F-aktin Mengatur Diferensiasi Osteoblastik Sel Punca Mesenkim pada TiO2 Nanotube Melalui MKL1 dan YAP/TAZ
Abstrak
Titanium dan paduan titanium banyak digunakan dalam implan ortopedi. Memodifikasi nanotopografi memberikan strategi baru untuk meningkatkan osseointegrasi substrat titanium. Polimerisasi filamen aktin (F-aktin), sebagai struktur pemuatan mekanis, umumnya dianggap terlibat dalam migrasi sel, endositosis, pembelahan sel, dan pemeliharaan bentuk sel. Apakah F-aktin terlibat dan bagaimana fungsinya dalam diferensiasi osteogenik yang diinduksi nanotube dari sel punca mesenkimal (MSC) masih harus dijelaskan. Dalam penelitian ini, kami membuat TiO2 nanotube pada permukaan substrat titanium dengan oksidasi anodik dan mengkarakterisasi fitur mereka dengan pemindaian mikroskop elektron (SEM), analisis dispersi energi sinar-X (EDS), dan mikroskop gaya atom (AFM). Pewarnaan alkaline phosphatase (ALP), Western blotting, qRT-PCR, dan pewarnaan imunofluoresensi dilakukan untuk mengeksplorasi potensi osteogenik, tingkat F-aktin, dan ekspresi MKL1 dan YAP/TAZ. Hasil kami menunjukkan bahwa diameter dalam dan kekasaran TiO2 nanotube meningkat dengan peningkatan tegangan oksidasi anodik dari 30 menjadi 70 V, sedangkan tingginya adalah 2 m secara konsisten. Selanjutnya, semakin besar diameter tabung, semakin kuat kemampuan TiO2 nanotube untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC. Menghambat polimerisasi F-aktin oleh Cyto D menghambat diferensiasi osteogenik MSC serta ekspresi protein yang terkandung dalam kompleks adhesi fokal seperti vinculin (VCL) dan fokal adhesi kinase (FAK). Sebaliknya, setelah pengobatan Jasp, polimerisasi F-aktin meningkatkan ekspresi RhoA dan faktor transkripsi YAP/TAZ. Berdasarkan data ini, kami menyimpulkan bahwa TiO2 nanotube memfasilitasi diferensiasi osteogenik MSC, dan kemampuan ini ditingkatkan dengan meningkatnya diameter nanotube dalam kisaran tertentu (30-70 V). F-aktin memediasi proses ini melalui MKL1 dan YAP/TAZ.
Pengantar
Titanium dan paduan titanium, karena biokompatibilitasnya yang sangat baik, ketahanan terhadap korosi, dan sifat mekanik, banyak digunakan dalam aplikasi klinis seperti penggantian sendi total dan implan gigi [1,2,3]. Namun, masih banyak tantangan yang harus diselesaikan, termasuk pelonggaran aseptik dan infeksi [4, 5]. Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah penelitian yang bertujuan untuk meningkatkan osseointegrasi dan sifat antibakteri telah dilakukan. Misalnya, MoS2 Pelapisan /PDA-RGD pada implan titanium tidak hanya dapat mendorong integrasi implan titanium dengan tulang inang tetapi juga menghambat pertumbuhan bakteri dengan efisiensi tinggi [6]. Selain itu, topografi permukaan telah menarik lebih banyak perhatian, dan modifikasi topografi berbeda dari modifikasi kimia dengan hanya mengubah struktur skala mikro dan nano. Stimulasi sinyal kimia pada sel tidak stabil dan sitotoksik. Sebagai perbandingan, sinyal fisik yang aman dan terkendali dapat menghindari beberapa efek samping yang disebabkan oleh molekul kimia. Oleh karena itu, modifikasi topografi permukaan implan dan pengaturan osseointegrasi melalui struktur topografi dapat memberikan cara baru untuk memecahkan masalah klinis osseointegrasi yang buruk setelah implantasi prostesis.
Di bidang rekayasa jaringan tulang dan regenerasi tulang, interaksi morfologi sel dianggap sebagai strategi manajemen yang menjanjikan untuk kontrol yang tepat dari fungsi dan diferensiasi sel benih. Pada saat yang sama, tulang itu sendiri memiliki hierarki yang elegan dalam rentang nanometer dan mikron [7]. Oleh karena itu, morfologi permukaan dapat memberikan ceruk serupa, yang dapat meniru struktur tulang alami dan mendorong diferensiasi osteogenik sel punca mesenkim pada permukaan tulang inang dan implan. Morfologi permukaan dapat terdiri dari banyak struktur yang berbeda, termasuk nanotube, nanowires, nanopori, dan sebagainya. Secara khusus, susunan nanotube telah menarik minat yang luas di banyak bidang dalam beberapa tahun terakhir karena karakteristik permukaannya yang unik, seperti rasio permukaan terhadap volume yang tinggi, plastisitas biologis, dan kapasitas adsorpsi yang tinggi. Sebagai contoh, sebuah studi baru menunjukkan bahwa boron nitrida nanotube (BNNT) merupakan bahan peka gas yang dapat digunakan sebagai sensor gas untuk memantau operasi transformator dengan mendeteksi komposisi dan kandungan gas terlarut dalam minyak [8]. Dalam biomedis, topografi permukaan juga mampu mengarahkan perilaku seluler, termasuk migrasi sel, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi. Studi terbaru mengungkapkan bahwa topografi skala nano dapat mengarahkan sel punca mesenchymal (MSCs) untuk berdiferensiasi menjadi osteoblas sehingga memperkuat osseointegrasi awal [9,10,11,12]. Bahkan dilaporkan bahwa modifikasi permukaan skala mikro dan nano dapat menyebabkan MSC berdiferensiasi menjadi sel otot polos kontraktil [13]. Namun, mekanisme molekuler tentang bagaimana topografi permukaan mengarahkan nasib sel belum dapat dijelaskan, yang penting untuk evaluasi keamanan material dan desain material.
Filamentous (F)-aktin, juga disebut mikrofilamen, adalah salah satu dari tiga komponen utama sitoskeleton dalam sel eukariotik. Ini terdiri dari polimer aktin globular (G), dimodifikasi oleh banyak protein lain. F-aktin memiliki polaritas struktural karena fakta bahwa semua subunit mikrofilamen mengarah ke ujung yang sama. Ujung berduri diarahkan pada monomer berdekatan yang berbeda, sedangkan ujung runcing memiliki subunit aktin dengan situs pengikatan ATP terbuka. Artinya, ATP terlibat dalam proses transformasi antara G-aktin dan F-aktin. Proses ini berada dalam keseimbangan dinamis, dengan polimerisasi dan depolimerisasi terjadi secara bersamaan, juga dikenal sebagai treadmill, sering terlihat pada lamellipodia dan filopodia [14]. Oleh karena itu, jelas bahwa dinamika aktin memainkan peran penting dalam fungsi seluler seperti migrasi sel, pembelahan sel, dan pemeliharaan bentuk sel. Namun, F-aktin tidak hanya bertindak sebagai struktur fisik yang mendukung pemuatan mekanis tetapi juga berpartisipasi dalam perilaku biologis lainnya seperti transduksi sinyal dan ekspresi gen. Mengumpulkan bukti menunjukkan bahwa F-aktin dapat mengubah sinyal fisik menjadi sinyal kimia dengan berinteraksi dengan protein lain [15,16,17,18]. Misalnya, rekonstruksi biomekanik dan geometrik mempromosikan apoptosis sel tumor dengan mencegah superposisi polimerisasi monomer aktin menjadi F-aktin [15]. Pulsa ultrasound meningkatkan osteogenesis sel punca mesenkim manusia dengan menghambat depolimerisasi F-aktin [16]. Penelitian kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa regangan mekanis meningkatkan stabilitas F-aktin [17]. Karena struktur berongga nanotube menyediakan lebih sedikit situs adhesi untuk sel, penataan ulang sitoskeleton tidak dapat dihindari untuk menjaga keseimbangan biomekanik. Akibatnya, kami pasti memiliki alasan untuk percaya bahwa F-aktin kemungkinan memediasi diferensiasi sel yang diinduksi nanotopografi.
Dalam penelitian ini, kami membuat TiO2 nanotube, memodifikasi topografinya dengan oksidasi anodik, dan mengeksplorasi kemampuannya untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC. Selanjutnya, kami menyelidiki apakah F-aktin memainkan peran penting dalam mekanotransduksi. Cytochalasin D (Cyto D), yang secara kompetitif mengikat ujung berduri F-aktin untuk mencegah G-aktin bergabung ke dalam filamen, digunakan untuk menghambat polimerisasi F-aktin, dan jasplakinolide (Jasp) digunakan untuk meningkatkan stabilisasi perakitan aktin. Selanjutnya, kami juga ingin menjelaskan bagaimana fungsi F-aktin dalam mengubah isyarat fisik menjadi sinyal biokimia. Berdasarkan hasil penelitian kami sebelumnya, kami berhipotesis bahwa jalur MAPK mungkin terlibat dalam proses ini [17]. Faktor transkripsi seperti protein terkait-Ya (YAP)/koaktivator transkripsional dengan motif pengikat PDZ (TAZ) dan MKL1, yang dianggap sebagai mekanosensor dan mekanotransduser, juga merupakan subjek penelitian kami untuk menyaring bagaimana F-aktin mempengaruhi sel induk nasib, karena beberapa penelitian di daerah lain menyiratkan bahwa mereka terkait dengan F-aktin [19,20,21]. Secara umum, kami berharap dapat mengklarifikasi peran F-aktin dalam proses diferensiasi sel punca yang diinduksi oleh nanotube, sehingga dapat memandu desain material dan penilaian biosafety dari implan yang dimodifikasi oleh nanotube.
Bahan dan Metode
Fabrikasi TiO2 Tabung nano
Irisan titanium murni (kemurnian 99,9%, ketebalan 2 mm; Shengshida, Hebei, China), digunakan sebagai substrat, dipoles dengan amplas silikon karbida No. 400 dan 1500 grit. Sampel kemudian dicuci secara berurutan dengan aseton, alkohol anhidrat, dan air deionisasi dalam mesin pembersih ultrasonik, dan akhirnya dikeringkan pada suhu kamar selama 3 jam. Untuk membuat nanotopografi, sampel pra-perlakuan difiksasi sebagai anoda, sedangkan menggunakan potongan platinum sebagai katoda lawan dalam larutan elektrolit berair 0,15 M NH4 F dan 90% glikol selama 1 jam. Tegangan anodisasi adalah tegangan konstan 30, 40, 50, 60, atau 70 V. Setelah oksidasi anodik, setiap sampel dibilas dengan air deionisasi selama 30 menit dan dicuci dengan alkohol anhidrat dalam mesin pembersih ultrasonik selama 15 menit. Terakhir, semua sampel disterilkan dalam autoklaf pada suhu 120 °C selama 1 jam kemudian dibasahi dengan media kultur sebelum digunakan.
Mekanisme reaksi fabrikasi nanotube tidak jelas, dan teori arus utama saat ini adalah teori disolusi yang ditingkatkan di lapangan. Pembentukan susunan nanotube adalah hasil dari keseimbangan dinamis di bawah aksi oksidasi medan, pelarutan medan, dan pelarutan kimia (Gbr. 1b). Proses anodisasi dapat digambarkan sebagai berikut:pada langkah pertama, lapisan penghalang oksida terbentuk pada antarmuka elektrolit-logam:
Bagan ringkasan penelitian kami. a Diagram alir menunjukkan oksidasi anodik dan induksi diferensiasi sel. b Substrat titanium pra-perlakuan difiksasi sebagai anoda dalam larutan berair elektrolit dengan 0,15 M NH4 F dan 90% glikol pada tegangan konstan selama 1 jam. Tabung nano yang dirakit sendiri diprediksi akan terbentuk secara seragam. Mekanisme reaksinya dijelaskan dalam bahan dan metode. c Diagram skematik mekanisme diferensiasi osteogenik sel punca yang diinduksi oleh nanotube
Kemudian retakan dan celah sempit muncul di permukaan karena pelarutan lapisan oksida yang ditingkatkan medan. Difusi F
−
ion ke dalam celah dan celah ini meningkatkan laju disolusi. Retakan membesar dan terhubung dengan retakan tetangga. Akhirnya, laju pembentukan dan laju disolusi lapisan titanium oksida mencapai keseimbangan dinamis, dan nanotube tidak lagi tumbuh:
Sampel dibuat dengan tegangan yang berbeda (30, 40, 50, 60, atau 70 V) dibilas dengan etanol dan air deionisasi selama 15 menit, kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Pemindaian mikroskop elektron (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) digunakan untuk mengkarakterisasi struktur permukaan, dan untuk mengukur diameter dalam dan tinggi nanotube setelah sampel pelapisan dengan lapisan tipis emas. Sementara itu, analisis dispersi energi sinar-X (EDS) dilakukan untuk menganalisis komposisi unsur nanotube. Mikroskop gaya atom (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Belgia) digunakan untuk menyelidiki morfologi permukaan dan kekasaran permukaan sampel. Tiga area berbeda dipilih dari setiap sampel dan pengukuran diulang tiga kali.
Budaya Sel
Tikus Sprague-Dawley (SD) jantan berusia empat minggu dibeli dari pusat hewan percobaan Rumah Sakit Rakyat Shanghai Ninth (Shanghai, Cina). Sel punca mesenkim sumsum tulang tikus (BMSC) diisolasi secara aseptik dari tulang paha dan tibia. BMSC dimurnikan dan diperluas lebih lanjut dalam medium esensial -minimal (α-MEM; Hyclone, Logan, UT, USA) yang mengandung 10% (v/v) serum janin sapi (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, USA ), 100 mg/mL streptomisin (Gibco), dan 100 U/mL penisilin (Gibco), dan diinkubasi pada suhu 37 °C dalam suasana lembab yang terdiri dari 95% udara dan 5% CO2 . Media kultur diperbarui setiap 2 hari, dan sel-sel ditripsinisasi dan disubkultur pada pertemuan 80%. Semua sel yang digunakan dalam penelitian ini berada di antara bagian 3 dan 5. Media induksi osteogenik terdiri dari media pertumbuhan yang dilengkapi dengan 100 nM deksametason, 10 mM -gliserofosfat, dan 50 mM asam askorbat (Sigma–Aldrich, St Louis, MO, USA) .
Uji Proliferasi Sel
TiO2 Irisan titanium yang dimodifikasi nanotube dipotong menjadi bentuk melingkar dan ditempatkan ke dalam sumur dari pelat kultur sel 24-sumur. BMSC antara bagian 3-5 dikultur pada TiO2 nanotube dengan kepadatan 3 × 10
4
sel/cakram baik dalam media pertumbuhan atau media osteogenik. Setelah 2 hari kultur sel, cytochalasin D (Cyto D, Sigma-Aldrich) dan jasplakinolide (Jasp, Sigma-Aldrich), yang digunakan untuk mengganggu polimerisasi F-aktin, ditambahkan ke media setiap hari selama 3 hari. Konsentrasi akhir dan waktu kerja Cyto D dan Jasp masing-masing adalah 5 M, 1 jam dan 2 M, 3 jam. Media kultur diperbarui setelah inkubasi dengan reagen. Viabilitas dan proliferasi sel dinilai menggunakan uji Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Jepang) 12 jam setelah pengobatan Cyto D atau Jasp. Sel diinkubasi dengan larutan CCK8 10% (v/v) selama 2 jam dalam inkubator sel pada suhu 37 °C di bawah 5% CO2 . Kemudian kami mentransfer 100 L campuran reaksi ke dalam sumur pelat 96-sumur dan absorbansi (OD) produk pewarna formazan dalam kultur diukur pada 450 nm menggunakan spektrofotometer UV-tampak Multiscan (Safire2; TECAN, Mannedorf, Swiss ). Selain itu, kami juga menghitung perkiraan jumlah sel menggunakan penghitung sel otomatis (AMQAX1000, Life Technologies). Sebelum penghitungan sel, BMSC secara enzimatik terlepas dari TiO2 nanotube dan diwarnai dengan Trypan blue (Sigma–Aldrich).
Pewarnaan Alkali Fosfatase dan Analisis Aktivitas ALP
BMSC diunggulkan ke lima TiO2 yang berbeda irisan titanium yang dimodifikasi nanotube (30, 40, 50, 60, atau 70 V) dengan kepadatan 3 × 10
4
per sumur dan dikultur dalam media osteogenik. Reagen ditambahkan seperti dijelaskan di atas. Setelah 7 hari inkubasi, BMSC dikultur pada TiO2 nanotube dicuci tiga kali dengan PBS, difiksasi dengan paraformaldehyde 4%, dan diinkubasi dalam larutan kerja alkaline phosphatase (ALP) dari kit ALP sesuai dengan instruksi pabrik (Hongqiao, Shanghai, Cina). Hasilnya diamati di bawah mikroskop stereo setelah dicuci dengan PBS.
Untuk analisis aktivitas ALP, sel pertama kali dilisiskan dengan buffer RIPA tanpa protease dan inhibitor fosfatase, dan kemudian lisat yang disentrifugasi diuji menggunakan ALP Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, China) mengikuti protokol yang disediakan. Aktivitas tersebut akhirnya dinormalisasi dengan konsentrasi protein lisat yang sesuai.
Imunositokimia
Setelah 3 hari perawatan Cyto D dan Jasp, BMSC difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 20 menit pada suhu kamar dan kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Sel-sel ditembus dengan 0,3% Triton-X 100 selama 30 menit, dicuci tiga kali dengan PBS, dan diwarnai dengan phalloidin terkonjugasi Rhodamin selama 1 jam pada suhu kamar dalam gelap. Kemudian sel dibilas dengan PBS, dan diwarnai dengan DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology) selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah tiga kali pencucian tambahan dengan PBS, sampel difiksasi pada kaca objek dan diamati dengan mikroskop confocal.
Western Blotting
Untuk mengevaluasi ekspresi protein, BMSC dikultur pada TiO2 nanotube dipanen dengan tripsin (Gibco). Sel-sel dicuci tiga kali dengan PBS dan dilisiskan dengan buffer RIPA yang dilengkapi dengan koktail protease dan inhibitor fosfatase selama 30 menit di atas es. Lisat dikumpulkan dengan sentrifugasi pada 12.000×g selama 15 menit pada suhu 4°C. Konsentrasi protein total dalam supernatan diukur menggunakan kit uji protein asam bicinchoninic (BCA) (Beyotime) sesuai dengan instruksi pabrik. Loading buffer ditambahkan ke sampel protein seperti di atas, yang kemudian direbus pada 95 °C selama 15 menit. Untuk analisis Western blotting, 10 L preparat protein dimasukkan ke dalam gel SDS-PAGE 12,5% (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, USA) dan dielektroforesis pada 120 V selama 1 jam, kemudian dipindahkan secara elektro ke polivinildenedifluorida (PVDF) membran pada 250 mA selama 2 jam. Membran kemudian diblokir dengan 5-10% susu kering tanpa lemak dalam TBST selama 1 jam pada shaker pada suhu kamar dan diinkubasi dengan antibodi primer yang diencerkan dalam buffer pengenceran (Beyotime) pada suhu 4 ° C semalaman. Selanjutnya, antibodi sekunder terkonjugasi fluoresen yang diencerkan dalam buffer pengenceran ditambahkan ke membran setelah dicuci tiga kali dengan TBST selama 5 menit, dan membran kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dalam gelap. Pita protein dideteksi oleh sistem pencitraan fluoresensi inframerah dua warna (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, USA). Secara khusus, jika pita protein referensi internal disatukan, membran dilucuti dan diulang dengan antibodi primer lain, diikuti dengan proses yang sama. Kami menggunakan antibodi GAPDH sebagai protein referensi internal kami untuk menormalkan ekspresi protein, dan antibodi utama lainnya yang digunakan dalam penelitian ini adalah anti-vinculin (pengenceran 1:1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), anti-FAK (pengenceran 1:1000). , Teknologi Pensinyalan Sel, Danvers, MA, USA), anti-Runx2 (pengenceran 1:1000, Teknologi Pensinyalan Sel), anti-RhoA (pengenceran 1:1000, Teknologi Pensinyalan Sel), anti-F-aktin (pengenceran 1:500 , Abcam), anti-Osx (pengenceran 1:500, Abcam), dan anti-pYAP (pengenceran 1:1000, Teknologi Pensinyalan Sel). Antibodi sekunder adalah IgG H&L anti-tikus kambing (IRDye® 680RD, pengenceran 1:5000, Abcam) dan IgG H&L anti-kelinci kambing (IRDye® 680RD, pengenceran 1:5000, Abcam).
PCR Waktu Nyata Kuantitatif
PCR real-time kuantitatif dilakukan pada hari ke 7 untuk mengevaluasi ekspresi gen faktor transkripsi terkait kerdil 2 (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteocalcin (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculin (VCL), focal adhesion kinase (FAK), dan megakarioblastik leukemia 1 (MKL1) dalam sel yang ditumbuhkan dalam media osteogenik pada TiO2 nanotube. Total RNA diekstraksi dari sel menggunakan Total RNA Kit (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, USA). Konsentrasi dan kemurnian sampel RNA ditentukan oleh kerapatan optik pada panjang gelombang 260 dan hanya sampel yang menyajikan rasio A260/280 dan rasio A260/230 lebih tinggi dari 1,8 yang dianalisis. Sampel RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan kit Sintesis cDNA qScript (Takara, Shiga, Jepang) sesuai dengan instruksi pabrik. PCR waktu-nyata kuantitatif dilakukan dengan SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) menggunakan sistem PCR waktu-nyata QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH, gen pemeliharaan rumah, digunakan sebagai referensi internal. Data dianalisis menggunakan perbandingan Ct (2
-ΔΔCt
) dan dinyatakan sebagai perubahan lipat dibandingkan dengan kontrol. Urutan primer yang digunakan tercantum pada Tabel 1.
Analisis Statistik
Semua data mewakili setidaknya tiga percobaan independen menggunakan sampel rangkap tiga kecuali dinyatakan lain. Data dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antar kelompok dievaluasi dengan analisis varians satu arah diikuti dengan uji post-hoc Student-Newman-Keuls atau t tes. P nilai < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.
Hasil
Karakterisasi Permukaan
Untuk membuat nanotopografi, TiO2 nanotube dibentuk pada substrat titanium murni dengan menggunakan peralatan oksidasi anodik pada tegangan konstan yang berbeda (30, 40, 50, 60, dan 70 V) selama 1 jam (Gbr. 1). Sebuah array yang seragam dari nanotube rakitan sendiri diamati dengan memindai mikroskop elektron (SEM). Tampak samping dan atas dari nanotube ditunjukkan pada Gambar. 2a, b. Ketinggian nanotube pada semua sampel dalam penelitian ini sekitar 2 m, sedangkan diameter dalam nanotube sekitar 74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V). V), dan 148 nm (70 V) (Gbr. 2c). Hal ini menunjukkan bahwa tinggi nanotube berhubungan dengan waktu oksidasi anodik dan diameter dalam berhubungan dengan tegangan oksidasi anodik. Analisis dispersi energi sinar-X (EDS) kemudian dilakukan untuk menganalisis komposisi unsur nanotube. Hal ini menunjukkan bahwa nanotube hanya terdiri dari dua elemen, O dan Ti (Gbr. 2d, e). Mikroskop gaya atom (AFM) digunakan untuk mendeteksi struktur nanotubular dan mengukur penyimpangan rata-rata aritmatika dari profil nanotube sebagai kekasaran permukaan (Ra) (Gbr. 2f). Data menunjukkan bahwa kekasaran permukaan nanotube meningkat seiring dengan meningkatnya diameter (yaitu, tegangan oksidasi anodik) (Gbr. 2g).
Karakterisasi permukaan nanotube. a Tampak samping nanotube. Bilah skala:1 m. b Tampilan atas nanotube. Bilah skala:500 nm. c Diameter dalam nanotube pada lima tegangan konstan yang berbeda (30, 40, 50, 60, 70 V). d Komposisi elemen kimia EDS dari struktur nanotube. e Rasio elemen Ti dan O. f Mikroskop gaya atom (AFM) gambar struktur nanotube. g Kekasaran permukaan rata-rata (Ra) dari nanotube
TiO2 Diferensiasi Osteogenik yang Diinduksi Nanotube dari MSC
Setelah 7 hari osteoinduksi, pewarnaan ALP pertama kali dilakukan untuk mengevaluasi diferensiasi osteogenik MSC. Hasil pewarnaan menunjukkan bahwa MSC dikultur pada TiO2 nanotube memiliki aktivitas ALP yang lebih tinggi daripada sel yang dikultur pada substrat titanium halus (kelompok kontrol) (Gbr. 3a). Analisis statistik area pewarnaan menunjukkan bahwa kemampuan nanotube untuk menginduksi diferensiasi osteogenik meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok kontrol. Sementara itu, kami mengamati kecenderungan bahwa dalam rentang diameter percobaan ini, semakin besar diameter TiO2 nanotube, semakin kuat kemampuan untuk menginduksi diferensiasi osteogenik (Gbr. 3b). Dengan demikian kelompok 70 V digunakan dalam percobaan berikutnya untuk menampilkan hasil yang lebih baik. Selanjutnya, kami menganalisis ekspresi gen osteogenik pada hari ke 3 dan 7. MSC yang dikultur pada TiO2 nanotube selama 3 hari dan 7 hari keduanya menunjukkan promosi yang signifikan dari ekspresi gen osteogenik (RUNX2, ALP, OCN, dan OSX) dibandingkan dengan kelompok kontrol (Gbr. 3d-g). Hasil Western blot menegaskan bahwa ekspresi protein RUNX2 dan OSX juga meningkat setelah 7 hari osteoinduksi (Gbr. 3c). Menariknya, kami menemukan bahwa F-aktin diregulasi di TiO2 kelompok nanotube. Oleh karena itu, jelas bahwa TiO2 nanotube mengarahkan MSC ke arah diferensiasi osteoblas, yang terkait dengan diameter nanotube. Hasil kami juga menyarankan keterlibatan F-aktin dalam proses ini.
TiO2 nanotube meningkatkan ekspresi gen osteogenik BMSC. a Pewarnaan ALP dari substrat titanium halus dan lima substrat nanotube yang berbeda. Sel diinduksi dengan media osteogenik selama 7 hari. b Analisis statistik area pewarnaan dilakukan menggunakan ImageJ. c Protein terkait osteogenesis (RUNX2, dan OSX) dan F-aktin di MSC dianalisis dengan Western blotting pada hari ke 7. Ekspresi mRNA RUNX2 (d ), ALP (e ), OCN (f ), dan OSX (g ) pada hari ke 3 dan 7, dianalisis dengan qRT-PCR. NT kelompok nanotube. Data mewakili mean ± SD dari tiga sampel. *P <0,05, **P <0,01, dan ***P <0,001
Diferensiasi Osteoblas yang Dimediasi F-aktin dari MSC pada TiO2 Tabung nano
Untuk mengeksplorasi lebih lanjut apakah F-aktin terlibat dalam diferensiasi sel yang diinduksi nanotopografi, kami menggunakan dua reagen, jasplakinolide (Jasp) dan cytochalasin D (Cyto D), untuk mengatur polimerisasi F-aktin secara positif dan negatif masing-masing. Fotomikrograf confocal dari pewarnaan Rhodamin-Phalloidin menunjukkan bahwa F-aktin dalam kelompok perlakuan Cyto D hampir terdepolimerisasi dan struktur berserat jarang terlihat, sementara F-aktin yang distabilkan dan dipolimerisasi Jasp, diverifikasi oleh struktur seperti bundel yang lebih berbeda dan lebih terang daripada yang diamati. pada kelompok kontrol (Gbr. 5a). Selain itu, analisis Western blot juga menegaskan bahwa ekspresi protein F-aktin terpengaruh, yang membuktikan bahwa Cyto D dan Jasp keduanya bertindak seperti yang diharapkan (Gbr. 5b). Uji proliferasi sel menunjukkan bahwa Cyto D secara signifikan menghambat proliferasi sel, sementara Jasp mendorong pertumbuhan sel (Gbr. 4a). Hasil jumlah sel konsisten dengan temuan ini (Gbr. 4b).
Perakitan F-aktin mengatur ekspresi gen osteogenik dalam BMSC. a , b Proliferasi sel setelah pengobatan Cyto D dan Jasp ditentukan menggunakan uji CCK-8 atau penghitung sel otomatis pada hari 1, 2, dan 3. c , d Pewarnaan ALP dan analisis aktivitas ALP dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi ALP dalam MSC setelah perawatan obat selama 3 hari. Area pewarnaan dianalisis menggunakan ImageJ. c , e –h Western blotting dan qRT-PCR digunakan untuk membandingkan perubahan penanda terkait osteogenesis pada kelompok NT+ Cyto D dan kelompok NT+ Jasp dengan kelompok kontrol (tanpa terapi obat). NT kelompok nanotube. Data mewakili mean ± SD dari tiga sampel. *P <0,05, **P <0,01, dan ***P <0,001
Selanjutnya, kami mengevaluasi kemampuan MSC untuk berdiferensiasi menjadi osteoblas untuk menyelidiki apakah F-aktin memediasi proses ini. Kami pertama kali mendeteksi ALP sebagai penanda awal osteogenesis. Dibandingkan dengan kelompok kontrol, pengobatan Cyto D mengurangi ekspresi ALP dan aktivitasnya sementara pada kelompok perlakuan Jasp diregulasi (Gbr. 4c, d). Konsisten dengan hasil ini, pengobatan Jasp menghasilkan peningkatan kadar protein RUNX2 dan OSX sementara Cyto D memiliki efek sebaliknya (Gbr. 4c). Sesuai dengan ini, tingkat ekspresi mRNA dari gen-gen spesifik-osteo, termasuk RUNX2, ALP, OCN, dan OSX, menunjukkan tren yang sama setelah terapi obat (Gbr. 4e–h). Di atas segalanya, data ini menunjukkan bahwa F-aktin memainkan peran penting dalam proses diferensiasi osteogenik MSC yang diinduksi oleh TiO2 nanotube. Mempromosikan depolimerisasi F-aktin menghambat diferensiasi osteoblas yang diinduksi nanotopografi sementara stabilisasi dan polimerisasi F-aktin meningkatkan diferensiasi osteoblas.
Diferensiasi Osteoblas yang Diatur F-aktin dari MSC pada TiO2 Nanotube Melalui MKL1 dan YAP/TAZ
Untuk membedah mekanisme mendasar yang melibatkan F-aktin dalam regulasi nasib MSC, kami menyelidiki protein/molekul yang secara langsung berinteraksi dengan F-aktin atau memengaruhi polimerisasi F-aktin. Pertama, kami mencoba mengidentifikasi bagaimana nanotopografi memengaruhi keseimbangan antara F-aktin dan G-aktin. TiO2 nanotube sebagai sinyal fisik berbeda dari sinyal kimia membran-permeabel dan dengan demikian harus menggunakan beberapa komponen membran sel untuk mengirimkan rangsangan ke dalam sel. Bukti yang terkumpul menunjukkan bahwa kompleks adhesi fokal, termasuk integrin, talin, kinase adhesi fokal (FAK), vinculin (VCL), tensin, dan protein lainnya, berfungsi sebagai pembawa sinyal, yang menginformasikan sel tentang kondisi matriks ekstraseluler (ECM). ) dan dengan demikian mempengaruhi perilaku biologis mereka [22, 23]. Lebih penting lagi, F-aktin berikatan dengan integrin melalui kompleks adhesi fokal tersebut, dan dengan demikian membentuk hubungan mekanis antara bundel aktin intraseluler dan ECM [24]. Akibatnya, kami selanjutnya menganalisis ekspresi komponen kompleks adhesi fokus. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekspresi protein dan mRNA VCL dan FAK konsisten dengan perubahan F-aktin, menunjukkan bahwa kompleks adhesi fokal terlibat dalam proses diferensiasi osteogenik MSC yang diinduksi oleh TiO2 nanotube (Gbr. 5b dan 6a, b). Selain itu, kami juga menemukan bahwa RhoA, protein GTPase kecil dalam keluarga Rho dari GTPase, diregulasi pada kelompok perlakuan Jasp dan dihambat oleh Cyto D (Gbr. 5b dan 6a, b). RhoA adalah molekul transduksi sinyal hulu penting dalam jalur MAPK, dan dapat diatur oleh FAK [25, 26]. Fungsi utama RhoA adalah untuk mempromosikan polimerisasi dan stabilitas serat stres (F-aktin) dan perakitan kompleks adhesi fokus [27]. Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa TiO2 nanotube dapat mempengaruhi polimerisasi F-aktin melalui kompleks adhesi fokal dan RhoA.
Pewarnaan imunofluoresensi mengungkapkan tingkat F-aktin dengan pewarnaan dengan phalloidin terkonjugasi rhodamin (a ). The protein expression of FAK and VCL contained in the focal adhesion complex, RhoA and phosphorylated YAP were investigated by Western blotting (b ). NT the nanotubes group
Effect of F-actin assembly on FAK (a ), vinculin (VCL) (b ), RhoA (c ), MKL1 (d ), YAP (e ), and TAZ (f ) gene expression in MSCs. NT the nanotubes group. Data represent the mean ± SD of three samples. *P <0,05, **P <0.01, and ***P <0,001
But how does F-actin regulate cell fate? Most studies have demonstrated that F-actin is involved in cell migration, cell division, endocytosis, and especially tumor cell invasion [28,29,30]. Few studies have suggested that F-actin could also regulate cell differentiation, let alone its specific molecular mechanism [31, 32]. Consequently, we searched for articles that mentioned the F-actin changes and found that YAP/TAZ, two closely related transcriptional co-activators in the Hippo signaling pathway, which shuttle between the cytoplasm and the nucleus, may serve as mechanotransducers in regulating MSC differentiation [33,34,35]. In addition, we also found that MKL1, a key regulator of smooth muscle cell differentiation, which interacts with the transcription factor serum response factor, could bind to G-actin and also circulate between the cytoplasm and the nucleus [21, 36]. Our results ultimately identified the involvement of YAP/TAZ and MKL1 in nanotube-induced osteoblast differentiation mediated by F-actin (Figs. 5b and 6d–f). Interestingly, the protein expression of phosphorylated YAP showed the opposite trend, indicating that not only was the expression of YAP changed, but the phosphorylation of YAP was also changed by Cyto D and Jasp (Fig. 5b). This result was consistent with the report that the phosphorylation of YAP/TAZ could be sequestrated in the cytoplasm [35].
In summary, our results preliminarily demonstrated that F-actin regulated osteoblast differentiation of MSCs on TiO2 nanotubes through MKL1 and YAP/TAZ (Fig. 7).
Schematic representation of F-actin assembly induced by nanotubes, and the putative role of MKL1 and YAP/TAZ in acting as the downstream mediators of F-actin signaling to regulate gene expression
Diskusi
Titanium and titanium alloys are the most widely used metal materials in orthopedic clinical implants due to the good properties of titanium [3]. However, aseptic loosening is still an urgent problem to be solved and improved, and the key is likely to lie in improving the integration of the implant and the host bone. Previous studies have shown that surface coating and modification or immobilization of biofunctional molecules will be beneficial to osseointegration [37]. Recently, the surface topography of implants has attracted the attention of many researchers thanks to studies into the cell response to physical cues [9,10,11, 13, 38]. In this study, we demonstrated the ability of nanotubes to promote osteogenic differentiation of MSCs, and this ability was enhanced with increasing inner diameter of the nanotubes (30–70 V). This will help guide the diameter of the nanotubes on the surface of the implants.
As a topographical structure, nanotubes first change the physical properties of the material, such as adsorption capacity and electrical and thermal conductivity. These physical properties determine their application in the industrial field. For example, most high-voltage power transformers need to be filled with insulating material, which is usually transformer oil or insulating gas. When the insulation of a transformer fails due to overheating and partial discharge, a serious discharge accident will occur. Therefore, finding an effective method that accurately detects the concentration and types of dissolved gases or insulating gas decomposition components in a transformer is necessary to monitor the operating state of the transformer [8, 39,40,41]. The traditional approach is to look for materials with good gas adsorption in transition elements, which are rich in d electrons, such as Pd(1 1 1) [39]. Nowadays, nanotubes are widely studied for their good gas adsorption properties. Dia dkk. found that CuO-BNNT was suitable for the adsorption of C2 H2 , because of its stronger adsorption on C2 H2 [8]. Meanwhile, TiO2 itself can be a gas-sensing material. Gui et al. found that Co-doped TiO2 further enhanced gas adsorption capacity and exhibited a superior adsorption ability and conductivity change toward C2 H4 molecules [40]. Consistent with this study, Mn-doped graphene also exhibited enhanced conductivity and superior capability of C2 H2 and CO detection than pristine graphene [41]. The above research indicates that the TiO2 nanotubes prepared in our experiment have a potential application in the field of monitoring the operative state of a transformer. However, the adsorption capacity and electrical conductivity of the nanotubes to gases need to be further studied, especially whether these properties are enhanced after doping with transition elements (e.g., Mn).
In addition to changing the physical properties of a surface, nanoscale morphology also affects the biological behavior of the cells attached to it. Cells first adhere to the surface of the material and then migrate, proliferate, and differentiate. Compared to a flat surface, the hollow structure of the nanotubes provides fewer adhesion sites for cells. Therefore, in order for the cells to adhere to the nanotube surface steadily and maintain the biomechanical balance within the cell, the focal adhesion complex begins to assemble and mature, and F-actin becomes strong and stable.
F-actin, a linear polymer microfilament consisting of G-actin monomers, is one of the three major components of the cytoskeleton. As a mechanical-loading structure, F-actin is generally believed to be involved in cell division, cell migration, endocytosis, and tumor cell invasion [28,29,30], but some recent studies showed that it can also affect cell differentiation [31,32,33, 36]. For example, actin cytoskeletal depolymerization by simvastatin induces chondrocyte differentiation [31], and actin depolymerization enhances adipogenic differentiation in human stromal stem cells [32]. Our results also revealed that, compared with the control group, MSCs cultured on nanotubes had higher F-actin levels and a more obvious fibrous structure. Meanwhile, promotion of F-actin polymerization by Jasp enhanced osteogenic differentiation, while the depolymerization of F-actin inhibited osteogenic differentiation, suggesting that F-actin mediates TiO2 nanotube-induced osteoblastic differentiation of MSCs.
F-actin can be regulated by Rho GTPases, members of the Ras superfamily [23, 42], and Rho can induce actin reorganization through at least two effectors, ROCK and Dia. ROCK is activated by binding to Rho-GTP and then myosin light chain (MLC), the substrate of ROCK, plays an important role in F-actin assembly. ROCK inhibits the activity of MLC phosphatase, leading to an increase in MLC phosphorylation, which stimulates the ATPase activity of myosin II and promotes the assembly of F-actin. In addition, ROCK also targets LIM kinase (LIMK). Phosphorylated LIMK inactivates cofilin by phosphorylation, which can disassemble F-actin in its active state. Another effector is Dia, a member of the formin-homology (FH) family of proteins which contains two FH domains. These domains contain multiple proline-rich motifs which bind to the G-actin-binding protein, profilin. This interaction contributes to actin polymerization and F-actin organization [42]. We detected one of the Rho GTPases, RhoA, and found that the expression of RhoA was consistent with the level of F-actin. However, we were unable to clearly describe how the nanotubes regulate the expression of RhoA, because there are many other regulators, including integrin signaling, other adhesion receptors, G protein-coupled receptors (GPCRs), soluble factors such as LPA, receptor tyrosine kinase signaling, and so on [43].
Knowing that F-actin can be regulated by RhoA, we next asked what role focal adhesion played in this process, because focal adhesion complexes, containing integrins, talin, vinculin, paxillin, and focal adhesion kinase (FAK), are formed and mature when cells attach to the surface of nanotubes. Integrins are transmembrane heterodimers that couple the ECM to the other focal adhesion proteins so as to facilitate cell attachment. They not only act simply as hooks but also transmit to the cell critical signals about the nature of its surroundings, which along with other signals such as EGFR, prompt the cell to make decisions about its biological behaviors. These signals are further transmitted to F-actin, which is directly connected to the focal adhesion complexes. On the one hand, the nanoscale morphology causes focal adhesion complex assembly and maturation. On the other hand, kinases such as FAK and Src kinase family members will recruit molecules such as CRK to self-regulate the assembly and maturation of focal adhesion complexes [44,45,46]. Our results demonstrated that the formation and maturation of focal adhesion complexes were impaired by F-actin depolymerization, suggesting that there was a feedback from focal adhesion complexes to actin assembly in line with published reports.
However, it should not be ignored that these proteins contained in focal adhesion complexes have the function of signal transduction [47]. That is to say, nanotubes may directly regulate gene expression through signal cascades, and F-actin may just participate in or be affected by this process. For instance, the dual kinase complex of FAK and Src can regulate Rho GTPases such as RhoA. This shows that nanotubes can regulate RhoA through integrins and the FAK/Src complex. In addition Src, a non-receptor tyrosine kinase protein, can activate Ras (small GTPase) by phosphorylating FAK at tyrosine residue 925 [47, 48]. Then, Ras activates numerous biochemical pathways, including the well-studied MAPK pathway and the PI3K/AKT/mTOR pathway. In the MAPK pathway, Ras activates c-Raf, followed by mitogen-activated protein kinase kinase (MAP2K) and then MAPK1/2, also known as extracellular signal-regulated kinase (ERK). ERK in turn activates transcription factors such as serum response factor (SRF) and c-Myc that are involved in regulating growth and differentiation [49]. What is more, Runx2, a key transcription factor in osteogenic differentiation, can also be regulated by ERK [50], and our previous study confirmed that mechanical strain promoted osteogenic differentiation of BMSCs through the FAK-Erk1/2-Runx2 pathway [17]. Therefore, we cannot rule out that ERK plays a role in nanotube-induced osteogenic differentiation and further study is still needed.
So what exactly is the role of F-actin in inducing differentiation of nanotubes, because its change can affect cell differentiation? One possibility is that the change of F-actin assembly can inversely regulate the level of FAK so as to induce osteogenic differentiation through the FAK-Erk1/2-Runx2 pathway as described above, because in our results, focal adhesion complexes and actin polymerization showed the same trends of change, indicating that they act as a whole in response to the extracellular environment. However, some other possibilities also exist, and a number of articles have shown that MKL1 and YAP/TAZ act downstream of the actin dynamic balance [20, 51,52,53,54]. Both of them shuttle between the cytoplasm and the nucleus, and may help to transduce signals from the cytoskeleton to the nucleus.
MKL1, also termed myocardin-related transcription factor A, is sensitive to changes in G-actin levels. When cytoplasmic G-actin levels increase, monomeric G-actin binds to MKL1 and prevents it from binding to SRF and activating transcription. SRF target genes include actins such as smooth muscle actin (SMA) as well as other actin-binding proteins, including immediate early genes like c-fos and egr1. Recent studies have demonstrated that changing SRF activity could regulate adipogenesis by activating the adipogenesis transcription factor peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ), and also regulate bone formation via IGF-1 and Runx2 signaling [55, 56].
YAP and TAZ are two transcriptional coactivators in the Hippo signaling pathway, identified as an important regulatory pathway that restricts cell proliferation, thereby controlling organ size and morphogenesis [20]. Large tumor suppressor genes 1 and 2 (LATS1/2) phosphorylate them, thereby creating a binding site for 14-3-3 proteins, the binding of which prevents their nuclear import [53, 54]. As a consequence, phosphorylated forms of YAP/TAZ are sequestered in the cytoplasm, preventing the expression of genes like Ctgf and Areg. In addition, some studies have shown that YAP/TAZ can interact with T-box 5 (TBX5), RUNX2, and p73 to regulate gene expression [57,58,59]. Further, cell adhesion to cell matrix proteins has been shown to trigger YAP nuclear localization through an integrin/FAK/Src axis. In our study, the results suggested that this pathway was possibly involved in nanotube-induced differentiation. Further study into the downstream mediators of the integrin/FAK/Src axis should be carried out to clarify the specific mechanism.
On the other hand, more and more studies illustrate that F-actin interacts with Hippo signaling, and somehow inhibits the phosphorylation of YAP [54, 60], which is consistent with our experimental results that promoting F-actin polymerization reduces the expression of phosphorylated YAP. We hypothesize that ATP involved in the process of the transformation between G-actin and F-actin may also play an important role in the phosphorylation of YAP, which is yet to be studied.
After understanding the above possible molecular mechanisms, we can try to explain some of the experimental phenomena found in this study. Our results revealed that the larger the diameter of the nanotubes, the stronger the ability of the nanotubes to promote osteogenic differentiation. This is consistent with previous research [61, 62]. The reason for this phenomenon is that the larger the diameter of the nanotubes, the less adhesion sites they can provide to the cells, and the greater the assembly and maturity of focal adhesion complexes. Along with these, stress fibers made of F-actin will have greater strength and stability. These structures enhance the signaling that promotes osteogenic differentiation. Predictably, however, this effect is significantly reduced when the nanotubes become too large in diameter, making it difficult for the cells to adhere to the surface [12]. Similarly, when the height of the nanotubes is inconsistent, the differences in height can result in a change of adhesion site and rearrangement of the cytoskeleton, which will further affect cell differentiation. Intriguingly, even flat surface materials without nanotube modification can induce changes in cell differentiation. A number of studies have demonstrated that focal adhesion formation and stress fiber organization are regulated by substrate stiffness [63,64,65], and YAP/TAZ also plays an important role in this process. Therefore, it is obvious that the integrins–FAs (focal adhesions)–F-actin axis plays a role in the transduction of physical signals into intracellular chemical signals.
In summary, our results demonstrated that F-actin regulates osteoblastic differentiation of mesenchymal stem cells on TiO2 nanotubes through MKL1 and YAP/TAZ, whose target genes partly explained the proliferation and differentiation of MSCs. We know that there is no single change in the signal network and any change is regulated by numerous molecules and proteins. One type of biological behavior must be the result of the regulation of a series of signaling pathways. Nanotubes induce cell differentiation by triggering a complex network of signals, including integrins, proteins contained in focal adhesion complexes, FAK, Src, Rho GTPase, the MAPK pathway, the Hippo pathway, and other reported signaling pathways. At least as important, there are many signal cycles in the signal network and a downstream signal can regulate the upstream signal via feedback. In this study, we found that vinculin and FAK can be regulated backwards by F-actin assembly, increasing the uncertainty of molecular function. Therefore, more details of the molecular mechanism await further study.
Kesimpulan
Our results showed that TiO2 nanotubes promoted the osteogenic differentiation of MSCs, and this ability was enhanced with the increasing diameter of nanotubes within a certain range (30–70 V). F-actin mediated nanotube-induced cell differentiation through MKL1 and YAP/TAZ, providing a novel insight into the study of cell differentiation.
Ketersediaan Data dan Materi
The datasets used and analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.
