Nanopartikel Donepezil Emulsi Polisorbat-80 yang Diarahkan ke Otak: Strategi Neuroprotektif Baru
Abstrak
Pengobatan penyakit Alzheimer (AD) sering gagal mencapai konsentrasi terapeutik di otak karena halangan darah-otak (BBB). Kami merakit nanopartikel pullulan modifikasi kolesterol (CHP) yang dimuat dengan inhibitor asetilkolinesterase donepezil (DZP) dan melapisi permukaannya dengan polisorbat 80 (PS) untuk mencapai transcitosis BBB yang aktif. Menggunakan pencaran cahaya dinamis dan kalorimetri titrasi isothermal, kami mengidentifikasi rasio 1:5 (w/w) DZP:CHP sebagai optimal, menghasilkan penangkap obat tinggi (86,5 persen) dan pemuatan (13,4 persen). Studi peluncuran in vitro menunjukkan peluncuran DZP yang berkelanjutan selama 72 jam. Citra fluoresens in vivo pada tikus mengonfirmasi bahwa nanopartikel dilapisi PS menumpuk secara preferensi pada jaringan otak, dengan deponesi organ sasaran yang bisa diabaikan. Uji fungsional pada sel PC12 dan SH-SY5Y yang diobati sebelumnya dengan Aβ25–35 menunjukkan bahwa nanopartikel DZP-CHP memulihkan kelangsungan sel, mengurangi kebocoran dehidrogenase laktat (LDH), memelihara potensi membran mitokondria (MMP), dan menghambat apoptoksi secara lebih efektif daripada DZP bebas. Mikro-termoforesis menunjukkan ikatan ApoE yang kuat (K_D = 3,6 µM), yang menunjukkan transportasi BBB terimedi reseptor. Hasil ini mendukung potensi klinis nanopartikel DZP-CHP dilapisi PS untuk neuroproteksi yang terarah pada AD.
Pendahuluan
AD ditandai dengan penurunan kognitif progresif dan deponesi beta-amiloid (Aβ). Donepezil oral konvensional menderita kelarutan air yang rendah, bioavailabilitas oral yang rendah, dan penetrasi BBB yang terbatas, memerlukan pengobatan harian dan mengorbankan kepatuhan pasien. Sistem pengiriman obat nanopartikel (nano-DDS) menawarkan platform yang menjanjikan untuk mengatasi hambatan ini dengan memfasilitasi difusi pasif dan transportasi terimedi reseptor melalui BBB. Polisorbat 80, surfactant non-ionik, telah terbukti mengikis apolipoprotein serum (ApoE, ApoB), sehingga meniru partikel lipoprotein padat rendah yang dapat mengecap reseptor LDL pada sel endotel dan melintasi BBB. Pullulan modifikasi kolesterol (CHP) menyusun diri sendiri menjadi nanopartikel amfifilik dengan inti hidrofobik yang cocok untuk mengenkapsulasi obat hidrofobik dan cangkir hidrofilik yang mengurangi opsonisasi.
Dalam studi ini, kami menggabungkan CHP dan PS untuk menciptakan nanopartikel multifungsi yang mengenkapsulasi DZP, mempromosikan penetrasi BBB, dan mengirimkan tingkat terapeutik yang berkelanjutan ke otak sambil mengurangi toksisitas Aβ in vitro.
Bahan dan Metode
Bahan
CHP (buatan sendiri), donepezil (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.), polisorbat 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute), indocyanine green (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.), tikus hitam C57BL/6, Aβ25–35 (US Sigma), reagen MTT (US Sigma), kit dehidrogenase laktat (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), kit pewarnaan AO/EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.), sel garis PC12 (feokromositoma adrenal tikus) dan SH-SY5Y (neuroblastoma manusia) (ATCC).
Persiapan Nanopartikel
Tiga rasio DZP:CHP (10:20, 4:20, 2:20 w/w) dilarutkan dalam media air dan dialisis (MWCO 1 kDa) untuk membentuk nanopartikel. PS (0,7 mM) ditambahkan ke 10 mL suspensi nanopartikel masing-masing, diaduk selama 1 jam, dan diultrasonik (100 W, pulsa 2 detik) hingga homogen. Nanopartikel DZP-CHP dilapisi PS (PS-DZP-CHP) difilter untuk mengeluarkan pengotor.
Karakterisasi
Mikroskop transmisi elektron (TEM) dan mikroskop elektron pemindai (SEM) mengonfirmasi morfologi bola. Pencaran cahaya dinamis (DLS) mengukur ukuran dan potensi zeta. Kalorimetri titrasi isothermal (ITC) menilai affinensi ikatan dan cakupan PS. Peluncuran in vitro dievaluasi melalui dialisis terhadap PBS pH 7,4 pada 37 °C, pemetaan hingga 72 jam dan pengukuran DZP dengan UV-vis (312 nm) terhadap kurva standar.
Targeting Otak In Vivo
Nanopartikel DZP-CHP dilabeli ICG disiapkan dengan dialisis 400 mg CHP-DZP dengan 20 mg ICG, diikuti dengan ultrasonikasi. Nanopartikel PS-ICG-DZP-CHP kemudian dirumuskan seperti di atas. Sepuluh tikus hitam menerima injeksi vena ekor 200 µL (200 µg/mL) dari PS-ICG-DZP-CHP atau ICG-DZP-CHP. Citra fluoresens (eksitasi 765–815 nm, emisi 815–845 nm) menangkap distribusi seluruh tubuh dan organ 30 menit setelah injeksi.
Distribusi Jaringan
Empat puluh lima tikus C57BL/6 dialokasikan ke kelompok DZP bebas, DZP-CHP, dan PS-DZP-CHP (0,25 mg/kg, IV). Darah dan organ (otak, jantung, hati, ginjal) dikumpulkan pada 1, 3, 6 jam. Homogenat diekstraksi dengan metanol, difusigen, dan dianalisis dengan LC–MS/MS (fasa seluler: air asam formiat 0,1 persen / metanol 70:30, aliran 0,3 mL/min). Kuantifikasi menggunakan pemantauan reaksi ganda (MRM) dengan ionisasi elektrospray positif.
Model Sel dan Uji Neuroproteksi
Sel PC12 dan SH-SY5Y dibudidayakan dalam DMEM + 10 persen FBS, diurai pada 1×10⁴ sel/mL (plate 96-lubang) atau 2–3×10⁵ sel/mL (uji lain). Neurotoksisitas diinduksi oleh Aβ25–35 (20 µM). Kelangsungan sel diukur dengan MTT (490 nm). Kebocoran LDH (450 nm) menilai integritas membran. MMP dievaluasi dengan fluoresens Rhodamine 123. Morfologi apoptoksi divisualisasikan melalui pewarnaan AO/EB.
Hasil
Karakterisasi Nanopartikel
CHP tunggal membentuk bola ~257 nm (zeta –2,8 mV). Pemuatan DZP meningkatkan ukuran sedikit menjadi 260–274 nm dan menggeser zeta menjadi –5 hingga –9 mV, tergantung pada rasio obat. Formulasi 1:5 DZP:CHP (DCN2) mencapai penangkap obat tertinggi (86,5 persen) dan pemuatan (13,4 persen). Lapisan PS meningkatkan ukuran menjadi 335 nm dan zeta menjadi –2,2 mV, mengonfirmasi modifikasi permukaan yang berhasil.
Afinensi Ikat PS
ITC mengungkapkan afinensi ikatan PS sebesar 1,47×10⁵, 2,98×10⁵, dan 3,67×10⁵ M⁻¹ untuk DCN1, DCN2, DCN3, masing-masing, dengan rasio cakupan 2,65, 2,70, dan 1,49 mol PS per mol nanopartikel. Interaksi endotermik, dipengaruhi entropi, menunjukkan asosiasi hidrofobik.
Peluncuran In Vitro
DZP bebas terlarut dengan cepat. PS-DZP-CHP melepaskan 35 persen dalam 6 jam, 70 persen pada 24 jam, dan 90 persen pada 72 jam, menunjukkan peluncuran yang berkelanjutan. DZP-CHP tanpa lapisan melepaskan lebih cepat, kemungkinan karena perlindungan PS yang lebih lemah.
Targeting Otak
Citra fluoresens menunjukkan sinyal yang bisa diabaikan pada kontrol ICG bebas. PS-ICG-DZP-CHP menghasilkan fluoresens otak yang cerah 30 menit setelah injeksi, dengan sinyal minimal pada organ perifer. Kuantifikasi jaringan mengonfirmasi konsentrasi DZP otak 3–4 kali lebih tinggi untuk PS-DZP-CHP dibandingkan DZP bebas, dan puncak tertunda (6 jam vs 1 jam) yang mengindikasikan peluncuran berkelanjutan.
Ikat ApoE
MST menghasilkan K_D sebesar 3,63 µM untuk interaksi PS-ICG-CHP–ApoE, mendukung transcitosis BBB terimedi reseptor.
Neuroproteksi pada Model Sel
Aβ25–35 pada 20 µM mengurangi kelangsungan sel PC12 menjadi 49,5 persen dan SH-SY5Y menjadi 49,7 persen. Pra-pengobatan dengan DZP-CHP (5 µM, 10 µM) memulihkan kelangsungan menjadi 68–75 persen (vs 48 persen dengan DZP bebas). Kebocoran LDH berkurang 30 persen dengan DZP-CHP, dan MMP tetap >80 persen dari kontrol, sedangkan DZP bebas hanya mencapai sekitar 70 persen. Pewarnaan AO/EB menunjukkan morfologi apoptoksi yang berkurang pada kelompok DZP-CHP.
Pembahasan
Nanopartikel DZP-CHP dilapisi PS kami telah mencapai pengiriman otak yang terarah, peluncuran obat yang berkelanjutan, dan efektivitas neuroprotektif yang lebih baik in vitro. Afinensi PS yang tinggi dan adsorpsi ApoE memfasilitasi transcitosis BBB terimedi LDLR, sementara inti CHP menyediakan reservoar lipofilik yang mengurangi agregasi Aβ. Dibandingkan dengan DZP bebas konvensional, platform nanopartikel memperpanjang interval dosis, yang berpotensi meningkatkan kepatuhan pasien dan mengurangi efek samping. Studi in vivo di masa depan akan berfokus pada farmakokinetik, toksisitas, dan efektivitas terapeutik pada model hewan AD.
Kesimpulan
Nanopartikel pullulan modifikasi kolesterol yang dimuat donepezil dan dilapisi permukaannya dengan polisorbat 80 menunjukkan pemuatan obat yang optimal (rasio 1:5 DZP:CHP), peluncuran berkelanjutan, penetrasi BBB yang efisien, dan neuroproteksi yang ditingkatkan terhadap toksisitas yang diinduksi Aβ. Temuan ini mendukung PS-DZP-CHP sebagai nanomedisin yang menjanjikan untuk pengobatan penyakit Alzheimer.
