Novel Dual Mitokondria dan Reseptor CD44 Menargetkan Nanopartikel untuk Rilis yang Dipicu Stimuli Redoks
Abstrak
Dalam karya ini, mitokondria baru dan reseptor CD44 dual-targeting redoks-sensitif nanopartikel multifungsi (misel) berdasarkan asam hialuronat oligomer (oHA) diusulkan. Nanocarrier amfifilik dibuat oleh (5-karboksipentil)trifenilfosfonium bromida (TPP), asam hialuronat oligomer (oHA), ikatan disulfida, dan kurkumin (Cur), dinamai TPP-oHA-S-S-Cur. TPP menargetkan mitokondria, obat antitumor Cur berfungsi sebagai inti hidrofobik, reseptor CD44 yang menargetkan oHA bekerja sebagai cangkang hidrofilik, dan ikatan disulfida bertindak sebagai lengan penghubung. Struktur kimia TPP-oHA-S-S-Cur dicirikan oleh
1
teknologi HNMR. Cur dimuat ke misel TPP-oHA-S-S-Cur dengan perakitan sendiri. Beberapa sifat, termasuk persiapan misel, morfologi, sensitivitas redoks, dan penargetan mitokondria, dipelajari. Hasil penelitian menunjukkan bahwa misel TPP-oHA-S-S-Cur memiliki diameter rata-rata 122,4 ± 23,4 nm, potensi zeta 26,55 ± 4,99 mV. Studi pelepasan in vitro dan uji serapan seluler menunjukkan bahwa misel TPP-oHA-S-S-Cur memiliki sensibilitas redoks, penargetan ganda pada reseptor mitokondria dan CD44. Karya ini menyediakan platform nanocarrier multifungsi pintar yang menjanjikan untuk meningkatkan kelarutan, mengurangi efek samping, dan meningkatkan kemanjuran terapi obat antikanker.
Latar Belakang
Dalam beberapa tahun terakhir, untuk mencapai pengobatan kanker yang efektif, banyak sistem penghantaran obat [1] dipelajari untuk menyiapkan pembawa obat polimer makromolekul multifungsi dengan modifikasi struktural yang dapat mengambil banyak keuntungan seperti meningkatkan ketersediaan hayati obat dengan mengurangi laju degradasinya. , meningkatkan penyerapan seluler, memungkinkan penargetan dan kontrol pelepasan obat, dan mengurangi efek samping [2, 3].
Curcumin (Cur), senyawa diphenolic, diisolasi dari obat tradisional Cina Curcuma longa . Dibandingkan dengan obat anti tumor umum, Cur memiliki efek anti tumor yang luas pada banyak tumor seperti kanker prostat, payudara, dan usus besar, dan sitotoksisitasnya relatif lebih rendah [4]. Tetapi kelarutan yang tidak memadai, ketidakstabilan, dan bioavailabilitas yang buruk sangat membatasi aplikasi klinisnya [5, 6]. Untuk meningkatkan kelarutan dan bioavailabilitas obat hidrofobik, banyak nanomaterial yang dirancang dengan baik telah dibuat dengan menggabungkan obat hidrofobik dan bahan hidrofilik oligomeric hyaluronic acid (oHA) [7]. Kami merancang semacam konjugat obat polimer amfipatik sebagai nanocarrier dengan memuat kurkumin ke dalam misel polimer melalui perakitan mandiri, yang memiliki stabilitas yang baik dan dapat memperpanjang waktu paruh obat dalam sirkulasi darah. Misel dengan ukuran partikel kecil dapat secara pasif terakumulasi menjadi tumor padat melalui efek EPR dari angiogenesis tumor secara efektif untuk mencapai efek pengobatan yang lebih baik [8, 9].
oHA, molekul kecil yang berasal dari degradasi HA, memiliki sifat unik, seperti hidrofilisitas yang baik, biokompatibilitas, stabilitas dalam plasma, dan menargetkan reseptor CD44 di permukaan sel [7, 10, 11], sedangkan reseptor CD44 diekspresikan secara berlebihan pada sel kanker paru-paru dan sel kanker payudara, dibandingkan dengan ekspresi yang lebih rendah pada sel normal [12]. Sel tumor memiliki sinyal seluler yang unik, termasuk glutathione (GSH, 2-10 mM), pH rendah, dan beberapa enzim, berbeda dengan sel manusia normal [13,14,15,16,17,18,19,20 ], sedangkan ikatan disulfida memiliki sensitivitas reduksi dan dapat patah di bawah aksi penurunan GSH di sitoplasma [21, 22].
Mitokondria adalah organel vital untuk kelangsungan hidup sel dan memainkan peran penting dalam produksi energi dan jalur apoptosis [23,24,25,26,27]. Oleh karena itu, mitokondria telah lama dianggap sebagai target subseluler yang diterapkan untuk pengobatan kanker dalam laporan sebelumnya [28]. Karena potensi membran mitokondria yang lebih tinggi di antara organel seluler, trifenilfosfin, trifenilmetilfosfonium, dan jenis kation lipofilik lainnya dapat dengan mudah diperkaya dalam mitokondria melalui penghalang hidrofilik lipid bilayer [29, 30].
Dalam karya ini, untuk meningkatkan kelarutan Cur dan meningkatkan spesifisitas pada sel kanker, konjugat obat polimer, yang terdiri dari oHA, TPP, ikatan disulfida, dan Cur, dirancang dan disintesis, yang secara khusus menargetkan reseptor CD44 dan mitokondria . Selain itu, ia memiliki sensitivitas reduksi dan dapat digunakan sebagai penanda fluoresensi. Nanocarrier baru multifungsi ini dinamai (5-carboxypentyl)triphenylphosphonium bromide, asam hialuronat oligomer, ikatan disulfida dan kurkumin (TPP-oHA-S-S-Cur). Cur dimuat ke misel TPP-oHA-S-S-Cur melalui perakitan sendiri dalam air [1, 31]. Misel TPP-oHA-S-S-Cur polimerik yang dienkapsulasi Cur (selanjutnya dilambangkan sebagai misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur) dapat meningkatkan kemanjuran terapeutik dan pemuatan obat kurkumin, serta mengurangi efek samping. Setelah menargetkan jaringan tumor, misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur menembus sel melalui endositosis yang dimediasi CD44, diikuti dengan menargetkan mitokondria dan ikatan disulfida terputus sebagai respons terhadap GSH tinggi (2–10 mM) yang mengarah ke pelepasan obat yang cepat (Gbr. 1). Di sini, kami dapat mengajukan hipotesis bahwa mitokondria dan reseptor CD44 baru yang menargetkan ganda nanopartikel multifungsi sensitif redoks ini akan menjadi platform baru untuk sistem pengiriman obat penargetan tumor. Setelah pembuatan misel, dilakukan penelitian pendahuluan tentang karakteristik misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dalam penelitian ini.
Ilustrasi skema mitokondria dan reseptor CD44 dual-targeting redoks-sensitif nanopartikel
Metode
Materi
Kurkumin (Sur, Shanghai Zhanyun Chemical Co. Ltd); asam hialuronat oligomer (oHA, Mn =10 kDa, Shandong Freda Biological Engineering Co. Ltd.); 3,3′-dithiodipropionic acid disediakan oleh Adamas Reagent Co. Ltd. (Shanghai, Cina). (5-karboksipentil)trifenilfosfoniumbromida (TPP), tetrahidrofuran anhidrat (THF), dimetil sulfoksida (DMSO), trietilamina (TEA), 1-etil-(3-dua metil amino propil) karbodiimida hidroklorida (EDC), dan 4-dimetilaminopiridin (DMAP) diperoleh dari Aladdin Chemistry Co. Ltd. Semua reagen lainnya memiliki tingkat analitis dan dipasok oleh Sinopharm Group Chemical Reagent Corp.
Sintesis dan Karakterisasi TPP-oHA-S-S-Cur
Nanocarrier multifungsi disintesis dengan tiga langkah, seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2.
Rute sintetis TPP-oHA, S-S-Cur, dan TPP-oHA-S-S-Cur
Langkah 1
TPP digabungkan dengan oHA melalui ikatan ester menggunakan metode yang dilaporkan sebelumnya [32]. Pertama, TPP, EDC, dan DMAP dilarutkan dalam DMSO untuk bereaksi selama 1 jam pada 60 °C. Kemudian, oHA dilarutkan dalam DMSO:H2 O (v /v = 1:1) dan menambahkan reaksi di atas ke dalamnya selama 8 jam pada suhu kamar. Campuran reaksi didialisis dengan kantong dialisis (MWCO 2000 Da) dalam air deionisasi selama 48 jam untuk menghilangkan pengotor dan diliofilisasi untuk mendapatkan polimer TPP-oHA.
Langkah 2
Secara singkat, asam 3,3′-dithiodipropionic dilarutkan dalam THF dan diaktifkan oleh oksalil klorida. Campuran tersebut kemudian direaksikan dengan Cur yang dikatalis oleh TEA. Produk yang diperoleh diisolasi dengan kromatografi kolom silika gel untuk mendapatkan produk murni S-S-Cur.
Langkah 3
S-S-Cur, EDC, dan DMAP dilarutkan dalam DMSO dan diaktifkan pada suhu 60°C selama 2 jam, kemudian TPP-oHA ditambahkan ke dalam larutan di atas dan direaksikan selama 24 jam pada suhu kamar. Campuran didialisis dalam air suling dengan tabung dialisis (MWCO 2000 Da) selama 48 jam, diikuti dengan liofilisasi untuk mendapatkan produk akhir TPP-oHA-S-S-Cur.
Struktur TPP-oHA, S-S-Cur, dan TPP-oHA-S-S-Cur dikonfirmasi dengan
1
HNMR (Advance Bruker 400M; Swiss Bruker Company, Madison, WI, USA) menggunakan DMSO-d6 yang dideuterasi , CD3 Cl, dan DMSO-D6 :D2 O (DMSO-d6 :D2 O = 1:1, v /v ) sebagai pelarut, masing-masing.
Persiapan dan Karakterisasi Misel
Misel TPP-oHA-S-S-Cur dan misel oHA-Cur keduanya disiapkan dengan metode dialisis [33]. Pertama, TPP-oHA-S-S-Cur (10 mg) dan kurkumin (1,5 mg) dilarutkan dalam formamida (6 mL). Kemudian, campuran didialisis dalam air deionisasi dengan kantong dialisis (MWCO 2000 Da) dalam kegelapan selama 24 jam untuk menghilangkan pelarut organik. Setelah itu, larutan dialisis disentrifugasi dengan kecepatan 2500 rpm selama 10 menit untuk menghilangkan Cur yang tidak berbeban. Akhirnya, suspensi misel disaring melalui membran filter jarum suntik 0,45 m. Misel oHA-Cur fungsional tunggal diperoleh dengan metode yang sama.
Ukuran partikel, potensi zeta, dan indeks polidispersitas (PI) misel bermuatan Cur diamati oleh Delsa Nano C (Beckman Coulter Inc.). Morfologi misel Cur-loaded dipantau dengan mikroskop elektron transmisi (TEM, H-600; Hitachi, Tokyo, Jepang). Stabilitas misel Cur-loaded dilakukan di PBS yang mengandung 20% FBS oleh Delsa Nano C.
Efisiensi penjeratan (EE) dan pemuatan obat (DL) diukur dengan metode filtrasi membran. Setelah disaring dengan membran 0,45 μm, larutan yang diperoleh diukur dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC, Agilent Technologies) pada 425 nm untuk mendapatkan EE dan DL. Persamaan untuk menghitung EE dan DL dari misel adalah sebagai berikut:
Responsivitas redoks GSH intraseluler dari misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dievaluasi menggunakan metode dialisis. Empat mililiter suspensi misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur (50 g kurkumin/mL) ditempatkan dalam tas dialisis (MWCO 7000 Da) dan didialisis dengan 45 mL PBS (pH 7,4, mengandung 45% serum janin sapi). dan 0,5% Tween 80) dengan tingkat GSH yang berbeda (0, 10, 2, dan 10 mM). Sampel dalam tabung sentrifus disimpan pada suhu 37 °C dalam shaker incubator (BS-2F, Changzhou, China) dengan kecepatan 100 rpm. Pada interval waktu yang telah ditentukan (0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 96, dan 120 jam), 2 mL media pelepas diambil dari tabung sentrifus dan diisi ulang dengan volume yang sama. media segar yang sesuai dan konsentrasi Cur dianalisis dengan HPLC. Setiap eksperimen dijalankan dalam rangkap tiga.
Budaya Sel
Sel karsinoma payudara manusia MDA-MB-231 dikultur dalam medium Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM, Hyclone) yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS). Reseptor CD44 diekspresikan tinggi dalam sel MDA-MB-231, sehingga garis sel MDA-MB-231 dipilih dan dikultur dalam inkubator yang dilembabkan pada suhu 37 °C dengan 5% CO2 atmosfer ditambah.
Uji Sitotoksisitas In Vitro
Uji sitotoksisitas in vitro dari TPP-oHA-S-S-Cur dievaluasi dengan metode MTT [32]. Sel MDA-MB-231 (reseptor CD44 berekspresi tinggi) dibudidayakan pada kepadatan 1 × 10
4
sel/sumur di piring 96-sumur. Seratus mikroliter misel Cur, Cur/oHA-Cur gratis, dan misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur termasuk konsentrasi Cur yang berbeda (0,5, 1,25, 2.5, 5, 10, 20, dan 40 μg/mL) telah ditambahkan ke sumur yang berbeda, sedangkan PBS sebagai kontrol ditambahkan. Setelah diinkubasi selama 24 jam, 100 μL larutan MTT (5 mg/mL) ditambahkan ke setiap sumur dan kemudian diinkubasi selama 4 jam. Kemudian MTT diganti dengan 100 μL DMSO dan dimasukkan ke dalam shaker incubator untuk melarutkan kristal formazan. Setelah diinkubasi selama 20 menit, absorbansi diukur menggunakan pembaca pelat mikro (Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA) pada 570 nm.
Serapan Sel In Vitro dan Lokalisasi Mitokondria
Analisis kualitatif serapan seluler misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dan misel Cur/oHA-Cur diamati menggunakan mikroskop fluoresensi (Eclipse E400; Nikon Corporation, Tokyo, Jepang). Sel MDA-MB-231 diunggulkan ke dalam pelat 24-sumur dengan kepadatan 5000 sel per sumur dan diinkubasi dengan DMEM (1 mL) yang mengandung 10% FBS dan kemudian dikultur selama 24 jam pada 37°C dalam 5% CO 2 . Setelah itu, media kultur segar (1 mL) dengan misel berisi obat (misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dan misel Cur/oHA-Cur) ditambahkan ke setiap sumur. Sel dikultur dengan Cur bebas bertindak sebagai kontrol; konsentrasi Cur akhir adalah 20 μg/mL. Selanjutnya, sel-sel diinkubasi dengan obat untuk interval waktu yang berbeda. Kemudian, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan difiksasi dengan paraformaldehida 4% selama 15 menit.
Selain itu, untuk mengevaluasi kemampuan penargetan CD44 dari misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur, HA (2 mg/mL) ditambahkan ke media sebagai kelompok kontrol untuk mengikat reseptor CD44.
Selain itu, untuk memberi label mitokondria sel untuk menemukan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dan misel Cur/oHA-Cur di dalam sel, sel selanjutnya diinkubasi dengan pelacak mitokondria (Mito-tracker Red CMXROS) selama 15 menit. Akhirnya, sel dicuci tiga kali dan diamati dengan mikroskop fluoresensi.
Flow Cytometry
Analisis kuantitatif diukur dengan menggunakan flow cytometry. Sel MDA-MB-231 diunggulkan ke dalam pelat enam sumur dengan kepadatan 10
5
sel/sumur dalam 2 mL media dengan 10% FBS dan diperlakukan seperti deskripsi di atas. Setelah inkubasi dengan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dan misel Cur/oHA-Cur (20 μg Cur/mL) untuk interval waktu yang berbeda, sel dicuci tiga kali dengan PBS dan ditripsinisasi dengan tripsin 0,25%. Kemudian, sel disentrifugasi pada 1500 rpm selama 5 menit. Setelah resuspensi dalam PBS (0,5 mL), sel dianalisis dengan flow cytometry (EPICS XL, Beckman, USA).
Analisis Statistik
Data disajikan sebagai sarana ± SD (n = 3). Selain itu, perangkat lunak SPSS (ver. 20, USA) digunakan; data dianalisis untuk perbedaan yang signifikan pada tingkat probabilitas *p < 0,05 (signifikan) menggunakan analisis variasi satu arah (ANOVA).
Hasil dan Diskusi
Karakterisasi Bahan Pembawa TPP-oHA-S-S-Cur
Rute sintesis TPP-oHA, S-S-Cur dan TPP-oHA-S-S-Cur disajikan pada Gambar. 2.
Selain itu,
1
Spektrum HNMR dari oHA, TPP-oHA, S-S-Cur, dan TPP-oHA-S-S-Cur terlihat pada Gambar 3. TPP-oHA disintesis oleh TPP dan oHA. Puncak karakteristik tiga cincin benzena di TPP terlihat pada 7,570–7,717 ppm di
1
Spektrum HNMR dari TPP-oHA, yang menegaskan bahwa TPP-oHA berhasil disintesis. Selain itu, S-S-Cur disintesis oleh asam 3,3′-dithio-dipropionic dan Cur. Selain itu, TPP-oHA-S-S-Cur disintesis oleh TPP-oHA dan S-S-Cur. TPP di TPP-oHA-S-S-Cur terlihat di wilayah antara 7,570 dan 7,717 ppm. Puncak karakteristik Cur diamati pada
1
Spektrum HNMR S-S-Cur dan TPP-oHA-S-S-Cur pada 6.795–7.467 ppm, dan puncak proton (-CH2 -S-S-CH2 -) asam 3,3-dithiodipropionic diamati pada 2.502 ppm sesuai dengan TPP-oHA-S-S-Cur. Hasil ini mengkonfirmasi keberhasilan sintesis TPP-oHA-S-S-Cur.
1
Spektrum HNMR dari oHA, TPP-oHA, S-S-Cur, dan TPP-oHA-S-S-Cur
Persiapan dan Evaluasi Misel TPP-oHA-S-S-Cur
Ukuran partikel, indeks polidispersitas, potensi zeta, DL, dan EE dari misel yang mengandung obat dapat dilihat pada Tabel 1. Ukuran rata-rata misel Cur/oHA-Cur dan misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur adalah 145,5 ± 2.1 dan 122.4 ± 4.6 nm, masing-masing. Hal ini mungkin karena TPP mengubah sifat fisiokimia permukaan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur yang menyebabkan perbedaan dua misel. Dan DL dan EE misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur lebih tinggi dari misel biasa yang dibuat dengan TPP-oHA. Selain itu, misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur memiliki potensi zeta negatif yang lebih kuat (− 21.56 ± 1.46 mV) dibandingkan dengan misel Cur/oHA-Cur (− 19.17 ± 0.55 mV), yang menunjukkan peningkatan stabilitas TPP-oHA -SS-Cur karena agregasi misel terutama disebabkan oleh keberadaan TPP.
Selain itu, kenampakan, distribusi ukuran partikel, potensi zeta, dan karakterisasi citra TEM misel TPP-oHA-SS-Cur ditunjukkan pada Gambar 4. Hasilnya menunjukkan bahwa misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur kurang lebih bulat ( Gbr. 4d), terdistribusi secara homogen (Gbr. 4b), dan memiliki diameter rata-rata sekitar 122,4 ± 4,6 nm. Selain itu, indeks polidispersitas misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur adalah 0,132 lebih kecil dari 0,2, menunjukkan keseragaman ukuran misel, yang konsisten dengan TEM (Gbr. 4c).
Penampilan (a ), distribusi ukuran partikel (b ), potensi zeta (c ), dan gambar TEM (d ) karakterisasi misel TPP-oHA-S-S-Cur
Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1, ukuran partikel misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur lebih kecil dalam PBS daripada PBS yang mengandung FBS. Dari 2 hingga 24 jam, ukurannya telah berubah dari 133,45 ± 6.8 menjadi 160.27 ± 7.1 nm dalam PBS yang berisi FBS. Fenomena ini menunjukkan bahwa misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dapat mempertahankan stabilitas yang lebih baik secara in vivo.
Studi Pelepasan Obat Misel In Vitro
Sensibilitas redoks TPP-oHA-S-S-Cur dipelajari oleh misel dalam konsentrasi GSH yang berbeda. Pelepasan arus dari misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dengan ada atau tidak adanya GSH dilakukan untuk mensimulasikan lingkungan tumor. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 5, dalam medium tanpa GSH, hanya 32,5% Cur yang dilepaskan dari TPP-oHA-SS-Cur dalam 120 jam, dan penambahan 10 μM GSH ke medium hanya menghasilkan sedikit peningkatan (37%) . Sebaliknya, pelepasan obat kelompok dengan 2 mM GSH dan 10 mM GSH masing-masing adalah 57,5 dan 75,3%. Ini diverifikasi bahwa pelepasan obat meningkat dengan konsentrasi GSH. Hasil ini diduga dapat mengganggu ikatan disulfida TPP-oHA-S-S-Cur, yang menunjukkan bahwa misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur memiliki sensitivitas reduksi.
Pelepasan in vitro misel TPP-oHA-S-S-Cur Cur-loaded pada konsentrasi GSH yang berbeda (n = 3)
Studi Sitotoksisitas
Sitotoksisitas formulasi kurkumin yang berbeda dalam sel MDA-MB-231 dipelajari dengan uji MTT. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 6, konsentrasi formulasi kurkumin yang berbeda memiliki viabilitas sel yang berbeda pada 24 jam. Misel yang mengandung Cur kurang beracun daripada Cur bebas, yang dapat dijelaskan bahwa bahan polimer sangat menurunkan sitotoksisitas sel. Sementara itu, Gambar 6b menunjukkan profil viabilitas sel yang bergantung pada konsentrasi, sedangkan misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur memiliki viabilitas sel paling rendah dibandingkan misel Cur/oHA-Cur dan formulasi lainnya, yang dapat dijelaskan bahwa Cur/TPP- Misel oHA-SS-Cur dengan mudah masuk ke dalam sel dan melepaskan obat di bawah efek GSH. IC50 nilai misel Cur, Cur/oHA-Cur bebas, dan misel Cur-TPP-oHA-SS-Cur dalam sel MDA-MB-231 berturut-turut adalah 6,534, 5,092, dan 3,871 μg/mL, yang menunjukkan sitotoksisitas seluler Cur -TPP-oHA-SS-Cur misel dalam sel MDA-MB-231.
a Sitotoksisitas formulasi kurkumin setelah inkubasi selama 24 jam. Data mewakili mean ± SD (n = 6). *p <0,05, dibandingkan dengan Cur bebas. b Sitotoksisitas misel Cur-loaded dengan konsentrasi Cur yang berbeda (0,5, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, dan 40 μg/mL). IC50 nilai misel Cur, Cur/oHA-Cur bebas, dan misel Cur-TPP-oHA-SS-Cur masing-masing adalah 6,534, 5,092, dan 3,871 μg/mL
Selain itu, misel kosong memiliki toksisitas tertentu (Gbr. 6) karena Cur dikaitkan dengan polimer dengan metode kimia. Ini akan meningkatkan kapasitas pemuatan obat misel dan kemudian meningkatkan efek antitumor.
Gambar Mikroskopi Fluoresensi dari Serapan Seluler
Serapan seluler misel Cur, Cur/oHA-Cur gratis, dan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dipelajari dengan mikroskop fluoresensi. Dalam karya ini, Cur sendiri tidak hanya obat antikanker tetapi juga probe fluoresensi hijau. Seperti terlihat pada Gambar. 7, misel Cur/oHA-Cur dan misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur menunjukkan serapan seluler yang baik dalam garis sel dan intensitas fluoresensi berbanding lurus dengan waktu, sedangkan intensitas fluoresensi lebih kuat pada 4 j. Sementara itu, intensitas fluoresensi kelompok perlakuan misel Cur/oHA-Cur lebih kuat dibandingkan kelompok Cur bebas pada titik waktu yang sama. Ini mungkin karena oHA-Cur dengan kemampuan menargetkan reseptor CD44 mendorong masuknya obat ke dalam sel. Lebih lanjut, mungkin berkat kemampuan peka redoks misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur, sinyal fluoresensinya jelas lebih tinggi daripada misel Cur/oHA-Cur. Dengan meningkatkan akumulasi Cur, itu akan diinduksi oleh sitotoksisitas dan apoptosis sel kanker, yang konsisten dengan hasil studi sitotoksisitas.
Gambar mikroskop fluoresensi dari serapan seluler Cur bebas (a ), oHA-Cur/ Cur-micelles (b ), dan TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micelles (c ) pada waktu yang berbeda. d Sel yang diobati dengan TPP-oHA-S-S-Cur/Cur-micelles dengan adanya HA gratis (2 mg/mL), menunjukkan efek penyelesaian HA dalam sel MDA-MB-231
Selain itu, intensitas fluoresensi kelompok misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur dengan HA lebih rendah daripada tanpa kelompok HA, kemungkinan besar karena fakta bahwa molekul HA bebas menempati reseptor CD44, yang selanjutnya menunjukkan kemampuan penargetan dari TPP-oHA-SS-Cur terhadap CD44.
Selanjutnya, lokalisasi mitokondria TPP-oHA-S-S-Cur dikonfirmasi dalam garis sel MDA-MB-231 dengan pewarnaan dengan Mito-tracker Red CMXRos (Gbr. 8). Gambar-gambar tersebut mengungkapkan bahwa fluoresensi hijau misel Cur/TPP-oHA-SS-Cur dengan baik tumpang tindih dengan fluoresensi merah dari pelacak mitokondria, yang menunjukkan bahwa obat tersebut dapat terakumulasi dalam mitokondria sel kanker, dan TPP-oHA-SS -Cur memiliki penargetan mitokondria.
Lokalisasi mitokondria. Lokalisasi mitokondria ditentukan dengan pewarnaan dengan pelacak mitokondria dalam sel MCF-7 dengan perlakuan Cur (a bebas) ), oHA-Sur (b ), dan TPP-oHA-S-S-Cur (c ); bilah skala:100 μm
Flow Cytometry
Intensitas fluoresen rata-rata (MFI) diukur dengan flow cytometry. Seperti terlihat pada Gambar. 9, MFI sel MDA-MB-231 yang diinkubasi dengan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur dan misel Cur/oHA-Cur berbanding lurus dengan waktu pemberian. Konsisten dengan pengamatan mikroskopis confocal, MFI sel yang diobati dengan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok misel Cur/oHA-Cur pada titik waktu yang sama (p < 0.05).
Intensitas fluoresensi sel MDA-MB-231 yang diinkubasi dengan formulasi Cur yang berbeda (20 μg Cur/mL). Data direpresentasikan sebagai mean ± SD (n = 3). *p < 0,05, ANOVA satu arah
Kesimpulan
Dalam penelitian ini, untuk meningkatkan kelarutan dan efek pengobatan Cur, mengurangi efek samping terapi tradisional, dan meningkatkan penargetan tumor obat, kami menggunakan disulfidebond responsif redoks sebagai lengan sambungan dan membangun penargetan ganda reseptor mitokondria dan CD44. konjugat obat polimer yang responsif terhadap redoks (TPP-oHA-SS-Cur). TPP menargetkan mitokondria, obat antitumor Cur berfungsi sebagai bagian hidrofobik, dan reseptor CD44 yang menargetkan oHA bertindak sebagai bagian hidrofilik. Cur, sebagai obat model, dimuat dalam blokkopolimer amfifilik dan membentuk misel melalui perakitan sendiri.
Sistem penghantaran obat ini merangkum Cur dengan metode kimia dan metode fisik tidak hanya meningkatkan DL/EE-nya tetapi juga meningkatkan stabilitas dan waktu sirkulasi darahnya, dan dapat mencapai penargetan tumor yang lebih baik. Uji pelepasan obat in vitro menunjukkan bahwa ikatan disulfida TPP-oHA-SS-Cur terputus oleh efek GSH tinggi (2–10 mM) dalam sel tumor, diikuti oleh pelepasan obat yang cepat dan kemudian menunjukkan reduksinya- peka. Hasil serapan seluler, lokalisasi mitokondria, dan sitotoksisitas menunjukkan misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur memiliki kemampuan penargetan reseptor CD44 dan kemampuan penargetan mitokondria. Langkah selanjutnya, kami akan mengevaluasi aktivitas antitumor misel Cur/TPP-oHA-S-S-Cur in vivo.
Selain itu, platform nanocarrier multifungsi pintar yang dikembangkan dalam penelitian ini menunjukkan potensi untuk digunakan untuk obat hidrofobik dengan kelarutan, stabilitas, dan kemanjuran terapeutik yang ditingkatkan secara signifikan. Sementara itu, metode ini memberikan ide baru untuk pengobatan tumor.
