Nec-1 Melemahkan Neurotoksisitas yang Diinduksi oleh Nanomaterial Titanium Dioksida pada Sel Sh-Sy5y Melalui RIP1
Abstrak
Nanomaterial titanium dioksida diterapkan di berbagai bidang karena karakteristik fisikokimianya yang luar biasa, yang pada gilirannya menimbulkan potensi ancaman bagi kesehatan manusia. Baru-baru ini, banyak penelitian in vivo telah mengungkapkan bahwa titanium dioksida nanopartikel (TNP) dapat diangkut ke otak hewan setelah terpapar melalui berbagai rute. TNP yang diserap dapat menumpuk di otak dan dapat mengganggu sel saraf, yang menyebabkan disfungsi otak. Studi in vitro memverifikasi neurotoksisitas TNP. Mekanisme yang mendasari neurotoksisitas TNP masih belum jelas. Apakah nekroptosis terlibat dalam neurotoksisitas TNP tidak diketahui. Oleh karena itu, kami melakukan penelitian in vitro dan menemukan bahwa TNP menginduksi cedera inflamasi pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis, yang dikurangi dengan pra-perawatan necrostatin-1 (Nec-1). Karena protein kinase 1 (RIP1) yang berinteraksi dengan reseptor dilaporkan sebagai target Nec-1, kami membungkamnya dengan siRNA. Kami mengekspos sel mutan dan tipe liar ke TNP dan menilai cedera inflamasi. Membungkam ekspresi RIP1 menghambat cedera inflamasi yang disebabkan oleh paparan TNP. Secara bersama-sama, Nec-1 memperbaiki neurotoksisitas TNP melalui RIP1. Namun, lebih banyak penelitian harus dilakukan untuk menilai secara komprehensif korelasi antara neurotoksisitas TNP dan RIP1.
Pengantar
Karena sifat fisikokimianya yang luar biasa, bahan nano titanium dioksida disintesis [1] dan banyak digunakan untuk berbagai keperluan, seperti kosmetik [2], bidang industri [3, 4], dan bidang medis [5]. Namun, penggunaan yang meluas ini dapat menimbulkan ancaman besar bagi kesehatan manusia [6]. Setelah terpapar, mayoritas titanium dioksida nanopartikel (TNPs) memasuki tubuh manusia melalui inhalasi dan konsumsi [6]. Sistem pernapasan [7], sistem pencernaan [8], dan sistem kardiovaskular [9] semuanya dapat terganggu oleh TNP yang diserap. Demikian pula otak, sebagai bagian terpenting dari sistem saraf pusat, juga dapat terganggu, karena TNP dalam sirkulasi dapat menembus sawar darah-otak, dan NP yang dihirup dapat diangkut ke otak melalui jalur olfaktorius. . Begitu TNP memasuki otak, mereka dapat menumpuk di sana dan menyebabkan kerusakan pada otak, yang menyebabkan disfungsi. Kerusakan pada otak biasanya tidak dapat diubah dan parah, oleh karena itu setiap potensi penyebab kerusakan harus diselidiki [11].
Meskipun tidak ada studi epidemiologi yang mengeksplorasi hubungan antara paparan TNPs dan penyakit otak, banyak studi in vivo dan in vitro telah mengkonfirmasi neurotoksisitas TNPs [12]. Selain itu, fokus utama telah pada penelitian untuk mengungkap mekanisme yang mendasarinya. Untuk tujuan ini, kami sebelumnya meninjau mekanisme molekuler neurotoksisitas TNP yang saat ini diketahui dan menemukan bahwa proses kematian sel terprogram (PCD), seperti apoptosis dan autophagy, terlibat dalam neurotoksisitas TNP [13].
Nekroptosis, juga disebut nekrosis teregulasi, adalah jenis lain dari PCD. Tidak seperti apoptosis yang bergantung pada caspase, nekroptosis bergantung pada protein kinase 1/3 (RIP1/RIP3) yang berinteraksi dengan reseptor. RIP1 yang diaktifkan merekrut RIP3 untuk membentuk nekrosom, yang mengaktifkan protein seperti domain kinase campuran (MLKL) untuk memulai nekroptosis [14]. Nekroptosis dapat mengatur kematian sel dan peradangan saraf [15, 16], yang keduanya terlibat dalam neurotoksisitas TNP. Oleh karena itu, kami berhipotesis bahwa nekroptosis terlibat dalam neurotoksisitas yang disebabkan oleh TNP.
Untuk menguji hipotesis kami, kami melakukan studi in vitro untuk mengeksplorasi peran nekroptosis dalam neurotoksisitas TNP. Dalam penelitian ini, viabilitas sel, kebocoran LDH, dan sitokin inflamasi (TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8) diukur setelah paparan TNP. Pertama, sel SH-SY5Y dikultur dengan berbagai konsentrasi TNP. Kedua, sel-sel terpapar TNP dengan atau tanpa Nec-1, yang merupakan penghambat kuat nekroptosis. Ketiga, ekspresi gen RIP1, yang dapat ditekan oleh Nec-1, dibungkam menggunakan siRNA, setelah itu sel mutan dan tipe liar diperlakukan dengan TNP. Studi ini menyoroti pemahaman komprehensif tentang mekanisme molekuler yang mendasari neurotoksisitas TNP.
Hasil
TNP Menghambat Viabilitas Sel
Untuk memverifikasi sitotoksisitas TNP pada sel SH-SY5Y, pertama-tama kami menilai viabilitas sel menggunakan uji CCK8. Sel dikultur dengan konsentrasi TNP mulai dari 5 hingga 160 g/mL selama 24, 48, dan 72 jam. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1, viabilitas sel tetap tidak berubah dalam sel yang diobati dengan 5, 10, 20, dan 40 g/mL setelah 24 jam pemaparan. Ketika sel dirawat selama 48 dan 72 jam, viabilitas sel tetap tidak berubah hanya pada kelompok 5 g/mL (p =0,4507 pada 48 jam dan p =0.1002 pada 72 jam). Selain itu, viabilitas sel secara dramatis lebih rendah pada sel yang diobati dengan 80 g/mL TNP setelah 48 (p =0,0007) dan 72 jam (p =0,0008). Berdasarkan hasil tersebut, kami menyimpulkan bahwa TNP menurunkan viabilitas sel dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (data tidak ditampilkan), menunjukkan bahwa paparan jangka panjang lebih beracun.
Perbedaan konsentrasi paparan TiO2-NPs pada viabilitas sel sel SH-SY5Y pada 24, 48, dan 72 jam dan kebocoran LDH pada 72 jam. (Dibandingkan dengan grup kontrol,
*p <0,05,
**p <0,01,
***p <0,001,
****p <0,0001)
TNP Merusak Integritas Membran
Nest, kami menganalisis efek toksik TNP pada integritas membran setelah 72 jam paparan. Integritas membran dinilai dengan mengukur kebocoran LDH. Seperti ditunjukkan pada Gambar. 1b, tingkat LDH meningkat secara signifikan dalam sel yang diobati dengan TNP pada dosis yang lebih tinggi dari 5 g/mL. Peningkatan produksi LDH diamati pada sel yang diobati dengan 40, 80, dan 160 g/mL (p <0,0001). Hasil ini menunjukkan bahwa TNP meningkatkan kadar LDH dengan cara yang bergantung pada dosis, yang serupa dengan uji CCK8.
Paparan TNP Meningkatkan Peradangan
Respon inflamasi setelah paparan TNP dianalisis menggunakan ELISA. Setelah sel diperlakukan dengan berbagai konsentrasi TNP selama 72 jam, kadar TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 diukur. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 2, sekresi IL-8 diregulasi di semua sel yang diobati dengan TNP; tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 secara seragam meningkat pada sel yang diobati dengan dosis lebih tinggi dari 5 g/mL (p <0,01). Selain itu, peradangan secara signifikan lebih tinggi pada sel yang diobati dengan dosis lebih tinggi dari kelompok 10 g/mL (p <0,0001). Secara keseluruhan, TNP meningkatkan peradangan dengan cara yang bergantung pada dosis.
Konsentrasi berbeda dari paparan TiO2-NPs (μg/mL) pada inflamasi sel SH-SY5Y pada 72 jam. (Dibandingkan dengan grup kontrol,
****p <0,0001)
Hasil kami menunjukkan bahwa TNP menginduksi cedera inflamasi dengan cara yang bergantung pada dosis. Kami mengadopsi konsentrasi TNP 80 g/mL dan periode paparan 72 jam dalam eksperimen berikut untuk mengeksplorasi peran nekroptosis dalam neurotoksisitas TNP.
Pengobatan bersama Nec-1 Menghambat Neurotoksisitas TNP
Untuk menganalisis peran nekroptosis dalam cedera inflamasi, kami merawat sel dengan Nec-1 (inhibitor nekroptosis) dan TNP. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 3a, sel SH-SY5Y terkena TNP atau TNPs+Nec-1 (1, 5, 10, 15, atau 20 M), dan kami menemukan bahwa Nec-1 secara dramatis memperbaiki pengurangan yang diinduksi TNP dalam viabilitas sel (10, 15, 20 M) (p <0,0001). Karena viabilitas sel pada kelompok yang diberi 15 M- dan 20 M tidak lebih tinggi dari pada kelompok yang diobati dengan 10 M (p =0,6643 dan p =0,6292), kami memperlakukan sel bersama dengan 10 M Nec-1 untuk menganalisis efeknya pada integritas membran.
Efek Nec-1 pada viabilitas sel dan LDH setelah paparan TNP. (
***p <0,001,
****p <0,0001)
Setelah mengkultur sel dengan TNPs atau TNPs + Nec-1, kami menemukan bahwa tingkat LDH pada kelompok TNPs + Nec-1 jauh lebih rendah daripada pada kelompok TNP saja (p =0,0005). Selain itu, pengobatan dengan Nec-1 saja tidak meningkatkan kebocoran LDH (p =0,9878.
Secara meyakinkan, 10 M Nec-1 dapat secara efektif menghambat sitotoksisitas TNP dan tidak beracun bagi sel.
Untuk menganalisis kemampuan anti-inflamasi Nec-1, sel dikultur dengan TNPs atau TNPs + Nec-1. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 4, produksi TNF-α (p =0,003), IL-1β (p =0,0013), IL-6 (p <0,0001), dan IL-8 (p =0,0004) secara signifikan lebih rendah pada kelompok TNPs + Nec-1 dibandingkan kelompok TNPs.
Efek Nec-1 pada peradangan setelah paparan TNP. (
**p <0,01,
***p <0,001,
****p <0,0001)
Hasil tersebut menyiratkan bahwa Nec-1 dapat mengurangi respons inflamasi yang disebabkan oleh paparan TNP.
Membungkam RIP1 Mengurangi Cedera Peradangan yang Diinduksi oleh TNP
Untuk menentukan apakah Nec-1 membatalkan cedera inflamasi yang disebabkan oleh TNP melalui RIP1, kami secara efektif membungkam ekspresi sel RIP1 menggunakan siRNA (Gbr. 5, p <0,0001). Selanjutnya, cedera inflamasi setelah paparan TNP pada sel mutan dan tipe liar diukur. Gambar 6a menunjukkan bahwa viabilitas sel pada kelompok TNPs + si-RIP1 jauh lebih tinggi daripada pada kelompok TNPs + si-NC (p =0,0002). Produksi LDH (Gbr. 6b, p <0,0001) dan kadar TNF-α (p <0,0001), IL-1β (p =0,0001), IL-6 (p <0,0001), dan IL-8 (p =0,0001) (Gbr. 7) pada kelompok TNPs + si-RIP1 secara dramatis lebih rendah daripada kelompok TNPs + si-NC. Hasil ini menunjukkan bahwa TNP mempromosikan cedera inflamasi melalui RIP1.
Ekspresi mRNA setelah sel SH-SY5Y ditransfeksi dengan si-RIP1. (
***p <0,0001)
Viabilitas sel dan kebocoran LDH setelah sel mutan dan tipe liar terpapar TNP. (
***p <0,001,
****p <0,0001)
Peradangan setelah sel mutan dan tipe liar terpapar TNP. (
***p <0,001,
****p <0,0001)
Diskusi
Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa paparan TNP menginduksi sitotoksisitas pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis dan bahwa nekroptosis terlibat dalam neurotoksisitas TNP. Untuk mengeksplorasi peran nekroptosis, kami mengekspos sel ke TNP dengan atau tanpa Nec-1 (penghambat nekroptosis yang kuat) [17, 18], dan mengukur viabilitas sel, kebocoran LDH, dan tingkat sitokin inflamasi. Data kami menunjukkan bahwa pengobatan bersama Nec-1 dapat mengurangi cedera inflamasi yang disebabkan oleh TNP. Karena penelitian telah menunjukkan bahwa Nec-1 memberikan efeknya dengan menekan aktivitas RIP1, kami mentransfeksi sel dengan si-RIP1 untuk menentukan apakah RIP1 terlibat dalam efek perlindungan Nec-1. Sel mutan dan tipe liar diobati dengan TNP, dan cedera inflamasi dinilai. Hal ini menunjukkan bahwa viabilitas sel pada kelompok si-RIP1 lebih tinggi dari pada kelompok si-NC, dan tingkat kebocoran LDH dan sitokin inflamasi lebih rendah pada kelompok si-RIP1 dibandingkan pada kelompok si-NC setelah terpapar TNP. . Sebagai kesimpulan, penelitian ini mengungkapkan untuk pertama kalinya bahwa nekroptosis terlibat dalam cedera inflamasi yang diinduksi TNP pada sel.
Kami menegaskan kembali neurotoksisitas TNP dalam penelitian in vitro kami. Setelah sel SH-SY5Y terkena berbagai konsentrasi TNP untuk berbagai waktu inkubasi, viabilitas sel dinilai menggunakan uji CCK8. Seperti yang ditunjukkan pada Gambar. 1a, paparan TNP mengurangi viabilitas sel dengan cara yang bergantung pada dosis; setelah 48 jam dan 72 jam paparan, viabilitas sel pada kelompok 80 dan 160 TNPs menurun secara dramatis dibandingkan dengan kelompok kontrol (p <0,001). Untuk mengkonfirmasi lebih lanjut sitotoksisitas, kami juga mengukur kebocoran LDH. Data pada Gambar 1b mengungkapkan bahwa produksi LDH meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis setelah 72 jam paparan, dan tingkat LDH pada kelompok 40, 80, dan 160 jauh lebih tinggi daripada kelompok kontrol (p <0,0001). Karena penelitian sebelumnya telah menunjukkan bahwa peradangan saraf dapat dipromosikan oleh paparan TNP [19], tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 juga diukur. Gambar 2 mengilustrasikan bahwa kadar keempat sitokin inflamasi tersebut diregulasi secara signifikan dibandingkan dengan kelompok kontrol dan secara dramatis lebih tinggi pada kelompok yang diobati dengan 20 hingga 160 g/mL (p <0,0001). Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa TNP dapat menginduksi neurotoksisitas dengan cara yang bergantung pada dosis, yang konsisten dengan penelitian sebelumnya. TNP dapat diserap oleh sel saraf dan menghambat proliferasi [20,21,22]. Selanjutnya, paparan TNP dapat menurunkan viabilitas sel dan meningkatkan kebocoran LDH dengan cara yang bergantung pada dosis [23,24,25,26,27].
Kami merawat sel dengan Nec-1 untuk mengklarifikasi apakah nekroptosis terlibat dalam neurotoksisitas yang disebabkan oleh TNP. Setelah sel diobati dengan konsentrasi TNP yang ditunjukkan dengan atau tanpa Nec-1, viabilitas sel, kebocoran LDH, dan peradangan dinilai. Gambar 3a menunjukkan bahwa pengurangan viabilitas sel setelah paparan TNP secara signifikan dihambat oleh pengobatan bersama dengan 10 M Nec-1. Sementara itu, Gambar 3b mengungkapkan bahwa pengobatan dengan 10 M Nec-1 tidak meningkatkan kadar LDH, dan kadar LDH dalam sel yang diobati dengan kelompok TNPs + Nec-1 secara dramatis lebih rendah daripada kelompok TNP saja. Selanjutnya, kami mengukur efek pengobatan bersama dengan Nec-1 pada peradangan yang disebabkan oleh TNP. Gambar 4 mengilustrasikan bahwa kadar TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 sangat rendah pada sel yang diobati dengan TNP + Nec-1. Hasil ini membuktikan kembali bahwa Nec-1 dapat melindungi sel dari kematian dan proses inflamasi [28, 29].
Akhirnya, karena RIP1 adalah target Nec-1, kami menilai apakah RIP1 dapat mengatur neurotoksisitas TNP. Kami membangun sel mutan dengan membungkam ekspresi RIP1 (Gbr. 5). Data dari Gambar 6 dan Gambar 7 mengungkapkan bahwa setelah paparan TNP, viabilitas sel lebih tinggi, dan kadar LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 lebih rendah pada kelompok si-RIP1 daripada kelompok si-RIP1. bahwa di si-NC, yang menunjukkan bahwa TNP mempromosikan sitotoksisitas melalui RIP1. Demikian juga, beberapa penelitian telah menemukan bahwa RIP1 dapat mengatur kematian sel dan proses inflamasi [30, 31].
Meskipun kami melaporkan untuk pertama kalinya bahwa Nec-1 dapat mengurangi neurotoksisitas TNP dengan menekan jalur pensinyalan nekroptosis, penelitian kami memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, sitotoksisitas bahan berukuran nano berbeda dari bahan berukuran besar dan sebagian besar dapat dipengaruhi oleh sifat permukaan [32], yang dapat menjelaskan hasil sebaliknya dari peningkatan viabilitas sel yang ditemukan oleh Sebastián et al. [33]. Oleh karena itu, penting untuk mengevaluasi nanotoksisitas secara komprehensif pada subjek dari berbagai aspek, seperti proliferasi sel, integritas membran, stres oksidatif, peradangan, fungsi mitokondria, siklus sel, sitoskeleton, dan epigenetik. Kedua, RIP1 dapat merekrut RIP3 untuk membentuk nekrosom fungsional, aktivator penting MLKL, untuk memulai nekroptosis [34]. Kami berhipotesis bahwa RIP3 / MLKL dapat terlibat dalam neurotoksisitas TNP, yang harus dieksplorasi dalam pekerjaan di masa depan. Selanjutnya, hubungan RIP3/MLKL dengan neurotoksisitas TNP juga harus dievaluasi. Ketiga, spesies oksigen reaktif (ROS), sebagai mekanisme utama yang mendasari neurotoksisitas TNP [35, 36], dilaporkan sebagai sinyal upstream RIP1 [37]. Oleh karena itu, apakah ROS adalah hulu RIP1 dalam neurotoksisitas TNP harus didiskusikan lebih lanjut. Keempat, sel harus terpapar pada konsentrasi non-toksik (TNP <5 g/mL) untuk periode jangka panjang (lebih dari 72 jam) untuk menilai sitotoksisitas kronis. Kelima, kita harus mengevaluasi peran nekroptosis dalam neurotoksisitas TNPs di lebih banyak garis sel saraf dan sel saraf primer manusia dan hewan.
Kesimpulan
Studi kami mengungkapkan nekroptosis sebagai mekanisme kematian sel terprogram lain yang terlibat dalam neurotoksisitas yang disebabkan oleh TNP. Dalam penelitian ini, kami menemukan bahwa TNP dapat menginduksi cedera inflamasi pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis dan bahwa pengobatan bersama Nec-1 (penghambat nekroptosis yang kuat) dapat memperbaiki efek berbahaya tersebut. RIP1, target Nec-1, dibungkam oleh si-RNA, yang secara efektif mengurangi cedera inflamasi yang disebabkan oleh paparan TNP. Kesimpulannya, Nec-1 menghambat cedera inflamasi sel SH-SY5Y yang disebabkan oleh paparan TNP dengan menargetkan jalur RIP1. Jalur pensinyalan hulu dan hilir RIP1 yang terlibat dalam neurotoksisitas TNP harus dinilai lebih lanjut.
Bahan dan Metode
Persiapan TNP dan Kultur Sel
Kami sebelumnya mengkarakterisasi TNPs dan menyiapkannya sesuai dengan prosedur kami yang diterbitkan sebelumnya [38]. Secara singkat, TNPs dilarutkan dalam RPMI 1640 dengan berbagai konsentrasi 5, 10, 20, 40, 80, dan 160 g/mL. Solusi TNP disterilkan dan disonikasi (300 W, 10 menit) pada suhu kamar untuk menjaga partikel dari agregasi sebelum pengobatan. Sel dalam media kultur yang tidak terpapar TNP berfungsi sebagai kelompok kontrol. Sel SH-SY5Y, dibeli dari Bank Sel Shanghai Institute of Life Sciences, Chinese Academy of Sciences, dikultur dalam media RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, USA) yang dilengkapi dengan 10% serum janin sapi (Gibco, produk garis Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 U/mL penisilin, dan 100 g/mL streptomisin pada 37 °C dalam inkubator yang dilembabkan dengan 5% CO2 .
Viabilitas Sel dan Uji Kebocoran LDH
Viabilitas sel diukur menggunakan cell counting kit-8 (CCK8. Dojindo, cat no.CK04). Singkatnya, 1 × 10
4
Sel SH-SY5Y ditempatkan di piring 96-sumur dan dikultur dalam inkubator pada 37 °C (5% CO2 ) selama 24 jam sebelum terpapar TNPs. Sel kemudian diinkubasi dengan TNP pada berbagai konsentrasi (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, dan 80 g/mL) selama 24 jam. Setelah perawatan, sel diinkubasi dengan CCK-8 selama 2 jam. Selanjutnya, kerapatan optik (OD) diukur pada 450 nm dengan menempatkan pelat 96-sumur ke dalam pembaca pelat mikro (BioTek, Winooski, VT, USA). Viabilitas sel dari setiap kelompok, dinyatakan sebagai persentase, dihitung sebagai (ODtreated−ODblank)/(ODcontrol ODblank) × 100%.
Integritas membran diukur dengan kit komersial (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, Cina). Setelah sel SH-SY5Y terkena berbagai konsentrasi TNP selama 72 jam, sekresi LDH dianalisis sesuai dengan instruksi pabrik.
Respons Peradangan
ELISA diterapkan untuk mengukur kadar TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 yang diproduksi oleh sel SH-SY5Y. Secara singkat, sel SH-SY5Y terpapar TNP selama 72 jam, dan supernatan dikumpulkan untuk dianalisis sesuai instruksi pabrik (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).
Transfeksi siRNA
Mengikuti protokol pabrikan, konsentrasi 100 nM si-RIP1 atau siRNA kontrol negatif (si-NC) ditransfusikan ke dalam sel dengan menggunakan Lipofectamine 2000. Efisiensi pembungkaman gen oleh siRNA diperkirakan dengan PCR waktu-nyata.
PCR Waktu Nyata
RNA sel yang terpapar berbagai konsentrasi TNP diisolasi menggunakan kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, USA) berdasarkan instruksi pabrik. Ekspresi relatif RIP1 diukur dengan PCR waktu nyata. Tingkat mRNA relatif RIP1 dinormalisasi menjadi ekspresi -aktin.
Analisis Statistik
Perangkat lunak SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) digunakan untuk menganalisis data. Analisis varians satu arah digunakan untuk membandingkan rata-rata kelompok. p <0,05 dianggap signifikan secara statistik.
