F-Aktin Memediasi Diferensiasi Osteogenik Sel Stem Mesenkimal pada Nanotipa TiO2 melalui MKL1 dan YAP/TAZ
Abstrak
Titanium dan legas titanium banyak digunakan dalam implant orthopedic. Modifikasi nanotopografi menyediakan strategi baru untuk meningkatkan oseointegrasi substrat titanium. Polimerisasi aktin filamen (F-aktin), sebagai struktur beban mekanik, umumnya dianggap terlibat dalam migrasi sel, endositosis, pembagian sel, dan pemeliharaan bentuk sel. Apakah F-aktin terlibat dan bagaimana ia berfungsi dalam diferensiasi osteogenik yang diinduksi nanotipa pada sel stem mesenkimal (MSC) masih perlu diungkapkan. Dalam studi ini, kami membuat nanotipa TiO2 pada permukaan substrat titanium melalui oksidasi anod dan memaparkan fitur-fiturnya oleh mikroskop elektron pemindai (SEM), analisis energi dispersif sinar X (EDS), dan mikroskop gaya atom (AFM). Pewarnaan fosfat alkali (ALP), Western blotting, qRT-PCR, dan pewarnaan imunofluoresensi dilakukan untuk menjelajahi potensi osteogenik, tingkat F-aktin, dan ekspresi MKL1 dan YAP/TAZ. Hasil kami menunjukkan bahwa diameter dalam dan kekasaran nanotipa TiO2 meningkat seiring bertambahnya tegangan oksidasi anod dari 30 hingga 70 V, sementara tingginya konsisten sebesar 2 μm. Lebih jauh, semakin besar diameter tab, semakin kuat kemampuan nanotipa TiO2 untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC. Melakukan inhibisi polimerisasi F-aktin oleh Cyto D menghambat diferensiasi osteogenik MSC serta ekspresi protein yang terkandung dalam kompleks adhesi fokus seperti vinculin (VCL) dan kinas adhesi fokus (FAK). Sebaliknya, setelah perawatan Jasp, polimerisasi F-aktin meningkatkan ekspresi RhoA dan faktor transkripsi YAP/TAZ. Berdasarkan data ini, kami menyimpulkan bahwa nanotipa TiO2 memfasilitasi diferensiasi osteogenik MSC, dan kemampuan ini ditingkatkan seiring bertambahnya diameter nanotipa dalam rentang tertentu (30–70 V). F-aktin memediasi proses ini melalui MKL1 dan YAP/TAZ.
Pendahuluan
Titanium dan legas titanium, karena biokompatibilitas, daya tahan korosi, dan properti mekanik yang unggul, banyak digunakan dalam aplikasi klinis seperti penggantian sendi total dan implant gigi [1,2,3]. Namun, masih banyak tantangan yang harus diatasi, termasuk longgaran aseptic dan infeksi [4, 5]. Dalam beberapa tahun terakhir, sejumlah studi yang bertujuan untuk meningkatkan oseointegrasi dan properti antibakteri telah dilakukan. Misalnya, lapisan MoS2/PDA-RGD pada implant titanium tidak hanya dapat mempromosikan integrasi implant titanium dengan tulang gastan tetapi juga dapat menghambat pertumbuhan bakteri dengan efisiensi tinggi [6]. Selain itu, topografi permukaan telah menarik perhatian yang semakin besar, dan modifikasi topografi berbeda dari modifikasi kimia dengan hanya mengubah struktur mikro- dan nano-skala. Stimulasi sinyal kimia pada sel tidak stabil dan sitotoksik. Dalam perbandingan, sinyal fisik yang aman dan dapat dikontrol dapat menghindari beberapa efek samping yang disebabkan oleh molekul kimia. Oleh karena itu, modifikasi topografi permukaan implant dan pengaturan oseointegrasi melalui struktur topografi dapat memberikan cara baru untuk memecahkan masalah klinis oseointegrasi yang buruk setelah implantasi prostesis.
Dalam bidang rekayasa jaringan tulang dan regenerasi tulang, interaksi sel-morfologi dianggap sebagai strategi manajemen yang menjanjikan untuk kontrol presisi fungsi dan diferensiasi sel benih. Pada saat yang sama, tulang itu sendiri memiliki hierarki yang elegan dalam rentang nanometer dan mikron [7]. Oleh karena itu, morfologi permukaan dapat memberikan niche yang serupa, yang dapat meniru struktur tulang alami dan mempromosikan diferensiasi osteogenik sel stem mesenkimal pada permukaan tulang gastan dan implant. Morfologi permukaan dapat terdiri dari banyak struktur yang berbeda, termasuk nanotipa, nanowire, nanopori, dan sebagainya. Khususnya, array nanotipa telah menarik minat yang luas dalam banyak bidang dalam beberapa tahun terakhir karena karakteristik permukaan uniknya, seperti rasio luas permukaan-volume yang tinggi, plastisitas biologis, dan kapasitas adsorpsi yang tinggi. Misalnya, studi baru menunjukkan bahwa nanotipa nitrida boron (BNNT) merupakan materi sensitif gas yang dapat digunakan sebagai sensor gas untuk memantau operasi transformator dengan mendeteksi komposisi dan kandungan gas terlarut dalam minyak [8]. Dalam biomedis, topografi permukaan juga dapat mengarahi perilaku sel, termasuk migrasi sel, adhesi, proliferasi, dan diferensiasi. Studi terbaru mengungkapkan bahwa topografi skala nano dapat mengarahi sel stem mesenkimal (MSC) untuk berdiferensiasi menjadi osteoblast sehingga memperkuat oseointegrasi awal [9,10,11,12]. Bahkan dilaporkan bahwa modifikasi permukaan gabungan mikro- dan nano-skala dapat menyebabkan MSC berdiferensiasi menjadi sel otot licin kontraksif [13]. Namun, mekanisme molekuler bagaimana topografi permukaan mengarahi nasib sel masih perlu diungkapkan, yang penting untuk evaluasi keamanan materi dan desain materi.
Aktin filamen (F)-aktin, juga disebut mikrofilamen, adalah salah satu tiga komponen utama sitoskeleton di sel eukaryot. Ia terdiri dari polimer globular (G)-aktin, yang dimodifikasi oleh banyak protein lainnya. F-aktin memiliki polaritas struktural karena semua subunit mikrofilamen menunjuk ke ujung yang sama. Ujung barbed diarahkan ke monomernya yang berbeda, sementara ujung pointed memiliki subunit aktin dengan situs bind ATP yang terbuka. Itu, ATP terlibat dalam proses transformasi antara G-aktin dan F-aktin. Proses ini dalam kesetimbangan dinamis, dengan polimerisasi dan depolimerisasi terjadi secara bersamaan, juga dikenal sebagai treadmilling, sering dilihat pada lamelipodia dan filopodia [14]. Oleh karena itu, jelas bahwa dinamika aktin memainkan peran penting dalam fungsi sel seperti migrasi sel, pembagian sel, dan pemeliharaan bentuk sel. Namun, F-aktin tidak hanya bertindak sebagai struktur fisik yang mendukung beban mekanik tetapi juga berpartisipasi dalam perilaku biologis lainnya seperti transduksi sinyal dan ekspresi gen. Bukti yang semakin berkumpul menunjukkan bahwa F-aktin dapat mengubah sinyal fisik menjadi sinyal kimia dengan berinteraksi dengan protein lain [15,16,17,18]. Misalnya, rekonstruksi biomekanik dan geometri mempromosikan apoptoosis sel tumor dengan mencegah superposisi polimerisasi monomernya aktin menjadi F-aktin [15]. Pulsa ultrasound meningkatkan osteogenesis sel stem mesenkimal manusia dengan menghambat depolimerisasi F-aktin [16]. Studi kami sebelumnya juga menunjukkan bahwa regangan mekanis meningkatkan stabilitas F-aktin [17]. Karena struktur rongga nanotipa menyediakan lebih sedikit situs adhesi untuk sel, rearrangemen sitoskeleton tidak dapat dihindari untuk menjaga keseimbangan biomekanik. Akibatnya, kami tentu memiliki alasan untuk percaya bahwa F-aktin kemungkinan memediasi diferensiasi sel yang diinduksi oleh nanotopografi.
Dalam studi ini, kami membuat nanotipa TiO2, memodifikasi topografinya melalui oksidasi anod, dan mengeksplorasi kemampuannya untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC. Selanjutnya, kami menyelidiki apakah F-aktin memainkan peran krusial dalam mekanotransduksi. Cytochalasin D (Cyto D), yang secara kompetitif bind ke ujung barbed F-aktin untuk mencegah G-aktin tergabung ke dalam filamen, digunakan untuk menghambat polimerisasi F-aktin, dan jasplakinolide (Jasp) digunakan untuk meningkatkan stabilisasi perakitan aktin. Selain itu, kami juga ingin mengungkapkan bagaimana F-aktin berfungsi dalam mengubah petunjuk fisik menjadi sinyal biokimia. Berdasarkan hasil studi kami sebelumnya, kami berhipotesis bahwa jalur MAPK mungkin terlibat dalam proses ini [17]. Faktor transkripsi seperti protein Yes-associated (YAP)/koaktivator transkripsi dengan motif binding PDZ (TAZ) dan MKL1, yang dianggap sebagai sensor mekanik dan transduser mekanik, juga menjadi subjek studi kami untuk menyaring bagaimana F-aktin mempengaruhi nasib sel stem, karena beberapa studi di bidang lain menyiratkan bahwa mereka terkait dengan F-aktin [19,20,21]. Secara umum, kami berharap untuk menjelaskan peran F-aktin dalam proses diferensiasi sel stem yang diinduksi oleh nanotipa, guna memandu desain materi dan evaluasi biosafety implant yang dimodifikasi oleh nanotipa.
Bahan dan Metode
Pembuatan Nanotipa TiO2
Irisan titanium murni (kemurnian 99,9%, ketebalan 2 mm; Shengshida, Hebei, Tiongkok), digunakan sebagai substrat, dipoleskan dengan kertas abrasif karbida silikon No. 400 dan 1500 grit. Sampel kemudian dicuci secara berurutan dengan asetona, alkohol anhidra, dan air deion dalam mesin cuci ultrasonik, dan akhirnya dikeringkan pada suhu kamar selama 3 jam. Untuk membuat nanotopografi, sampel yang telah diproses ditempatkan sebagai anoda, sementara menggunakan irisan platinum sebagai katoda lawan dalam larutan elektrolit air 0,15 M NH4F dan 90% glikol selama 1 jam. Tegangan oksidasi anod adalah tegangan konstan 30, 40, 50, 60, atau 70 V. Setelah oksidasi anod, setiap sampel dibersihkan dengan air deion selama 30 min dan dicuci dengan alkohol anhidra dalam mesin cuci ultrasonik selama 15 min. Akhirnya, semua sampel sterilisasi dalam autoklaf pada 120 °C selama 1 jam lalu dibasahi dengan medium kultur sebelum digunakan.
Mekanisme reaksi pembuatan nanotipa tidak jelas, dan teori mainstream saat ini adalah teori pelepasan yang ditingkatkan medan. Pembentukan array nanotipa adalah hasil dari kesetimbangan dinamis di bawah tindakan oksidasi medan, pelepasan medan, dan pelepasan kimia (Gambar 1b). Proses oksidasi anod dapat dijelaskan sebagai berikut: pada langkah pertama, lapisan penghalang oksida terbentuk pada antarmuka elektrolit–logam:
Grafik ringkasan studi kami. a Diagram alur yang menunjukkan oksidasi anod dan induksi diferensiasi sel. b Substrat titanium yang telah diproses ditempatkan sebagai anoda dalam larutan elektrolit air dengan 0,15 M NH4F dan 90% glikol pada tegangan konstan selama 1 jam. Nanotipa yang tersusun mandiri diperkirakan terbentuk secara merata. Mekanisme reaksinya dijelaskan dalam bahan dan metode. c Diagram skematis mekanisme diferensiasi osteogenik sel stem yang diinduksi oleh nanotipa
Kemudian retakan dan celah sempit muncul pada permukaan karena pelepasan yang ditingkatkan medan dari lapisan oksida. Difusi ion F− ke dalam retakan dan celah ini meningkatkan laju pelepasan. Retakan membesar dan terhubung dengan retakan tetangga. Akhirnya, laju pembentukan dan laju pelepasan lapisan oksida titanium mencapai kesetimbangan dinamis, dan nanotipa tidak lagi tumbuh:
Sampel yang dibuat dengan berbagai tegangan (30, 40, 50, 60, atau 70 V) dibersihkan dengan etanol dan air deion selama 15 min, kemudian dikeringkan pada suhu kamar. Mikroskop elektron pemindai (SEM450, FEI Nova Nano SEM; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS) digunakan untuk mengkarakterisasi struktur permukaan, dan untuk mengukur diameter dalam dan tinggi nanotipa setelah melapisi sampel dengan lapisan tipis emas. Sementara itu, analisis energi dispersif sinar X (EDS) dilakukan untuk menganalisis komposisi elemen nanotipa. Mikroskop gaya atom (AFM, NanoManVS, Bruker Nano Surfaces, Bruker MicroCT, Kontich, Belgia) digunakan untuk menyelidiki morfologi permukaan dan kekasaran permukaan sampel. Tiga area berbeda dipilih dari setiap sampel dan pengukuran diulang tiga kali.
Kultur Sel
Tikus Sprague-Dawley (SD) jantan berusia empat minggu dibeli dari pusat hewan percobaan Rumah Sakit Umum Kedokteran Keseluruhan Kedokteran Shanghai Kesembilan (Shanghai, Tiongkok). Sel stem mesenkimal sumsum tulang tikus (BMSCs) diisolasi secara aseptic dari femur dan tibia. BMSCs dipurnikan dan diperluas lebih lanjut dalam medium α-minimal essential (α-MEM; Hyclone, Logan, UT, AS) yang mengandung 10% (v/v) serum fetus sapi (FBS) (Gibco/Life Technologies, Carlsbad, CA, AS), 100 mg/mL streptomisin (Gibco), dan 100 U/mL penicilin (Gibco), dan diinkubasi pada 37 °C dalam atmosfer lembap yang terdiri dari 95% udara dan 5% CO2. Medium kultur diperbarui setiap 2 hari, dan sel ditripsin dan dibudidayakan ulang pada 80% konfluensi. Semua sel yang digunakan dalam studi ini berada antara passase 3 dan 5. Medium induksi osteogenik terdiri dari medium pertumbuhan yang ditambahkan 100 nM deksametason, 10 mM β-giserfosfat, dan 50 mM asam askorbat (Sigma–Aldrich, St Louis, MO, AS).
Assay Proliferasi Sel
Irisan titanium yang dimodifikasi nanotipa TiO2 dipotong menjadi bentuk lingkaran dan ditempatkan ke dalam wells dari plate kultur sel 24-well. BMSCs antara passase 3–5 dibudayakan pada nanotipa TiO2 dengan densitas 3 × 104 sel/disc dalam medium pertumbuhan atau medium osteogenik. Setelah 2 hari kultur sel, cytochalasin D (Cyto D, Sigma–Aldrich) dan jasplakinolide (Jasp, Sigma–Aldrich), yang digunakan untuk mengganggu polimerisasi F-aktin, ditambahkan ke dalam medium setiap hari selama 3 hari. Konsentrasi akhir dan waktu kerja Cyto D dan Jasp masing-masing 5 μM, 1 jam dan 2 μM, 3 jam. Medium kultur diperbarui setelah inkubasi dengan reagensi. Kehidupan dan proliferasi sel dievaluasi menggunakan assay Cell Counting Kit-8 (CCK8) (Dojindo, Kumamoto, Jepang) 12 jam setelah perawatan Cyto D atau Jasp. Sel diinkubasi dengan larutan CCK8 10% (v/v) selama 2 jam dalam inkubator sel pada 37 °C di bawah 5% CO2. Kemudian kami mentransfer 100 μL campuran reaksi ke dalam wells plate 96-well dan absorbansi (OD) produk warna formazan dalam kultur diukur pada 450 nm menggunakan spektrofotometer UV–visible Multiscan (Safire2; TECAN, Mannedorf, Swiss). Selain itu, kami juga menghitung jumlah sel yang mendekati menggunakan counter sel otomatis (AMQAX1000, Life Technologies). Sebelum menghitung sel, BMSCs dilepas secara enzimatik dari nanotipa TiO2 dan diwarnai dengan Trypan blue (Sigma–Aldrich).
Pewarnaan Fosfat Alkali dan Analisis Aktivitas ALP
BMSCs ditanam pada lima irisannya titanium yang dimodifikasi nanotipa TiO2 yang berbeda (30, 40, 50, 60, atau 70 V) dengan densitas 3 × 104 per well dan dibudayakan dalam medium osteogenik. Reagen ditambahkan seperti yang dijelaskan di atas. Setelah 7 hari inkubasi, BMSCs yang dibudayakan pada nanotipa TiO2 dicuci tiga kali dengan PBS, diperbaiki dengan paraformaldehida 4%, dan diinkubasi dalam larutan kerja fosfat alkali (ALP) dari kit ALP sesuai dengan petunjuk produsen (Hongqiao, Shanghai, Tiongkok). Hasilnya diamati di bawah mikroskop stereo setelah dicuci dengan PBS.
Untuk analisis aktivitas ALP, sel pertama kali dilisis dengan buffer RIPA tanpa inhibi protease dan fosfatase, dan kemudian lisat yang di sentrifugasi dianalisis menggunakan kit Assay ALP (Beyotime Institute of Biotechnology, Jiangsu, Tiongkok) sesuai dengan protokol yang disediakan. Aktivitas akhirnya dinormalisasi terhadap konsentrasi protein lisat yang sesuai.
Imunocytochemistry
Setelah 3 hari perawatan Cyto D dan Jasp, BMSCs diperbaiki dengan paraformaldehida 4% selama 20 menit pada suhu kamar dan kemudian dicuci tiga kali dengan PBS. Sel diaktifkan dengan Triton-X 100 0,3% selama 30 menit, dicuci tiga kali dengan PBS, dan diwarnai dengan phalloidin yang dikonjugasi Rodamin selama 1 jam pada suhu kamar dalam kegelapan. Kemudian sel dibersihkan dengan PBS, dan diwarnai kembali dengan DAPI (Beyotime Institute of Biotechnology) selama 10 menit pada suhu kamar. Setelah tiga kali pencucian tambahan dengan PBS, sampel ditempel pada kaca slide dan diamati oleh mikroskop konfokal.
Western Blotting
Untuk mengevaluasi ekspresi protein, BMSCs yang dibudayakan pada nanotipa TiO2 diambil dengan tripsin (Gibco). Sel dicuci tiga kali dengan PBS dan dilisis dengan buffer RIPA yang dilengkapi dengan koctail inhibi protease dan fosfatase selama 30 menit pada es. Lisat dikumpulkan oleh sentrifugasi pada 12.000×g selama 15 menit pada 4 °C. Konsentrasi protein total dalam supernat diukur menggunakan kit assay protein asam bisinokotinat (BCA) (Beyotime) sesuai dengan petunjuk produsen. Buffer loading ditambahkan pada sampel protein di atas, yang kemudian direbus pada 95 °C selama 15 menit. Untuk analisis Western blotting, 10 μL persiapan protein dimuat pada gel SDS-PAGE 12,5% (EpiZyme Inc., Cambridge, MA, AS) dan mengalami elektroforesis pada 120 V selama 1 jam, kemudian ditransfer elektro pada membran polyvinylidenedifluorida (PVDF) pada 250 mA selama 2 jam. Membran kemudian diblokir dengan susu krim tanpa lemak 5–10% dalam TBST selama 1 jam pada pengayut pada suhu kamar dan diinkubasi dengan primer antibody yang diencerkan dalam buffer pengenceran (Beyotime) pada 4 °C selama malam hari. Selanjutnya, secondary antibody yang dikonjugasi fluorescein yang diencerkan dalam buffer pengenceran ditambahkan pada membran setelah dicuci tiga kali dengan TBST selama 5 menit, dan membran kemudian diinkubasi pada suhu kamar selama 1 jam dalam kegelapan. Band protein terdeteksi oleh sistem citra fluoresensi inframerah dua warna (Odyssey, LiCor Biosciences, Lincoln, NE, AS). Khususnya, jika band protein referensi internal terpadu, membran dicabut dan diulangi dengan primer antibody lain, diikuti oleh proses yang sama. Kami menggunakan antibody GAPDH sebagai protein referensi internal untuk menormalisasi ekspresi protein, dan primer antibody lain yang digunakan dalam studi ini adalah anti-vinculin (1:1000 pengenceran, Abcam, Cambridge, MA, AS), anti-FAK (1:1000 pengenceran, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, AS), anti-Runx2 (1:1000 pengenceran, Cell Signaling Technology), anti-RhoA (1:1000 pengenceran, Cell Signaling Technology), anti-F-aktin (1:500 pengenceran, Abcam), anti-Osx (1:500 pengenceran, Abcam), dan anti-pYAP (1:1000 pengenceran, Cell Signaling Technology). Secondary antibody adalah kambing anti-mouse IgG H&L (IRDye® 680RD, 1:5000 pengenceran, Abcam) dan kambing anti-rabbit IgG H&L (IRDye® 680RD, 1:5000 pengenceran, Abcam).
Quantitative Real-Time PCR
Quantitative real-time PCR dilakukan pada hari 7 untuk mengevaluasi ekspresi gen faktor transkripsi terkait runt 2 (Runx2), Osterix (Osx), Alp, osteokalcin (OCN), RhoA, YAP, TAZ, vinculin (VCL), kinas adhesi fokus (FAK), dan megakaryoblastic leukemia 1 (MKL1) dalam sel yang tumbuh dalam medium osteogenik pada nanotipa TiO2. Total RNA diekstrak dari sel menggunakan Total RNA Kit (R6812-01HP, Omega Bio-Tek Inc., Norcross, GA, AS). Konsentrasi dan keutuhan sampel RNA ditentukan oleh densitas optik pada panjang gelombang 260 dan hanya sampel yang memiliki rasio A260/280 dan A260/230 lebih tinggi dari 1,8 yang dianalisis. Sampel RNA ditranskripsi balik menjadi cDNA menggunakan kit Sintesis cDNA qScript (Takara, Shiga, Jepang) sesuai dengan petunjuk produsen. Quantitative real-time PCR dilakukan dengan SYBR® Premix Ex Taq™ (Takara) menggunakan sistem real-time PCR QuantStudio 6 Flex (Life Technologies). GAPDH, gen pengempa, digunakan sebagai referensi internal. Data dianalisis menggunakan metode perbandingan Ct (2−ΔΔCt) dan diekspresikan sebagai lipatan perubahan dibandingkan dengan kontrol. Sekuensi primer yang digunakan tercantum dalam Tabel 1.
Analisis Statistik
Semua data mewakili setidaknya tiga eksperimen independen dengan sampel triplikasi kecuali dinyatakan lain. Data diekspresikan sebagai mean ± standar deviasi (SD). Perbedaan antar grupo dievaluasi dengan analisis variansi satu arah diikuti oleh uji lanjutan Student-Newman-Keuls atau uji t Student. Nilai P < 0,05 dianggap berarti secara statistik.
Hasil
Karakterisasi Permukaan
Untuk membuat nanotopografi, nanotipa TiO2 terbentuk pada substrat titanium murni menggunakan peralatan oksidasi anod pada berbagai tegangan konstan (30, 40, 50, 60, dan 70 V) selama 1 jam (Gambar 1). Array nanotipa yang tersusun mandiri dan terdistribusi merata diamati oleh mikroskop elektron pemindai (SEM). Tampilan sisi dan atas dari nanotipa ditampilkan dalam Gambar 2a, b. Tinggi nanotipa dalam semua sampel dalam studi ini sekitar 2 μm, sementara diameter dalam nanotipa masing-masing sekitar 74 nm (30 V), 92 nm (40 V), 112 nm (50 V), 128 nm (60 V), dan 148 nm (70 V) (Gambar 2c). Ini menunjukkan bahwa tinggi nanotipa terkait dengan waktu oksidasi anod dan diameter dalam terkait dengan tegangan oksidasi anod. Analisis energi dispersif sinar X (EDS) kemudian dilakukan untuk menganalisis komposisi elemen nanotipa. Ini menunjukkan bahwa nanotipa terdiri dari hanya dua elemen, O dan Ti (Gambar 2d, e). Mikroskop gaya atom (AFM) digunakan untuk mendeteksi struktur nanotipatik dan mengukur deviasi mean aritmetika profil nanotipa sebagai kekasaran permukaan (Ra) (Gambar 2f). Data menunjukkan bahwa kekasaran permukaan nanotipa meningkat seiring bertambahnya diameter (yaitu, tegangan oksidasi anod) (Gambar 2g).
Karakterisasi permukaan nanotipa. a Tampilan sisi nanotipa. Skala bar: 1 μm. b Tampilan atas nanotipa. Skala bar: 500 nm. c Diameter dalam nanotipa pada lima tegangan konstan yang berbeda (30, 40, 50, 60, 70 V). d Komposisi elemen kimia EDS dari struktur nanotipa. e Rasio elemen Ti dan O. f Gambar mikroskop gaya atom (AFM) dari struktur nanotipa. g Kekasaran permukaan rata (Ra) dari nanotipa
Setelah 7 hari osteoinduksi, pewarnaan ALP pertama dilakukan untuk mengevaluasi diferensiasi osteogenik MSC. Hasil pewarnaan menunjukkan bahwa MSC yang dibudayakan pada nanotipa TiO2 memiliki aktivitas ALP yang lebih tinggi dibandingkan sel yang dibudayakan pada substrat titanium licin (grup kontrol) (Gambar 3a). Analisis statistik dari area pewarnaan menunjukkan bahwa kemampuan nanotipa untuk menginduksi diferensiasi osteogenik meningkat secara signifikan dibandingkan dengan grup kontrol. Sementara itu, kami mengamati tren bahwa dalam rentang diameter eksperimen ini, semakin besar diameter nanotipa TiO2, semakin kuat kemampuan untuk menginduksi diferensiasi osteogenik (Gambar 3b). Jadi grup 70 V digunakan dalam eksperimen selanjutnya untuk menampilkan hasilnya dengan lebih baik. Selanjutnya, kami menganalisis ekspresi gen osteogenik pada hari 3 dan 7. MSC yang dibudayakan pada nanotipa TiO2 selama 3 hari dan 7 hari keduanya menunjukkan promosi yang signifikan dari ekspresi gen osteogenik (RUNX2, ALP, OCN, dan OSX) dibandingkan dengan grup kontrol (Gambar 3d–g). Hasil Western blotting mengonfirmasi bahwa ekspresi protein RUNX2 dan OSX juga meningkat setelah 7 hari osteoinduksi (Gambar 3c). Menariknya, kami menemukan bahwa F-aktin diupregulasi dalam grup nanotipa TiO2. Oleh karena itu, jelas bahwa nanotipa TiO2 mengarahkan MSC ke diferensiasi osteoblast, yang terkait dengan diameter nanotipa. Hasil kami juga menunjukkan terlibatnya F-aktin dalam proses ini.
Nanotipa TiO2 meningkatkan ekspresi gen osteogenik BMSCs. a Pewarnaan ALP dari substrat titanium licin dan lima substrat nanotipa yang berbeda. Sel diinduksi dengan medium osteogenik selama 7 hari. b Analisis statistik dari area pewarnaan dilakukan menggunakan ImageJ. c Protein osteogenesis (RUNX2, dan OSX) dan F-aktin dalam MSC dianalisis oleh Western blotting pada hari 7. Ekspresi mRNA RUNX2 (d), ALP (e), OCN (f), dan OSX (g) pada hari 3 dan 7, dianalisis oleh qRT-PCR. NT grup nanotipa. Data mewakili mean ± SD dari tiga sampel. *P < 0,05, **P < 0,01, dan ***P < 0,001
F-Aktin Memediasi Diferensiasi Osteoblast MSC pada Nanotipa TiO2
Untuk lebih jauh mengeksplorasi apakah F-aktin terlibat dalam diferensiasi sel yang diinduksi oleh nanotopografi, kami menggunakan dua reagensi, jasplakinolide (Jasp) dan cytochalasin D (Cyto D), untuk mengatur polimerisasi F-aktin secara positif dan negatif, masing-masing. Mikrograf konfokal pewarnaan Rhodamine-Phalloidin menunjukkan bahwa F-aktin dalam grup perawatan Cyto D hampir depolimerisasi dan struktur serat jarang terlihat, sementara Jasp memstabilkan dan mempolimerisasi F-aktin, terverifikasi oleh struktur serat berseragam yang lebih terang dan jelas daripada yang diamati dalam grup kontrol (Gambar 5a). Selain itu, analisis Western blotting juga mengonfirmasi bahwa ekspresi protein F-aktin terpengaruh, yang membuktikan bahwa Cyto D dan Jasp berfungsi sesuai harapan (Gambar 5b). Assay proliferasi sel menunjukkan bahwa Cyto D secara signifikan menghambat proliferasi sel, sementara Jasp mempromosikan pertumbuhan sel (Gambar 4a). Hasil perhitungan sel konsisten dengan temuan ini (Gambar 4b).
Perakitan F-aktin mengatur ekspresi gen osteogenik BMSCs. a, b Proliferasi sel setelah perawatan Cyto D dan Jasp ditentukan menggunakan assay CCK-8 atau counter sel otomatis pada hari 1, 2, dan 3. c, d Pewarnaan ALP dan analisis aktivitas ALP dilakukan untuk mengevaluasi ekspresi ALP dalam MSC setelah perawatan obat selama 3 hari. Area pewarnaan dianalisis menggunakan ImageJ. c, e–h Western blotting dan qRT-PCR digunakan untuk membandingkan perubahan penanda osteogenesis dalam grup NT+ Cyto D dan grup NT+ Jasp dengan yang ada dalam grup kontrol (tanpa perawatan obat). NT grup nanotipa. Data mewakili mean ± SD dari tiga sampel. *P < 0,05, **P < 0,01, dan ***P < 0,001
Selanjutnya, kami mengevaluasi kemampuan MSC untuk berdiferensiasi menjadi osteoblast untuk menyelidiki apakah F-aktin memediasi proses ini. Kami pertama kali mendeteksi ALP sebagai penanda awal osteogenesis. Dibandingkan dengan grup kontrol, perawatan Cyto D mengurangi ekspresi ALP dan aktivitasnya sementara pada grup perawatan Jasp itu diupregulasi (Gambar 4c, d). Konsisten dengan hasil ini, perawatan Jasp menghasilkan peningkatan level protein RUNX2 dan OSX sementara Cyto D memiliki efek yang berlawanan (Gambar 4c). Sepakat dengan ini, level ekspresi mRNA gen spesifik osteo, termasuk RUNX2, ALP, OCN, dan OSX, menunjukkan tren yang sama setelah perawatan obat (Gambar 4e–h). Secara keseluruhan, data ini menunjukkan bahwa F-aktin memainkan peran penting dalam proses diferensiasi osteogenik MSC yang diinduksi oleh nanotipa TiO2. Mempromosikan depolimerisasi F-aktin menghambat diferensiasi osteoblast yang diinduksi oleh nanotopografi sementara stabilisasi dan polimerisasi F-aktin meningkatkan diferensiasi osteoblast.
F-Aktin Mengatur Diferensiasi Osteoblast MSC pada Nanotipa TiO2 Melalui MKL1 dan YAP/TAZ
Untuk mengurai mekanisme yang mendasari yang melibatkan F-aktin dalam pengaturan nasib MSC, kami menyelidiki protein/molekul yang secara langsung berinteraksi dengan F-aktin atau mempengaruhi polimerisasi F-aktin. Pertama, kami mencoba untuk mengidentifikasi bagaimana nanotopografi mempengaruhi keseimbangan antara F-aktin dan G-aktin. Nanotipa TiO2 sebagai sinyal fisik berbeda dari sinyal kimia yang dapat menembusi membran dan oleh karena itu harus menggunakan beberapa komponen membran sel untuk menyampaikan stimulus ke dalam sel. Bukti yang semakin berkumpul menunjukkan bahwa kompleks adhesi fokus, termasuk integrin, talin, kinas adhesi fokus (FAK), vinculin (VCL), tensin, dan protein lainnya, berfungsi sebagai penguat sinyal, yang memberitahu sel tentang kondisi matriks ekstraseluler (ECM) dan oleh karena itu mempengaruhi perilaku biologis mereka [22, 23]. Penting lagi, F-aktin terikat pada integrin melalui kompleks adhesi fokus tersebut, dan oleh karena itu membentuk hubungan mekanik antara rangka aktin intrakeluler dan ECM [24]. Akibatnya, kami kemudian menganalisis ekspresi komponen kompleks adhesi fokus. Hasil menunjukkan bahwa ekspresi protein dan mRNA VCL dan FAK konsisten dengan perubahan F-aktin, yang menunjukkan bahwa kompleks adhesi fokus terlibat dalam proses diferensiasi osteogenik MSC yang diinduksi oleh nanotipa TiO2 (Gambar 5b dan 6a, b). Selain itu, kami juga menemukan bahwa RhoA, protein GTPase kecil dalam keluarga GTPase Rho, diupregulasi dalam grup perawatan Jasp dan dihibatkan oleh Cyto D (Gambar 5b dan 6a, b). RhoA adalah molekula transduksi sinyal upstream penting dalam jalur MAPK, dan dapat diatur oleh FAK [25, 26]. Fungsi utama RhoA adalah untuk mempromosikan polimerisasi dan stabilitas serat stres (F-aktin) dan perakitan kompleks adhesi fokus [27]. Secara keseluruhan, data ini menyiratkan bahwa nanotipa TiO2 dapat mempengaruhi polimerisasi F-aktin melalui kompleks adhesi fokus dan RhoA.
Pewarnaan imunofluoresensi mengungkapkan tingkat F-aktin dengan pewarnaan phalloidin yang dikonjugasi rodamin (a). Ekspresi protein FAK dan VCL yang terkandung dalam kompleks adhesi fokus, RhoA dan YAP fosforilasi diselidiki oleh Western blotting (b). NT grup nanotipa
Efek perakitan F-aktin pada ekspresi gen FAK (a), vinculin (VCL) (b), RhoA (c), MKL1 (d), YAP (e), dan TAZ (f) dalam MSC. NT grup nanotipa. Data mewakili mean ± SD dari tiga sampel. *P < 0,05, **P < 0,01, dan ***P < 0,001
Tapi bagaimana F-aktin mengatur nasib sel? Sebagian besar studi telah menunjukkan bahwa F-aktin terlibat dalam migrasi sel, pembagian sel, endositosis, dan terutama invasi sel tumor [28,29,30]. Sedikit studi yang menyiratkan bahwa F-aktin juga dapat mengatur diferensiasi sel, tidak pernah menyebut mekanisme molekuler spesifiknya [31, 32]. Oleh karena itu, kami mencari artikel yang menyebutkan perubahan F-aktin dan menemukan bahwa YAP/TAZ, dua koaktivator transkripsi yang erat terkait dalam jalur Hippo, yang bergerak antara sitoplasma dan inti sel, dapat berfungsi sebagai transduser mekanik dalam mengatur diferensiasi MSC [33,34,35]. Selain itu, kami juga menemukan bahwa MKL1, regulator kunci dari diferensiasi sel otot licin, yang berinteraksi dengan faktor transkripsi serum response factor, dapat terikat pada G-aktin dan juga beredar antara sitoplasma dan inti sel [21, 36]. Hasil kami pada akhirnya mengidentifikasi terlibatnya YAP/TAZ dan MKL1 dalam diferensiasi osteoblast yang diinduksi oleh nanotipa dan dimediasi oleh F-aktin (Gambar 5b dan 6d–f). Menariknya, ekspresi protein YAP fosforilasi menunjukkan tren yang berlawanan, yang menunjukkan bahwa tidak hanya ekspresi YAP yang berubah, tetapi fosforilasi YAP juga berubah oleh Cyto D dan Jasp (Gambar 5b). Hasil ini konsisten dengan laporan bahwa fosforilasi YAP/TAZ dapat tersedot di sitoplasma [35].
Secara ringkasan, hasil kami awalnya menunjukkan bahwa F-aktin mengatur diferensiasi osteoblast MSC pada nanotipa TiO2 melalui MKL1 dan YAP/TAZ (Gambar 7).
Representasi skematis perakitan F-aktin yang diinduksi oleh nanotipa, dan peran yang diyakini MKL1 dan YAP/TAZ dalam bertindak sebagai mediator downstream dari sinyal F-aktin untuk mengatur ekspresi gen
Pembahasan
Titanium dan legas titanium adalah bahan logam yang paling banyak digunakan dalam implant klinis orthopedic karena properti baik dari titanium [3]. Namun, longgaran aseptic masih merupakan masalah yang mendesak untuk diatasi dan ditingkatkan, dan kunci kemungkinan terletak pada peningkatan integrasi implant dan tulang gastan. Studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa pelapisan permukaan dan modifikasi atau immobilisasi molekul biofungsional akan menguntungkan oseointegrasi [37]. Baru-baru ini, topografi permukaan implant telah menarik perhatian banyak peneliti berkat studi tentang respons sel terhadap petunjuk fisik [9,10,11, 13, 38]. Dalam studi ini, kami menunjukkan kemampuan nanotipa untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC, dan kemampuan ini ditingkatkan seiring bertambahnya diameter dalam nanotipa (30–70 V). Ini akan membantu memandu diameter nanotipa pada permukaan implant.
Sebagai struktur topografi, nanotipa pertama mengubah properti fisik materi, seperti kapasitas adsorpsi dan konduktivitas listrik dan termal. Properti fisik ini menentukan aplikasi mereka di bidang industri. Misalnya, sebagian besar transformator listrik tegangan tinggi perlu diisi dengan materi isolasi, yang biasanya adalah minyak transformator atau gas isolasi. Ketika isolasi transformator gagal karena panas berlebih dan pengurasan parsial, kecelakaan listrik serius akan terjadi. Oleh karena itu, menemukan metode yang efektif yang secara akurat mendeteksi konsentrasi dan jenis gas terlarut atau komponen dekomposisi gas isolasi dalam transformator adalah perlu untuk memantau status operasional transformator [8, 39,40,41]. Pendekatan tradisional adalah mencari materi dengan adsorpsi gas yang baik dalam elemen transisi, yang kaya akan elektron d, seperti Pd(1 1 1) [39]. Kini, nanotipa banyak dikaji karena properti adsorpsi gas yang baik. He et al. menemukan bahwa CuO-BNNT cocok untuk adsorpsi C2H2, karena adsorpsinya terhadap C2H2 yang lebih kuat [8]. Sementara itu, TiO2 itu sendiri dapat menjadi materi sensor gas. Gui et al. menemukan bahwa TiO2 yang doped Co lebih meningkatkan kapasitas adsorpsi gas dan menunjukkan kemampuan adsorpsi serta perubahan konduktivitas yang unggul terhadap molekul C2H4 [40]. Konsisten dengan studi ini, grafen yang doped Mn juga menunjukkan konduktivitas yang ditingkatkan dan kemampuan unggul dalam deteksi C2H2 dan CO dibandingkan grafen asli [41]. Penelitian di atas menunjukkan bahwa nanotipa TiO2 yang disiapkan dalam eksperimen kami memiliki aplikasi potensial dalam bidang pemantauan status operasional transformator. Namun, kapasitas adsorpsi dan konduktivitas listrik nanotipa terhadap gas perlu diteliti lebih lanjut, terutama apakah properti ini ditingkatkan setelah doping dengan elemen transisi (misalnya, Mn).
Selain mengubah properti fisik permukaan, morfologi skala nano juga mempengaruhi perilaku biologis sel yang melekat padanya. Sel pertama melekat pada permukaan materi dan kemudian bermigrasi, berkembang biak, dan berdiferensiasi. Dibandingkan dengan permukaan datar, struktur rongga dari nanotipa menyediakan lebih sedikit situs adhesi untuk sel. Oleh karena itu, agar sel dapat melekat secara stabil pada permukaan nanotipa dan menjaga keseimbangan biomekanik di dalam sel, kompleks adhesi fokus mulai tersusun dan matang, dan F-aktin menjadi kuat dan stabil.
F-aktin, mikrofilamen linier yang terdiri dari monomernya G-aktin, adalah salah satu tiga komponen utama sitoskeleton. Sebagai struktur beban mekanik, F-aktin umumnya diyakini terlibat dalam pembagian sel, migrasi sel, endositosis, dan invasi sel tumor [28,29,30], tetapi beberapa studi terbaru menunjukkan bahwa ia juga dapat mempengaruhi diferensiasi sel [31,32,33, 36]. Misalnya, depolimerisasi sitoskeleton aktin oleh simvastatin menginduksi diferensiasi kondrosit [31], dan depolimerisasi aktin meningkatkan diferensiasi adipogenic dalam sel stem stroma manusia [32]. Hasil kami juga menunjukkan bahwa, dibandingkan dengan grup kontrol, MSC yang dibudayakan pada nanotipa memiliki level F-aktin yang lebih tinggi dan struktur serat yang lebih jelas. Sementara itu, promosi polimerisasi F-aktin oleh Jasp meningkatkan diferensiasi osteogenik, sementara depolimerisasi F-aktin menghambat diferensiasi osteogenik, yang menyiratkan bahwa F-aktin memediasi diferensiasi osteoblast MSC yang diinduksi oleh nanotipa TiO2.
F-aktin dapat diatur oleh Rho GTPases, anggota dari keluarga Ras [23, 42], dan Rho dapat menginduksi reorganisasi aktin melalui setidaknya dua effector, ROCK dan Dia. ROCK diaktifkan dengan terikat pada Rho-GTP dan kemudian rantai ringan miosin (MLC), substrat ROCK, memainkan peran penting dalam perakitan F-aktin. ROCK menghambat aktivitas fosfatase MLC, yang mengakibatkan peningkatan fosforilasi MLC, yang memicu aktivitas ATPase miosin II dan mempromosikan perakitan F-aktin. Selain itu, ROCK juga target LIM kinase (LIMK). LIMK yang difosforilasi menonaktifkan kofilin dengan fosforilasi, yang dapat merangkaian F-aktin dalam keadaan aktifnya. Effector lain adalah Dia, anggota dari keluarga protein formin-homology (FH) yang memiliki dua domain FH. Domain ini mengandung banyak motif kaya proline yang terikat pada protein binding G-aktin, profilin. Interaksi ini berkontribusi pada polimerisasi aktin dan organisasi F-aktin [42]. Kami mendeteksi salah satu Rho GTPases, RhoA, dan menemukan bahwa ekspresi RhoA konsisten dengan level F-aktin. Namun, kami tidak dapat secara jelas menggambarkan bagaimana nanotipa mengatur ekspresi RhoA, karena terdapat banyak regulator lain, termasuk sinyal integrin, reseptor adhesi lain, reseptor G-protein (GPCR), faktor larut seperti LPA, sinyal reseptor tirosin kinase, dan sebagainya [43].
Mengetahui bahwa F-aktin dapat diatur oleh RhoA, kami kemudian bertanya peran apa yang dimainkan oleh adhesi fokus dalam proses ini, karena kompleks adhesi fokus, yang mengandung integrin, talin, vinculin, paxillin, dan kinas adhesi fokus (FAK), terbentuk dan matang ketika sel melekat pada permukaan nanotipa. Integrin adalah heterodimer transmembran yang menghubungkan ECM ke protein adhesi fokus lainnya guna memfasilitasi adhesi sel. Mereka tidak hanya bertindak sebagai kait sederhana tetapi juga menyampaikan ke sel sinyal kritis tentang sifat lingkungannya, yang bersama dengan sinyal lain seperti EGFR, memicu sel untuk membuat keputusan tentang perilaku biologisnya. Sinyal ini lebih ditransmisikan ke F-aktin, yang secara langsung terhubung dengan kompleks adhesi fokus. Pada satu sisi, morfologi skala nano menyebabkan perakitan dan maturasi kompleks adhesi fokus. Pada sisi lain, kinase seperti FAK dan anggota keluarga kinase Src akan merekrut molekul seperti CRK untuk mengatur sendiri perakitan dan maturasi kompleks adhesi fokus [44,45,46]. Hasil kami menunjukkan bahwa pembentukan dan maturasi kompleks adhesi fokus terganggu oleh depolimerisasi F-aktin, yang menyiratkan bahwa ada umbal balik dari kompleks adhesi fokus ke perakitan aktin sesuai dengan laporan yang diterbitkan.
Namun, tidak boleh diabaikan bahwa protein yang terkandung dalam kompleks adhesi fokus memiliki fungsi transduksi sinyal [47]. Itu artinya, nanotipa dapat secara langsung mengatur ekspresi gen melalui kaskade sinyal, dan F-aktin mungkin hanya berpartisipasi atau terpengaruh oleh proses ini. Misalnya, kompleks kinase ganda FAK dan Src dapat mengatur Rho GTPases seperti RhoA. Ini menunjukkan bahwa nanotipa dapat mengatur RhoA melalui integrin dan kompleks FAK/Src. Selain itu, Src, protein kinase tirosin non-reseptor, dapat mengaktifkan Ras (GTPase kecil) dengan memfosforilasi FAK pada residu tirosin 925 [47, 48]. Kemudian, Ras mengaktifkan banyak jalur biokimia, termasuk jalur MAPK yang telah banyak dipelajari dan jalur PI3K/AKT/mTOR. Dalam jalur MAPK, Ras mengaktifkan c-Raf, diikuti oleh MAP2K dan kemudian MAPK1/2, juga dikenal sebagai kinase sinyal eksternal (ERK). ERK pada gilirannya mengaktifkan faktor transkripsi seperti serum response factor (SRF) dan c-Myc yang terlibat dalam mengatur pertumbuhan dan diferensiasi [49]. Yang lebih penting lagi, Runx2, faktor transkripsi kunci dalam diferensiasi osteogenik, juga dapat diatur oleh ERK [50], dan studi kami sebelumnya telah mengonfirmasi bahwa regangan mekanis mempromosikan diferensiasi osteogenik BMSCs melalui jalur FAK-Erk1/2-Runx2 [17]. Oleh karena itu, kami tidak dapat mengecualikan bahwa ERK memainkan peran dalam diferensiasi osteogenik yang diinduksi oleh nanotipa dan studi lebih lanjut masih diperlukan.
Jadi apa sebenarnya peran F-aktin dalam menginduksi diferensiasi nanotipa, karena perubahan itu dapat mempengaruhi diferensiasi sel? Salah satu kemungkinan adalah bahwa perubahan perakitan F-aktin dapat secara terbalik mengatur level FAK guna menginduksi diferensiasi osteogenik melalui jalur FAK-Erk1/2-Runx2 seperti yang dijelaskan di atas, karena dalam hasil kami, kompleks adhesi fokus dan polimerisasi aktin menunjukkan tren perubahan yang sama, yang menunjukkan bahwa mereka bertindak sebagai satu kesatuan sebagai respons terhadap lingkungan ekstraseluler. Namun, kemungkinan lain juga ada, dan sejumlah artikel telah menunjukkan bahwa MKL1 dan YAP/TAZ bertindak downstream dari keseimbangan dinamis aktin [20, 51,52,53,54]. Keduanya bergerak antara sitoplasma dan inti sel, dan mungkin membantu mentransmisikan sinyal dari sitoskeleton ke inti sel.
MKL1, juga disebut faktor transkripsi terkait miokardin A, sensitif terhadap perubahan level G-aktin. Ketika level G-aktin sitoplasma meningkat, monomernya G-aktin terikat pada MKL1 dan mencegahnya terikat pada SRF dan mengaktifkan transkripsi. Gen target SRF termasuk aktin seperti aktin otot licin (SMA) serta protein binding aktin lain, termasuk gen segera awal seperti c-fos dan egr1. Studi terbaru telah menunjukkan bahwa mengubah aktivitas SRF dapat mengatur adipogenesis dengan mengaktifkan faktor transkripsi adipogenesis reseptor proliferator peroksisom γ (PPARγ), dan juga mengatur pembentukan tulang melalui sinyal IGF-1 dan Runx2 [55, 56].
YAP dan TAZ adalah dua koaktivator transkripsi dalam jalur Hippo, diidentifikasi sebagai jalur regulasi penting yang membatasi proliferasi sel, sehingga mengontrol ukuran organ dan morfogenesis [20]. Gen presor tumor besar 1 dan 2 (LATS1/2) memfosforilasi mereka, sehingga menciptakan situs bind untuk protein 14-3-3, bindingnya mencegah impor inti mereka [53, 54]. Akibatnya, bentuk fosforilasi YAP/TAZ tersedot di sitoplasma, mencegah ekspresi gen seperti Ctgf dan Areg. Selain itu, beberapa studi telah menunjukkan bahwa YAP/TAZ dapat berinteraksi dengan T-box 5 (TBX5), RUNX2, dan p73 untuk mengatur ekspresi gen [57,58,59]. Lebih jauh, adhesi sel ke protein matriks sel telah menunjukkan untuk memicu lokalisasi inti YAP melalui sumbu integrin/FAK/Src. Dalam studi kami, hasilnya menyiratkan bahwa jalur ini mungkin terlibat dalam diferensiasi yang diinduksi oleh nanotipa. Studi lebih lanjut tentang mediator downstream dari sumbu integrin/FAK/Src harus dilakukan untuk mengklarifikasi mekanisme spesifik.
Di satu sisi, semakin banyak studi yang menunjukkan bahwa F-aktin berinteraksi dengan sinyal Hippo, dan Somehow menghambat fosforilasi YAP [54, 60], yang konsisten dengan hasil eksperimen kami bahwa promosi polimerisasi F-aktin mengurangi ekspresi YAP fosforilasi. Kami berhipotesis bahwa ATP yang terlibat dalam proses transformasi antara G-aktin dan F-aktin mungkin juga memainkan peran penting dalam fosforilasi YAP, yang masih perlu diteliti.
Setelah memahami beberapa mekanisme molekuler yang mungkin di atas, kami dapat mencoba menjelaskan beberapa fenomena eksperimental yang ditemukan dalam studi ini. Hasil kami mengungkapkan bahwa semakin besar diameter nanotipa, semakin kuat kemampuan nanotipa untuk mempromosikan diferensiasi osteogenik. Ini konsisten dengan penelitian sebelumnya [61, 62]. Alasan fenomena ini adalah semakin besar diameter nanotipa, semakin sedikit situs adhesi yang dapat mereka berikan pada sel, dan semakin besar perakitan dan maturasi kompleks adhesi fokus. Seiring dengan itu, serat stres yang terdiri dari F-aktin akan memiliki kekuatan dan stabilitas yang lebih besar. Struktur-struktur ini meningkatkan sinyal yang mempromosikan diferensiasi osteogenik. Namun, dapat diprediksi bahwa efek ini berkurang secara signifikan ketika nanotipa menjadi terlalu besar diameternya, sehingga sulit bagi sel untuk melekat pada permukaan [12]. Demikian pula, ketika tinggi nanotipa tidak konsisten, perbedaan tinggi dapat menghasilkan perubahan situs adhesi dan rearrangemen sitoskeleton, yang akan lebih mempengaruhi diferensiasi sel. Menariknya, bahkan materi permukaan datar tanpa modifikasi nanotipa dapat menginduksi perubahan dalam diferensiasi sel. Sejumlah studi telah menunjukkan bahwa pembentukan adhesi fokus dan organisasi serat stres diatur oleh kekakuan substrat [63,64,65], dan YAP/TAZ juga memainkan peran penting dalam proses ini. Oleh karena itu, jelas bahwa sumbu integrin–adhesi fokus (FAs)–F-aktin memainkan peran dalam transmisi sinyal fisik menjadi sinyal kimia intrakeluler.
Secara ringkasan, hasil kami menunjukkan bahwa F-aktin mengatur diferensiasi osteoblast sel stem mesenkimal pada nanotipa TiO2 melalui MKL1 dan YAP/TAZ, yang gen targetnya sebagian menjelaskan proliferasi dan diferensiasi MSC. Kami tahu bahwa tidak ada satu perubahan tunggal dalam jaringan sinyal dan setiap perubahan diatur oleh banyak molekul dan protein. Satu jenis perilaku biologis harus menjadi hasil dari regulasi serangkaian jalur sinyal. Nanotipa menginduksi diferensiasi sel dengan memicu jaringan sinyal yang kompleks, termasuk integrin, protein yang terkandung dalam kompleks adhesi fokus, FAK, Src, Rho GTPase, jalur MAPK, jalur Hippo, dan jalur sinyal yang dilaporkan lainnya. Tidak kurang penting, ada banyak siklus sinyal dalam jaringan sinyal dan sinyal downstream dapat mengatur sinyal upstream melalui umbal balik. Dalam studi ini, kami menemukan bahwa vinculin dan FAK dapat diatur secara terbalik oleh perakitan F-aktin, yang meningkatkan ketidakpastian fungsi molekuler. Oleh karena itu, lebih banyak detail dari mekanisme molekuler menunggu studi lebih lanjut.
Kesimpulan
Hasil kami menunjukkan bahwa nanotipa TiO2 mempromosikan diferensiasi osteogenik MSC, dan kemampuan ini ditingkatkan seiring bertambahnya diameter nanotipa dalam rentang tertentu (30–70 V). F-aktin memediasi diferensiasi sel yang diinduksi oleh nanotipa melalui MKL1 dan YAP/TAZ, memberikan wawasan baru dalam studi diferensiasi sel.
Ketersediaan Data dan Bahan
Data yang digunakan dan dianalisis selama studi saat ini tersedia dari penulis yang sesuai atas permintaan yang wajar.
