit. Pengelompokan khusus adalah kontrol (saline), RV, RV@Ft, dan RV@Ft-RGD. Pada awal perlakuan, sampel disuntikkan sekali sehari melalui vena ekor selama tiga hari berturut-turut. Volume tumor dan berat badan tikus dicatat setiap 5 hari. Setelah 45 hari pengobatan, tumor dari masing-masing kelompok dikumpulkan. Jaringan tumor difiksasi dalam larutan formalin 10%, dipotong, dan kemudian dilakukan pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E).
Biokompatibilitas Di Vivo
Dua ratus mikroliter RV@Ft-RGD disuntikkan ke tikus Balb/c yang sehat melalui vena ekor (dosis RV adalah 15 mg/kg). Tikus sehat yang disuntik dengan garam fisiologis dengan cara yang sama digunakan sebagai kelompok kontrol kosong. Pada hari ke 0, 10, dan 45 setelah injeksi, darah tikus dikumpulkan untuk evaluasi jumlah sel termasuk sel darah putih (WBC), sel darah merah (RBC), hemoglobin (HGB), dan mean platelet volume (MPV). , rerata hemoglobin sel darah merah (MCH), hematokrit (HCT), rerata konsentrasi hemoglobin sel darah merah (MCHC), rerata volume sel darah merah (MCV), dan trombosit (PLT). Selain itu, jaringan jantung, hati, limpa, paru-paru, dan ginjal masing-masing kelompok dikumpulkan untuk pewarnaan H&E pada hari ke-45.
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai mean ± standar deviasi (s.d.). Analisis statistik sampel dilakukan dengan menggunakan t . Student tes, dan p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil dan Diskusi
Sintesis dan Karakterisasi RV@Ft-RGD
Pemuatan dan pelepasan RV dari RV@Ft-RGD dilakukan melalui pembongkaran reversibel yang diinduksi pH dan pemasangan kembali Ft (Gbr. 1). Pertama, feritin dikonjugasikan dengan RGD peptida penargetan tumor untuk membentuk Ft-RGD. Ini kemudian dilarutkan kembali dalam buffer asetat (pH =5) untuk membongkar subunit polipeptida dan membentuk bola berpori berongga. Molekul RV kemudian ditambahkan dan dibiarkan masuk ke dalam rongga, setelah itu larutan perlahan-lahan disesuaikan ke pH 7,4 untuk merakit kembali Ft, menjebak molekul RV di dalam rongga Ft yang disegel. Ketika pH buffer kemudian diturunkan menjadi ~ 5, pori-pori nanopartikel membuka secara reversibel dan melepaskan molekul RV-nya. Gambar 2a dan File tambahan 1:Gambar S1 menunjukkan gambar SEM dan TEM dari rakitan RV@Ft-RGD, yang menampilkan struktur bola. Menurut analisis DLS, partikel RV@Ft-RGD memiliki diameter lebih besar (~ 22,5 nm) dibandingkan dengan nanopartikel Ft mentah (~ 11,8 nm) (Gbr. 2b) dan memiliki potensi zeta yang serupa dengan nanopartikel Ft mentah (− 29,6 mV) (Gbr. .2c). Setelah 20 hari, indeks polidispersitas (PDI) RV@Ft-RGD dalam air, FBS, media sel, dan PBS tidak menunjukkan perubahan yang signifikan (Gbr. 2d), menunjukkan bahwa RV@Ft-RGD memiliki stabilitas koloid yang luar biasa. Gambar 2e menunjukkan spektrum absorbansi RV bebas, Ft-RGD, dan RV@Ft-RGD. Seperti dapat dilihat, dibandingkan dengan RV dan Ft-RGD, spektrum penyerapan RV@Ft-RGD menunjukkan puncak baru pada 306 nm (berasal dari RV), yang menunjukkan keberhasilan pemuatan RV. Selain itu, RV@Ft-RGD menunjukkan fluoresensi emisi signifikan yang serupa dengan RV bebas pada 400 nm, ketika dieksitasi oleh laser 325 nm (Gbr. 2f).
Ilustrasi skema persiapan RV@Ft-RGD dan kemoterapi target tumor
a Gambar TEM dari RV@Ft-RGD. b , c Distribusi ukuran dan distribusi potensi zeta Ft-RGD dan RV@Ft-RGD. d Perubahan PDI dari RV@Ft-RGD dalam air, FBS, media sel, dan PBS selama 20 hari. e Spektrum absorbansi RV bebas, Ft-RGD, dan RV@Ft-RGD. f Spektrum absorbansi RV dan RV@Ft-RGD gratis
Pemuatan dan Pelepasan Obat
Kapasitas pemuatan maksimum Ft-RGD ditemukan 252,6%, kemungkinan karena rongga besar di dalam lubang Ft-RGD. Karena Ft sensitif terhadap pH, kami dapat mengkarakterisasi kapasitas pemuatan RV di bawah kondisi pH yang berbeda. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, dengan peningkatan pH dari 5,0 menjadi 8,5, efisiensi pemuatan RV menurun secara dramatis. Pelepasan RV dari kompleks juga ditandai dengan nilai pH yang berbeda dari 5,0 hingga 8,5. Profil pelepasan RV yang bergantung pada nilai pH dan waktu dibuat dari data ini dan ditunjukkan pada Gambar 3b. Rasio pelepasan obat maksimum (51,6%) terjadi pada pH =5,0 selama 24 jam, lebih tinggi dibandingkan pada pH =6,5, 7,4, dan 8,5. Menurut laporan terkait, nilai pH 5,0, 6,5, dan 7,4 adalah yang biasanya ditemukan di lisosom sel, jaringan tumor, darah, dan lingkungan fisiologis normal, masing-masing [31]. Dalam kondisi fisiologis (pH7.4), kandungan obat RV di RV@Ft-RGD tetap tinggi bahkan setelah 50 jam (Gbr. 3c), menunjukkan bahwa RV di RV@Ft-RGD stabil dan tidak mudah bocor. Selain itu, kami menyelidiki perubahan diameter RV @ Ft-RGD di bawah beberapa kondisi pH yang berbeda. Setelah inkubasi pada 37 °C selama 12 jam, analisis DLS menunjukkan bahwa diameter RV@ Ft-RGD hampir konstan, sekitar 23 nm pada pH8,5 dan 7,4. Ketika nilai pH diturunkan menjadi 6,5 dan 5,0, diameter RV @ Ft-RGD masing-masing meningkat menjadi 25 nm dan 28,6 nm (Gbr. 3d). Hasil ini mengkonfirmasi perilaku pembongkaran reversibel yang diinduksi pH dan pemasangan kembali RV@Ft-RGD, yang bermanfaat untuk pemuatan obat yang dapat dikontrol secara in vitro dan pelepasan obat dalam jaringan tumor.
a Memuat efisiensi Ft-RGD dalam berbagai kondisi pH. b Profil pelepasan RV dari RV@Ft-RGD dalam berbagai kondisi pH dari 5,0 hingga 8,5. c RV permanen di RV@Ft-RGD dalam kondisi fisiologis. d Perubahan ukuran rata-rata RV@Ft-RGD dalam berbagai kondisi pH dari 5,0 menjadi 8,5
Serapan dan Lokalisasi Seluler In Vitro
Penyerapan seluler in vitro dan lokalisasi RV@Ft-RGD kemudian dievaluasi. Pertama, RV@Ft dan RV@Ft-RGD diberi label oleh FITC melalui interaksi ikatan hidrogen dan penyerapan fisik. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4a, sel-sel bebas yang diberi perlakuan FITC menunjukkan sinyal fluoresensi sitoplasma yang dapat diabaikan. Sel yang diperlakukan RV@Ft-RGD, sebaliknya, menunjukkan fluoresensi hijau FITC yang intens, yang lebih tinggi daripada sel yang dirawat dengan RV@Ft. Khususnya, sel yang diobati dengan RV @ Ft-RGD dan RGD keduanya menunjukkan fluoresensi hijau yang rendah. Dari hasil ini, kami dapat menyimpulkan bahwa RV@Ft-RGD diambil oleh sel dalam jumlah tinggi, kemungkinan melalui efek target aktif yang dimediasi RGD. Sel-sel yang dirawat ini juga dianalisis oleh FCM, yang hasilnya ditunjukkan pada Gambar. 4b. Hasil statistik intensitas fluoresensi seluler menunjukkan kesimpulan serupa.
a Gambar fluoresensi sel A549 setelah inkubasi dengan FITC gratis dan FITC berlabel RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, dan RV@Ft-RGD, masing-masing. Bilah skala =60 m. b Pengukuran FCM intensitas fluoresensi FITC seluler dalam sel A549 setelah inkubasi dengan FITC gratis dan FITC berlabel RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, dan RV@Ft-RGD, masing-masing. c Koefisien co-lokalisasi fluoresensi seluler FITC dan Lyso Tracker Red. **P <0,01, masing-masing dibandingkan dengan kelompok lain
Untuk mempelajari lokalisasi organel RV@Ft-RGD, pewarna khusus lisosom (Lyso Tracker Red) digunakan untuk mewarnai sel yang diinkubasi dengan nanopartikel. Seperti dapat dilihat pada Gambar. 4a, sitoplasma menunjukkan fluoresensi merah yang kuat di semua kelompok. Setelah bergabung dengan fluoresensi hijau FITC, RV@Ft-RGD menunjukkan fluoresensi kuning (hijau + merah) paling intens dalam sitoplasma di antara kelompok-kelompok ini. Berdasarkan analisis statistik, kelompok yang diberi perlakuan RV@Ft-RGD memiliki koefisien co-localization tertinggi antara FITC dan fluoresensi Lyso Tracker Red (Gbr. 4c). Hasil ini menunjukkan bahwa RV@Ft-RGD dapat secara aktif memasuki sel dan kemudian ditransfer ke lingkungan asam lisosom (pH 5.0). Kelebihan ini, bersama dengan pelepasan obat yang responsif terhadap pH, memberikan RV@Ft-RGD dengan banyak aplikasi potensial untuk terapi tumor in vivo.
Biokompatibilitas In Vitro dan Terapi Tumor
Sebelum mempelajari sifat antitumor RV@Ft-RGD, sitotoksisitas pembawa Ft-RGD diselidiki. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 5a dan File tambahan 1:Gambar S2 dan S3, Ft-RGD tidak menunjukkan penekanan viabilitas yang jelas terhadap sel A549 kanker paru-paru dan sel NCI-H358 pada konsentrasi hingga 1 mg/mL. Morfologi sel juga tidak menunjukkan perubahan yang signifikan ketika sel yang diberi perlakuan 1 mg/mL dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 5b), dengan jelas menunjukkan bahwa Ft-RGD sebagai pembawa memiliki biokompatibilitas yang sangat baik. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 6a, b, RV bebas, RV@Ft, dan RV@Ft-RGD semuanya membunuh sel dengan cara yang bergantung pada konsentrasi. Sel yang diberi perlakuan RV@Ft-RGD menunjukkan penurunan viabilitas yang lebih besar dan hanya memiliki viabilitas sel 11,2% pada kelompok 40 g/mL, yang lebih rendah dari kelompok yang diberi perlakuan RV@Ft dan RV@Ft-RGD + RGD. Sebuah studi pendahuluan dengan FCM lebih lanjut mengungkapkan bahwa dengan RV saja, RV@Ft, atau RV@Ft-RGD, sebagian besar kematian sel dimediasi melalui apoptosis (Gbr. 6c). Hasil ini menunjukkan bahwa efek pembunuhan sel tumor dari RV sangat ditingkatkan dengan memuat ke Ft-RGD, terutama karena peningkatan akumulasi RV@Ft-RGD dalam lisosom, di mana kondisi pH asam memicu peningkatan pelepasan RV yang mempromosikan apoptosis. ke dalam sitoplasma [32, 33].
a Sitotoksisitas in vitro terhadap sel A549 yang diobati dengan konsentrasi Ft-RGD yang berbeda selama 24 jam. b Gambar mikroskop sel A549 setelah perlakuan 24 jam dengan Ft-RGD 1 mg/mL
a Viabilitas sel dengan konsentrasi berbeda dari sel A549 yang diobati dengan RV. b Viabilitas sel sel yang diberi perlakuan RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, dan RV@Ft-RGD dengan berbagai konsentrasi RV. c Apoptosis sel sel A549 yang diobati dengan PBS (kontrol), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, dan RV@Ft-RGD dengan flow cytometry. **P <0,01, masing-masing dibandingkan dengan kelompok lain
Waktu Paruh Darah RV@Ft-RGD
Konsentrasi RV dalam plasma darah pada waktu yang berbeda setelah injeksi dipelajari masing-masing pada kelompok yang diobati dengan RV dan RV@Ft-RGD. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 7a, waktu paruh darah RV@Ft-RGD adalah 5,1 ± 0,23 jam. RV gratis memiliki pencucian lebih cepat dari sirkulasi, dengan waktu paruh darah hanya 0,43 ± 0,11 jam. Waktu paruh RV@Ft-RGD yang diperpanjang secara signifikan dalam darah bermanfaat untuk meningkatkan retensi obat dalam sirkulasi sistemik dan memfasilitasi akumulasi obat di lokasi tumor.
a Waktu sirkulasi RV dan RV@Ft-RGD gratis dalam darah. b Profil pertumbuhan tumor xenograft A549 setelah injeksi salin intravena tiga kali (kontrol), RV, RV@Ft, RV@Ft-RGD + RGD, dan RV@Ft-RGD. Panah merah menunjukkan titik waktu injeksi. **P <0,01, dibandingkan dengan kelompok lain, masing-masing. c Berat badan tikus pembawa tumor setelah berbagai perawatan. d Mikrograf irisan tumor bernoda H&E dikumpulkan dari berbagai kelompok tikus setelah akhir perawatan. Bilah skala adalah 50 m
Efek Antitumor Pada Vivo dan Toksisitas Sistemik RV@Ft-RGD
Gambar 7b menunjukkan profil pertumbuhan tumor dari tikus yang mengandung tumor dengan perlakuan yang berbeda, yang dinyatakan sebagai volume tumor relatif. Pertumbuhan tumor dihambat sampai tingkat tertentu ketika diobati dengan RV@Ft, kemungkinan karena penyerapan RV@Ft yang rendah. Namun, pada kelompok yang diobati dengan RV@Ft-RGD, pertumbuhan tumor ditekan secara signifikan dibandingkan dengan kelompok lain (kontrol, RV, RV@Ft, dan RV@Ft-RGD + RGD). Selama perawatan, tidak ada penurunan berat badan yang nyata pada setiap kelompok eksperimen (Gbr. 7c), yang menunjukkan bio-safety yang tinggi dari RV@Ft-RGD. Setelah akhir kursus pengobatan, pewarnaan H&E jaringan tumor pada kelompok-kelompok ini dilakukan untuk menyelidiki efek kemoterapi. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar 7d, area apoptosis yang luas diamati pada tumor yang diobati dengan RV@Ft-RGD, yang sangat kontras dengan hanya area kecil apoptosis pada tumor yang diobati dengan RV, RV@Ft, dan RV@ gratis. Ft-RGD + RGD. Selain itu, toksisitas sistemik RV@Ft-RGD juga dievaluasi pada tikus normal. Sampel darah utuh dari saline dan tikus kesehatan yang diobati dengan RV@Ft-RGD dikumpulkan pada 0, 10, dan 45 hari setelah injeksi untuk analisis darah. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 8a, b, jumlah darah lengkap (WBC, RBC, HGB, MPV, MCH, HCT, MCV, PLT, dan MCHC) mencit yang disuntik RV@Ft-RGD tidak menunjukkan perbedaan yang signifikan dari 0 hari sampai 45 hari. Organ utama tikus sehat yang diobati dengan saline dan RV@Ft-RGD juga dikumpulkan pada 45 hari untuk pewarnaan H&E. Tidak ada efek samping yang jelas ditemukan pada jaringan ini (Gbr. 8c), menunjukkan toksisitas merugikan jangka panjang yang dapat diabaikan. Semua hasil ini menunjukkan potensi yang menjanjikan dari RV@Ft-RGD untuk meningkatkan kemoterapi kanker in vivo.
a Analisis darah tikus kesehatan yang diobati dengan RV@Ft-RGD selama 45 hari. b Gambar organ utama tikus sehat yang diwarnai H&E yang diobati dengan RV@Ft-RGD selama 45 hari. c Pewarnaan HE menggambarkan organ utama dalam kontrol dan kelompok yang diberi perlakuan RV@Ft-RGD. Bilah skala adalah 50 m
Kesimpulan
Singkatnya, kami telah berhasil mengembangkan sistem perakitan reversibel yang diinduksi pH (PIRAS) dengan pemuatan dan pelepasan obat antitumor RV yang dapat dikontrol pH untuk kemoterapi penargetan tumor yang ditingkatkan. Dalam kondisi asam (pH =5,0), sistem dapat membongkar dan memuat atau melepaskan RV, sedangkan dalam kondisi netral (pH =7,4), RV@Ft-RGD sangat stabil dan menunjukkan kebocoran obat yang dapat diabaikan. Melalui efek target yang dimediasi RGD, RV@Ft-RGD dapat diserap dalam konsentrasi tinggi oleh sel A549 dan terakumulasi dalam lisosom, yang bermanfaat untuk pelepasan RV baik in vitro maupun in vivo. Karena akumulasi RV@Ft-RGD dalam lisosom, dan pelepasan RV yang memicu pH asam lisosom ke dalam sitoplasma, RV@Ft-RGD menunjukkan efek pembunuhan sel tumor dan peningkatan apoptosis yang sangat baik dibandingkan dengan RV gratis. Selain itu, setelah pemuatan RV ke Ft-RGD, RV@Ft-RGD menunjukkan waktu paruh darah yang jauh lebih lama daripada RV gratis. Hasil in vivo menunjukkan bahwa RV@Ft-RGD menunjukkan penekanan tumor yang luar biasa dan tidak ada toksisitas sistemik yang nyata. Studi ini menunjukkan bahwa PIRAS berbasis Ft sangat efisien dalam pemuatan dan pelepasan obat untuk terapi antikanker yang ditingkatkan.
Ketersediaan Data dan Materi
Kesimpulan yang dibuat dalam naskah ini didasarkan pada data yang semuanya disajikan dan ditampilkan dalam makalah ini.
