Brain-Targeted Polysorbate 80-Emulsified Donepezil Drug-Loaded Nanopartikel untuk Neuroprotection
Abstrak
Sebagian besar obat penyakit Alzheimer tidak bekerja secara efisien karena penghalang darah-otak. Oleh karena itu, kami merancang nanopartikel baru (PS-DZP-CHP):kolesterol-modifikasi pullulan (CHP) nanopartikel dengan cakupan permukaan polisorbat 80(PS), sebagai pembawa donepezil (DZP) untuk mewujudkan pengiriman jaringan otak. Dengan analisis ukuran dan kalorimetri titrasi isotermal, kami memilih rasio dosis obat yang optimal dengan bahan nano (1:5) dan merancang serangkaian percobaan untuk memverifikasi kemanjuran nanopartikel. Hasil eksperimen pelepasan in vitro menunjukkan bahwa nanopartikel dapat mencapai pelepasan obat secara terus menerus dalam waktu 72 jam. Hasil pengamatan fluoresensi pada tikus menunjukkan penargetan otak yang baik dari nanopartikel PS-DZP-CHP. Selanjutnya, nanopartikel dapat meningkatkan konsentrasi obat dalam jaringan otak pada tikus. Nanopartikel DZP-CHP digunakan untuk mengobati sel saraf dengan kerusakan protein Aβ. Konsentrasi laktat dehidrogenase ditentukan dengan pewarnaan MTT, rhodamin 123 dan AO-EB, yang membuktikan bahwa nanopartikel DZP-CHP memiliki efek perlindungan pada neurotoksisitas yang diinduksi oleh Aβ25–35 dan lebih unggul dari donepezil gratis. Uji meteran gerak perpetual mikrotermal menunjukkan bahwa nanopartikel PS-DZP-CHP memiliki afinitas dengan apolipoprotein E, yang mungkin penting untuk penargetan nanopartikel ini ke jaringan otak.
Pengantar
DA merupakan penyakit sistem saraf pusat dengan mekanisme patologis yang rumit yang menyebabkan disfungsi kognitif progresif, tetapi sangat sulit untuk diobati karena kesulitan dalam pemberian obat dan rendahnya konsentrasi obat yang dapat mencapai jaringan otak [1, 2]. Bagian dari BBB telah menjadi kesulitan utama dalam sistem pengiriman obat (DDS) penelitian [3, 4]. Sebagian besar obat membuka BBB melalui cara biologis, kimia atau fisik; di antaranya, metode fisik sekarang paling umum digunakan secara klinis [5]. Karena cacat yang tidak dapat diatasi dalam penghantaran obat intrakranial berdasarkan teknologi invasif, menghasilkan prodrug lipofilik atau substrat transpor aktif melalui modifikasi kimia permukaan obat memiliki lebih banyak keuntungan [6]. Di antara mereka, nanopartikel adalah salah satu pilihan terbaik untuk mencapai pengiriman obat intrakranial dengan secara aktif menargetkan BBB [7,8,9].
Nano-DDS telah menjadi fokus penelitian penargetan otak dan mencakup nanopartikel polimer, nanopartikel organik, liposom, serat nano, dan misel yang telah dirancang untuk memberikan perawatan dan diagnostik [6, 10,11,12]. Baik nanopartikel yang mengandung obat dan obat lipofilik molekul kecil dapat melewati BBB. Perbedaannya adalah nanopartikel yang mengandung obat lebih mungkin untuk melewati difusi pasif melalui adsorpsi pada dinding kapiler di otak. Selain itu, obat bebas menghadapi penghalang kedua, penghalang cairan serebrospinal darah (B-CSF) [13]. Tidak seperti rekan-rekan penghalang lainnya, sebagian besar obat relatif permeabel melalui CSF dan berdifusi ke dalam parenkim otak. Namun, karena proses difusi yang sangat lambat, konsentrasi obat bebas di CSF jauh lebih tinggi daripada di parenkim otak, dan konsentrasi yang tinggi di CSF akan menyebabkan beberapa toksisitas [14, 15]. Dalam proses ini, nanopartikel memiliki keunggulan yang unik dan signifikan. Jika permukaan nanocarrier dilapisi dengan surfaktan hidrofilik, ApoE akan teradsorpsi ke permukaan, dan CSF dapat mendorong pergerakan nanopartikel menuju parenkim otak melalui ruang di sekitar pembuluh darah [16]. Nanopartikel dilapisi dengan polisorbat surfaktan nonionik 80 disiapkan oleh Kreuter et al. [17] adalah obat pertama yang berhasil dikirim ke sistem otak dan diangkut melalui adsorpsi protein serum ApoE dalam plasma. Oleh karena itu, modifikasi polisorbat 80 pada permukaan nanopartikel untuk membentuk komposit obat-spesifik memungkinkan penargetan obat dan pengenalan reseptor BBB endogen, sangat meningkatkan bioavailabilitas obat [18,19,20].
Saat ini, inhibitor asetilkolinesterase (AChE) donepezil (DZP) umumnya digunakan untuk pengobatan DA sedang, tetapi karena kelarutannya dalam lemak, disolusi yang buruk dalam vivo , dan bioavailabilitas oral yang rendah, tablet donepezil konvensional harus diminum setiap hari untuk mempertahankan efek terapeutik [21, 22]. Karena kemampuan kognitif pasien AD sangat terganggu, yang menyebabkan ketidaknyamanan yang besar dalam mempertahankan jadwal pengobatan, pengembangan persiapan DZP pelepasan berkelanjutan jangka panjang sangat mendesak. Hipotesis kaskade amiloid menunjukkan bahwa penyebab DA adalah deposisi plak amiloid di sekitar parenkim otak dan dinding serebrovaskular. Sejumlah besar bintik-bintik difus juga diamati di area otak, yang terdiri dari deposit Aβ ekstraseluler amorf, sangat fibrotik dan tidak larut [23, 24]. Boridy dkk. menemukan bahwa nanopartikel polisakarida pullulan yang tidak beracun dan mudah terdegradasi dapat membentuk kompleks dengan protein Aβ dan efektif mencegah agregasi protein dan dapat dengan cepat dibersihkan dari sel untuk menghambat toksisitas sel [25]. Kolesterol-hidrofobik termodifikasi pullulan (CHP) adalah zat amfifilik yang dapat merakit diri menjadi struktur nano dengan inti hidrofobik dan cangkang hidrofilik rantai gula dalam larutan berair [26, 27]. Pada saat yang sama, nanopartikel CHP dapat menyerap protein Aβ untuk mencegah deposisi dan agregasi, memainkan peran sinergis. Sebagai nanocarrier, CHP memiliki keunggulan signifikan.
Berdasarkan pengetahuan di atas, tim peneliti merancang nanopreparasi DZP-CHP pada tahap awal dan menentukan rasio dosis obat yang optimal terhadap nanocarrier. Kemudian, polisorbat diadsorpsi pada permukaan nanopartikel untuk secara aktif menargetkan bagian melalui BBB untuk mencapai pengayaan otak. Dalam penelitian ini, serangkaian nanosolutions DZP-CHP dikarakterisasi, dan proses pelepasan obat secara in vitro dieksplorasi dan dipelajari. Setelah nanopartikel berhasil disiapkan, Aβ25-35 digunakan untuk menginduksi kerusakan sel saraf untuk membentuk model sel AD [28, 29]. Kemudian, efek perlindungan dari larutan nano DZP-CHP diselidiki dalam model sel PC12 dan SH-SY5Y.
Bahan dan Metode
Materi
Berikut ini digunakan:pullulan yang dimodifikasi secara hidrofobik kolesterol (buatan sendiri) [30]; donepezil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); polisorbat 80 (Institut Reagen Tianjin Fuchen); pewarna hijau indocyanine (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); polisorbat 80 (Tween 80, PS) (Kantor Reagen Tianjin Fuchen); tikus hitam (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35 (US Sigma); garam tetrametil azozole (MTT) (US Sigma); serum sapi yang baru lahir (Gibco AS); kit dehidrogenase laktat (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); Kit fluoresensi pewarnaan ganda AO/EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); dan sel PC12 (sel pheochromocytoma adrenal tikus) yang diperoleh dari Departemen Neurologi, Second Xiangya Hospital, Central South University. Sel SH-SY5Y (sel neuroblastoma sumsum tulang manusia) dibeli dari ATCC Cell Bank (Manassas, VA, USA).
Persiapan Nanopartikel
Tiga jenis nanopartikel dengan rasio DZP dan CHP yang berbeda (b/b) (10:20, 4:20 dan 2:20) berhasil disiapkan terlebih dahulu melalui dialisis air sesuai dengan metode yang dilaporkan dalam literatur [31]. Nanopartikel DZP-CHP konsentrasi tertentu ditambahkan ke dalam gelas kimia dengan volume konstan 10 mL dan kemudian disedot ke dalam gelas kimia lain yang berisi pengemulsi polisorbat 80 (PS) (konsentrasi 0,7 mmol) untuk mengendap selama 1 jam. Campuran kemudian ditempatkan dalam tabung EP dan disonikasi selama 3 menit (daya keluaran 100 W, mode kerja pulsa intermiten:lebar pulsa 2,0 detik, waktu intermiten 2,0 detik). Operasi diulang tiga kali sampai diperoleh dispersi yang seragam [32]. Polisorbat 80-emulsi nanopartikel obat-loaded donepezil (PS-DZP-CHP) akhirnya diperoleh setelah kotoran dihilangkan melalui penyaringan.
Karakterisasi Nanopartikel
Morfologi Nanopartikel
Bentuk, morfologi permukaan dan ukuran nanopartikel DZP-CHP (DCPs) dengan rasio DZP terhadap CHP 1:2, 1:5 dan 1:10 dianalisis dengan mikroskop elektron transmisi Tecnai F20. Setetes nanopartikel CHP, DZP-CHP dan PS-DZP-CHP ditempatkan pada mesh tembaga berlapis karbon untuk membentuk film cair tipis. Kemudian, larutan asam fosfotungstat 2% (b/v) digunakan untuk mendapatkan pewarnaan negatif sampel setelah pengeringan alami film. Larutan nanopartikel berair yang baru disiapkan ditambahkan tetes demi tetes ke wafer silikon bersih, dikeringkan pada suhu kamar, dan kemudian ditempatkan di bawah mikroskop elektron pemindaian emisi medan JSM-6700F untuk mengamati struktur permukaan.
Ukuran Nanopartikel dan Potensi Zeta
Ukuran, koefisien polidispersitas (PDI) dan potensi zeta nanopartikel DZP-CHP dan PS-DZP-CHP dianalisis menggunakan hamburan cahaya dinamis (DLS). Ukuran partikel rata-rata dan distribusi ukuran dari suspensi homogen yang diperoleh diukur masing-masing tiga kali.
Pelepasan Obat In Vitro
Pelepasan donepezil diukur menggunakan dialisis air dinamis. Satu miligram nanopartikel DZP-CHP dan PS-DZP-CHP dilarutkan dalam 5 ml fosfat buffer saline (PBS, pH 7,4, konsentrasi 0,01 M) dan kemudian dipindahkan ke kantong dialisis, yang disimpan dalam larutan yang sama pada suhu suhu konstan 37 °C dengan pengadukan magnet. Empat mililiter PBS pada 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 dan 72 jam diencerkan dengan volume PBS yang sama pada pH yang sama. Spektrofotometri ultraviolet–tampak digunakan untuk mendeteksi absorbansi dialisat pada 312 nm pada waktu yang berbeda; isi larutan ditentukan dengan kurva standar, dan uji pelepasan diulang tiga kali secara in vitro. Persentase pelepasan donepezil dihitung menurut rumus berikut:
Cn adalah konsentrasi sampel pada titik waktu Tn, g/mL; V adalah volume total larutan pelepasan PBS, mL; Vn adalah volume cairan pelepasan PBS pada titik waktu Ti, mL; dan Ci adalah konsentrasi donepezil pada titik waktu Ti, g/mL.
Kalorimetri Titrasi Isothermal (ITC)
Konsentrasi tertentu dari larutan PS diteteskan ke dalam larutan nanopartikel CHP, dan perubahan panas diukur dengan ITC (vip-itc, Microcal, Northampton, MA, USA). Solusi nanopartikel CHP mencakup tiga jenis nanopartikel dengan rasio DZP-to-CHP yang berbeda (1:2, 1:5 dan 1:10). Semua larutan dihilangkan gasnya sebelum titrasi. Suhu seluruh sistem dijaga konstan pada 25 °C.
Eksperimen Hewan untuk Mengamati Penargetan Otak
Persiapan Nanopartikel CHP Donepezil Berlabel ICG
Empat ratus miligram CHP-DZP dan 20 mg ICG ditimbang menggunakan neraca analitik, dan jumlah DMSO yang sesuai ditambahkan untuk mencampur dan melarutkan secara menyeluruh. Kemudian, larutan yang diperoleh di atas ditambahkan tetes demi tetes ke dalam kantong dialisis dengan pipet, dan air suling diganti setiap satu jam sekali. Tiga jam kemudian, air suling diganti setiap 2 jam, dan 400–800 mL air suling ditambahkan setiap kali selama 48 jam sampai DMSO didialisis sepenuhnya. Setelah itu, larutan di atas dipindahkan dengan pipet ke dalam labu takar untuk mendapatkan volume yang konstan dan kemudian diperlakukan dengan gelombang ultrasound selama 2 menit. Filtrasi melalui membran filter 0,45 m menghasilkan nanopartikel DZP-CHP berlabel ICG (ICG-DZP-CHP), yang dikemas secara terpisah dan disimpan dalam lemari es pada suhu 4 °C untuk penggunaan di masa mendatang.
Sejumlah ICG-DZP-CHP yang sesuai ditempatkan ke dalam gelas kimia 10 mL, dan 1 (v/v) polisorbat 80 (PS) emulsifier ditambahkan. Gelas disimpan selama 1 jam dan kemudian dipindahkan ke dalam tabung EP untuk ultrasonikasi selama 2 menit pada 100 W. Operasi di atas diulang tiga kali sampai diperoleh larutan nano yang seragam. Akhirnya, nanopartikel obat-loaded donepezil yang disaring dan berlabel ICG diperoleh (PS-ICG-DZP-CHP).
Eksperimen MST untuk Memverifikasi Pengikatan APOE ke Nanopartikel
Semua eksperimen MST dilakukan pada sistem Monolith NT.115 (201810-BR-N024). Semua solusi disiapkan dengan air deionisasi dan reagen analitis. Buffer disiapkan dan disimpan pada suhu kamar. Sampel protein disimpan dalam es sampai digunakan [33]. Nanopartikel PS-ICG-CHP (55,6 μM) diencerkan hingga 40 nM dengan air deionisasi, dan ICG dimuat untuk fluoresensi. Larutan APOE (30 μl, 55.6 M) disiapkan, dan 16 tabung kapiler diberi label 1 sampai 16; pertama, 20 l APOE ditambahkan ke tabung 1, dan 10 l ditambahkan ke tabung 2 sampai 16. Kemudian, 10 L larutan dipindahkan dari tabung 1 ke tabung 2 dan dicampur secara menyeluruh. Setelah itu, 10 l larutan dikeluarkan dari tabung 2 dan dipindahkan ke tabung 3. Operasi ini diulang sampai 10 L larutan akhirnya dikeluarkan dari tabung 16 untuk memastikan bahwa larutan di setiap tabung memiliki volume yang sama. Sepuluh mikroliter nanopartikel encer ditambahkan ke setiap tabung dan dicampur secara menyeluruh untuk memulai pengukuran. Data uji MST dianalisis dengan perangkat lunak analisis NT, dan pemasangan KD dilakukan menurut hukum aksi massa mengikuti instruksi perangkat lunak.
Teknologi Pencitraan Fluoresensi In Vivo untuk Pengamatan Penargetan Otak
Tikus hitam sehat dengan berat masing-masing sekitar 18–22 g dipilih dan dibagi secara acak menjadi 2 kelompok:kelompok PS-ICG-DZP-CHP dan kelompok ICG-DZP-CHP. Setiap tikus disuntik dengan 200 l 200 g/ml obat kelompok di atas melalui vena ekor, dan 0,5 jam kemudian, tikus dibius dengan natrium pentobarbital 1% (50 mg/kg). Setelah itu, semua tikus ditempatkan di area pemotretan live imager dengan parameter pencitraan diatur ke panjang gelombang eksitasi 765 nm-815 nm dan panjang gelombang serapan 815 nm-845 nm untuk mendapatkan gambar fluoresensi seluruh hewan. . Setelah pencitraan, semua tikus dibedah, dan ginjal, jantung, limpa, paru-paru, hati, dan otak dikeluarkan untuk mendapatkan gambar fluoresensi. Parameter pencitraan konsisten dengan yang dijelaskan di atas.
Studi Distribusi Jaringan Nanopartikel
Pengelompokan dan Pengambilan Sampel Tikus
Empat puluh lima tikus C57BL/6 secara acak dibagi menjadi 15 kelompok:5 kelompok disuntik dengan donepezil bebas (kelompok bebas), 5 dengan nanopartikel donepezil (grup nano), dan 5 lainnya dengan nanopartikel donepezil termodifikasi PS (grup PS) di 0,25 mg/kg melalui ekor vena. Kemudian, darah diambil pada 1 jam, 3 jam dan 6 jam setelah injeksi. Setelah itu, semua hewan dikorbankan, dan jaringan jantung, otak, hati, dan ginjal dikumpulkan dan diparut. Kemudian, 0,2 g jaringan di atas ditimbang dengan tepat dan ditambahkan ke sekitar 1 ml larutan NaCl 0,9% dan dihomogenisasi dengan homogenizer (65 Hz, 150 detik). Seratus mikroliter homogenat jaringan secara akurat dimasukkan ke dalam tabung EP 1,5 mL dengan 0,7 mL metanol, divorteks hingga tercampur selama 30 detik untuk pengendapan protein, lalu disentrifugasi pada 12.000 r·min
−1
selama 10 mnt. Akhirnya, 100 L supernatan dipindahkan ke dalam botol injeksi untuk dianalisis.
Metode Penentuan
HPLC pertama kali digunakan untuk pemeriksaan, tetapi sensitivitasnya tidak cukup tinggi. Oleh karena itu, percobaan LC-MS tindak lanjut dilakukan, yang menunjukkan spesifisitas yang kuat dan tidak ada zat endogen yang mengganggu penentuan obat. Protokol LC-MS mematuhi pedoman untuk penentuan sampel biologis. Kondisi kromatografi adalah sebagai berikut:fase gerak A, air (mengandung asam format 0,1%); fase gerak B, metanol (mengandung 0,1% asam format); elusi isokratik:A30%-B70%; laju aliran, 0,3 mL· menit
−1
; suhu kolom, 35 °C; volume injeksi, 10 L. Kondisi tumbukan adalah sebagai berikut:suhu sumber ionisasi elektrospray (ESI), 150 °C; laju aliran gas desolasi, 550 L·h
−1
; suhu gas desolasi, 500 °C. Kondisi untuk deteksi ion positif adalah sebagai berikut:tegangan kapiler, 3 kV; tegangan kerucut, 30 V; mode pemindaian, pemantauan reaksi ganda (MRM).
Eksperimen Sel
Budaya dan Lintasan Sel
Sel PC12 dan SH-SY5Y dikultur dalam DMEM gula tinggi yang dilengkapi dengan 10% (v/v) serum janin sapi yang tidak diaktifkan panas (FBS) dan 1% (v/v) penisilin dan streptomisin dan kemudian disimpan dalam inkubator yang berisi 5 % CO2 pada 37 °C. Sel digunakan dalam berbagai eksperimen atau dilewatkan segera setelah mencapai pertemuan 80%. Sebelum percobaan, sel PC12 dan SH-SY5Y diunggulkan pada pelat pralapis kolagen tipe I pada kepadatan sel yang diperlukan sesuai dengan skala percobaan.
Kriopreservasi Sel
Saat diamati tumbuh hingga fase log di bawah mikroskop, sel PC12 dan SH-SY5Y dibekukan dan dicuci dua kali dengan PBS, ditripsinisasi untuk membentuk suspensi sel dan ditempatkan dalam tabung sentrifus steril untuk pengumpulan sentrifugasi (1000 r × min
− 1
, 3 mnt). Kemudian, larutan kriopreservasi sel ditambahkan, dan sel-sel disimpan dalam tabung dengan nama sel dan tanggal ditandai. Sel-sel ditempatkan di lemari es pada suhu 4 °C selama 1 jam, 20 °C selama 2 jam, 80 °C (beku) semalaman dan akhirnya dipindahkan ke tangki nitrogen cair.
Metode MTT untuk Mendeteksi Tingkat Kelangsungan Hidup Sel
Viabilitas sel diukur menggunakan uji reduksi MTT. Secara singkat, sel PC12 dan SH-SY5Y diunggulkan dalam pelat 96-sumur (dilapisi dengan kolagen tipe I) dengan kepadatan 1 × 10
4
sel/mL untuk memungkinkan sel menempel pada masing-masing sumur. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel diprainkubasi dengan larutan nano CHP donepezil yang berbeda konsentrasinya atau larutan donepezil gratis selama 2 jam. Selanjutnya, Aβ25-35 (konsentrasi akhir 20 μM) ditambahkan ke setiap sumur. Pelat 96-sumur yang telah dirawat diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Setelah itu, MTT (50 L, 5 mg/mL) ditambahkan dan diinkubasi dengan sel yang diberi perlakuan pada suhu 37 °C selama 4 jam. Akhirnya, media dikeluarkan dengan hati-hati, dan kristal formazan dilarutkan dalam 150 L DMSO. Absorbansi diperoleh pada 490 nm menggunakan pembaca pelat mikro. Viabilitas sel dinyatakan sebagai persentase sel hidup pada kelompok perlakuan dan persentase sel hidup pada kelompok kontrol yang tidak diberi perlakuan.
Penentuan Aktivitas LDH di Supernatan Sel
Sel PC12 dan SH-SY5Y diunggulkan ke dalam pelat kultur 96-sumur (dilapisi dengan kolagen tipe I) dengan kepadatan 2 × 10
5
dan 3 × 10
5
sel/mL, masing-masing. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel diprainkubasi dengan larutan nano CHP donepezil yang berbeda konsentrasinya atau larutan donepezil gratis selama 2 jam. Selanjutnya, Aβ25-35 (konsentrasi akhir 20 μM) ditambahkan ke setiap sumur. Aktivitas LDH diukur sesuai dengan instruksi yang diberikan oleh kit. Secara singkat, sel-sel yang dikultur dengan media dikumpulkan dan kemudian disentrifugasi pada 3500 rpm. Supernatan (50 L) dicampur dengan reaktan dengan volume yang sama untuk memulai reaksi LDH. Absorbansi diperoleh pada 450 nm menggunakan pembaca lempeng mikro, dan aktivitas LDH dihitung.
Metode Pewarnaan AO/EB untuk Mengamati Morfologi Apoptosis
Pewarna fluoresen AO/EB digunakan untuk mengevaluasi karakteristik sel apoptosis. Sel PC12 dan SH-SY5Y diunggulkan dalam pelat kultur 12 lubang hitam (dilapisi dengan kolagen tipe I) dengan kepadatan 3 × 10
5
dan 4 × 10
5
sel/sumur, masing-masing. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel diprainkubasi dengan larutan nano CHP donepezil yang berbeda konsentrasinya atau larutan donepezil gratis selama 2 jam. Selanjutnya, Aβ25-35 (konsentrasi akhir 20 μM) ditambahkan ke setiap sumur. Setelah perawatan, operasi dilakukan sesuai dengan kit. Cahaya dihindari selama percobaan. Akhirnya, morfologi sel diamati.
Metode Pewarnaan Rhodamin 123 untuk Deteksi Potensi Membran Mitokondria
MMP diukur menggunakan pewarna fluoresen rhodamin 123 (Rh123), pewarna kationik permeabel sel yang secara istimewa didistribusikan ke mitokondria karena sifatnya yang sangat negatif. Sel PC12 dan SH-SY5Y diunggulkan dalam pelat kultur 24-sumur hitam (dilapisi dengan kolagen tipe I) dengan kepadatan 2 × 10
5
dan 3 × 10
5
sel/sumur, masing-masing. Setelah inkubasi selama 24 jam, sel diprainkubasi dengan larutan nano CHP donepezil yang berbeda konsentrasinya atau larutan donepezil gratis selama 2 jam. Selanjutnya, Aβ25-35 (konsentrasi akhir 20 μM) ditambahkan ke setiap sumur. Setelah perlakuan, sel dicuci dengan PBS dan diinkubasi dengan 10 g/mL rhodamin 123 selama 30 menit dalam gelap pada suhu 37 °C. Setelah inkubasi, sel dicuci 3 kali dengan PBS, dan intensitas fluoresensi diukur pada 488 nm dan 510 nm menggunakan pembaca pelat fluoresensi.
Pemrosesan Statistik dan Analisis Data
Semua percobaan diulang tiga kali, dan hasilnya dinyatakan sebagai mean ± standar deviasi. Perangkat lunak statistik GraphPad Prism digunakan, dan ANOVA satu arah, t Siswa tes dan metode lain yang digunakan untuk analisis statistik. P < 0,05 menunjukkan bahwa perbedaan signifikan secara statistik.
Hasil
Karakteristik Nanopartikel
CHP mengagregasi sendiri untuk membentuk nanopartikel dengan inti hidrofobik, yang dapat dimuat dengan DZP. Nanopartikel CHP bermuatan DZP (DZP) dengan rasio obat terhadap nanomaterial 1:2, 1:5 dan 1:10 diberi nama DCN1, DCN2 dan DCN3. Menurut hasil pemindaian mikroskop elektron, nanopartikel CHP menunjukkan struktur sferis, dan setelah pemuatan DZP, DCN juga sferis, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 1. Ukuran rata-rata dan potensi zeta nanopartikel CHP adalah 257 ± 3.05 nm dan 2.81 ± 0,27 mV, masing-masing. Setelah pemuatan DZP, ukuran rata-rata adalah 273 ± 3.72, 260.7 ± 1.76 dan 266.8 ± 4.56 nm, dan potensi zeta masing-masing adalah -6.20 ± 0.40, 5.75 ± 0.64 dan -9.30 ± 0.39 mV untuk DCN1, DCN2, dan DCN3 , seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1. Persentase penjebakan obat adalah 42,00 ± 5,65%, 86,54 ± 1,31% dan 59,71 ± 4,43%, dan persentase pemuatan obat adalah 12,02 ± 1,90%, 13,42 ± 2,03% dan 7,40 ± 1,72%, masing-masing.
Memindai gambar mikroskop elektron (a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), distribusi ukuran (b a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) dan potensial zeta (c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) dari partikel nano
Pengukuran ITC
Untuk DCN, selama seluruh proses reaksi, reaksi terutama menunjukkan puncak ke atas (Gbr. 2), dan reaksinya endotermik karena puncak ke atas menunjukkan reaksi pelepasan panas. Oleh karena itu, PS dapat secara spontan teradsorpsi pada permukaan DCN. Afinitas PS adalah (14,7 ± 2,76) × 10
4
M
−1
, (29.8 ± 1.66) × 10
4
M
−1
dan (36,7 ± 3.84) × 10
4
M
−1
, dan derajat cakupan PS masing-masing adalah 2,65 ± 0,193, 2,70 ± 0,372 dan 1,49 ± 0,434 untuk DCN1, DCN2 dan DCN3. Hasil ini menunjukkan bahwa PS teradsorpsi ke permukaan DCN dengan afinitas tinggi dan memiliki jumlah cakupan yang lebih besar pada DCN2. ∆H> 0 dan ∆S> 0 menunjukkan bahwa ketiga partikel tersebut terutama terikat melalui interaksi hidrofobik dengan PS.
Data kalorimetri isotermal untuk titrasi PS (0,9 mM) ke dalam a DCN1, b DCN2 dan c Solusi DCN3 (0,02 mM) pada 25 °C. Derajat cakupan, afinitas (KA) dan perubahan entalpi dan entropi untuk pengikatan PS dengan nanopartikel (NP) setelah titrasi menjadi larutan NP
Karakterisasi Tiga Jenis Nanopartikel
NP CHP dan DCN yang dibuat dengan dialisis menunjukkan bentuk bola yang seragam (Gbr. 3a). Menurut penelitian di atas, kami memilih nanopartikel DZP-CHP dengan rasio obat terhadap bahan nano 1:5 sebagai subjek percobaan berikut. Nanopartikel DZP-CHP memiliki ukuran partikel yang relatif seragam 260,7 ± 1,76 nm, dan indeks dispersi 0,196 ± 0,019. Meskipun ukuran partikel tetap relatif stabil setelah pemuatan obat, namun meningkat tajam menjadi 335,2 ± 5,46 nm setelah adsorpsi PS. Potensi zeta nanopartikel DZP-CHP adalah 0.66 ± 0.04 mV, dan setelah dilapisi dengan polisorbat 80, potensi zeta turun menjadi 2.22 ± 0.86 mV (Gbr. 3b).
Karakterisasi nanopartikel yang berbeda. a a Foto mikroskop elektron transmisi NP CHP, b foto mikroskop elektron transmisi NP DZP-CHP, c foto mikroskop elektron transmisi NP PS-DZP-CHP. B:Diagram ukuran partikel dan diagram potensi zeta NP CHP-DZP (rasio umpan 1:5) dan NP DZP-CHP yang dimodifikasi dengan polisorbat 80 (rasio umpan 1:5)
Melepaskan Nanopartikel Obat In Vitro
Hasil menunjukkan bahwa dibandingkan dengan donepezil gratis, NP DZP-CHP dan NP PS-DZP-CHP melepaskan DZP selama 72 jam dengan efek pelepasan terkontrol yang jelas. Laju pelepasan cepat awal nanopartikel yang mengandung obat mungkin disebabkan oleh disolusi dan pelepasan molekul obat yang cepat, dan kemudian, perlambatan dapat disebabkan oleh penurunan konsentrasi obat, yang hanya dapat dipengaruhi oleh disolusi dan difusi. Pelepasan obat in vitro dari NP DZP-CHP yang dilapisi dan tidak dilapisi dengan polisorbat 80 kemudian dipelajari. Alasan pelepasan NP PS-DZP-CHP yang lebih lambat mungkin karena adsorpsi polisorbat 80 yang kuat ke obat molekuler hidrofobik kecil (Gbr. 4).
Kurva pelepasan obat in vitro untuk DZP, NP DZP-CHP (1:5) dan NP PS-DZP-CHP
Efek Penargetan Otak Nanopartikel
Pengamatan Penargetan Otak Menggunakan Teknologi Pencitraan Fluoresensi Langsung
Otak tikus yang disuntik dengan ICG gratis tidak menunjukkan fluoresensi, tetapi otak yang disuntik dengan nanopartikel yang diemulsi dengan PS menunjukkan fluoresensi yang lebih kuat di otak daripada yang disuntik dengan nanopartikel nonemulsi karena kedua nanopartikel mampu mencapai otak setelah injeksi melalui vena ekor (Gbr. . 5a). Untuk memverifikasi ini, kami membedah tikus 30 menit setelah injeksi intravena larutan ICG-DZP-CHP dan PS-ICG-DZP-CHP, mengeluarkan semua organ yang diperlukan untuk penelitian, dan kemudian melakukan pencitraan fluoresensi. Nanopartikel PS-ICG-DZP-CHP menunjukkan fluoresensi yang kuat di otak, tetapi tidak ada yang diamati di organ lain (Gbr. 5b). Gambar menunjukkan bahwa nanopartikel yang dimodifikasi dengan PS menyajikan fluoresensi terkuat di jaringan otak, sedangkan yang tidak dimodifikasi menunjukkan fluoresensi yang lemah. Tidak ada fluoresensi yang diamati pada jaringan otak tikus yang disuntik dengan ICG gratis (Gbr. 5c).
Gambar fluoresensi in vivo setelah solusi yang berbeda disuntikkan melalui vena ekor. a Gambar fluoresensi seluruh hewan yang disuntikkan melalui vena ekor dengan 200 μg/ml nanopartikel DZP-CHP atau PS-DZP-CHP yang dimuat dengan ICG sebagai noda. solusi ICG Gratis (intensitas fluoresensi × 10
9
), b Nanopartikel ICG-DZP-CHP (intensitas fluoresensi × 10
7
), c Nanopartikel ICG-DZP-CHP dimodifikasi oleh PS (intensitas fluoresensi × 109). b Gambar fluoresensi berbagai organ setelah injeksi nanopartikel DZP-CHP yang dimodifikasi oleh PS melalui vena ekor. c Fluorescence images of the brain after dissection. d Brain of mice injected with ICG-PS-DZP-CHP nanoparticles, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG
Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice
Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).
a The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. b The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times
MST Results
MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the KD value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).
a Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. b The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model
Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ25–35
MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ25– 35 on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ25– 35 concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P < 0.01).
Effects of different concentrations of Aβ25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. a , b The effect of different concentrations of Aβ25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P < 0.05, ** P < 0.01 vs control group). c The effect of different concentrations of Aβ25– 35 on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b Aβ25– 35 (5 μM) injury group, c Aβ25– 35 (10 μM) injury group, d Aβ25– 35 (20 μM) injury group, e Aβ25– 35 (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ25– 35 on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g Aβ25– 35 (5 μM) injury group, h—Aβ25– 35 (10 μM) injury group, i—Aβ25– 35 (20 μM) injury group, j—Aβ25– 35 (40 μM) injury group
Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ25– 35 (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ25– 35 increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ25– 35 was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.
Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.
Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)
MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0,05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25– 35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0.05).
Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. a dan b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P < 0.05, ## P < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P < 0.05 vs DZP group). c The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio
LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0.05).
According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P < 0,05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.
An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.
Discussion
Although nanoparticles have been shown to be an effective delivery medium for nervous system diseases, the complexity of their structure and performance makes it challenging to detect and evaluate their physical–chemical properties and biological safety [34,35,36]. Therefore, after nanodrugs are designed, experiments to verify the safety and effectiveness of the nanomaterials at the cell and animal levels are extremely necessary. In the early laboratory stage, PS-DZP-CHP nanoparticles were successfully synthesized, and the optimal dosing ratio of the drug to CHP was set at 1:5. Due to the stable adsorption of PS to apolipoproteins ApoB and ApoE, brain targeting of nanoparticles can be achieved by permeation through the BBB [37]. The expected goal is that nanoparticles begin to decompose after reaching the brain; DZP is released and increases the concentration of cholinesterase; CHP reduces Aβ protein deposition and improves the brain environment; and administration frequency decreases because of the sustained release from nanoparticles [38,39,40,41].
Therefore, this study conducted an in vitro drug release test to assess the sustained release effect of nanoparticles. Compared with free DZP, nanoparticles achieved local sustained release in the brain, and PS can adsorb plasma proteins and reduce the loss of nanoparticles and prolong the release time to achieve a long cycle. After injection of ICG-labeled DZP-CHP and PS-DZP-CHP nanoparticles into rats, emulsified nanoparticles showed stronger fluorescence in the brain than those not emulsified with Tween 80. After organ biopsy, fluorescence imaging of various organs revealed that only the brain presented strong fluorescence, while other organs did not, indicating that nanoparticles did not release the drug until they reached the brain, which met the expected goal. In addition, nanoparticles modified with polysorbate 80 adsorbed ApoE to the surface and simulated low-density lipoprotein to bind to lipoprotein receptors on the surface of endothelial cells and enter the brain through LDLR induction [42, 43]. Moreover, the mechanisms by which nanoparticles regulate the tight junctions between endothelial cells and the inhibition of P-glycoprotein may produce a synergistic effect on their transcellular transport into the brain parenchyma [44]. However, since polysorbate 80 is prone to produce toxic substances, which cause untoward reactions, such as hypotension, dyspnea and shock, the dosage should be strictly controlled [45, 46]. Although a large number of nanodrugs have been developed for treatment of CNS diseases, most have shown poor effects [4]. In this study, we built a brain model of AD patients to evaluate the protective effect of nanoparticles on the brain. Because the toxicity of the Aβ protein to nerve cells varies with the concentration, it is better to screen an appropriate concentration to better simulate the brain environment of AD patients. The model was treated with DZP and DZP-CHP nanosolutions in advance to investigate the protective effect of DZP-CHP against PC12 and SH-SY5Y cell damage induced by Aβ25-35. The results showed that both solutions improved the cell proliferation activity caused by Aβ25-35, LDH release declined, and the mitochondrial potential rose. The inhibitory effect of the DZP-CHP nanosolution on cell damage induced by Aβ25-35 was significantly better than that of free DZP solution, and a concentration of 10 M DZP-CHP nanosolution proved to be the best, which may be due to the optimal drug concentration approach.
Basically, this study deduced the activity process of nanoparticles in vivo , verifying that PS-DZP-CHP nanoparticles have strong brain targeting, a good sustained release effect and a good AD therapeutic effect, thus demonstrating that they are clinically promising nanodrugs. The difficulty of treating the brain with medication has always been a major problem for researchers. The BBB leads to difficulty in curing CNS diseases, such as Parkinson's disease, brain tumors and brain stroke [47]. PS-DZP-CHP nanoparticles can effectively pass the BBB without destroying it, and DZP can be replaced as a model drug. Loading other drugs with high fat solubility and poor dissolution in vivo into the hydrophobic center of the NPs can not only increase brain targeting but also improve the water solubility of the drug. In addition, the design of CHP nanoparticle solutions is simple, and the drug dosage of the hydrophobic center can be flexibly controlled to ensure the best therapeutic effect while minimizing cytotoxicity [48, 49]. In future work, we will conduct in vivo research on DZP-CHP nanoparticles, such as evaluation of drug metabolism and side effects. These studies supplied a new strategy for brain drug delivery, and it is advantageous to clinical application of nanodrug with AD treatment.
Conclusion
DZP-CHP nanoparticles showed an optimal drug to nanomaterials dosing ratio of 1:5, which led to higher PS coverage and drug loading. DZP-CHP nanoparticles with PS adsorption exhibited slow release and significant brain targeting. Nanoparticle surface modification with PS can promote adsorption of Apo E and thus is vital for brain targeting. DZP-CHP nanoparticles had a protective effect on neurotoxicity and were superior to free donepezil.
