Nec-1 Mengurangi Neurotoksis Nanopartikel Dioxid Titanium pada Sel SH-SY5Y melalui Modulasi RIP1

Abstrak

Nanomaterial dioksida titanium diterapkan dalam berbagai bidang karena karakteristik fisikokimia yang luar biasa, yang pada gilirannya menimbulkan ancaman potensi terhadap kesehatan manusia. Baru-baru ini, banyak studi in vivo telah menunjukkan bahwa nanoparticle dioksida titanium (TNPs) dapat diangkut ke otak hewan setelah paparan melalui berbagai rute. TNPs yang terserap dapat mengakumulasi di otak dan mungkin mengganggu sel neuron, yang mengarah pada disfungsi otak. Studi in vitro memverifikasi neurotoksis TNPs. Mekanisme di balik neurotoksis TNPs masih belum jelas. Apakah nekroptosis terlibat dalam neurotoksis TNPs tidak diketahui. Oleh karena itu, kami melakukan studi in vitro dan menemukan bahwa TNPs menginduksi cedera inflamasi pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis, yang diminuta oleh pemberian necrostatin-1 (Nec-1) terlebih dahulu. Karena protein kinas interaksi reseptor 1 (RIP1) dilaporkan sebagai target Nec-1, kami menyilanginya dengan siRNA. Kami mengekspos sel mutant dan liar ke TNPs dan menilai cedera inflamasi. Penekanan ekspresi RIP1 menghambat cedera inflamasi yang diinduksi oleh paparan TNPs. Secara keseluruhan, Nec-1 memperbaiki neurotoksis TNPs melalui RIP1. Namun, lebih banyak studi harus dilakukan untuk menilai secara komprehensif korelasi antara neurotoksis TNPs dan RIP1.

Pendahuluan

Karena sifat fisikokimia yang luar biasa, nanomaterial dioksida titanium disintesis [1] dan digunakan secara luas untuk berbagai tujuan, seperti kosmetik [2], bidang industri [3, 4], dan area medis [5]. Namun, penggunaan yang luas ini dapat menimbulkan ancaman besar terhadap kesehatan manusia [6]. Setelah paparan, mayoritas nanoparticle dioksida titanium (TNPs) masuk ke dalam tubuh manusia melalui hirunan dan pengelaran [6]. Sistem pernapasan [7], sistem pencernaan [8], dan sistem kardiovaskular [9] semuanya mungkin terganggu oleh TNPs yang terserap. Sebagai hal yang sama, otak, sebagai bagian paling penting dari sistem saraf pusat, juga dapat terganggu, karena TNPs dalam sirkulasi dapat menembus halangan darah-otak, dan NP yang dihirun dapat diangkut ke otak melalui jalur olfaktori [10]. Setelah TNPs masuk ke otak, mereka dapat mengakumulasi di sana dan menyebabkan kerusakan pada otak, yang mengarah pada disfungsi. Kerusakan pada otak biasanya tidak dapat diembalikan dan parah, dan oleh karena itu setiap penyebab potensi kerusakan harus diteliti [11].

Meskipun tidak ada studi epidemiologis yang telah mengeksplorasi asosiasi antara paparan TNPs dan penyakit otak, banyak studi in vivo dan in vitro telah mengonfirmasi neurotoksis TNPs [12]. Selain itu, fokus utama telah pada penelitia untuk mengungkap mekanisme yang mendasarinya. Untuk tujuan ini, kami sebelumnya telah meninjau mekanisme molekuler yang saat ini diketahui dari neurotoksis TNPs dan menemukan bahwa proses kematian sel terprogram (PCD), seperti apoptosis dan autofagi, terlibat dalam neurotoksis TNPs [13].

Nekroptosis, juga disebut nekrosis teratur, adalah tipe PCD lainnya. Berbeda dengan apoptosis yang bergantung pada kaspase, nekroptosis bergantung pada protein kinas interaksi reseptor 1/3 (RIP1/RIP3). RIP1 yang diaktifkan merekrut RIP3 untuk membentuk nekrosom, yang mengaktifkan protein kinase domain-like nasab (MLKL) untuk memulai nekroptosis [14]. Nekroptosis dapat mengatur kematian sel dan neuroinflamasi [15, 16], yang keduanya terlibat dalam neurotoksis TNPs. Oleh karena itu, kami menghipotesiskan bahwa nekroptosis terlibat dalam neurotoksis yang disebabkan oleh TNPs.

Untuk menguji hipotesis kami, kami melakukan studi in vitro untuk mengeksplorasi peran nekroptosis dalam neurotoksis TNPs. Dalam studi ini, keberadaan sel, kebocoran LDH, dan sitokin inflamasi (TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8) diukur setelah paparan TNPs. Pertama, sel SH-SY5Y dikultur dengan berbagai konsentrasi TNPs. Kedua, sel diekspos ke TNPs dengan atau tanpa Nec-1, yang merupakan inhibitor nekroptosis yang kuat. Ketiga, ekspresi gen RIP1, yang dapat ditekan oleh Nec-1, disilang menggunakan siRNA, setelah itu sel mutant dan liar diobati dengan TNPs. Studi ini memberikan wawasan pada pemahaman yang komprehensif tentang mekanisme molekuler yang mendasari neurotoksis TNPs.

Hasil

TNPs Menghambat Keberadaan Sel

Untuk memverifikasi toksisitas seluler TNPs pada sel SH-SY5Y, kami pertama kali menilai keberadaan sel menggunakan uji CCK8. Sel dikultur dengan konsentrasi TNPs yang berkisar dari 5 hingga 160 μg/mL selama 24, 48, dan 72 jam. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 1, keberadaan sel tetap tidak berubah pada sel yang diobati dengan 5, 10, 20, dan 40 μg/mL setelah 24 jam paparan. Ketika sel diobati selama 48 dan 72 jam, keberadaan sel tetap tidak berubah hanya pada grup 5 μg/mL (p = 0,4507 pada 48 jam dan p = 0,1002 pada 72 jam). Selain itu, keberadaan sel secara dramatis lebih rendah pada sel yang diobati dengan 80 μg/mL TNPs setelah 48 (p = 0,0007) dan 72 jam (p = 0,0008). Berdasarkan hasil tersebut, kami menyimpulkan bahwa TNPs menurunkan keberadaan sel dengan cara yang bergantung pada dosis dan waktu (data tidak ditunjukkan), menunjukkan bahwa paparan jangka panjang lebih toksik.

TNPs Merusak Integritas Sel Membran

Selanjutnya, kami menganalisis efek toksik TNPs pada integritas membran setelah 72 jam paparan. Integritas membran dievaluasi dengan mengukur kebocoran LDH. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 1b, tingkat LDH secara signifikan meningkat pada sel yang diobati dengan TNPs pada dosis lebih tinggi dari 5 μg/mL. Peningkatan produksi LDH diamati pada sel yang diobati dengan 40, 80, dan 160 μg/mL (p < 0,0001). Hasil ini menunjukkan bahwa TNPs meningkatkan tingkat LDH dengan cara yang bergantung pada dosis, yang mirip dengan uji CCK8.

Paparan TNPs Memromoskan Inflamasi

Respons inflamasi setelah paparan TNPs dianalisis menggunakan ELISA. Setelah sel diobati dengan berbagai konsentrasi TNPs selama 72 jam, tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 diukur. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 2, sekresi IL-8 ditingkatkan pada semua sel yang diobati TNPs; tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 secara seragam meningkat pada sel yang diobati dengan dosis lebih tinggi dari 5 μg/mL (p < 0,01). Selain itu, inflamasi secara signifikan lebih tinggi pada sel yang diobati dengan dosis lebih tinggi dari grup 10 μg/mL (p < 0,0001). Secara keseluruhan, TNPs meningkatkan inflamasi dengan cara yang bergantung pada dosis.

Hasil kami menunjukkan bahwa TNPs menginduksi cedera inflamasi dengan cara yang bergantung pada dosis. Kami mengadopsi konsentrasi TNPs 80 μg/mL dan periode paparan 72 jam dalam eksperimen berikutnya untuk mengeksplorasi peran nekroptosis dalam neurotoksis TNPs.

Pemberian Bersama Nec-1 Mencegah Neurotoksis TNPs

Untuk menganalisis peran nekroptosis dalam cedera inflamasi, kami memberikan perawatan bersama sel dengan Nec-1 (inhibitor nekroptosis) dan TNPs. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 3a, sel SH-SY5Y diekspos ke TNPs atau TNPs+Nec-1 (1, 5, 10, 15, atau 20 μM), dan kami menemukan bahwa Nec-1 secara dramatis memperbaiki penurunan keberadaan sel yang diinduksi oleh TNPs (10, 15, 20 μM) (p < 0,0001). Karena keberadaan sel pada grup yang diobati 15 μM dan 20 μM tidak lebih tinggi dari pada grup yang diobati 10 μM (p = 0,6643 dan p = 0,6292), kami memberikan perawatan bersama sel dengan 10 μM Nec-1 untuk menganalisis efek pada integritas membran.

Setelah mengkultur sel dengan TNPs atau TNPs + Nec-1, kami menemukan bahwa tingkat LDH pada grup TNPs + Nec-1 jauh lebih rendah daripada pada grup TNPs saja (p = 0,0005). Selain itu, perawatan dengan Nec-1 saja tidak meningkatkan kebocoran LDH (p = 0,9878).

Secara kesimpulan, 10 μM Nec-1 dapat secara efektif menghambat toksisitas seluler TNPs dan tidak toksik terhadap sel.

Untuk menganalisis kemampuan antiinflamasi Nec-1, sel dikultur dengan TNPs atau TNPs + Nec-1. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 4, produksi TNF-α (p = 0,003), IL-1β (p = 0,0013), IL-6 (p < 0,0001), dan IL-8 (p = 0,0004) secara signifikan lebih rendah pada grup TNPs + Nec-1 daripada pada grup TNPs.

Hasil-hasil tersebut menyiratkan bahwa Nec-1 dapat mengurangi respons inflamasi yang diinduksi oleh paparan TNPs.

Penekanan RIP1 Mengurangi Cedera Inflamasi yang Diinduksi oleh TNPs

Untuk menentukan apakah Nec-1 membatalkan cedera inflamasi yang diinduksi oleh TNPs melalui RIP1, kami secara efektif menyilangkan ekspresi RIP1 sel menggunakan siRNA (Gambar 5, p < 0,0001). Selanjutnya, cedera inflamasi setelah paparan TNPs pada sel mutant dan liar diukur. Gambar 6a menunjukkan bahwa keberadaan sel pada grup TNPs + si-RIP1 secara signifikan lebih tinggi daripada pada grup TNPs + si-NC (p = 0,0002). Produksi LDH (Gambar 6b, p < 0,0001) dan tingkat TNF-α (p < 0,0001), IL-1β (p = 0,0001), IL-6 (p < 0,0001), dan IL-8 (p = 0,0001) (Gambar 7) pada grup TNPs + si-RIP1 secara dramatis lebih rendah daripada pada grup TNPs + si-NC. Hasil ini menunjukkan bahwa TNPs memromoskan cedera inflamasi melalui RIP1.

Pembahasan

Dalam studi ini, kami menemukan bahwa paparan TNPs menginduksi toksisitas seluler pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis dan bahwa nekroptosis terlibat dalam neurotoksis TNPs. Untuk mengeksplorasi peran nekroptosis, kami mengekspos sel ke TNPs dengan atau tanpa Nec-1 (inhibitor nekroptosis yang kuat) [17, 18], dan mengukur keberadaan sel, kebocoran LDH, dan tingkat sitokin inflamasi. Data kami menunjukkan bahwa pemberian bersama Nec-1 dapat mengurangi cedera inflamasi yang diinduksi oleh TNPs. Karena studi telah menunjukkan bahwa Nec-1 mempengaruhi dengan menekan aktivitas RIP1, kami mentransfeksi sel dengan si-RIP1 untuk menentukan apakah RIP1 terlibat dalam efek pelindung Nec-1. Sel mutant dan liar diobati dengan TNPs, dan cedera inflamasi dinilai. Ini menunjukkan bahwa keberadaan sel pada grup si-RIP1 lebih tinggi daripada pada grup si-NC, dan tingkat kebocoran LDH serta sitokin inflamasi lebih rendah pada grup si-RIP1 daripada pada grup si-NC setelah paparan TNPs. Kesimpulannya, studi ini pertama kalinya mengungkapkan bahwa nekroptosis terlibat dalam cedera inflamasi yang diinduksi oleh TNPs pada sel.

Kami mengonfirmasi kembali neurotoksis TNPs dalam studi in vitro kami. Setelah sel SH-SY5Y diekspos ke berbagai konsentrasi TNPs untuk berbagai waktu inkubasi, keberadaan sel dinilai menggunakan uji CCK8. Seperti yang ditunjukkan dalam Gambar 1a, paparan TNPs mengurangi keberadaan sel dengan cara yang bergantung pada dosis; setelah paparan 48 jam dan 72 jam, keberadaan sel pada grup TNPs 80 dan 160 berkurang secara dramatis dibandingkan dengan grup kontrol (p < 0,001). Untuk mengonfirmasi toksisitas seluler lebih lanjut, kami juga mengukur kebocoran LDH. Data dalam Gambar 1b menunjukkan bahwa produksi LDH meningkat dengan cara yang bergantung pada dosis setelah paparan 72 jam, dan tingkat LDH pada grup 40, 80, dan 160 secara signifikan lebih tinggi daripada pada grup kontrol (p < 0,0001). Karena studi sebelumnya telah menunjukkan bahwa neuroinflamasi dapat dipromosikan oleh paparan TNPs [19], tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 juga diukur. Gambar 2 menggambarkan bahwa tingkat empat sitokin inflamasi tersebut secara signifikan ditingkatkan dibandingkan dengan grup kontrol dan secara dramatis lebih tinggi pada grup yang diobati dengan 20 hingga 160 μg/mL (p < 0,0001). Secara keseluruhan, hasil kami menunjukkan bahwa TNPs dapat menginduksi neurotoksis dengan cara yang bergantung pada dosis, yang konsisten dengan studi sebelumnya. TNPs dapat terserap oleh sel neuron dan menghambat proliferasi [20,21,22]. Selain itu, paparan TNPs dapat menurunkan keberadaan sel dan memromoskan kebocoran LDH dengan cara yang bergantung pada dosis [23,24,25,26,27].

Kami memberikan perawatan bersama sel dengan Nec-1 untuk mengklarifikasi apakah nekroptosis terlibat dalam neurotoksis yang disebabkan oleh TNPs. Setelah sel diobati dengan konsentrasi TNPs yang ditunjukkan dengan atau tanpa Nec-1, keberadaan sel, kebocoran LDH, dan inflamasi dinilai. Gambar 3a menunjukkan bahwa penurunan keberadaan sel setelah paparan TNPs secara signifikan dihemat oleh pemberian bersama 10 μM Nec-1. Sementara itu, Gambar 3b mengungkapkan bahwa perawatan dengan 10 μM Nec-1 tidak meningkatkan tingkat LDH, dan tingkat LDH pada sel yang diobati dengan grup TNPs + Nec-1 secara dramatis lebih rendah daripada pada grup TNPs saja. Selanjutnya, kami mengukur efek pemberian bersama Nec-1 pada inflamasi yang diinduksi oleh TNPs. Gambar 4 menggambarkan bahwa tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 secara signifikan lebih rendah pada sel yang diobati dengan TNPs + Nec-1. Hasil ini memverifikasi kembali bahwa Nec-1 dapat melindungi sel dari kematian dan proses inflamasi [28, 29].

Akhirnya, karena RIP1 adalah target Nec-1, kami menilai apakah RIP1 dapat mengatur neurotoksis TNPs. Kami membangun sel mutant dengan menyilangkan ekspresi RIP1 (Gambar 5). Data dari Gambar 6 dan Gambar 7 mengungkapkan bahwa setelah paparan TNPs, keberadaan sel lebih tinggi, dan LDH, TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 lebih rendah pada grup si-RIP1 daripada pada grup si-NC, yang menyiratkan bahwa TNPs memromoskan toksisitas seluler melalui RIP1. Seperti halnya, beberapa studi telah mengungkapkan bahwa RIP1 dapat mengatur baik kematian sel maupun proses inflamasi [30, 31].

Meskipun kami melaporkan untuk pertama kalinya bahwa Nec-1 dapat mengurangi neurotoksis TNPs dengan menekan jalur sinyal nekroptosis, studi kami memiliki beberapa keterbatasan. Pertama, toksisitas seluler bahan nano berukuran berbeda dari bentuk bulk-nya dan dapat sangat dipengaruhi oleh sifat permukaan [32], yang dapat menjelaskan hasil yang berlawanan dari peningkatan keberadaan sel yang ditemukan oleh Sebastián et al. [33]. Oleh karena itu, penting untuk mengevaluasi toksisitas nano pada subjek dari berbagai aspek, seperti proliferasi sel, integritas membran, stres oksidatif, inflamasi, fungsi mitokondria, siklus sel, sitoskeleton, dan epigenetika. Kedua, RIP1 dapat merekrut RIP3 untuk membentuk nekrosom fungsional, aktivator vital MLKL, untuk memulai nekroptosis [34]. Kami menghipotesiskan bahwa RIP3/MLKL mungkin terlibat dalam neurotoksis TNPs, yang harus diteliti di masa depan. Selanjutnya, asosiasi RIP3/MLKL dengan neurotoksis TNPs juga harus dievaluasi. Ketiga, spesies reaktif oksigen (ROS), sebagai mekanisme utama yang mendasari neurotoksis TNPs [35, 36], dilaporkan sebagai sinyal upstream dari RIP1 [37]. Oleh karena itu, apakah ROS adalah upstream dari RIP1 dalam neurotoksis TNPs harus dibahas lebih lanjut. Keempat, sel harus diekspos ke konsentrasi non-toksik (TNPs < 5 μg/mL) untuk jangka panjang (lebih dari 72 jam) untuk menilai toksisitas kronis. Kelima, kami harus mengevaluasi peran nekroptosis dalam neurotoksis TNPs pada lebih banyak baris sel neuron dan sel neuron primer manusia dan hewan.

Kesimpulan

Studi kami mengungkapkan nekroptosis sebagai mekanisme kematian sel terprogram lainnya yang terlibat dalam neurotoksis yang disebabkan oleh TNPs. Dalam studi ini, kami menemukan bahwa TNPs dapat menginduksi cedera inflamasi pada sel SH-SY5Y dengan cara yang bergantung pada dosis dan bahwa pemberian bersama Nec-1 (inhibitor nekroptosis yang kuat) dapat memperbaiki efek berbahaya tersebut. RIP1, target Nec-1, disilang dengan si-RNA, yang secara efektif mengurangi cedera inflamasi yang diinduksi oleh paparan TNPs. Kesimpulannya, Nec-1 menghambat cedera inflamasi sel SH-SY5Y yang diinduksi oleh paparan TNPs dengan menargetkan jalur RIP1. Jalur sinyal upstream dan downstream RIP1 yang terlibat dalam neurotoksis TNPs harus dievaluasi lebih lanjut.

Bahan dan Metode

Persiapan TNPs dan Kultur Sel

Kami sebelumnya telah mem karakterisasi TNPs dan menyiapkannya sesuai dengan prosedur yang telah kami terbitkan sebelumnya [38]. Secara singkat, TNPs dilarutkan dalam RPMI 1640 ke berbagai konsentrasi 5, 10, 20, 40, 80, dan 160 μg/mL. Larutan TNPs dipasterikan dan di-sonikasi (300 W, 10 menit) pada suhu kamar untuk mencegah partikel mengumpuk sebelum perawatan. Sel dalam media kultur yang tidak diekspos ke TNPs berfungsi sebagai grup kontrol. Sel SH-SY5Y, dibeli dari Bank Sel Institut Ilmu Kehidupan Shanghai, Akademi Ilmu Pengetahuan China, dikultur dalam media RPMI 1640 (HyClone, Logan, UT, AS) yang dilengkapi dengan 10% serum sapi fetal (Gibco, garis produk Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AS), 100 U/mL penisilin, dan 100 μg/mL streptomisin pada 37 °C dalam incubator lembap dengan 5% CO₂.

Uji Keberadaan Sel dan Kebocoran LDH

Keberadaan sel diukur menggunakan kit perhitungan sel-8 (CCK8. Dojindo, cat no.CK04). Secara singkat, 1 × 10⁴ sel SH-SY5Y ditempatkan dalam plate 96-lubang dan dikultur dalam incubator pada 37 °C (5% CO₂) selama 24 jam sebelum paparan TNPs. Sel kemudian diinkubasi dengan TNPs pada berbagai konsentrasi (0, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, dan 80 μg/mL) selama 24 jam lagi. Setelah perawatan, sel diinkubasi dengan CCK-8 selama 2 jam lagi. Selanjutnya, kepadatan optik (OD) diukur pada 450 nm dengan menempatkan plate 96-lubang ke dalam pembaca plate mikro (BioTek, Winooski, VT, AS). Keberadaan sel setiap grup, dinyatakan sebagai persentase, dihitung sebagai (ODtreated−ODblank)/(ODcontrol − ODblank) × 100%.

Integritas membran diukur menggunakan komersial kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute, China). Setelah sel SH-SY5Y diekspos ke berbagai konsentrasi TNPs selama 72 jam, sekresi LDH dianalisis sesuai dengan petunjuk produsen.

Respons Inflamasi

ELISA digunakan untuk mengukur tingkat TNF-α, IL-1β, IL-6, dan IL-8 yang dihasilkan oleh sel SH-SY5Y. Secara singkat, sel SH-SY5Y diekspos ke TNPs selama 72 jam, dan supernatant dikoleksi untuk analisis sesuai dengan petunjuk produsen (Elabscience Biotechnology Co., Ltd.).

Transfeksi siRNA

Mengikuti protokol produsen, konsentrasi 100 nM si-RIP1 atau siRNA kontrol negatif (si-NC) ditransfeksi ke dalam sel menggunakan Lipofectamine 2000. Efisiensi penekanan gen oleh siRNA diestimasi dengan PCR real-time.

PCR Real-Time

RNA dari sel yang diekspos ke berbagai konsentrasi TNPs diekstrak menggunakan kit RNAqueous (Ambion Inc., Austin, TX, AS) berdasarkan petunjuk produsen. Ekspresi relatif RIP1 diukur dengan PCR real-time. Tingkat mRNA relatif RIP1 dinormalisasi terhadap ekspresi β-actin.

Analisis Statistik

Perangkat lunak SPSS 11.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, AS) digunakan untuk menganalisis data. Analisis variansi satu arah digunakan untuk membandingkan rata-rata grup. p < 0,05 dianggap signifikan secara statistik.

Ketersediaan Data dan Bahan

Tersedia dari naskah.

Singkatan

TNPs:

Nanopartikel Dioxid Titanium

Nec-1:

Necrostatin-1

RIP:

Protein Kinas Interaksi Reseptor

MLKL:

Protein Kinase Domain-like Nasab

ROS:

Spesies Reaktif Oksigen