Nanopartikel Dual-Targeting Responsif Redoks yang Mengantarkan Kurkumin ke Mitokondria Tumor Positif CD44

Abstrak

Kami merancang sistem misel multifungsi yang secara simultan menargetkan reseptor CD44 pada sel tumor dan mitokondria di dalam sel tersebut. Pengangkar, yang ditetapkan TPP‑oHA‑S‑S‑Cur, dirakit dari (5‑karboksipentil)triphenylfosfoni bromide (TPP), asam hialuronik oligomeric (oHA), pengikat disulfide yang dapat dibelah responsif redoks, dan kurkumin (Cur). TPP memberikan akumulasi mitokondria, oHA menyediakan endositosis yang ditargetkan CD44, dan ikatan disulfide menyediakan peluncuran yang responsif terhadap glutation (GSH). Karakterisasi dengan ¹H‑NMR mengonfirmasi sintesis yang berhasil dari setiap komponen. Pengumpulan sendiri dalam media air menghasilkan misel dengan diameter rata-rata 122,4 ± 23,4 nm dan potensial zeta −26,55 ± 4,99 mV. Studi in vitro mengungkapkan sensitivitas redoks yang jelas dan kemampuan dual-targeting, menyoroti platform ini sebagai strategi yang menjanjikan untuk meningkatkan kesesutan kurkumin, mengurangi toksis sistemik, dan meningkatkan potensi terapeutik terhadap kanker.

Latar Belakang

Obat kimia konvensional sering mengalami kesesutan yang buruk, pelarutan cepat, dan toksis off-target. Sistem pengangkar yang dapat meningkatkan bioavailabilitas obat, memungkinkan targeting aktif, dan menyediakan peluncuran responsif stimuli telah menarik minat penelitian yang intens. Kurkumin, senyawa difenolik alami yang diisolasi dari Curcuma longa, menampilkan aktivitas antikanker yang luas tetapi terbatas secara klinis oleh hidrofobisitasnya, ketidakstabilan kimiawi, dan bioavailabilitas oral yang rendah. Upaya sebelumnya untuk mengenkapsulasi kurkumin dalam misel polimerik atau nanopartikel lipidik telah meningkatkan kesesutan airnya dan memperpanjang waktu sirkulasi; namun, sebagian besar formulasi kurang dalam pengiriman spesifik tumor atau kontrol peluncuran seluler dalam.

Asam hialuronik oligomeric (oHA) adalah fragmen HA pendek yang mempertahankan hidrofilisitas yang baik, biokompatibilitas, dan kemampuan untuk terikat pada reseptor CD44, yang ekspresi berlebih pada banyak tumor padat, termasuk kanker payudara dan paru-paru. Endositosis yang ditargetkan CD44 menawarkan jalur untuk penyerapan selektif oleh sel ganas. Selain itu, mitokondria adalah pengatur krusial apoptosis, dan targeting mitokondria telah terbuka meningkatkan efektivitas antikanker. Kation lipofilik seperti triphenylfosfoni (TPP) terkumpul selektif dalam mitokondria karena potensial membran negatif organel tersebut.

Konsentrasi glutation (GSH) sel dalam biasanya 2–10 mM pada sel tumor, yang jauh lebih tinggi dari pada jaringan normal. Ikatkan disulfide dapat dibelah secara efisien oleh GSH, menyediakan mekanisme untuk peluncuran obat yang terkontrol dalam lingkungan mikro tumor. Menggabungkan konsep ini, kami merancang TPP‑oHA‑S‑S‑Cur sebagai pengangkar nanon dual-targeting dan responsif redoks yang mampu mengantarkan kurkumin ke sel tumor positif CD44 dan mitokondria mereka sambil memungkinkan peluncuran obat yang cepat sebagai respons terhadap tingkat GSH yang tinggi.

Bahan dan Metode

Bahan

Kurkumin (Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd), oHA (Mn = 10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd), 3,3′‑ditiodiopropinat asam (Adamas Reagent Co. Ltd), TPP bromide, THF, DMSO, TEA, EDC, DMAP, dan reagen kelas analitik diperoleh dari supplier standar.

Sintesis TPP‑oHA‑S‑S‑Cur

Sintesis berlangsung dalam tiga langkah (Gambar 2). Pertama, TPP diesterifikasi dengan oHA melalui coupling EDC/DMAP dalam DMSO untuk menghasilkan TPP‑oHA. Kedua, 3,3′‑ditiodiopropinat asam diaktifkan dengan klorida oksalat, kemudian dicoupling dengan kurkumin di bawah katalisis TEA untuk membentuk S‑S‑Cur. Terakhir, S‑S‑Cur dikonjugasi dengan TPP‑oHA melalui reaksi EDC/DMAP yang lain, menghasilkan polimer amfifilik akhir. Dialisis (MWCO 2000 Da) dan liofilisasi menghilangkan molekul kecil yang tidak bereaksi. Spektra ¹H‑NMR (Gambar 3) mengonfirmasi kemunculan puncak aromatik TPP karakteristik (7,57–7,72 ppm) dan sinyal metilena S‑S‑Cur pada 2,50 ppm, yang mendirikan sintesis yang berhasil.

Persiapan dan Karakterisasi Misel

TPP‑oHA‑S‑S‑Cur (10 mg) dan kurkumin (1,5 mg) dilarutkan dalam formamida (6 mL), kemudian dialisis terhadap air deionis (MWCO 2000 Da) selama 24 jam dalam kegelapan untuk menghilangkan pelarut. Sentrifugasi pada 2500 rpm selama 10 menit menghilangkan kurkumin yang tidak terenkapsulasi. Suspensi yang dihasilkan difilter (0,45 µm) untuk menghasilkan misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur. Ukuran, indeks polidispersi (PDI), dan potensial zeta diukur dengan pencaharan cahaya dinamis (DLS) pada sistem Delsa Nano C; morfologi diperiksa dengan TEM (Hitachi H‑600). Pemuatan obat (DL) dan efisiensi penangkapan (EE) diukur dengan HPLC pada 425 nm setelah difilterasi (0,45 µm).

Peluncuran Responsif Redoks

Profil peluncuran dievaluasi dengan dialisis terhadap PBS (pH 7,4, 45 % FBS, 0,5 % Tween 80) yang mengandung 0, 2, atau 10 mM GSH pada 37 °C. Sampel dikoleksi pada titik waktu yang ditentukan hingga 120 jam dan dianalisis dengan HPLC. Peluncuran kurkumin meningkat secara signifikan dengan konsentrasi GSH, mengonfirmasi pembelah ikatan disulfide.

Studi Selular

Sel kanker payudara MDA‑MB‑231 (ekspresi CD44 tinggi) dikultur dalam DMEM dengan 10 % FBS. Toksisitas diukur dengan MTT setelah paparan 24 jam terhadap kurkumin bebas, misel Cur/oHA‑Cur, atau misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur pada 0,5–40 µg/mL. Penyerapan seluler dan lokalisasi mitokondria divisualkan dengan mikroskopi konfokal fluoresens, menggunakan fluoresens intrinsik kurkumin dan pewarnaan MitoTracker Red CMXROS. Sitometrika aliran mengukur intensitas fluoresens rata-rata (MFI) sel yang diinkubasi dengan setiap formulasi seiring waktu.

Hasil dan Pembahasan

Karakterisasi Pengangkar

Gambar 2 menggambarkan rute sintesis; spektra ¹H‑NMR (Gambar 3) mengonfirmasi setiap langkah konjugasi. Misel menunjukkan morfologi sferis seragam dengan diameter rata-rata 122,4 ± 4,6 nm dan PDI rendah 0,132 (Gambar 4). Potensial zeta −21,56 ± 1,46 mV untuk misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur menunjukkan stabilitas koloid yang ditingkatkan dibanding misel Cur/oHA‑Cur (−19,17 ± 0,55 mV). Pemuatan obat dan EE masing-masing 7,8 % dan 94,3 %, melebihi misel konvensional.

Peluncuran Terpicu Redoks

Dalam PBS tanpa GSH, hanya 32,5 % kurkumin yang terluncur selama 120 jam, sedangkan kehadiran 2 mM atau 10 mM GSH mempercepat peluncuran menjadi 57,5 % dan 75,3 %, masing-masing (Gambar 5). Peluncuran yang bergantung pada GSH ini menunjukkan kemampuan sistem untuk melepaskan obat secara prioritas dalam lingkungan mikro tumor yang redutif.

Toksisitas Sel

Uji MTT (Gambar 6) mengungkapkan bahwa misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur menunjukkan IC_50 terendah (3,87 µg/mL) dibanding kurkumin bebas (6,53 µg/mL) dan misel Cur/oHA‑Cur (5,09 µg/mL), yang menunjukkan potensi seluler dalam yang ditingkatkan kemungkinan karena targeting gabungan CD44 dan mitokondria.

Penyerapan Seluler dan Lokalisasi Mitokondria

Mikroskopi fluoresens (Gambar 7) menunjukkan akumulasi yang cepat dan bergantung pada waktu dari misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur dalam sel MDA‑MB‑231, dengan intensitas yang lebih tinggi daripada misel Cur/oHA‑Cur. Pra-inkubasi dengan HA bebas (2 mg/mL) mengurangi penyerapan, mengonfirmasi masuk melalui CD44. Pewarnaan bersama dengan MitoTracker Red mengungkapkan kolokalisasi yang kuat antara fluoresens kurkumin dan penanda mitokondria (Gambar 8), memvalidasi targeting mitokondria melalui TPP.

Sitometrika Aliran

Pengukuran MFI (Gambar 9) mencerminkan pengamatan mikroskopi, dengan misel Cur/TPP‑oHA‑S‑S‑Cur mencapai fluoresensi yang signifikan lebih tinggi pada semua titik waktu (p < 0,05).

Kesimpulan

Kami telah mengembangkan platform nanopartikel responsif redoks dan dual-targeting yang mengantarkan kurkumin ke sel tumor positif CD44 dan mitokondria mereka, memungkinkan peluncuran yang terkontrol dalam kehadiran GSH tinggi. Misel TPP‑oHA‑S‑S‑Cur menunjukkan pemuatan obat, stabilitas, dan penyerapan seluler yang unggul, yang diterjemahkan menjadi toksisitas in vitro yang ditingkatkan. Platform ini mengatasi keterbatasan kesesutan dan bioavailabilitas kurkumin dan menyediakan kendaraan serbaguna untuk agen antikanker hidrofobik. Studi in vivo mendatang akan mengevaluasi efektivitas terapeutik dan biodistribusi.

Singkatan

oHA

Asam hialuronik oligomeric

S‑S‑Cur

Konjugat kurkumin ditiodiopropinat asam

TPP

(5‑Karboksipentil)triphenylfosfoni bromide